SKRINING BAKTERI PELARUT FOSFAT
advertisement
SKRINING BAKTERI PELARUT FOSFAT ADAPTIF VINASSE DARI LAHAN TEBU PABRIK GULA JATIROTO KABUPATEN LUMAJANG JAWA TIMUR SKRIPSI Oleh Ahmad Bukhari Saragih NIM 061810401018 JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2013 SKRINING BAKTERI PELARUT FOSFAT ADAPTIF VINASSE DARI LAHAN TEBU PABRIK GULA JATIROTO KABUPATEN LUMAJANG JAWA TIMUR SKRIPSI diajukan guna melengkapi tugas akhir dan memenuhi salah satu syarat untuk menyelesaikan Program Studi Biologi (S1) dan mencapai gelar Sarjana Sains Oleh Ahmad Bukhari Saragih NIM 061810401018 JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2013 i PERSEMBAHAN Dengan nama Allah Yang Maha Pengasih dan Maha Penyayang, skripsi ini Penulis persembahkan kepada : 1. Ummi Linda Afrida Nasution S.Pd., dan Buya Prof. DR. Abdul Hasan Saragih M. Pd., yang tercinta; 2. Adik-adik tersayang Siti Hafnisa Saragih, Muhammad Zulham Hidayah Saragih, dan Muhammad Baihaqi Saragih; 3. Nenek Hj. Nurnani dan Oppu Alm. Kamianna Purba. ii MOTO Allah akan meninggikan orang-orang yang beriman dan orang-orang yang diberi ilmu pengetahuan beberapa derajat. (Terjemahan Surat Al-Mujaadalah ayat 11)*) *) Departemen Urusan Agama Islam, Wakaf, Dakwah dan Irsyad Kerajaan Saudi Arabia.1995. Al-Qur’an dan terjemahannya dalam Bahasa Indonesia. Madinah Al-Munawwarah: Komplek Percetakan Alquranul Karim Kepunyaan Raja Fahd. iii PERNYATAAN Saya yang bertanda tangan di bawah ini nama : Ahmad Bukhari Saragih NIM : 061810401018 menyatakan dengan sesungguhnya bahwa karya ilmiah yang berjudul ”Skrining Bakteri Pelarut Fosfat Adaptif Vinasse dari Lahan Tebu Pabrik Gula Jatiroto Kabupaten Lumajang Jawa Timur” adalah benar-benar hasil karya ilmiah sendiri, kecuali jika dalam pengutipan substansi disebutkan sumbernya dan belum pernah diajukan pada institusi manapun, serta bukan karya jiplakan. Karya ilmiah ini merupakan bagian dari penelitian proyek Dr. Kahar Muzakhar, S.Si., yang didanai oleh DIPA Stranas 2010 dan karya ilmiah ini tidak dapat dipublikasikan kecuali atas seijin pemilik proyek. Saya bertanggung jawab atas keabsahan dan kebenaran isinya sesuai dengan sikap ilmiah yang harus dijunjung tinggi. Demikian pernyatan ini saya buat dengan sebenarnya, tanpa ada tekanan dan paksaan dari pihak manapun serta bersedia mendapat sanksi akademik jika ternyata di kemudian hari pernyataan ini tidak benar. Jember, 14 Februari 2013 Yang Menyatakan, Ahmad Bukhari Saragih NIM 061810401018 iv SKRIPSI SKRINING BAKTERI PELARUT FOSFAT ADAPTIF VINASSE DARI LAHAN TEBU PABRIK GULAJATIROTO KAPUBATEN LUMAJANG JAWA TIMUR Oleh Ahmad Bukhari Saragih NIM 061810401018 Pembimbing Dosen Pembimbing Utama : Dr. Kahar Muzakhar, S.Si. Dosen Pembimbing Anggota : Drs. Sutoyo, M.Si. v PENGESAHAN Skripsi berjudul “Skrining Bakteri Pelarut Fosfat Adaptif Vinasse dari Lahan Tebu Pabrik Gula Jatiroto Kabupaten Lumajang Jawa Timur” telah diuji dan disahkan pada: hari, tanggal : tempat : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember. Tim Penguji Ketua, Sekretaris, Dr. Kahar Muzakhar, S.Si. NIP 196805031994011001 Drs. Sutoyo, M.Si. NIP 196610141992031002 Anggota I, Anggota II, Sattya Arimurti, S.P., M.Si. NIP 19740331999032001 Esti Utarti S.P., M.Si. NIP 197003031999032001 Mengesahkan Dekan, Prof. Drs. Kusno, DEA., Ph.D. NIP 196101081986021001 vi RINGKASAN Skrining Bakteri Pelarut Fosfat Adaptif Vinasse dari Lahan Tebu Pabrik Gula Jatiroto Kabupaten Lumajang Jawa Timur; Ahmad Bukhari Saragih, 061810401018; 2012: 38 halaman; Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember. Bakteri pelarut fosfat (BPF) adalah mikroorganisme tanah yang mampu melarutkan P terikat dalam mineral fosfat sehingga dapat diserap oleh akar tanaman. Kemampuan tersebut membuat BPF kerap digunakan sebagai pupuk hayati untuk memenuhi kebutuhan P pertanian secara alami. Aplikasi BPF sebagai pupuk hayati memerlukan media pembawa dengan kriteria non toksik bagi BPF dan tanaman, mudah disterilisasi, murah, serta tersedia dalam jumlah melimpah. Vinasse merupakan limbah hasil pengolahan etanol yang mengandung bahan organik seperti gula tereduksi dan bahan anorganik bermanfaat seperti P sehingga dapat dimanfaatkan sebagai pupuk tambahan. Hal ini memungkinkan vinasse untuk dimanfaatkan sebagai media pembawa BPF yang mampu meningkatkan kesuburan tanah sehingga penggunaan vinasse tidak hanya sebagai pupuk tambahan tetapi juga mempunyai nilai tambah sebagai pupuk organik. Pemanfaatan tersebut dapat diperoleh dengan mengadaptasikan BPF dalam media vinasse sehingga dapat bersama-sama digunakan sebagai pupuk organik yang diperkaya pupuk hayati. Berdasarkan hal tersebut, masalah yang diangkat pada penelitian ini adalah bagaimana daya adaptasi BPF terhadap vinasse dengan tujuan untuk mendapatkan isolat BPF terbaik dari lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto yang adaptif terhadap vinasse dan diharapkan mampu memberikan informasi mengenai daya adaptasi BPF dari lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto terhadap vinasse. Isolat terbaik hasil penelitian ini dapat dimanfaatkan sebagai bahan untuk penelitian lebih lanjut dalam rangka pengembangan pupuk hayati berbasis vinasse. vii Metode yang digunakan dalam penelitan ini terdiri dari (i) skrining isolat BPF dari lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto Kabupaten Lumajang Jawa Timur, kemudian (ii) pengamatan perbandingan kurva pertumbuhan isolat BPF dalam media Pikovskaya dan vinasse murni serta vinasse dengan berbagai pengenceran, yaitu 1:1, 1:2 dan 1:3 (vinasse : akuades), dan diakhiri dengan (iii) identifikasi sampai tingkat genus berdasarkan Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Dalam penelitian ini, diperoleh sembilan isolat asal lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto Kabupaten Lumajang Jawa Timur yang mampu tumbuh dalam media Pikovskaya Agar. Lima diantaranya adalah BPF karena mampu menghasilkan zona bening disekitar koloni dengan indeks berkisar antara 1.1 sampai 2.1, yaitu pvk-5a, pvk-5b, pvk-6b, pvk-7a, dan pvk-8a. Kelima isolat tersebut memiliki fase logaritmik pada pertumbuhan setelah 12 sampai dengan 16 jam ditumbuhkan dalam media Pikovskaya cair dengan nilai tertinggi pada isolat pvk-5a mencapai 1,6 x 109 CFU/ml pada inkubasi 16 jam. Kelima isolat tersebut tidak mampu tumbuh dalam media vinasse murni. Namun demikian, tiga dari lima isolat BPF tersebut merupakan isolat yang berpotensi adaptif dalam media vinasse, yaitu isolat pvk-5a, pvk-5b dan pvk-7a. Potensi ini terlihat dari kemampuan ketiga isolat tersebut untuk tumbuh sampai dengan umur 12 jam dalam media vinasse dengan pengenceran 1:2 (vinasse:akuades) dengan nilai tertinggi pada isolat pvk-5b mencapai 7,0 x 109 CFU/ml pada inkubasi 16 jam. Hasil identifikasi morfologi makroskopis dan mikroskopis serta uji biokima menunjukkan bahwa tiga isolat BPF potensial adaptif vinasse tersebut adalah isolat yang memiliki kemiripan dengan genus Chromobacterium. Diperlukan uji lebih lanjut untuk mendapatkan formulasi yang terbaik bagi vinasse untuk dapat digunakan sebagai media pembawa BPF sebagai agen pupuk hayati. Selain itu juga diperlukan uji lebih lanjut untuk mengidentifikasi BPF potensial adaptif hingga tingkat spesies berdasarkan 16s rRNA. viii PRAKATA Puji syukur kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan hidayah-Nya, serta shalawat beriring salam keharibaan baginda Rasulullah SAW, sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi yang berjudul “Skrining Bakteri Pelarut Fosfat Adaptif Vinasse dari Lahan Tebu Pabrik Gula Jatiroto Kabupaten Lumajang Jawa Timur”. Skripsi ini disusun guna memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember. Penulisan skripsi ini tidak lepas dari dukungan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan kepada: 1. Dr. Kahar Muzakhar, S.Si., selaku Dosen Pembimbing Utama dan Drs. Sutoyo, M.Si., selaku Dosen Pembimbing Anggota yang telah banyak meluangkan waktu, serta bimbingan dan arahan hingga penulis mampu menyelesaikan skripsi ini; 2. Sattya Arimurti, S.P., M.Si., dan Esti Utarti, S.P., M.Si., selaku Dosen Penguji, yang telah memberikan kritik dan saran bagi penulis sampai terselesainya skripsi ini; 3. Dra. Hari Sulistyowati M.Si., selaku Dosen Pembimbing akademik yang telah membimbing selama penulis menjadi mahasiswa 4. Ummi Linda Afrida Nasution S.Pd., serta Buya Prof. DR. Abdul Hasan Saragih M.Pd., atas curahan doa, cinta, nasehat, teguran, serta kesabarannya yang tiada henti dan tidak pernah terganti sampai akhir hayat kelak; 5. Ir. Endang Susetyaningsih dan Sutrisno selaku teknisi dan staf Laboratorium Mikrobiologi yang telah membantu dan melayani selama penelitian; 6. Adik-adik tersayang Siti Hafnisa Saragih, Muhammad Zulham Hidayah Saragih, dan Muhammad Baihaqi Saragih yang senantiasa mendukung dan memberi motivasi; ix 7. Nenek Hj. Nurnani dan Oppu Alm.Kamianna Purba atas doanya; 8. Rekan-rekan IONS, KAMMI, HMJ Biologi, IKAHIMBI, dan LBB DELTA yang memberikan pengalaman terbaik selama ini; 9. Ririn, Eko, Ratno, Lia, Friska, Audi, Anja, Anton serta seluruh rekan mahasiswa Jurusan Biologi atas segala kebersamaan, semangat dan dukungannya selama ini; 10. semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu. Penulis memohon maaf apabila terdapat kesalahan penulisan serta menerima kritik dan saran dari semua pihak demi kesempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi kita semua. Jember, 14 Februari 2013 Penulis x DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................... ii HALAMAN MOTO ....................................................................................... iii HALAMAN PERNYATAAN ........................................................................ iv HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ vi RINGKASAN ................................................................................................. vii PRAKATA .................................................................................................... ix DAFTAR ISI ................................................................................................... xi DAFTAR TABEL ......................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xv BAB 1. PENDAHULUAN ............................................................................ 1 1.1 Latar Belakang .......................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ................................................................... 2 1.3 Tujuan dan Manfaat ................................................................. 2 BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................... 3 2.1 Potensi Bakteri Pelarut Fosfat sebagai Agen Pupuk Hayati 3 2.2 Potensi Vinasse sebagai Media Pembawa Pupuk Hayati ...... 5 BAB 3. METODE PENELITIAN ................................................................ 8 3.1 Waktu dan Tempat .................................................................. 8 3.2 Rancangan Penelitian .............................................................. 8 3.3 Alat dan Bahan ......................................................................... 10 3.3.1 Alat ................................................................................... 10 3.3.2 Bahan ................................................................................ 10 3.4 Prosedur Penelitian ................................................................... 11 xi 3.4.1 Pengambilan Sampel Tanah dari Lahan Tebu Pabrik Gula Jatiroto ...................................................................... 11 3.4.2 Isolasi BPF dari Sampel Tanah ........................................ 12 3.4.3 Pembuatan Kurva Pertumbuhan ........................................ 13 3.4.4 Uji Kemampuan Tumbuh dalam Media Vinasse .............. 13 3.4.5 Identifikasi BPF ................................................................. 14 BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 19 4.1 Pengambilan Sampel Tanah dan Isolasi BPF pada Media Selektif........................................................................................ 19 4.2 Pola Pertumbuhan Isolat BPF Terpilih pada Media Pikovskaya Cair dan Vinasse .................................................. 21 4.3 Identifikasi Morfologi Makroskopis, Mikroskopis, dan Biokimia Isolat BPF Terpilih .................................................. 25 BAB 5. PENUTUP.......................................................................................... 28 5.1 Kesimpulan ............................................................................... 28 5.2 Saran ......................................................................................... 28 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 29 LAMPIRAN .................................................................................................... 33 xii DAFTAR TABEL Halaman 2.1 Komposisi kandungan bahan organik dan anorganik vinasse.................... 6 3.1 Parameter pengamatan morfologi makroskopis ......................................... 14 4.1 Rerata indeks pelarutan P dari isolat BPF pada media Pikovskaya Agar umur 72 jam .............................................................................................. 20 4.2 Karakteristik isolat BPF terpilih berdasarkan morfologi makroskopis dan mikroskopis ....................................................................................... 26 4.3 Karakteristik biokimia isolat BPF terpilih yang berpotensi adaptif dalam media vinasse ................................................................................ xiii 27 DAFTAR GAMBAR Halaman 2.1 Skema pelepasan P melalui proses khelasi ............................................... 4 2.2 Skema reaksi pelarutan P oleh enzim pelarut fosfat ................................. 4 3.1 Diagram prosedur skrining BPF dan uji adaptasinya pada media vinasse 9 3.2 Skema pengambilan sampel tanah di lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto Kabupaten Lumajang ............................................................................... 11 4.1 Zona bening yang terbentuk di sekitar koloni isolat BPF pvk-5a, pvk-5b, pvk-6b, pvk-7a, dan pvk-8a pada media Pikovskaya Agar inkubasi 72 jam pada suhu 320 C ............................................................. 19 4.2 Pola pertumbuhan isolat BPF terpilih pada media dalam waktu inkubasi 32 jam (a) media Pikovskayacair (b) media vinasse cair perbandingan 1:2 (c) media vinasse cair perbandingan 1:3 ..................... xiv 22 DAFTAR LAMPIRAN Halaman A. KOMPOSISI MEDIA .............................................................................. 33 A.1 Komposisi Media Pikovskaya ........................................................... 33 A.2 Komposisi Media Nutrien Agar ........................................................ 33 A.3 Komposisi Media O-F Hugh & Leifson’s ........................................ 33 A.4 Komposisi Media Gelatin .................................................................. 33 A.5 Komposisi Media Tripton Cair ........................................................ 33 A.6 Komposisi Media Nitrat Cair ........................................................... 34 A.7 Komposisi Media Pati Agar .............................................................. 34 A.8 Komposisi Media Glukosa Ekstrak Khamir Agar ......................... 34 B. KOMPOSISI LARUTAN PENGECATAN GRAM ............................. 35 B.1 Larutan Cat Hucker’s Crystal Violet (Gram A) ............................ 35 B.2 Larutan Mordan Lugol’s Iodine (Gram B) ..................................... 35 B.3 Larutan Pencuci (Gram C) ............................................................... 35 B4. Larutan Cat Safranin (Gram D) ...................................................... 35 C. PENGECATAN GRAM ISOLAT BPF................................................... 36 D. PEWARNAAN ENDOSPORA ISOLAT BPF ....................................... 37 E. DATA JUMLAH ISOLAT PADA MEDIA PIKOVSKAYA ............... 38 F. JUMLAH ISOLAT PADA MEDIA VINASSE 1:2 ................................ 39 G. KECOCOKAN KARAKTERISTIK ISOLAT BPF POTENSIAL ADAPTIF VINASSE ................................................................................ xv 40 BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Bakteri pelarut fosfat (BPF) merupakan salah satu mikroorganisme tanah yang mampu melarutkan ion P yang terikat dengan kation tanah berupa Al, Fe, Ca dan Mg lalu mengubahnya menjadi bentuk tersedia untuk diserap tanaman secara alami (Keneni et al., 2010). Kemampuan tersebut membuat BPF kerap digunakan sebagai agen pupuk hayati untuk meningkatkan efisiensi penggunaan pupuk P pada jenis tanah yang banyak mengandung endapan kalsium fosfat atau pada jenis tanah lainnya karena sifat ion P tersedia yang relatif cepat menjadi bentuk tidak tersedia (Hanafiah, 2012). Namun aplikasi isolat BPF sebagai pupuk hayati memiliki efektifitas dan viabilitas yang bervariasi jika dipergunakan pada kondisi lahan yang berbeda. Oleh sebab itu perlu dilakukan eksplorasi BPF untuk memperkaya agen pupuk hayati. Produksi BPF sebagai pupuk hayati selain membutuhkan isolat baru juga membutuhkan media pembawa yang mampu menjaga viabilitas agen hayati yang terkandung didalamnya agar tersimpan dalam waktu yang lama. Selain itu, media pembawa juga harus bersifat non-toksik bagi BPF dan tanaman, mudah disterilisasi, mudah berikatan dengan tanah, murah, serta tersedia dalam jumlah yang melimpah (Muraleedharam et al., 2010). Berbagai media pembawa telah teruji, diantaranya adalah tanah gambut, vermikulit hingga kompos (Ginting et al., 2010). Media pembawa yang dipkergunakan saat ini hanya terbatas pada bahan padat yang terkadang tidak dapat berdifusi langsung di daerah pemupukan. Oleh karena itu perlu dicari elternatif media pembawa berupa media cair yang lebih mudah berdifusi di daerah pemupukan serta bermanfaat bagi tanaman, diantaranya adalah vinasse. 2 Vinasse adalah limbah produksi etanol yang tersedia dalam jumlah melimpah dan teruji meningkatkan produktifitas tanaman jika digunakan sebagai pupuk tambahan (Zanuar, 2010). Kondisi tersebut membuat vinasse berpotensi sebagai media pembawa pupuk hayati karena memenuhi kriteria murah, tersedia dalam jumlah melimpah dan terbukti bersifat non-toksik bagi tanaman. Selain itu, komposisi bahan organik dan anorganik dalam vinasse seperti gula tereduksi, protein serta ketersediaan P total dapat dimungkinkan untuk memenuhi kebutuhan sumber nutrisi bagi BPF yang bersifat kemoorganotrof dan kemolitotrof (Hidalgo, 2009). 1.2 Rumusan Masalah Ketersediaan nutrisi berupa bahan organik dan anorganik dalam vinasse berpotensi untuk digunakan sebagai media pembawa agen pupuk hayati, terutama BPF. Namun demikian, tidak semua BPF mampu beradaptasi pada vinasse. Berdasarkan hal tersebut maka masalah yang diangkat pada penelitian ini adalah bagaimanakah daya adaptasi isolat BPF asal lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto terhadap vinasse? Penelitian ini terbatas pada isolat BPF yang diperoleh dari sampel tanah dari satu petak lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto yang pernah dialiri vinasse sebagai tambahan pemupukan. BPF yang diharapkan dari penelitian ini adalah BPF terpilih yang diketahui daya adaptasinya terhadap media vinasse dengan membandingkan pola pertumbuhan isolat tersebut pada Media Pikovskaya dan vinasse. 1.3 Tujuan dan Manfaat Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat BPF terbaik dari lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto yang adaptif terhadap vinasse. Penelitian ini juga diharapkan mampu memberikan pengetahuan dan informasi mengenai daya adaptasi BPF dari lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto terhadap vinasse. Selain itu, isolat terbaik hasil penelitian ini juga dapat dimanfaatkan sebagai bahan untuk penelitian lebih lanjut dalam rangka pengembangan pupuk hayati berbasis vinasse. BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Potensi Bakteri Pelarut Fosfat sebagai Agen Pupuk Hayati Bakteri pelarut fosfat (BPF) adalah kelompok mikroorganisme tanah yang mampu melarutkan P terfiksasi tanah dan mengubahnya menjadi bentuk tersedia untuk diserap tanaman (Keneni et al., 2010). Isolasi bakteri pada penelitian sebelumnya diketahui bahwa sekitar 105 CFU sampai dengan 107 CFU per gram tanah adalah bakteri yang mampu melarutkan P dan banyak dijumpai di daerah perakaran tanaman. Karakteristik BPF sebagian besar bersifat aerob khemoorganotrof, bentuk batang lurus atau lengkung dengan ukuran sel berkisar 0.50.1 μm x 1.5-5.0 μm, bersifat gram negatif dan tidak membentuk endospora. Penelitian Rodriquez et al. (2000) menunjukkan bahwa dari beberapa strain bakteri, genus Pseudomonas dan Bacillus mempunyai kemampuan yang tinggi dalam melarutkan P. Menurut Rao (1994), BPF dapat ditumbuhkan dalam media yang mengandung Ca3(PO4)2, FePO4, AlPO4, apatit, batuan P, dan komponen P-anorganik lainnya sebagai sumber P. Mekanisme BPF dalam melarutkan P tanah terjadi karena adanya sekresi asam organikberupa asam formiat, asetat, propionat, laktat, glikolat, fumarat, suksinat, oksalat, tartrat, sitrat, dan ketoglutarat serta kemampuan bakteri tersebut dalam menghasilkan enzim fosfatase dan fitase (Illmer et al., 1995). Asam-asam organic tersebut akan membentuk khelat organic dari Al, Fe, dan Ca dengan reaksinya terhadap AlPO4, FePO4, dan Ca(PO4)2 sehingga ion H2PO4-1 bebas dan larut serta tersedia untuk tanaman. Mekanisme pengikatan Al, Fe, dan Ca oleh gugus fungsi dari komponen organik adalah karena adanya satu gugus karboksil dan satu gugus fenolik, atau dua gugus karboksil yang berdekatan bereaksi dengan ion logam (Rao, 1994). Skema pelepasan P melalui proses khelasi dapat digambarkan pada Gambar 2.1. 4 CaX2.3Ca(PO4)2 + as. organik H2PO4-1 larut + kompleks Ca-khelat Al.(H2O)3(OH)2H2PO4+as. organik H2PO4-1 larut + kompleks Al-khelat Fe.(H2O)3(OH)2H2PO4+ as. Organik H2PO4 -1 larut + kompleks Fe-khelat Gambar 2.1 Skema pelepasan P melalui proses khelasi (Sumber : Rao, 1994) Peningkatan kadar asam organik juga menyebabkan turunnya pH rizosfer sehingga ion P dapat larut dan tersedia bagi tanaman. Selain fosfatase dan fitase, BPF juga menghasilkan enzim lain yang mampu menghasilkan P bebas, yaitu firofosfatase, dan metafosfatase (Mehrvars dan Chaichi., 2008). Skema pelarutan P oleh beberapa enzim pelarut P digambarkan pada Gambar 2.2. Esterofosfat + H2O ROH + fosfat fosfatase (tersedia) Firofosfat + H2O 2 ortofosfat firofosfatase (tersedia) Heksafosfatinositol + 6H2O inositol + 6 fosfat (tersedia) fitase Metafosfat ortofosfat (tersedia) metafosfatase Gambar 2.2 Skema reaksi pelarutan P oleh berbagai enzim pelarut fosfat (Mehrvars et al., 2008) Pelarutan P juga dapat dilakukan oleh mikroorganisme yang tidak menghasilkan asam organik, yaitu melalui mekanisme pelepasan proton (ion H+) pada proses respirasi, asimilasi amonium (NH4+), dan adanya kompetisi antara anion organik dengan ortofosfat pada permukaan koloid yang dapat menyebabkan terjadinya motilitas ortofosfat dalam media cair. Menurut Illmer et al. (1995), Pseudomonas sp. dan Pseudomonas aurantiogesum adalah jenis bakteri yang lebih efektif melarutkan P dalam bentuk Ca-P seperti apatit dan brushit. 5 Pemanfaatan BPF sebagai pupuk hayati dilakukan dengan cara menambahkan isolat BPF ke lahan pertanian yang umumnya dilakukan pada rizosfer tanah dengan menggunakan media pembawa. Hal ini bertujuan untuk membantu mempercepat proses penyediaan nutrisi utama bagi tanaman khususnya P tersedia tanah sehingga mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman. BPF sebagai pupuk hayati dapat diaplikasikan bersama dengan pupuk anorganik dan pupuk organik lainnya dengan tujuan untuk mempercepat penyerapan dan menjaga ketersediaan nutrisi (Simanungkalit et al., 2006). Selain itu, beberapa BPF juga dapat berperan sebagai biokontrol yang dapat meningkatkan kesehatan akar dan pertumbuhan tanaman (Arshad dan Frankenberger, 1993). Aplikasi BPF sebagai pupuk hayati saat ini diantaranya adalah Bacilus megateriumyang diketahui mampu meningkatkan serapan P tanaman kedelai sekitar 10% jika digunakan bersama dengan pupuk TSP, serta meningkatkan serapan P antara 18% sampai dengan 30% jika digunakan bersama dengan batuan fosfat (Gaur, 1980). 2.2 Potensi Vinasse sebagai Media Pembawa Pupuk Hayati Vinasse adalah limbah cair hasil destilasi etanol pada pabrik alkohol yang rata-rata diproduksi 10-15 kali lebih banyak daripada etanol itu sendiri (Cortes dan Perez, 1997). Produksi satu liter etanol akan dihasilkan sekitar 13 liter limbah vinasse (1:13) (Zanuar, 2010). Sifat fisik vinasse ditentukan oleh bahan baku produksi etanol yang digunakan. Untuk bahan baku dari tetes tebu (sugar cane juice), vinasse yang dihasilkan akanberwarna coklat muda dengankan dungan padatan 20.000 - 40.000 mg/L. Sedangkan untuk bahan baku berupa molasse, vinasse yang dihasilkan akan berwarna hitam kemerahan dengan kandungan padatan 50.000100.000 mg/L. Vinasse mempunyai turbiditas tinggi, pH rendah dan banyak mengandung bahan-bahan organik serta mineral berupa kalsium, potassium, fosfor dan nitrogen (Mariano et al, 2009). 6 Variasi kandungan bahan organik vinasse dipengaruhi oleh jenis produksi alkohol, bahan dasar yang digunakan, kondisi iklim dan tanah serta teknologi yang digunakan.Gambaran mengenai persentase komposisi bahan organik vinasse dari hasil penelitian Hidalgo (2009) dapat dilihat pada Tabel 2.1. Tabel 2.1. Komposisi kandungan bahan organik dan anorganik vinasse Rata-rata Rentang Bahan kering (%) 26,90 21,0 - 31,7 Protein kasar (%) 12,10 9,7 - 15,6 Protein Murni (%) 10,3 8,7 - 13,2 Abu (%) 6,60 5,0 - 8,5 Serat Deterjen Netral (%) 3,55 3,1 - 3,9 Serat Deterjen Asam (%) 0,05 0,02 - 0,13 Ph 4,5 4,2 - 5,1 0 Bx* 30,7 24 – 40 Berat Spesifik (%) 1,104 1,084 - 1,135 Gula Tereduksi (mg/ml) 4,43 1,4 - 6,2 Kalsium (%) 0,50 0,39 - 1,00 Fosfor (%) 0,24 0,18 - 0,31 Potassium (%) 1,60 1,28 - 2,17 Natrium (%) 0,08 0,05 - 0,22 Sulfur 1,19 0,84 - 2,13 Besi (ppm) 6,90 2,31 - 11,67 Keterangan : * Derajat Brix, adalah pengukuran yang digunakan untuk mengetahui rasio kelarutan gula menjadi air dalam suatu cairan. Nilai 30,70Bx larutan menggambarkan bahwa dalam 100 gram larutan terdapat 30,7 gr sukrosa dan 69,3 gr air. (Hidalgo, 2009) Produksi etanol di Indonesia semakin meningkat. Hal ini akan berdampak pada melimpahnya produksi vinasse. PT PASA Jatiroto Lumajang Jawa Timur mampu memproduksi etanol hingga 7.500 kiloliter pertahun, atau setara dengan 25 kiloliter per hari (Finance, 2009). Angka tersebut menunjukkan bahwa produksi vinasse sangat melimpah. Jika limbah sebanyak itu dimanfaatkan dengan baik, maka akan dapat menghindari kerusakan lingkungan disekitar pabrik penghasil vinasse. Nilai tersebut juga menunjukkan bahwa ketersediaan bahan baku bagi pengembangan pupuk organik berbasis vinasse sangat tinggi dan sangat mudah didapatkan. 7 Pengelolaan vinasse sebagai bahan tambahan pupuk sering dilakuakan karena dapat memberikan nutrisi tambahan pada tanaman. Ketersediaan bahan organik dalam vinasse yang melimpah dapat berpotensi sebagai sumber nutrisi bagi mikroorganisme sehingga memungkinakan vinasse untuk diaplikasikan menjadi media pembawa bagi agen pupuk hayati. Komponen nutrisi yang berpotensi antara lain kandungan sukrosa yang terlihat dari nilai derajat brix (0Bx) yang mencapai rentang 24 sampai dengan 40, gula reduksi dengan nilai mencapai 6,2 mg/l serta kandungan mineral yang memiliki total mencapai 10% per liter vinasse (Hidalgo, 2009). Selain itu, ketersediaan P pada vinasse bersama dengan mineral lain memungkinkan adanya ikatan antara ion P dengan ion lain membetuk P terikat yang tidak dapat diserap langsung oleh akar tanaman. Namun, kondisi tersebut memungkinkan BPF untuk membentuk reaksi khelat dengan ion-ion pengikat P sehingga ion P menjadi bebas dan dapat dimanfaatkan oleh tanaman. BAB 3. METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dimulai Maret 2011 sampai dengan Agustus 2012. Pengambilan sampel tanah sebagai bahan uji untuk mendapatkan isolat BPF dilakukan di lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto Kabupaten Lumajang Jawa Timur yang pernah teraliri vinasse. Penelitian dilanjutkan dengan skrining dan uji adaptasi BPF di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jember. 3.2 Rancangan Penelitian Penelitian dilakukan dengan metode deskriptif melalui eksplorasi BPF dari lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto dengan hasil akhir berupa isolat BPF yang diketahui adaptasinya pada media vinasse. Tahap pertama yang dilakukan adalah pengambilan sampel tanah rizosfer, yang selanjutnya digunakan dalam isolasi bakteri dengan menggunakan media Pikovskaya hingga diperoleh isolat tunggal yang terkarakterisasi makroskopis, mikroskopis dan biokimia, serta uji kemampuan tumbuh isolat pada media vinasse (Suliasih dan Rahmat, 2007). Uji kemampuan tumbuh dilakukan dengan melakukan perbandingan terhadap pola pertumbuhan pada media Pikovskaya dan media vinasse. Identifikasi BPF potensial dilakukan berdasarkan Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 2nd Edition Vol. 2, 3 dan, 4 (Brenner et al., 2009a; Brenner et al., 2009b; Brenner et al., 2009c; Vos et al., 2009; dan Krieg et al., 2010). Rancangan penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 3.1. 9 Sampling Tanah pH, Suhu Isolasi BPF Menggunakan Media Pikovskaya Agar Isolat Tunggal BPF Penghitungan Indeks Zonasi BPF pada Media Pikovskaya Agar Isolat Non-potensial Isolat BPF Potensial Pembuatan Kurva Pertumbuhan pada Media Pikovskaya Cair Uji Adaptasi pada Media Vinasse Isolat Adaptif Terbaik Identifikasi Makroskopis, Mikroskopis, dan Biokimia Menggunakan Bergey’s manual of systematic bacteriology Gambar 3.1 Diagram prosedur skrining BPF dan uji adaptasinya pada media vinasse 10 3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat Alat yang digunakan pada pengambilan sampel tanah terdiri dari sekop kecil, nampan plastik, soil tester, termometer, sprayer, korek api gas, kantong plastik tebal serta kotak stereoform berisi es batu. Sedangkan alat yang digunakan dalam penelitian di laboratorium terdiri dari tabung reaksi beserta raknya, pipet volume, sprayer, erlenmeyer, beaker glass, cawan petri, tabung reaksi, pipet mikro beserta tipnya, ependoolf, lampu bunsen, jarum ose, spatula, pinset, gelas preparat, gelas preparat cekung, kertas doorslag, karet gelang, plastik tebal transparan bening, mikroskop, laminar air flow, inkubator, inkubator bergoyang, lemari pendingin, vortex, timbangan serta buku panduan identifikasi bakteri Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 2nd Edition volume 2, 3, dan 4 (Brenner et al., 2009a; Brenner et al., 2009b; Brenner et al., 2009c; Vos et al., 2009; dan Krieg et al., 2010). 3.3.2 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanah disekitar rizosfer tanaman tebu dari lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto Kabupaten Lumajang Jawa Timur yang pernah teraliri vinasse, akuades, alkohol 70%, garam fisiologis (0.85% NaCl), spiritus, Nutrien Agar (NA), media Pikovskaya Agar dan cair, media O-F Hugh & Leifson’s (Media Oksidasi-Fermentasi), media Gelatin, media Tripton cair, media Nitrat cair, media Pati Agar, Glukosa Ekstrak Khamir Agar, Vinasse cair, larutan pelarut pigmen (eter, khloroform, alkohol dan aseton), larutan pengecatan Gram (Cristal Violet, Iodium, Alkohol Asam dan Safranin), larutan pengecatan endospora (Hijau Malakit dan Safranin), serta larutan pengecatan flagella (Safranin dan Mordan). Komposisi media dan kompisisi larutan cat mikroskopis sel disajikan berturut-turut disajikan pada Lampiran A dan B. 11 3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Pengambilan Sampel Tanah dari Lahan Tebu Pabrik Gula Jatiroto Pengambilan sampel tanah dilakukan dengan menggunakan metode acak di 5 titik dari satu petak lahan seluas 7,2 ha yang telah ditentukan di kawasan lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto yang pernah teraliri vinasse. Skema lokasi pengambilan sampel tanah ditampilkan pada Gambar 3.2. Hal ini bertujuan agar pengambilan sampel tanah dapat mewakili seluruh area sampling. Dari 5 titik tersebut diambil masing-masing sekitar 25 gr pada kedalaman 0 sampai 15 cm dari permukaan tanah dengan menggunakan skop kecil yang disterilisasi dengan alkohol 70% dan nyala api. Sampel tanah kemudian disimpan dalam kantung plastik tebal dan dimasukkan kedalam kotak stereoform berisi es untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan biokimiawi selama perjalanan menuju laboratorium (Husen, 2004). Dua puluh lima gram dari total sampel tanah dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 250 ml berisi 225 ml larutan garam fisiologis steril, kemudian dihomogenkan selama 1 jam pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm (Suliasih dan Rahmat, 2007). Sampel dipersiapkan untuk digunakan pada metode selanjutnya. Gambar 3.2 Skema pengambilan sampel tanah di lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto Kabupaten Lumajang 12 Pada tahapan pengambilan sampel tanah dilakukan pengukuran faktor abiotik tanah sebagai berikut. a. Pengukuran pH Pengukuran pH tanah dilakukan dengan menggunakan soil tester. Langkah yang dilakukan adalah dengan terlebih dahulu mensterilisasi ujung soil tester dengan alkohol 70% lalu di lap kemudian ditancapkan pada titik pengambilan sampel yang telah digali pada kedalaman 0 cm sampai 15 cm. Nilai yang ditunjukan pada soil tester kemudian dicatat dan dilakukan tiga kali pengulangan untuk mendapatkan nilai rata-rata. b. Pengukuran Suhu Pengukuran suhu tanah dilakukan dengan menggunakan termometer batang yang telah disterilkan dengan alkohol 70% kemudian ditancapkan pada titik pengambilan sampel lalu didiamkan selama 5 menit hingga penunjuk raksa stabil. Nilai yang ditunjukkan kemudian dicatat dan dilakukan tiga kali pengulangan untuk mendapatkan nilai rata-rata. Data hasil pengukuran disimpan untuk digunakan sebagai acuan perbandingan pH dan suhu media, baik media selektif maupun media vinasse untuk BPF. 3.4.2 Isolasi BPF dari Sampel Tanah Dibuat satu seri pengenceran 10-1 sampai 10-8 dari sampel tanah pada metode sebelumnya dengan cara, sebanyak 25 gr sampel tanah dimasukkan kedalam 225 ml larutan garam fisiologis steril lalu dihomogenkan selama 1 jam pada inkubator goyang dengan kecepatan 150 rpm. Hasil dari pengenceran ini diperoleh seri pengenceran 10-1. Selanjutnya 1 ml larutan dari pengenceran 10-1 dihomogenkan dengan 9 ml larutan garam fisiologis dan diperoleh pengenceran 10-2. Pengenceran dilakukan hingga seri pengenceran 10-8. Hasil pengenceran selanjutnya ditumbuhkan kedalam media Pikovskaya Agar dengan menggunakan metode sebaran terhadap 100 l dari masing-masing seri pengenceran dan diinkubasi terbalik pada suhu 30o C 13 selama 72 jam. Keberadaan BPF ditunjukkan dengan terbentuknya koloni yang dikelilingi oleh zona bening (holozone). Pemurnian dilakukan terhadap beberapa koloni yang berbeda secara makroskopis dan mikroskopis ke media Pikovskaya lain dengan metode goresan untuk mendapatkan isolat tunggal. Lima isolat tunggal BPF yang membentuk indeks zona bening paling besar dari hasil pemurnian dibuat stok pada media Pikovskaya Agar miring dan diinkubasi pada suhu 30o C selama 72 jam lalu disimpan untuk digunakan sebagai inokulum pada metode selanjutnya (Suliasih dan Rahmat, 2007). 3.4.3 Pembuatan Kurva Pertumbuhan Diambil satu ose dari stok BPF dalam media Pikovskaya Agar lalu diinokulasikan dalam 25 ml media Pikovskaya cair dan diinkubasi pada suhu ruang diatas inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm selama 32 jam. Pengenceran dilakukan setiap empat jam selama 32 jam mulai dari 10-1 hingga 10-12 secara bertingkat untuk dihitung kepadatan Collony Form Unit (CFU) per ml dengan metode Total Plate Count. Sebanyak 5 l dari masing-masing sampel pengenceran ditumbuhkan dengan metode drop plate pada media Pikovskaya lalu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 30o C selama 32 jam. Perhitungan kepadatan CFU per ml berdasarkan standar jumlah koloni antara 5 sampai dengan 50 dan dihitung dengan rumus sebagai berikut (Fardiaz et al., 1993). Total koloni per cawan (CFU ml) = 3.4.4 koloni per cawan . 1000 μl 5μl . faktor 1 pengenceran Uji Kemampuan Tumbuh dalam Media Vinasse Kemampuan tumbuh isolat dalam media vinasse diamati dengan menggunakan parameter pola pertumbuhan pada media vinasse terhadap isolat yang telah diinkubasi dalam media Pikovskaya cair pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm selama fase logaritmik dari masing-masing isolat. Uji dilakukan dengan menggunakan suspensi vinasse dan akuades dengan perbandingan 1:0 (vinasse murni), 1:1, 1:2 dan 1:3 untuk mendapatkan formulasi yang terbaik. Hasil inkubasi pada media Pikovskaya cair kemudian diinokulasikan sebanyak 1 ml 14 kedalam larutan vinasse dan diinkubasi selama 32 jam pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm dengan pengenceran mulai dari 10-1 hingga 10-12 secara bertingkat untuk dihitung kepadatan CFU per ml dengan metode Total Plate Count setiap empat jam. Sebanyak 5 l dari masing-masing sampel pengenceran ditumbuhkan dengan metode drop plate pada media Pikovskaya Agar dan diinkubasi pada suhu 30o C selama 32 jam. Perhitungan kepadatan CFU bakteri dilakukan menggunakan rumus yang sama dengan perhitungan pada kurva pertumbuhan dalam media Pikovskaya cair. 3.4.5 Identifikasi BPF Identifikasi dilakukan terhadap isolat BPF terpilih adaptif vinasse sampai tingkat genus dengan merujuk kepada buku Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 2nd Edition Vol. 2, 3 dan, 4 (Brenner et al., 2009a; Brenner et al., 2009b; Brenner et al., 2009c; Vos et al., 2009; dan Krieg et al., 2010). Kriteria yang digunakan sebagai parameter dalam identifikasi meliputi pengamatan makroskopis, mikroskopis serta uji biokimia. Pengamatan makroskopis dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat BPF terpilih adaptif vinasse pada media Pikovskaya Agar dan diinkubasi pada suhu 30o C selama 72 jam. Hasil inkubasi kemudian diamati secara langsung pada bentuk koloni, diameter koloni, permukaan koloni, elevasi, tepi dan warna koloni berdasarkan parameter berikut. Tabel 3.1. Parameter pengamatan morfologi makroskopis Variabel Bentuk koloni Permukaan koloni Elevasi Tepi koloni Struktur dalam Warna koloni Pertumbuhan Garis koloni Kriteria Sirkular, irregular, rhizoid, filamentous, curled, myceloid Mengkilat, tidak mengkilat Effuse, convex, umbonated, pulvinated, dll Entire, erose, crenate, undulate, dll Transparan, opaque, smooth, dll Berwarna (sebutkan), tidak berwarna Permukaan, tengah, didasar media Konsentris, radial, tanpa garis koloni 15 Pengamatan mikroskopis isolat BPF terpilih adaptif vinase dilakukan dengan melakukan uji pewarnaan Gram, pewarnaan endospora, pengamatan pergerakan sel, serta pewarnaan flagella berdasarkan Jutono (1987) sebagai berikut. a. Pewarnaan Gram. Pewarnan Gram bertujuan untuk mengetahui bentuk sel dan sifat dinding sel bakteri. Langkah awal yang dilakukan adalah dengan mengambil satu ose biakan BPF terpilih umur 24 jam dari media Pikovskaya lalu diletakkan di atas gelas benda yang telah ditetesi dengam akuades steril. Isolat tersebut kemudian difiksasi diatas lampu Bunsen hingga sel isolat bakteri diperkirakan menempel dengan sempurna di atas gelas benda. Isolat yang telah menempel pada gelas benda kemudian ditetesi dengan dengan larutan cat Hucker’s Crystal Violet (Gram A) sebanyak 2-3 tetes dan didiamkan selama 1 menit lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringaginkan. Selanjutnya isolat tersebut ditetesi dengan beberapa tetes larutan Mordan Lugol’s Iodine (Gram B) dan didiamkan selama 1 menit, lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Isolat selanjutnya ditetesi dengan larutan pencuci (Gram C) yang berperan sebagai peluntur, selama 30 detik, lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Tahap akhir dari pengecatan ini adalah dengan memberikan 2-3 tetes larutan cat Safranin (Gram D) sebagai cat penutup dan didiamkan selama 2 menit, lalu dicuci dengan air mengalir dan didiamkan hingga benar-benar kering. Hasil yang diperoleh dari pengecatan ini kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran kuat. Bakteri Gram positif akan terlihat berwarna ungu sedangkan bakteri Gram negatif akan berwana merah. b. Pewarnaan endospora Pewarnaan endospora bertujuan untuk mengetahui keberadaan endospora dari suatu sel bakteri. Endospora bakteri memiliki sifat resistensi yang tinggi sehingga tidak dapat diwarnai dengan pengecatan biasa. Pengecatan endospora dilakukan dengan menggunakan cat hijau malakit. Langkah awal yang dilakukan adalah dengan mengambil satu ose biakan BPF terpilih umur 24 jam dari media 16 Pikovskaya lalu diletakkan diatas gelas benda yang telah ditetesi dengan akuades steril. Isolat tersebut kemudian difiksasi diatas lampu bunsen hingga sel isolat bakteri diperkirakan menempel dengan sempurna di atas gelas benda. Selanjutnya hasil fiksasi tersebut ditetesi dengan cat hijau malakit sebanyak mungkin selama 30 detik lalu dicuci dengan air mengalir selama 30 detik dan dikeringanginkan. Hasil pengecatan ini kemudian ditetesi dengan safranin selama 30 detik lalu dicuci dengan air mengalir kemudian didiamkan hingga kering. Hasil yang diperoleh dari pengecatan ini diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran kuat. Spora yang terlepas dari sel akan tampak berwarna hijau, spora yang masih terdapat di dalam sel akan tampak transparan, sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah. c. Pengamatan pergerakan sel Pengamatan pergerakan sel dilakukan dengan menggunakan metode hanging drop. Pada metode ini, isolat BPF terpilih diinokulasikan pada akuades lalu divorteks dan diteteskan pada cekungan gelas benda khusus hangging drop lalu ditutup dengan gelas penutup. Hasil tersebut kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran sedang. Bakteri yang memiliki motilitas akan terlihat bergerak didalam preparat, baik secara soliter ataupun berkelompok. d. Pewarnaan flagella Pewarnaan flagella bertujuan untuk mengetahui keberadaan flagella dari sel bakteri yang diketahui memiliki pergerakan atau motilitas. Flagella pada dasarnya adalah filamen-filamen protein halus yang sulit diamati secara umum dan tidak dapat diwarnai dengan pengecatan biasa. Prinsip dasar agar flagella dapat diamati adalah dengan memperbesar diameternya menggunakan mordan dan cat akan terikat dengan kuat. Tahap awal yang dibutuhkan adalah dengan menginkubasi suspensi isolat BPF terpilih dalam 200-300 ml akuades steril pada suhu 37o C selama 10 jam. Setelah didinginkan, diambil 1 ose suspensi dan diletakkan pada bagian tepi permukaan gelas benda yang telah dipanasi pada baigan ujungnya kemudian gelas benda dimiringkan sehingga cairan mengalir ke 17 daerah yang telah dipanasi. Suspensi tersebut kemudian dikeringanginkan dengan cepat lalu difiksasi diatas lampu bunsen. Hasil fiksasi kemudian ditetesi dengan safranin berlebih dan didiamkan selama 3,5 menit. Kemudian buang safranin lalu ditambahkan dengan larutan mordan berlebih dan didiamkan selama 7 menit. Hasil tersebut kemudian dicuci dengan air mengalir dan didiamkan hingga benarbenar kering. Hasil yang diperoleh dari pengecatan ini kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran kuat. Flagella akan tampak berwarna lebih muda dibandingkan dengan warna sel vegetatifnya. Uji biokimia yang digunakan sebagai parameter identifikasi adalah uji katalase, pigmentasi, oksidasi fermentasi, hidrolisis gelatin, produksi indol, reduksi nitrat dan hidrolisis pati merujuk pada Jutono (1987) sebagai berikut. a. Uji Katalase Uji katalase dilakukan dengan menggunakan larutan H2O2 3%. Tahap awal yang dilakukan adalah dengan menginokulasikan isolat BPF terpilih pada media miring selama 48 jam dengan suhu 37 O C. Setelah masa inkubasi kemudian ditambahkan 200 - 300 ml larutan H2O2 pada permukaan medium. Jika terjadi reduksi H2O2 akan terlihat adanya gelembung-gelembung udara di sekeliling pertumbuhan isolat bakteri. Jika dalam uji tersebut tidak dihasilkan gelembung, maka uji dinyatakan negatif. b. Uji Pigmentasi. Penampakan pigmentasi pada isolat bakteri pada dasarnya akan teramati jika isolat tersebut tumbuh dalam kondisi aerob, yaitu pada isolat yang tumbuh dipermukaan media, sehingga dapat diamati secara makroskopis. Namun demikian, pengamatan lebih lanjut terhadap pigmentasi dapat diamati dengan cara menginokulasikan isolat bakteri berumur 1 minggu terhadap beberapa pelarut pigmen, diantaranya adalah alkohol, eter, khloroform dan, aseton. Keberadaan pigmen dari isolat tersebut dapat terlihat dari warna, sifat difusi dalam media serta daya kelarutan pigmen pada berbagai macam zat pelarut tersebut. 18 c. Uji Oksidasi Fermentasi Uji oksidasi fermentasi dilakukan dengan menginokulasikan isolat BPF dalam media oksidasi fermentasi selama 48 jam dan diamati adanya perubahan warna menjadi kebiruan. d. Hidrolisis Gelatin Uji hidrolisis gelatin dilakukan dengan menginokulasikan isolat BPF pada media gelatin dan diinkubasi 48 jam lalu disimpan dalam lemari pendingin minimal delapan jam. Jika media tidak memadat setelah disimpan dalam lemari pendingin maka isolat tersebut mampu merombak gelatin. e. Produksi Indol Isolat BPF diinokulasikan pada media Tripton cair dan diinkubasi pada selama 48 jam. Hasil inkubasi kemudian ditetesi dengan ether lalu dihomogenkan dengan sentrifuse lalu secara perlahan ditetesi dengan reagen Ehrlich. Reaksi positif terjadi jika terbentuk lapisan warna merah ungu dibawah lapisan eter. f. Reduksi Nitrat Isolat BPF diinokulasikan pada media nutrien cair dan ditambahkan dengan KNO3 0,1% lalu diinkubasi selama 48 jam. Hasil inkubasi kemudian ditetesi dengan larutan asam sulfanilik dan reagen 1-napthylamine masing masing sebanyak 1ml. Terbentuknya warna merah muda menandai adanya reaksi positif pembentukan nitrit dari nitrat yang tersedia pada media. g. Hidrolisis Pati Hidrolisis pati dilakukan dengan menginokulasikan isolat BPF pada media pati agar dalam petridis lalu diinkubasi selama 48 jam. Hasil inkubasi kemudian ditetesi dengan larutan iodin untuk memperlihatkan terbentuknya zona bening disekitar koloni. BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Skrining BPF Secara Semikuantitatif Sebanyak sembilan isolat bakteri diisolasi dari tanah lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto yang dialiri vinasse dengan suhu 27o C hingga 28o C dengan pH tanah berkisar antara 4 sampai dengan 6 pada kondisi tidak hujan di pagi hari dalam masa tanam. Dari sembilan isolat bakteri hanya terdapat lima isolat yang memiliki aktifitas pelarutan fosfat yang ditandai dengan kemampuan tumbuh pada media Pikovskaya Agar dan menghasilkan zona bening disekitar koloni, yaitu pvk-5a, pvk-5b, pvk-6b, pvk-7a, dan pvk-8a (Gambar 4.1). Terbentuknya zona bening disekitar koloni menunjukkan bahwa isolat tersebut mampu menghasilkan asam organik ekstraseluler yang mampu berikatan dengan ion Ca- yang terikat dalam bentuk Ca3(PO4)2 pada media Pikovskaya agar dan membebaskan ion H2PO4 sehingga membentuk area yang berwarna lebih jernih daripada area yang masih memiliki P terikat. Menurut Widawati et al. (2006), asam organik tersebut dapat berupa asam sitrat, glutamat, suksinat, laktat, oksalat, glikooksalat, malat, fumarat, tartarat ataupun asam alpha-ketobutirat. Menurut Chen et al. (2005), isolat yang mampu membentuk zona ini adalah BPF. 5a 6b 8a 7a 5b Gambar 4.1 Zona bening yang terbentuk di sekitar koloni isolat BPF pvk-5a, pvk-5b, pvk-6b, pvk-7a dan pvk-8a pada media Pikovskaya Agar inkubasi 72 jam pada suhu 320 C 20 Pengamatan terhadap terbentuknya zona bening disekitar koloni isolat BPF menunjukkan adanya indeks yang bervariasi (Tabel 4.1). Isolat pvk-5a adalah isolat dengan indeks pelarutan terbesar, sedangkan isolat pvk-6b memiliki indeks pelarutan terkecil. Variasi indeks tersebut dapat disebabkan karena perbedaan kemampuan isolat BPF dalam mensekresikan asam organik ekstraselulernya sehingga zona bening yang terbentuk berbeda. Selain itu, ukuran koloni tidak berpengaruh terhadap terbentuknya zona bening disekitar koloni tersebut. Hal ini ditunjukkan dari penelitian bahwa ukuran diameter suatu koloni yang besar tidak selalu menghasilkan zona bening yang besar pula. Uji pelarutan P melalui pengamatan zona bening disekitar koloni dalam media Pikovskaya agar tersebut bersifat semi kuantitatif karena hasil indeks zona bening yang diperoleh belum dapat menunjukkan kadar P terlarut yang berhasil diikat oleh BPF secara akurat. Tabel 4.1 Rerata indeks pelarutan P dari isolat BPF pada media Pikovskaya agar umur 72 jam. Nama Isolat pvk-5a pvk-5b pvk-6b pvk-7a pvk-8a Rerata Diameter Koloni (mm) 3,75 3,78 2,08 3 2,74 Rerata Indeks Zona Pelarutan P (mm) 2,01 1,52 1,01 1,65 1,58 Berdasarkan penelitian Rodriguez dan Fraga (1999), bakteri yang mampu melarutkan fosfat diantaranya terdiri dari genus Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium, Microccocus, Aereobacter, Flavobacterium dan Erwinia. Escherichia, Serratia, dan Chromobacterium. Bakteri genus tersebut sudah umum digunakan sebagai agen pupuk hayati untuk membebaskan P terikat yang terdapat dalam tanah. 21 4.2 Pola Pertumbuhan Isolat BPF Terpilih pada Media Pikovskaya Cair dan Vinasse Cair Kemampuan adaptasi BPF pada penelitian ini terlebih dahulu diamati berdasarkan pola pertumbuhan masing-masing isolat pada media Pikovskaya, kemudian diuji pada media vinasse. Uji pertumbuhan pada media Pikovskaya bertujuan untuk mengamati isolat yang memiliki daya adaptasi terbaik pada media Pikovskaya. Fase logaritmik yang teramati dari setiap isolat selanjutnya akan digunakan sebagai patokan waktu awal untuk inkubasi pada media vinasse. Hasil pengamatan pada media vinasse memperlihatkan bahwa semua isolat BPF tidak tumbuh pada media vinasse murni. Hal ini dapat disebabkan beberapa hal, diantaranya adalah oBx, pH, kandungan bahan organik sebagai sumber nutrisi serta nilai osmolaritas dan viskositas pada vinasse. Berdasarkan penelitian Hidalgo (2009), nilai derajat brix (oBx) pada vinasse yang memiliki nilai rentang antara 24 sampai 40 adalah nilai yang cukup tinggi. Kondisi ini disebabkan adanya padatan berupa sukrosa yang tidak sepenuhnya larut dalam vinasse. Selain itu, kondisi bahan kering dengan nilai 21% sampai dengan 31,7% dan serat dengan nilai mencapai 15,1% yang tersisa dalam vinasse akan berpengaruh terhadap osmolaritas dan viskositas vinasse. Oleh sebab itu diperlukan adanya pengenceran untuk mengurangi nilai derajat brix, osmolaritas dan viskositas pada vinasse sehingga dapat dimanfaatkan baik sebagai bahan tambahan pemupukan maupun sumber nutrisi bagi organisme hidup lainnya. Berdasarkan hal tersebut, penelitian dilanjutkan dengan uji isolat BPF pada media vinasse dengan pengenceran 1:1, 1:2 dan, 1:3 (vinasse : akuades). Pengenceran ini dilakukan untuk mengurangi nilai oBx, osmolaritas dan viskositas vinasse yang diindikasikan sebagai faktor pembatas adaptasi BPF dalam media tersebut. Hasil pengamatan dari kurva pertumbuhan yang terbentuk oleh isolat BPF pada media Pikovskaya dan vinasse ditampilkan dalam bentuk grafik pada Gambar 4.2. 14 12 10 8 6 4 2 0 pvk-5a pvk-5b pvk-6b pvk-7a 0 4 8 12 16 20 24 28 32 pvk-8a Waktu Inkubasi (Jam) (a) 12 10 8 pvk-5a 6 pvk-5b 4 pvk-6b 2 pvk-7a 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Waktu inkubasi (jam) (b) pvk-8a Log jumlah sel (CFU/ml) Log jumlah sel (CFU/ml) Log Jumlah Sel (CFU/ml) 22 8 6 pvk-5a 4 pvk-5b 2 pvk-6b 0 pvk-7a 0 4 8 12 16 20 24 28 32 pvk-8a Waktu inkubasi (jam) (c) Gambar 4.2 Pola pertumbuhan isolat BPF terpilih pada media dalam waktu inkubasi 32 jam (a) media Pikovskaya cair (b) media vinasse cair perbandingan 1:2 (c) media vinasse cair perbandingan 1:3 Grafik pertumbuhan isolat BPF terpilih pada media Pikovskaya menunjukkan rata-rata fase logaritmik pada media pikovskaya terdapat pada umur biakan 12 sampai dengan 16 jam, tetapi dengan jumlah sel yang berbeda (Gambar 4.2). Pada akhir pengamatan sebagian isolat mengalami penurunan populasi sel sedangkan yang lainnya menunjukkan kecenderungan meningkat. Hal ini menunjukkan bahwa beberapa isolat masih memungkinkan untuk mengalami fase pertumbuhan lebih lanjut dalam waktu yang lebih lama dari waktu inkubasi 32 jam dan belum memasuki fase kematian. Kurva pertumbuhan isolat BPF sampai dengan inkubasi 32 jam pada penelitian ini menunjukkan dua tipe pola pertumbuhan yang berbeda, yaitu pertumbuhan diauxic dan normal. Pertumbuhan diauxic terjadi pada isolat pvk-5a, pvk-5b, dan pvk-8a. Pertumbuhan diauxic adalah pertumbuhan isolat yang mengalami dua fase logaritmik dengan kecepatan pertumbuhan yang berbeda. 23 Menurut Baker et al. (2011), pertumbuhan diauxic disebabkan karena pemanfaatan ketersediaan nutrisi sebagai sumber karbon yang berbeda dalam media sehingga mengakibatkan berubahnya kecepatan pertumbuhan isolat tersebut. Pertumbuhan diauxic pada penelitian ini terjadi karena isolat BPF menggunakan sumber karbon berupa glukosa dan serat yang terdapat dalam vinasse. Kecepatan pertumbuhan pertama terjadi karena BPF memanfaatkan glukosa sebagai sumber karbon yang lebih sederhana sehingga BPF segera memasuki fase logaritmiknya. Setelah glukosa habis selanjutnya BPF kembali memasuki fase adaptasi untuk memecah serat yang terdapat dalam vinasse menjadi karbon sederhana dan selanjutnya akan memasuki fase logaritmik kedua. Isolat yang memiliki jumlah populasi tertinggi adalah isolat pvk-5a pada umur inkubasi 16 jam pada akhir fase logaritmiknya yang pertama dengan jumlah 1,6 x 109 CFU/ml. Berdasarkan aspek kemampuan adaptasi dalam arti bertahan hidup dalam jumlah populasi seperti awal masa pertumbuhan dalam jangka waktu yang lama, maka isolat pvk-5b adalah isolat yang tumbuh relatif paling baik pada media Pikovskaya. Selanjutnya secara berturut-turut diikuti oleh isolat pvk-5a, dan ketiga isolat lainnya yaitu pvk-6b, pvk-7a, dan pvk-8a. Inokulasi isolat terpilih pada vinasse 1:1 ternyata tetap tidak menghasilkan pertumbuhan yang dapat ditampilkan dalam bentuk kurva pertumbuhan karena BPF tidak tumbuh. Hal ini menunjukkan bahwa vinasse murni dan vinasse denganpengenceran 1:1 tidak sesuai untuk pertumbuhan kelima isolat BPF. Diduga bahwa isolat BPF yang diinokulasikan kedalam media vinasse tidak mampu memanfaatkan sumber nutrisi yang terdapat pada media vinasse dengan kondisi dengan kepekatan tersebut sehingga menyebabkan kematian pada BPF sebelum mampu merombak nutrisi yang terdapat dalam media vinasse. Pola pertumbuhan isolat BPF dalam media vinasse dengan pengenceran 1:2 mengalami fluktuasi. Isolat pvk-5a, pvk-6b dan pvk-8a cendurung mengalami penurunan sampai jumlah populasi nol selama waktu inkubasi delapan jam pertama. Namun isolat pvk-5a terdeteksi tumbuh kembali setelah waktu inkubasi 20 jam hingga mencapai jumlah populasi awal kemudian menuju fase kematian mulai umur 24 inkubasi jam ke 28 hingga jam ke 32. Isolat pvk-5b dan pvk-7a memiliki kurva yang berbeda dengan ketiga isolat BPF lainnya yaitu mengalami percepatan pertumbuhan setelah waktu inkubasi empat jam hingga mencapai fase eksponensial. Kedua isolat tersebut mengalami pertumbuhan diauxic. Laju pertumbuhan yang sangat cepat pada isolat pvk-5b pada akhirnya akan mengakibatkan laju kematian yang cenderung lebih cepat. Hal disebabkan karena sumber nutrisi yang dimanfaatkan lebih cepat habis. Sedangkan isolat pvk-7a mengalami pertumbuhan diauxic yang perlahan sehingga fase kematian terjadi lebih lambat daripada isolat pvk-5b. Hal ini menunjukkan bahwa pvk-7a memerlukan waktu yang lebih lama untuk mengolah sumber nutrisi yang terdapat dalam media vinasse, namun tetap dapat beradaptasi dengan cukup baik sehingga tidak mudah mengalami fase kematian karena kekurangan sumber nutrisi. Pola pertumbuhan yang terbentuk pada media vinasse dengan pengenceran 1:2 memperlihatkan bahwa isolat pvk-6b dan, pvk-8a tidak adaptif. Namun, isolat pvk5a, pvk-5b dan pvk-7a adalah isolat yang berpotensi adaptif terhadap vinasse. Inokulasi BPF pada media vinasse 1:3 juga memperlihatkan adanya pertumbuhan, namun membentuk kurva yang berbeda dengan vinasse pada pengenceran sebelumnya. Pola pertumbuhan isolat BPF pada media vinasse pengenceran 1:3 menunjukkan kemampuan adaptasi yang tidak lebih baik dari uji sebelumnya. Hal ini terlihat dari hanya tiga isolat dari lima isolat yang diinokulasikan yang mampu tumbuh sampai umur empat jam dengan jumlah sel tertinggi 1,9x102 CFU/ml pada isolat pvk-5a. Namun, ketiga isolat tersebut pada akhirnya mengalami fase kematian pada waktu inkubasi delapan jam dan mencapai jumlah sel terendah. Kurva pertumbuhan pada media pikovskaya dan media vinasse merupakan representasi dari kemampuan adaptasi BPF terhadap media tersebut. Hasil inokulasi BPF pada media vinasse menunjukkan bahwa pertumbuhan BPF kurang baik dalam media vinasse pada empat macam pengencerani, yaitu vinasse murni, pengenceran 1:1 dan, 1:3. Ketidakmampuan tumbuh BPF terhadap media vinasse dengan pengenceran tersebut mengindikasikan bahwa BPF tidak adaptif. Berbeda dengan 25 pengenceran 1:2, terdapat tiga isolat yang berpotensi adaptif pada vinasse 1:2 yaitu pvk-5a, pvk-5b, dan pvk-7a yang terlihat dari adanya pertumbuhan pada formulasi tersebut sampai dengan periode waktu yang lebih lama (antara 20 sampai dengan 28 jam) dibandingkan dengan isolat lainnya, akan tetapi masih lebih pendek daripada inkubasi dalam media Pikovskaya (lebih dari 32 jam). Dengan demikian, formulasi vinasse 1:2 adalah formulasi yang cukup baik bagi pertumbuhan BPF pada penelitian ini yang selanjutnya diperlukan uji lebih lanjut untuk mengetahui faktor-faktor apa saja yang menyebabkan BPF kurang adaptif. Oleh karena daya toleransi dari kelima isolat BPF dalam penelitian ini tidak diketahui memiliki karakteristik seperti pada genus bakteri tertentu, maka perlu dilakukan identifikasi lebih lanjut terutama untuk isolat yang berpotensi adaptif pada media dengan pengenceran 1:2 (vinasse : akuades), walaupun kurva yang terbentuk tidak sebaik yang terbentuk pada media Pikovskaya. 4.4 Identifikasi Morfologi Makroskopis, Mikroskopis, dan Biokimia Isolat BPF Terpilih Identifikasi isolat BPF pada penelitian ini dilakukan berdasarkan morfologi makroskopis, mikroskopis dan uji biokimia merujuk pada Bergey’s (Brenner et al., 2009a; Brenner et al., 2009b; Brenner et al., 2009c; Vos et al., 2009; dan Krieg et al., 2010) dan Jutono (1987). Hasil identifikasi morfologi makroskopis dan mikroskopis menunjukkan bahwa lima isolat BPF memiliki perbedaan bentuk makroskopis dan mikroskopis sehingga dapat digolongkan sebagai isolat berbeda. Selanjutnya identifikasi biokimia dilakukan terhadap isolat BPF terpilih yang berpotensi adaptif pada media vinasse 1:2. Karakteristik morfologi makroskopis dan mikroskopis kelima isolat BPF ditampilkan dalam Tabel 4.2. 26 Tabel 4.2 Karakteristik isolat BPF terpilih berdasarkan morfologi makroskopis dan mikroskopis No 2 Karakteristik isolat bakteri Bentuk Koloni Biakan cawan Biakan miring Biakan tegak Permukaan 3 4 5 6 Elevasi Tepi Koloni Bagian Dalam Warna Koloni 1 pvk-5a pvk-5b irregular echinulated beaded tidak mengkilap Curled Echinulated Beaded tidak mengkilap RCBE Crenate Opaque putih susu Isolat pvk-6b Irregular Echinulated echinulated tidak mengkilap RCBE RCBE undulate crenate opaque opaque putih putih kekuningan kekuningan 7 Pertumbuhan permukaan Permukaan permukaan 8 Garis Koloni konsentris Konsentris konsentris 9 Bentuk Sel Kokus Kokus kokus 10 Sifat Gram Negatif Negatif negatif 11 Endospora 12 Motilitas 13 Flagella Keterangan : RCBE = Raised with Concave Beveled Edge (+) : ada (-) : tidak ada pvk-7a pvk-8a irregular echinulated beaded tidak mengkilap umbonated undulate opaque putih susu Curled echinulated beaded tidak mengkilap permukaan konsentris kokus negatif - umbonated undulate opaque putih kekuningan permukaan konsentris kokus negatif - Data hasil pengamatan morfologi makroskopis memperlihatkan bahwa koloni BPF yang berhasil diisolasi memiliki perbedaan pada bentuk koloni pada semua bentuk media baik cawan, miring maupun tegak. Selain itu juga terdapat beberapa perbedaan pada elevasi dan tepi koloni, namum memiliki kesamaan pada warna koloni yang kekuningan dengan bagian dalam opaque dan tumbuh dipermukaan media dengan garis konsentris. Berbeda halnya dengan pengamatan mikroskopis yang secara umum memperlihatkan ciri yang sama pada bentuk sel kokus, sifat gram negatif, tanpa endospora, serta non-motil tanpa flagella. Kesamaan beberapa ciri morfologi makrsoskopis dan mikroskopis tersebut mengindikasikan bahwa kelima isolat BPF tersebut terdapat dalam golongan genus yang sama, oleh sebab itu perlu dilakukan pendekatan uji biokimia sebagai identifikasi mendekati genus. Identifikasi mendekati genus terbatas pada isolat BPF yang berpotensi adaptif pada media vinasse dengan pengenceran 1 : 2, yaitu pvk-5a, pvk-5b dan pvk-7a sebagai isolat BPF 27 terpilih potensial adaptif vinasse. Karakteristik biokimia ketiga isolat BPF terpilih ditampilkan dalam Tabel 4.3 berikut. Tabel 4.3 Karakteristik biokimia isolat BPF terpilih yang berpotensi adaptif dalam media vinasse No Karakteristik biokimia Isolat isolat bakteri pvk-5a pvk-5b 1 Katalase + + 2 Pigmentasi 3 Oks/ fer 4 Nitrat 5 Indol 6 Reduksi gelatin 7 Hidrolisis pati Keterangan : (+) : positif / ada reaksi (-) : negatif / tidak ada reaksi pvk-7a + - Hasil pengamatan makroskopis, mikroskopis dan uji biokimia merujuk pada Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 2nd Edition Vol. 2, 3 dan, 4 (Brenner et al., 2009a, Brenner et al., 2009b, Brenner et al., 2009c, Vos et al., 2009 dan, Krieg et al., 2010) memperlihatkan bahwa isolat pvk-5a, pvk-5b dan, pvk-7a yang merupakan isolat BPF potensial adaptif terbaik yang memiliki kemiripan dengan genus Chromobacterium dengan ciri bentuk sel kokus, gram negatif, non-motil, tanpa endospora, indol negatif dan memiliki kemampuan katalase positif, kecuali untuk kemampuan reduksi nitrat. Kesamaan isolat BPF terpilih dengan beberapa BPF pada penelitian sebelumnya berdasarkan Bergey’s (Brenner et al., 2009a; Brenner et al., 2009b; Brenner et al., 2009c; Vos et al., 2009; dan Krieg et al., 2010) ditampilkan dalam tabel pada Lampiran F. BAB 5. PENUTUP 5.1 Kesimpulan Sebanyak lima isolat BPF berhasil diisolasi dari lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto kabupaten Lumajang Jawa Timur dengan kode isolatpvk-5a, pvk-5b, pvk-6b, pvk-7a dan pvk-8a. Kelima isolat BPF tersebut memiliki indeks kelarutan P berkisar antara 1,1 sampai dengan 2,1 dalam media pikovskaya agar namun tidak mampu tumbuh pada media vinasse murni. Tiga dari lima isolat BPF mampu berpotensi adaptif dalam media vinasse dengan pengenceran 1:2 (vinasse : akuades), yaitu isolat pvk-5a, pvk-5b dan pvk-7a. Hasil identifikasi morfologi makroskopis, mikroskopis dan biokimia diketahui tiga isolat BPF terpilih yang berpotensi adaptif tersebut memiliki kemiripan dengan kelompok genus Chromobacterium. 5.2 Saran Hasil penelitian menunjukkan bahwa vinasse berpotensi untuk digunakan sebagai media pembawa agen pupuk hayati berupa BPF jika dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan formulasi yang terbaik. Selain itu, untuk melengkapi karakteristik kelima isolat BPF yang berhasil diisolasi dari lahan tebu Pabrik Gula Jatiroto, Kabupaten Lumajang, Jawa Timur maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan analisis 16s rRNA atau analisis lain untuk dapat mengetahui identifikasi isolat BPF tersebut sampai tingkat spesies. DAFTAR PUSTAKA Buku Arshad, M. & Frankenberger, W.T. 1993. “Microbial Production of Plant Growth Regulators.” Dalam Mettind, F.B (Ed.). Soil Microbial Ecology. New York: Marcel Dekker, Inc. Baker, S., Griffths, C., Nicklin, J. 2004. Microbiology. Fourth Edition. Nwe York: Garland Science. Taylor & Francis Group. Brenner, D.J., Krieg, N. R., & Staley, J. T. 2009a. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Second Edition. Volume Two The Proteobacteria Part A. Introductory Essays. New York: Springer Science+Business Media. Brenner, D.J., Krieg, N. R., & Staley, J. T. 2009b. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Second Edition. Volume Two The Proteobacteria Part B. The Gammaproteobacteria. New York: Springer Science+Business Media. Brenner, D.J., Krieg, N. R., & Staley, J. T. 2009c. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Second Edition. Volume Two. The Proteobacteria Part C. The Alpha-, Beta-, Delta-, and Epsilonproteobacteria. New York: Springer Science+Business Media. Fardiaz. S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta: Raja Grafindo Persada. Ginting, R. C. B., Saraswati R., dan Husein E. 2006. “Mikroorganisme Pelarut Fosfat”. Dalam Simanungkalit, Suriadikarta, Saraswati, Setyorini, dan Hartatik (Ed.). Pupuk Organik dan Pupuk Hayati. Bogor: Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Sumberdaya Lahan Pertanian. Hanafiah, K. A. 2012. Dasar-Dasar Ilmu Tanah. Jakarta: PT Raja Grafindo Persada. Jutono. 1987. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Krieg, N. R., Staley, J. T., Brown, D. R., Hedlund, B. P., Paster, B. J., Ludwig, W., Ward, N. L, & Whitman, W. B. 2010. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Second Edition. Volume Four. The Bacteroidetes, Spirochaetes, Tenericutes(mollicutes), Acidobacteria, Fibrobacteres, Fusobacteria, Dictyoglomi, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, 30 Verrucomicrobia, Chlamydiae, and Planctomycetes. New York: Springer Science+Business Media. Muraleedharam, H., Seshadri, S., & Perumal, K. 2010. Biofertilizer Phosphobacteria. Chennai: Shri AMM Murugappa Chettiar Research Center. Rao, N. S. 1994. Biofertilizeres inAgriculture and Forestry. 3rd Edition. New Delhi: Oxford and IBH Publishing Co. Pvt. LTD.,PP: 129-135. Simanungkalit, R. D. M., Husein E., dan Saraswati. 2006. “Baku Mutu Pupuk Hayato dan Sistem Pengawasannya”. Dalam Simanungkalit, Suriadikarta, Saraswati, Setyorini, dan Hartatik (Ed.). Pupuk Organik dan Pupuk Hayati. Bogor: Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Sumberdaya Lahan Pertanian. Vos, P. V., Garrity, G. M., Jones, D., Krieg, N. R., Ludwig, W., Rainey, F. A., Schleifer, K. H., & Withman, W. B. 2009. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Second Edition. Volume Three. The Firmicutes. New York: Springer Science+Business Media. Tidak diterbitkan Gaur, A. C. 1981. Phospho-microorganism and varians transformation InCompost Technology. Project Field Document FAO (13):106-111. Husen, E. 2004. Prosedur Pengambilan Contoh Tanah untuk Analisis Mikroba Leaflet Balai Penelitian Tanah. Bandung: Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanah dan Agroklimat Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian Departemen Pertanian. Terbitan Berkala Chen. Y.P., Rekha. P.B., Arun. A.B., Shen. F.T., Lai. W.A., & Young. C.C. 2005. Phosphate solubilizing bacteria from subtropical soil andtheir tricalcium phosphate solubilizing abilities. Applied Soil Ecology 34(2006):33-41 Cortez & Perez. 1997. Experiences on Vinasse Disposal Part III: Combustion of Vinasse -# 6 Fuel Oil Emultion. International Journal1 4(1):1. 31 Gaur, A. C., & Kundu, B. S. 1980. Establisment of Nitrogen Fixing and Phosphate Solubilizing Bacteria in Rhizosphere and their effect on yield and nutrient uptake of wheat crop. Plant Soil 57 (21) : 223 -230. Illmer, P. & Schinner, F. 1995. Solubilization of inorganic calciumphosphate solubilization mechanisms. Soil Biol. Biochem., 27: 257-63. Keneni, A., Assefa, F., and Prabu, P. C., 2010. Isolation of Phosphate Solubilizing Bacteria from the Rhizosphere of Faba Bean of Ethiopia and Their Abilities on Solubilizing Insoluble Phosphates. J. Agr. Sci. Tech., 12: 7989. Mariano, Cliveralo, Angelis & Bonotto. 2009. The Use of Vinasse as an Amandment To ex-situ Bioremediation of Soil and Groundwater Contaminated with Diesel Oil. An International Journal. 4(52): 1-5. Mehrvars, S. & Chaichi, M. R. 2008. Efect of Phosphate Solubilizing Microorganisms and Phosphorus Chemical Fertilizer on Forage and Grain Quality of Barely (Hordeum vulgare L.). American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci., 3 (6) : 855-856. Rodríguez, H., & Fraga, R. 1999. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion. Biotechnol Adv 17: 319-339. Suliasih dan Rahmat. 2007. Aktivitas Fosfatase dan Pelarutan Kalsium Fosfat oleh beberapa Bakteri Pelarut Fosfat. Biodiversitas, 8 (1): 23-26 Widawati, S., dan Suliasih. 2006. Populasi Bakteri Pelarut Fosfat (BPF) di Cikaniki, Gunung Botol, dan Ciptarasa, serta Kemampuannya Melarutkan P Terikat di Media Pikovskaya Padat. Biodiversitas. 7 (2): 10-14 Media Elektronik Finance. 2009. Info Market untuk Bioethanol 95%. http://finance.groups.yahoo .com/group/apbi/messages439. [8 Desember 2010]. Hidalgo, K. 2009. Vinasse in Feed: Good for Animal and Environment. Cuba: Institut of Animal Science, San Jose De Las Lajas. http:allaboutfeed.net.20090707-8_fet_vinasse.pdf. [30 Agustus 2010]. Patentstorm. 2010. Composition For Qualitative Screening Of Phosphate Solubilizing Microorganisms And A Qualitative Method For Screening Microorganisms. http://www.patentstorm.us/patents/6638730/fulltext. html. [5 November 2010]. 32 Zanuar. 2010. Pengolahan Limbah Gula sebagai Pupuk Organik http://forum.upi.edu/v3/index.php?topic=15122.0 [8 Desember 2010]. LAMPIRAN A. KOMPOSISI MEDIA A.1 Komposisi Media Pikovskaya Komposisi Glukosa Ca3 (PO4)2 (NH4)2 SO4 NaCl MgSO4.7H.sub.2 O KCl yeast extract, 0.5 MnSO4.H.sub.2 O FeSO4.7H.sub.2 O (Paternstorm 2010) Jumlah (gr/l) 10 5 0,5 0,2 0,1 0,2 0,5 0,02 0,02 A. 2 Komposisi Media Nutrien Agar (NA) Komposisi Ekstrak Daging Pepton NaCl Agar Jumlah (gr/l) 10 10 5 15 A. 3 Komposisi Media O-F Hugh & Leifson’s Komposisi BPW Agar BTB Jumlah (gr/50 ml) 50 ml Agar 0,75 BTB 0,25 ml A. 4 Komposisi Media Gelatin Komposisi Ekstrak Daging Pepton Gelatin Jumlah (gr/l) 3 5 12 s.d 15 % A.5 Komposisi Media Tripton Cair Komposisi Tripton Ekstrak Daging Jumlah (gr/l) 10 3 34 A.6 Komposisi Media Nitrat Cair Komposisi Ekstrak Daging Pepton KNO3 Jumlah (gr/l) 3 5 1 A.7 Komposisi Media Pati Agar Komposisi Ekstrak Daging Pati Terlarut (Soluble Starch) Agar Jumlah (gr/l) 1 2 1,5 s.d 2 % A.8 Komposisi Media Glukosa Ekstrak Khamir Agar Komposisi Ekstrak Khamir Pepton Glukosa Agar Jumlah (gr/l) 5 5 10 20 35 B. KOMPOSISI LARUTAN PENGECATAN GRAM B.1 Larutan Cat Hucker’s Crystal Violet (Gram A) Bahan Kristal Violet Etil Alkohol 95 Ammonium Oksalat Akuades Jumlah 2 gr 20 ml 0,8 gr 80 ml B2. Larutan Mordan Lugol’s Iodine (Gram B) Bahan Yodium Kalium Yodida Akuades Jumlah 1 gr 2 gr 300 ml B.3 Larutan Pencuci (Gram C) Bahan Aseton Etil Alkohol 95 % Jumlah 50 ml 50 ml B4. Larutan Cat Safranin (Gram D) Bahan Safranin Etil Alkohol 95 % Akuades Jumlah 0,25 gr 10 ml 90 ml 36 C. PENGECATAN GRAM ISOLAT BPF a c b d e Keterangan. Pewarnaan gram isolat BF perbesaran 100 kali (a) pvk-5a; (b) pvk5b; (c) pvk-6b; (d) pvk-7a; (e)pvk-8a 37 D. PEWARNAAN ENDOSPORA ISOLAT BPF a b d c e Keterangan. Pewarnaan endospora isolat BF perbesaran 100 kali (a) pvk-5a; (b) pvk-5b; (c) pvk-6b; (d) pvk-7a; (e)pvk-8a E. DATA JUMLAH ISOLAT PADA MEDIA PIKOVSKAYA Waktu Inkubasi (Jam) 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Isolat pvk-5a Jumlah sel Log (CFU/ml) jumlah sel 6 1,2 x10 6,09 5,8 x106 6,76 4,2 x107 7,62 8,4 x1011 11,92 1,6 x1013 13,30 1,4 x109 9,15 9 1,0 x10 9,02 1,4 x1010 10,14 1,6 x109 9,19 Isolat pvk-5b Jumlah sel Log (CFU/ml) jumlah sel 7 6,2 x10 7,79 9,2 x106 6,96 2,8 x108 8,45 9,4 x108 8,97 5,8 x109 9,76 1,6 x109 9,21 9 1,8 x10 9,26 3,4 x109 9,53 4,6 x109 9,66 Isolat pvk-6b Jumlah sel Log (CFU/ml) Jumlah sel 7 1,4 x10 7,15 4,6 x106 6,66 5,8 x108 8,76 3,2 x108 8,50 4,0 x108 8,60 5,6 x108 8,75 8 6,6 x10 8,82 1,5 x108 8,16 4,4 x106 6,64 Isolat pvk-7a Jumlah sel Log (CFU/ml) jumlah sel 7 1,2 x10 7,10 1,0 x107 7,00 4,4 x107 7,64 1,6 x108 8,32 2,6 x108 8,41 2,4 x108 8,38 8 3,2 x10 8,51 1,3 x108 8,12 3,6 x106 6,56 Isolat pvk-8a Jumlah sel Log (CFU/ml) jumlah sel 5 8,4 x10 5,92 6,0 x107 7,00 6,4 x107 7,81 3,2 x108 8,50 1,5 x108 8,18 9,8 x106 6,23 5 6,6 x10 5,82 6,2 x107 7,79 5,4 x106 6,81 38 F. DATA JUMLAH ISOLAT PADA MEDIA VINASSE 1:2 Waktu Inkubasi (Jam) 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Isolat pvk-5a Jumlah sel Log (CFU/ml) jumlah sel 7 3,0 x10 7,48 8,4 x105 5,92 4 7,6 x10 4,88 3,2 x107 7,51 - Isolat pvk-5b Jumlah sel Log (CFU/ml) jumlah sel 7 1,6 x10 7,21 6,2 x104 4,79 6,6 x105 5,82 2,0 x106 6,30 7,0 x109 9,85 - Isolat pvk-6b Jumlah sel Log jumlah (CFU/ml) sel 6 2,4 x10 6,55 7,6 x107 7,88 - Isolat pvk-7a Jumlah sel Jumlah sel (CFU/ml) (CFU/ml) 6 3,2 x10 6,51 5,6 x104 4,75 4,0 x107 7,62 2,2 x109 9,34 3,0 x108 8,48 7,2 x107 7,85 - Isolat pvk-8a Jumlah sel Log jumlah (CFU/ml) sel 6 1,2 x10 6,89 1,0 x104 4,30 - Keterangan : (-) Tidak tumbuh 39 Pvk-8a kokus streptokokus nd = Not Described - - Oksidase + - Indole nd - Nitrat Chromobacterium kokus streptokokus Pvk-5a kokus streptokokus Pvk-5b kokus streptokokus - nd nd nd putih nd kuning cerah putih putih putih susu putih katalase + + + + + nd fermentasi +/+ +/+ + - + - + + nd + + + + +/+/+/+ + nd nd nd nd nd nd + +/+ - aerob aerob aerob - + + + + - - nd - aerob - + - - - Respirasi Flagella nd + + - Sifat gram Motilitas streptobasil monobasil streptobasil streptobasil streptobasil monobasil nd + karotenoid flexirubin violet - (-) (+) (-) (-) (-) (-) aerob aerob aerob aerob aerob aerob (-) (-) (-) - (-) Pigmen Endospora basil basil basil basil basil basil Warna koloni Formasi sel Pseudomonas Bacillus Escherichia Serratia Achromobacter Flavobacterium Bentuk sel F. KECOCOKAN KARAKTERISTIK ISOLAT BPF POTENSIAL ADAPTIF VINASSE 40
