Ekspresi dan Karakteristik Isozim Esterase pada Hyphessobrycon

Rosdanelli Hasibuan / Jurnal Teknologi Proses 5(2) Juli 2006: 92 – 99
100
Jurnal
Teknologi Proses
Media Publikasi Karya Ilmiah
Teknik Kimia
5(2) Juli 2006:100 – 104
ISSN 1412-7814
Ekspresi dan Karakteristik Isozim Esterase
pada Hyphessobrycon callistus (Serpae Tetra)
Menggunakan Substrat α–Naphthyl Asetat dan β–Naphthyl Asetat
1
2
Deny Supriharti1 dan Amir Husin2
Departemen Biologi, Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara, Medan 20155
Departemen Teknik Kimia, Fakultas Teknik Universitas Sumatera Utara, Medan 20155
Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk melijar ekspressi dan karakteristik isozim esterase pada dua spesies
Hyphessobrycon callistus (serpae tetra) dengan menggunakan slab gel vertikal elektroforesis pada gel
akrilamid 7 %. Adapun ekstrak yang diambil berasal dari organ -organ otak, mata, insang, otot, usus dan
lambung. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada H. callistus dengan menggunakan substrat αnaphthyl asetat mengahasilkan total 9 esterase yang menyebar pada organ yang berbeda dengan nilai Rf
berkisar 0,043 sampai 0,553, sedangkan pada substrat β- naphthyl asetat hanya 7 esterase yang
terekspressi. Esterase yang didapatkan dibedakan atas 5 karakter yaitu Arylesterase (AR), esterase
sensitive terhadap eserin sulfat dan DFP (Esdp), esterase resisten terhadap DFP (ER),.
Carboksilesterase (CE) dan kolinesterase (CHO.
Kata kunci: isozim, esterase, Hyphessobrycon.
Pendahuluan
Multilokus isozim merupakan suatu
protein yang banyak digunakan untuk
mempelajari proses evolusi dan aspek yang
terkait dengan ekspresi gen sehingga dapat
digunakan untuk mengetahui perbandingan
dan klasifikasi protein (Esbenshade dan
Triantaphyllou 1986; Markert 1987; Kijima
dan Fujio 1990). Multilokus isozim biasanya
berasal dari beberapa duplikasi gen yang
diikuti oleh proses evolusi dari gen –gen
yang berduplikasi dan terekspresi pada
berbagai
organ
dari
suatu
spesies
(Salamastrakis et al. 1998; Lee dan Lees
2001).
Sebagai suatu protein hidrolitik, esterase
telah banyak dipelajari pada berbagai
organisme tingkat tinggi. Di antara kelompok
ikan teleostei, esterase ditemukan dalam
bentuk multimolekul (Schmidt dan Schmidt
1994; Li dan Fan 1997; Supriharti dan
Frankel 1998; 2002). Berdasarkan hasil studi
pada populasi ikan terlihat esterase
merupakan enzim yang tidak mempunyai
spesifikasi, dapat tersebar pada berbagai
organ yang tidak spesifik serta mempunyai
substrat dan kegunaan yang tumpang tindih,
sebagaimana yang terlihat pada Barbus
(Varma dan Frankel 1998); Brachydanio
(Hart dan Cook 1976) Pseudorasbora parva,
Carrasius auratus, Gambusia afiinis dan
Salmo gairdneri ( Li dan Fan 1997) Tilapia
(Lesli dan Pontier 1998).
Klasifikasi dan karakteristik isozim
esterase pada umumnya ditentukan oleh
perbedaan substrat dan
daya tahannya
terhadap berbagai senyawa inhibitor. Secara
101
Deny Supriharti dan Amir Husin / Jurnal Teknologi Proses 5(2) Juli 2006: 100 – 104
garis besar esterase dibedakan atas empat
kelompok yaitu karboksilesterase (CE) EC
3.1.1.1; Arylesterase (AR), EC 3.1.1.2; dan
kolinesterase (CHO), EC 3.1.1.7 dan EC
3.1.1.8 (Varma dan Frankel 1980;
Antosiewicz et al. 1995). Selain itu ada 3
jenis esterase lainnya yaitu esterase resisten
terhadap DFP (ER), esterase resisten pada
Eserine dan DFP (Esdp) dan Ese yaitu
esterase yang resisten terhadap eserin sulfat
(Hart dan Cook 1976; Varma dan Frankel
1980; Pen dan Beintennema 1986).
Bahan dan Metode
Pengambilan sampel
Sampel ikan dibeli dari distributor
penjualan ikan di kota Medan. Ikan
dimatikan dengan menggunakan air es
selanjutnya diambil 6 (enam) organ yaitu
otak, mata, otot, usus, lambung, dan insang.
Masing-masing organ dibilas dengan air
suling untuk selanjutnya dihancurkan sampai
halus. Perlakuan khusus diberikan untuk usus
dan lambung yaitu dengan membuang
terlebih dahulu semua isi kedua jaringan
tersebut. Sampel yang telah hancur
dihomogenkan dengan menggunakan 0,2 M
Tris –HCl dalam larutan 0,3 sukrosa dengan
pH 8,0. Setelah larutan homogen pada
larutan tersebut ditambahkan bromophenol
blue sebagai pewarna dan selanjutnya sampel
disentrifus pada 15.000 rpm sampai
menghasilkan supernatan yang segera
dianalisa dengan menggunakan elektroforesis
(Frankel 1982).
Analisa elektroforesis
Analisa elektroforesis dilakukan dengan
menggunakan slab gel elektroforesis pada EC model 490 horizontal cell. Selama proses
elektroforesis, suhu gel dijaga konstan sekitar
4oC. Adapun gel yang digunakan adalah
Acrylamide gel dengan konsentrasi 7% yang
dipasangkan pada 300 voltage. Buffer yang
digunakan adalah 0,155M Tris –sitrat dengan
pH 6,8. Proses analisa elektroforesis
dihentikan setelah “gel running” selama 4
(empat) jam. Setelah proses running selesai
maka gel diberi bahan inhibitor dan
selanjutnya diberi pewarna fast blue RR.
Karakteristik Esterase
Untuk menentukan karakter esterase yang
didapat digunakan uji pada berbagai
inhibitor. Gel di potong secara vertikal dan
diinkubasikan pada 0,2 M Tris –HCl dan
yang lainnya pada salah satu inhibitor berikut
ini:
10-3
M
PHMB
(parahidroksimerkuribenzoat).
10-3
M
PCMB
-4
(parakloromerkuribenzoat), 10 M DFP
(diiso-prophylflourophospat) dan 10-4 M ES
(eserin sulfat). Kedua potongan gel tersebut
diinku-basikan selama 30 menit selanjutnya
diberi warna Fast Blue RR (Supriharti dan
Frankel 1998).
Pewarnaan
Pewarnaan dilakukan dengan cara
menginkubasikan gel pada larutan pewarna
yang terdiri atas α - naphthyl asetat, βnaphthyl asetat sebagai substratnya, di mana
komposisi zat warna adalah 50mg substrat
yang dilarutkan pada 1 ml aseton dan 100 mg
fast blue RR salt pada larutan buffer 0,2 M
Tris –HCl sebanyak 60 ml dengan pH 8,0.
Selanjutnya gel diinkubasikan pada inkubator
dengan suhu konstan 37oC selama 30 menit.
Bila proses pewarnaan selesai dan
didapatkan band dari isozyme esterase maka
gel disimpan pada 7% asam asetat (Frankel
1982).
Analisis data
Data yang dianalisa adalah nilai relative
mobility (Rf Value) yang akan dianalisis
menggunakan standar deviasi dengan cara
mengambil nilai rata-rata rf value dari setiap
individu. Rf value tidak akan berbeda lebih
dari satu standar deviasi dari nilai Rf yang
telah ditentukan.
Hasil dan Pembahasan
Ekspresi esterase
Berdasarkan zimogram isozim esterase
pada H. callistus didapatkan total 9 aktivitas
esterase dengan nilai Rf 0,043 sampai 0,553
yang secara umum lebih tersebar pada
substrat α–naphthyl asetat dibandingkan pada
Deny Supriharti dan Amir Husin / Jurnal Teknologi Proses 5(2) Juli 2006: 100 – 104
substrat β–naphthyl asetat. Hal ini
kemungkinan disebabkan rantai α–naphthyl
asetat lebih panjang dibandingkan β –
naphthyl asetat sebagaimana dinyatakan juga
oleh Huang et al. 1993.
Pada substrat α –naphthyl asetat
kesembilan pita esterase terekspresi pada
berbagai satu organ yaitu esterase ke-9 (E-9)
atau dua organ saja yaitu esterase 1, 3, 6, dan
7 (E-1, E-3, E-6 dan E-7). Esterase 4 (E-4 )
dan esterase ke 8 (E-8) terekspresi pada 3
organ. Sementara hanya esterase ke-5 (E-5)
yang tersebar pada seluruh organ. Untuk
lebih jelasnya dapat dilihat pada Tabel 1.
Ekspresi isozim esterase pada substrat βnaphthyl asetat cenderung ke arah anoda
dibandingkan dengan substrat α–naphthyl
asetat. Akan tetapi ekspresinya hanya pada
organ-organ tertentu saja, hanya esterase ke-
102
1 (E-1) terekspresi pada 4 organ dan esterase
ke-4 (E-4) yang menyebar hampir pada
semua organ.
Penyebaran isozim ini juga diperlihatkan
oleh berbagai penelitian lain seperti pada
Pseudorasbora parva, Carrasius auratus,
Gambusia afiinis dan Salmo gairdneri, di
mana distribusinya lebih terkonsentrasi pada
bagian pencernaan dan aktivitas esterase
yang paling tinggi terdapat pada ikan nila
(Tilapia nilotica). Isozim esterase pada ikan
G. ternetzi menunjukkan pola ekspresi
penyebaran yang tinggi pada hampir semua
jaringan, akan tetapi aktivitas esterase yang
tertinggi didapatkan pada mata dan yang
terendah pada insang (Li and Fan 1997; Lesli
dan Pontier, 1998; Supriharti dan Frankel
2002). Untuk lebih jelasnya dapat dilihat
pada Tabel 2.
TABEL 1: Ekspresi isozim esterase Hyphessobrycon callistus pada substrat α–naphthyl asetat
Esterase
E-1
E-2
E-3
E-4
E-5
E-6
E-7
E-8
E-8
Mata
0,043
0,091
0,134
0,196
0.237
0.553
Insang
0,237
-
Otak
0,091
0,134
0,196
0,237
0,307
0,467
,
Otot
0,134
0,194
0,237
0,307
-
Usus
0,091
0,237
0,374
0,467
-
Lambung
0,043
0,091
0.237
0,467
-
TABEL 2: Ekspresi isozim esterase Hyphessobrycon callistus pada substrat β–naphthyl asetat
Esterase
E-1
E-2
E-3
E-5
E-6
E-8
E-9
Mata
0,043
0,091
0,237
0,457
-
Insang
0,043
0,307
-
Otak
-
Otot
0,043
0,307
-
Usus
0,043
0,091
0,237
-
Lambung
0,134
0,467
0,554
103
Deny Supriharti dan Amir Husin / Jurnal Teknologi Proses 5(2) Juli 2006: 100 – 104
TABEL 3: Karakteristik isozim esterase pada ikan Hyphessobrycon callistus dengan menggunakan
substrat α-naphthyl asetat
No.
1
2
3
4
5
6
No.
Tipe
AR
Esdp
AR
ER
ER
CE
Tipe
RF Value
0,043
0,091
0,134
0,196
0,237
0,307
RF Value
Aktivitas
Mata
1
2
++
+++
+++
++
++
--
Aktivitas
*
*
*
3
Aktivitas
Insang
1
2
3
Otak
Aktivitas 1 2
3
3
Lambung
Aktivitas 1 2
3
*
*
*
Otot
1
2
3
Aktivitas
Usus
1
1
AR
0,043
2
Esdp
0,091
3
AR
0,134
4
ER
0,196
5
ER
0,237
6
CE
0,307
Keterangan:
= Sensitif terhadap Eserine sulfat
= Sensitif terhadap PCMB dan/atau PHMB
= Sensitif terhadap DFP
2
+
+
_ _+++
__
++
+
__
+
+
+
Karakteristik Esterase
Kesimpulan
Berdasarkan uji inhibitor terhadap
esterase yang terekspressi pada H. callistus
didapatkan 5 karakter isozim esterase yaitu
Arylesterase (AR), esterase sensitif terhadap
DFP dan eserin sulfat (Esdp), Eserine
Resisten (ER), Carboksilesterase (CE) serta
Kolinesterase (CHO). Uji inhibitor dilakukan
dengan menggunakan substrat α-naphthyl
asetat, karena substrat tersebut memberikan
hasil yang lebih baik dibandingkan dengan
β–naphthyl asetat. Salah satu dari jenis
esterase yang didapat yaitu Cholinesterase
(CHO) yang mempunyai peranan penting
terhadap daya survival beberapa spesies
(Esbenshade dan Triantaphyllou 1986; Pen
dan Beintennema, 1986). Cholinesterase
sendiri terdiri atas Asetil-cholinesterase dan
Pseudo-cholinesterase,
di
mana
asetilcholinesterase
merupakan
Cholinesterase yang dapat menghidrolisa
asetilcholin (Esbenshade dan Triantaphyllou,
1986; dan Huang et al. 1996). Untuk lebih
jelas dapat dilihat pada Tabel 3.
Dari hasil penelitian di atas dapat diambil
kesimpulan
bahwa
ekspresi
isozim
Hyphessobrycon callitus pada α-naphthyl
asetat yaitu 9 esterase lebih banyak
dibanding β–naphthyl asetat hanya 7 esterase
yang tersebar pada organ – organ yang
berbeda.
Karakter esterase yang didapatkan pada
ikan ini ada 5 kelompok yaitu 5 karakter
isozim esterase yaitu Arylesterase (AR),
esterase sensitif terhadap DFP dan eserin
sulfat (Esdp), Eserine Resisten (ER),
Carboksilesterase (CE) serta Kolinesterase
(CHO).
Daftar Pustaka
Antosiewicz, J., McCammon, J.A., Wlodek,
T & Gilson, K., 1995. Simulations of
Charge- Mutant Acethylcholinesterase.
Biochemistry. 34: 4211 – 4219.
+
Deny Supriharti dan Amir Husin / Jurnal Teknologi Proses 5(2) Juli 2006: 100 – 104
Esbenshade, P.R. & Triantaphyllou., A.C.
1986. Partial Characterization of
Esterase in Meloidogyne (Nematoda).
Comp. Biochem. Physiol. 83B (1): 31 –
38.
Frankel, J.S. 1982. Serum esterases variation
and characterization in populations of
the longnose Garpike, Lepisosteus
osseus. Comp. Biochem. Physiol. 73B:
347 –347.
Hart, N.H. & Cook, M. 1976. Comparative
analysis of tissues esterases of Zebra
danio (Brachydanio rerio) and the
Pearl danio (B. albolineatus) by disc
gel electrophoresis. Comp. Biochem.
Physiol. 54B: 357 – 364.
Huang, T.L; Szekacs, A; Uematsu, T;
Kuwano, E;Parkinson, A & Hammock,
B.D. 1996. Hydrolysis of Carbonates,
Thiocarbonates,
carbamates,
and
Carboxylic Esters of α-Naphthol, βNaphthol, dan ρ-Nitrophenol by
Human, Rat, and Mouse Liver
Carboxylesterases.
Pharmaceutical
Research. 10: 639 – 648.
Kijima, A dan Fujio, Y. 1990. Genetics
analysis of populations structure in
marine Teleost around Japan. Dalam
Isozymes: Structure, Function, and
Use in Biology and Medicine. 177 –
206. Wiley-Liss, Inc.
Lee, SE dan EM Lees. 2001. Biochemical
mechanisms of resistance in strain of
Oryzaephillus surinamensis resistans
to malathion dan chlorpyrofos –
methyl.
J. Econ. Entomol.; 94(3):
706 – 713.
Lesli, JF dan PJ Pontier. 1998. Linkage
conservations of homologous esterase
loci in fish (Cyprinodontoidei:
Poeciliidae).
Biochem.
Genet.
18(2):203 - 215
Li, SN dan DF. Fan. 1997. Activity of
esterases from different tissues of
freswater fish and responses of their
isozymes to inhibitors. J. Toxicol.
Environ.Health. 51(2):149-157.
104
Markert, C.L. 1987. Isozymes and the
regulatory structure of the genome.
Dalam Isozymes; Current Topics in
Biological and Medical Research.
Mollecular and Cellular Biology. 14:
1-17. Alan R. Liss, New York.
Pen, J., dan Beintennema, J.J. 1986.
Nomenclature of Esterase. Biochem
Journal 238: 691 –699.
Salamastrakis SS dan AA Haritos. 1998.
Physicochemical characterization and
tissue distribution multiple molecular
forms of fish (Trachurus trachurus)
esterase. Comp. Biochem Physiol Bio.
91(4): 741 – 750.
Schmidt, E dan Schmidt, F.W. 1994. Serum
Cholinesterase in Diabetes. In
Esterase, Lipases and Phospholipases.
From
Structure
to
Clinical
Significance. Edited by M.I Mackness
and M . Clerck. 71 – 89. Plenun Press.
New
Supriharti, D. & J.S. Frankel. 1998.
Characterization of soluble esterase
isozymes in five species of fishes in
the Characidae. Gene Families and
Isozyme Bulletin. 31: 56.
Supriharti, D. & J.S. Frankel. 2002.
Multiplicity and Expression of soluble
esterase isozymes inAmerican and
African Characins. Gene Families and
Isozyme Bulletin. 35: 64.
Triantaphyllidis, C.D., Damianakis, H.,
Economidis, P.S. and Karakousis, J.
1981. Genetic variation in greek
Barbel populations-I. Esterases, LDH,
MDH, ME, and PGM in Barbus
meridionalisis (Pisces, Cyprinidae).
Comp. Biochem. Physiol. 70B: 289293.
Varma, A.K. dan Frankel, J.S. 1980. A
comparison of tissue esterase in the
genus Barbus by vertical gel
electrophoresis.
Comp.
Biochem.
Physiol. 68B: 267 – 273.