II. TINJAUAN PUSTAKA A. Tulang 1. Komposisi tulang Menurut

II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Tulang
1. Komposisi tulang
Menurut terminologi biologi, tulang didefinisikan sebagai jaringan
penghubung yang menyokong struktur tubuh. Secara makroskopis terdapat
dua bentuk utama dari jaringan tulang, yaitu tulang kompak atau kortikal dan
tulang cancellous atau trabecular. Tulang kompak adalah tulang yang tebal,
sedangkan tulang cancellous tersusun atas materi tulang yang bernama
trabeculae. Jalinan trabeculae memberikan penampakan tulang cancellous
terlihat kenyal. Secara fisik, komponen penyusun tulang terdiri atas kombinasi
antara kolagen yang visko-elastis dan kaku dan fase anorganik hidroksiapatit
(Kubisz, 2007). Sifat psikokimia dan biologi tulang berbeda dengan masingmasing komponen penyusunnya dalam keadaan tunggal. Kolagen memiliki
struktur yang fibrous dan didukung oleh beberapa kristal mineral yang
memperkuat struktur. Meskipun keberadaan komponen yang fibrous dan
kristal mineral ini saling mempengaruhi, akan tetapi tidak dipahami dengan
jelas peranan masing-masing komponen (Landis, 1995).
Sekitar 70% tulang dewasa tersusun atas fase anorganik, yang berada
dalam keseimbangan dengan fase organik dan air. Fraksi mineral tulang mirip
dengan hidroksiapatit [Ca10(PO4) CO3]3. Hidroksiapatit adalah materi yang
heterogen dan tidak dapat dideskripsikan sebagai materi tunggal (Landis,
1995). Hidroksiapatit (HAP) merupakan mineral yang paling stabil di dalam
tulang (Kubisz, 2007). Mineral-mineral lain seperti fluorin, klorida, dan
magnesium dapat juga menyatu dengan kisi-kisi kristal. Subtitusi gugus OHdan gugus PO43- oleh ion karbonat – CO3 menghasilkan karbonat apatit yang
juga dikenal dengan dahllite (Ca5(PO4CO3). Komponen lain penyusun tulang
sebanyak 10% adalah glikosoaminogikan, glikoprotein, lipid, peptida, dan
enzim.
Menurut kajian struktural, triple heliks dari kolagen adalah protein
yang unik yang digambarkan oleh superheliks dari tiga rantai polipeptida.
Struktur helik kolagen umumnya tersusun atas urutan asam amino (X-YGlisin)n, dengan prolin dan hidroksiprolin sering ada pada posisi X dan Y.
Asam amino lain yang sering ada pada tulang adalah alanin, lisin, arginin,
leusin, valin, serin, phenylalanin, dan threonin. Urutan asam amino pada rantai
polipeptida pada kolagen dinamakan struktur primer. Satu rantai yang
memiliki struktur helik dikenal dengan α-heliks yang tidak stabil dalam
keadaan tunggal. Adanya asam amino glisin di setiap residu ketiga sangat
dibutuhkan untuk membentuk triple heliks karena glisin adalah asam amino
yang paling kecil, selain itu, glisin juga merupakan satu-satunya asam amino
yang tidak memiliki gugus samping. Triple heliks membentuk struktur tersier
kolagen. Superheliks distabilkan oleh ikatan hidrogen di antara rantai (Kubisz,
2007).
Kandungan hidroksiprolin yang tinggi juga melibatkan interaksi
dengan air yang memberikan karakteristik pada kolagen. Hidroksiprolin
berperan pada stabilisasi konformasi triple heliks pada kolagen karena
hidroksiprolin terlibat dalam ikatan hidrogen antar rantai polipeptida. Molekul
triple heliks berbentuk silinder dengan diameter 1.5 nm dan panjang 300 nm.
Posisi dari molekul tripel heliks adalah paralel, tetapi dipisahkan oleh lubang
sekitar 35 nm di ujungnya dan molekul berdekatan dengan jarak sekitar 68
nm. Struktur kuartener berupa mikrofibril yang terbentuk oleh sekitar lima
unit tropokolagen. Mikrofibril dikemas dalam bentuk tetragonal. Diameter
fibril hanya beberapa angstroms, setiap fibril tersusun atas tiga rantai
polipeptida dengan jumlah asam amino sebanyak 1000 asam amino (Kubisz,
2007).
Komponen tulang selain komponen organik dan anorganik adalah air.
Air yang berasosiasi dengan protein dibagi menjadi tiga tipe, yaitu struktural,
terikat, dan air bebas. Air struktural terdapat pada struktur kolagen dengan
jumlah sekitar 0-0.07 g/g. Air terikat sebanyak 0.07-0.25 g/g, adalah molekul
air yang terikat secara spesifik pada rantai kolagen dan terdapat pada ruang
antar molekul. Interaksi antara air dan protein pada air terikat tidak sekuat
interaksi air dan protein pada air struktural. Air bebas adalah komponen air
dengan jumlah lebih tinggi dari 0.45 g/g. Adanya kandungan air ini
5
dikarenakan oleh struktur fibrous dan komposisi kimia yang mengandung
gugus hidrofilik seperti gugus C=O, N-H, COOH, dan OH (Kubisz, 2007).
2. Dampak iradiasi pada tulang
Tulang yang diiradiasi kehilangan resistensi mekanis yang berarti
kehilangan kapasitas untuk menyerap energi dan menghasilkan tulang yang
rapuh. Kehilangan resistensi ini dipengaruhi oleh kondisi penyinaran dan
sebelum penyinaran. Sebagai contoh, tulang yang diiradiasi tanpa perlakuan
pembekuan akan menghasilkan tulang yang lebih rapuh dibandingkan dengan
tulang yang diiradiasi dalam keadaan beku. Kajian mengenai sifat mekanis
tulang telah dipelajari pada dosis 30+5 kGy, yang cukup untuk mengurangi
jumlah mikroba sampai 109. Radiasi dapat membuat tulang menjadi rapuh
karena terjadinya denaturasi pada komponen kolagen. Menurut Currey et al.
(1997), iradiasi dengan dosis sekitar 90 kGy menghasilkan integritas mekanis
tulang yang tidak dapat diterima.
Dari sudut pandang mikroskopis, perubahan makroskopis disebabkan
oleh radikal bebas yang terbentuk selama iradiasi. Sebagai contoh, perubahan
kimia pada protein yang melibatkan radikal bebas. Radiasi ionisasi dapat
menghasilkan radikal bebas yang bersifat stabil dalam sistem biologi makhluk
hidup. Kerusakan yang terjadi selama iradiasi tulang disebabkan oleh radikal
bebas hasil radiasi seperti radikal hidroksi, ion superoksida, radikal turunan
asam amino, dan radikal anorganik CO33- dan CO21-. Radikal bebas turunan
dari mineral tulang mempunyai umur simpan yang panjang sekitar 107 tahun
pada suhu 250C, sebagai akibatnya tulang biasa digunakan sebagai dosimeter
alami (Kubisz, 2007).
Radikal bebas yang disebabkan oleh iradiasi tulang terjebak sangat
lama dan keberadaanya dapat dideteksi dengan cara spektroskopi ESR.
Radikal bebas yang terdeteksi oleh ESR merupakan radikal bebas yang
dihasilkan baik dalam matriks organ maupun komponen mineral dalam tulang.
Turunan radikal organik dari kolagen cukup stabil dalam sampel di suhu
ruang, akan tetapi mengalami kerusakan dengan cepat saat dipanaskan.
Kemungkinan karena rekombinasi antar radikal. Pemberian udara ke spesimen
6
yang tidak dipanaskan memicu kerusakan. Radikal anorganik yang paling
stabil CO2 1- memiliki waktu paruh 107 tahun pada 250C. Berlawanan dengan
radikal anorganik, radikal organik dapat dengan mudah direkombinasi. Alasan
dari sifat ini kemungkinan karena terjadi ikatan hidrogen yang lemah dan
fleksibel di kolagen dan struktur kristalin yang padat dari hidroksiapatit
(Kubisz, 2007).
B. Ikan Mas
Ikan Mas (Cyprinus carpio Linn) mempunyai ciri-ciri badan
memanjang, sedikit pipih ke samping (compressed), mulut dapat disembulkan,
dan terletak di ujung tengah (terminal), mempunyai dua pasang sungut, sisik
yang relatif besar yang tergolong tipe cycloid, mempunyai garis rusuk yang
lengkap dan berada pada pertengahan sirip ekor (Susanto, 1993). Hampir
seluruh tubuh ikan mas ditutup sisik, sirip punggung (dorsal) berukuran relatif
panjang dengan bagian belakang berjari keras, dan sirip ketiga dan keempat
bergerigi. Letak permukaan sirip punggung berseberangan dengan letak
permukaan sirip perut (ventral). Sirip dubur atau sirip anal yang terakhir
bergerigi. Linea literalis terletak di pertengahan tubuh, melintang dari tutup
insang sampai dengan ke ujung belakang pangkal ekor. Gigi kerongkongan
(pharinreal teeth) terdiri dari tiga baris yang berbentuk gigi geraham (Suseno,
1994).
Menurut Okada (1990), berdasarkan komposisi kimia protein dan
lemak, ikan dibagi dalam empat golongan, yaitu
1. Lemak rendah (< 5%) dan protein tinggi (> 15%)
2. Lemak sedang (5%-15%) dan protein tinggi (> 15%)
3. Lemak tinggi (> 15%) dan protein rendah (< 15%)
4. Lemak rendah (< 15%) dan protein rendah (< 15%)
Berdasarkan penggolongan di atas, ikan mas termasuk ke dalam ikan berlemak
rendah dan berprotein tinggi.
Komponen kimia ikan mas menurut Shimone dan Shikata (1993), yaitu
kadar air antara 70.4-73.9%, protein antara 16.70-18.43%, lemak antara 6.208.30%, dan kadar abu antara 2.66-3.41% atau berdasarkan perhitungan berat
7
kering untuk kadar protein antara 56.45-62.28%, kadar lemak antara 20.9628.05%, dan kadar abu antara 9.0-11.52%.
C. Pepes Ikan
Pepes ikan merupakan salah satu makanan tradisional Indonesia. Pepes
ini biasanya dibuat dengan menggunakan bahan dasar ikan mas di Jawa Barat.
Sedangkan di wilayah lain, pepes juga dapat dibuat dengan bahan dasar ikan
laut seperti ikan makarel. Pepes adalah produk olahan daging (unggas atau
ikan) dengan menambahkan rempah bumbu pada daging dan dikemas dengan
menggunakan daun pisang. Rempah atau bumbu yang digunakan dalam
pembuatan pepes ikan mas adalah bawang putih, kunyit, jahe, daun sereh,
lemon, dan daun salam. Cara membuat pepes ikan secara tradisional di daerah
adalah bumbu dan rempah dihaluskan dan ditambah daun kemangi, tomat, dan
cabai kemudian dibalutkan ke ikan mas yang sudah dibersihkan. Setelah itu,
dibungkus dengan daun pisang dan disemat dengan 2 buah bambu kecil di
setiap ujungnya. Bungkusan ini lalu diolah dengan perlakuan termal(Irawati et
al., 2000).
Salah satu cara untuk meningkatkan kualitas pepes dengan
menggunakan teknologi yang ada adalah dengan membuat produk pepes
iradiasi. Menurut Irawati et al. (2000), pepes ikan mas iradiasi dibuat melalui
tahap-tahap sebagai berikut: pertama, ikan mas dibersihkan dengan cara
dikeluarkan isi perutnya, kemudian dicuci dengan menggunakan air yang telah
dicampur lemon dan garam selama 15 menit. Ikan kemudian dicuci kembali
menggunakan air dan segera diasinkan dengan menggunakan bumbu seperti
bawang putih, kunyit, jahe, daun sereh, lemon, dan daun salam. Setelah itu,
ikan dibungkus menggunakan daun pisang dan diproses panas menggunakan
Inoxpran pressure cooker selama 45-60 menit pada suhu 120C. Pepes yang
dihasilkan dibekukan pada suhu -13C. Pepes tersebut dikemas secara vakum
menggunakan kemasan yang terdiri dari LDPE dan alumunium foil. Pepes
yang telah dikemas kemudian disusun dalam styrofoam boxes yang telah
dilapisi oleh dry ice dan dan disimpan selama semalam sebelum diiradiasi.
Proses iradiasi dilakukan dengan menggunakan sinar gamma melalui
iradiator IRKA di National Nuclear Energy Agency, Pasar Jumat, Jakarta.
8
Cobalt 60 digunakan sebagai sumber radiasi ionisasi dengan dosis rata-rata 5.2
kGy/jam. Radiochromic FW-60 digunakan sebagai kalibrasi dosimeter,
sedangkan perspex dosimeter digunakan untuk menentukan dosis minimum
yang terserap. Pepes ikan mas diiradiasi dengan dosis minimum 45 kGy di
dalam dry ice. Dosis sterilitas ditentukan dengan mengacu pada metode AAMI
(Association for the Advancement of Medical Instrumentation) ISO/DIS
11137.2 berdasarkan bioburden. Setelah dosis sterilitas tercapai, pepes ikan
mas iradiasi disimpan pada suhu ruang.
Gambar 1. Pepes ikan mas iradiasi dalam kemasan
D. Prinsip Iradiasi Pangan
Pada pengawetan bahan pangan dengan iradiasi digunakan radiasi
berenergi tinggi yang dikenal dengan nama radiasi pengion, karena dapat
menimbulkan ionisasi pada materi yang dilaluinya (Maha, 1981). Prinsip
pengawetan bahan pangan dengan iradiasi ditunjukkan pada Gambar 2.
Sumber iradiasi
Bahan pangan
Eksitasi, ionisasi, dan
perubahan komponen sumber iradiasi
Efek fisik, kimia,
dan biologis bahan pangan
Pertumbuhan sel bahan terhambat, mikroorganisme
patogen dan pembusuk mati
Gambar 2. Skema proses pengolahan bahan pangan dengan iradiasi
9
Gambar di atas menunjukkan bahwa eksitasi dan ionisasi elektron
menyebabkan perubahan komponen pada bahan pangan tersebut. Apabila
perubahan terjadi pada sel hidup, maka akan menghambat sintesis DNA yang
menyebabkan proses terganggu dan terjadi efek biologis. Efek inilah yang
digunakan sebagai dasar untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme
pada bahan pangan (Maha, 1981).
Pemanfaatan praktis iradiasi bahan pangan banyak berkaitan dengan
pengawetan. Radiasi menonaktifkan organisme perusak pangan, yaitu
bakteri, kapang dan khamir. Iradiasi juga efektif untuk memperpanjang masa
simpan sayur dan buah segar karena membatasi perubahan hayati yang
berkaitan dengan pematangan, pertumbuhan, dan penuaan.
Jenis sinar yang memiliki kemampuan untuk mengionisasi diantaranya
adalah sinar , , dan . Dari ketiga jenis sinar tersebut sinar  memiliki daya
penetrasi yang paling tinggi dan dapat digunakan untuk radiasi ionisasi. Sinar
 memiliki daya tembus yang amat kuat dan tidak terbelokkan oleh medan
magnet atau medan listrik. Iradiasi dengan sinar  paling banyak digunakan
untuk aplikasi iradiasi pangan (Winarno et al., 1980). Partikel lain yang
memiliki efek yang mirip dengan sinar  adalah neutron, akan tetapi
penggunaan neutron tidak boleh digunakan untuk iradiasi pangan karena dapat
menghasilkan radioaktivitas pada pangan (Diehl, 1990).
Menurut Maha (1985), iradiasi adalah suatu teknik yang digunakan
untuk pemakaian energi radiasi secara sengaja dan terarah. Sedangkan
menurut Winarno et al., (1980), iradiasi adalah teknik penggunaan energi
untuk penyinaran bahan dengan menggunakan sumber radiasi buatan. Apabila
suatu zat dilalui oleh radiasi pengion, energi yang melewatinya akan diserap
dan menghasilkan pasangan ion. Energi yang diserap oleh tumbukan radiasi
pengion dengan partikel bahan pangan akan menyebabkan eksitasi dan
ionisasi beribu-ribu atom dalam lintasannya yang terjadi dalam waktu kurang
dari 0.001 detik.
10
Dua jenis radiasi pengion yang umum digunakan untuk pengawetan
makanan adalah :
a.
Sinar gamma
Dipancarkan oleh radio nuklida
60
Co dan
137
Cs. Keduanya merupakan
gelombang elektromagnetik dengan panjang gelombang pendek.
b
Berkas elektron
Dihasilkan oleh mesin pemercepat elektron yang terdiri dari partikelpartikel bermuatan listrik.
Dosis iradiasi adalah jumlah energi radiasi yang diserap bahan pangan
dan merupakan faktor kritis pada iradiasi pangan. Untuk setiap jenis pangan
dibutuhkan dosis khusus sehingga diperoleh hasil yang diinginkan. Besarnya
dosis iradiasi yang digunakan dalam pengawetan pangan tergantung pada jenis
bahan dan tujuan pengawetan yang ingin dicapai. Dosis iradiasi yang
digunakan
untuk
bahan
makanan
berdasarkan
tujuan
pengawetan
dikelompokkan sebagai berikut:
a.
Dosis rendah, Radurisation (0-1 kGy)
Pemakaian dosis ini bertujuan untuk menghambat pertumbuhan tunas
pada berbagai jenis umbi-umbian serta untuk membunuh serangga
perusak makanan
b.
Dosis sedang, Radicidation (1-10kGy)
Dosis ini ditujukan untuk menurunkan jumlah mikroba guna
memperpanjang umur simpan.
c.
Dosis tinggi, Radappertisation (10-50kGy)
Pemakaian dosis tinggi ini bertujuan untuk sterilisasi guna membunuh
semua mikroba termasuk virus, sehingga produk dapat disimpan dalam
suhu ruang tanpa pendinginan (Urbain, 1986). Umumnya diaplikasikan
pada produk daging agar tetap awet selama jangka penyimpanan pada
kondisi normal.
11
Selain ditujukan untuk pengawetan makanan, dapat memperpanjang
daya awet, dan juga tidak mengubah mutu fisik produk. Pemilihan dosis
optimum dilakukan dengan memperhatikan tiga kriteria dasar, yaitu:
a.
Dosis iradiasi tidak menyebabkan perubahan karateristik organoleptik.
b.
Daya awet makanan pada suhu penyimpanan tertentu.
c.
Tingkat keamanan.
Pengembangan dan penggunaan iradiasi untuk stabilitasasi bahan
pangan memberikan kemungkinan bahan pangan dapat diawetkan tanpa
mengalami perubahan nyata sifat alaminya. Bidang ini dirintis oleh Dr. B.E.
Proctor dan Dr. S.A. Goldblith pada akhir tahun 1940 dan sejak itu menjadi
tantangan bagi banyak ilmuwan dan ahli teknologi bahan pangan (Desrosier,
1988).
Tanggal 29 Desember 1987 Departemen Kesehatan RI telah
memberikan izin PERMENKES No. : 826/MENKES/PER/XII/1987 untuk
beberapa jenis produk bahan pangan iradiasi dan telah diperbaharuhi pada
tahun 1995 yaitu PERMENKES No. : 152/MENKES/SK/II/1995 untuk dosis
maksimum 10 kGy). Adapun JECFI (Joint Expert Committee on Food
Irradiation) pada tahun 1980 telah merekomendasi bahwa dosis sampai 10
kGy aman untuk dikonsumsi.
Tabel 1. Jenis komoditas yang telah diijinkan oleh Depkes untuk
proses iradiasi
No.
Komoditas
Tujuan Iradiasi
Batas Dosis
Maksimal
(kGy)
10
1
Rempah-rempah,
daun-daunan, dan
bumbu kering
Mencegah/menghambat
pertumbuhan serangga dan
mikroba
2
Umbi-umbian
Menghambat pertunasan
0.15
3
Udang beku dan paha
kodok beku
Menghilangkan bakteri
salmonella
7
4
Ikan kering
Memperpanjang masa
simpan
5
5
Biji-bijian
Menghilangkan serangga
dan bakteri patogen
5
Sumber: http://infonuklir.com
12
E. Uji In Vitro dan Kultur Sel
Kultur
sel
merupakan
teknik
yang
biasa
digunakan
untuk
mengembangbiakan sel di luar tubuh (in vitro). Kultur sel dapat digunakan
untuk mengevaluasi dampak yang ditimbulkan dari kondisi abnormal atau
dari keberadaan senyawa berbahaya pada sel. Untuk melakukan kultur sel
secara in vitro dibutuhkan kondisi pertumbuhan yang mirip dengan kondisi in
vivo seperti pengaturan temperatur, konsentrasi O2 dan CO2, pH, tekanan
osmosis, dan kandungan nutrisi. Saat ini kultur sel telah banyak digunakan
dalam laboratorium sitogenetik, biokimia, dan molekuler untuk melakukan
diagnostik dan penelitian. Dalam bidang ilmu pangan, kultur sel seringkali
digunakan untuk evaluasi fungsi dan keamanan bahan pangan secara in
vitro(Davis, 1994).
Beberapa kelemahan dari teknik kultur sel, yaitu kultur sel harus
dilakukan dalam kondisi steril, butuh keahlian dan ketrampilan khusus untuk
mengkultur, dan biaya relatif mahal. Keuntungan penggunaan kultur sel
adalah lingkungan tempat hidup sel dapat dikontrol, seperti pH, tekanan
osmosis, tekanan CO2 dan O2, sehingga kondisi fisiologis dari kultur relatif
konstan (Malole, 1990).
Menurut Malole (1990), faktor yang mendukung pertumbuhan sel
dalam kultur adalah media pertumbuhan. Fungsi media kultur sel adalah
mempertahankan pH, menyediakan lingkungan yang baik dimana sel dapat
bertahan hidup, dan juga menyediakan sunbstansi-substansi yang tidak dapat
disintesis oleh sel itu sendiri. Nutrisi yang biasanya terkandung dalam plasma
adalah asam amino, vitamin, glukosa atau gula lain, garam, dan protein
tertentu.
Pemilihan media pertumbuhan didasarkan pada kandungan zat gizi
yang disesuaikan dengan jenis sel yang ditumbuhkan (Davis, 1994). Media
yang sering digunakan untuk mengkultur sel limfosit manusia adalah RPMI1640. RPMI dikembangkan oleh Roswell Park Memorial Institute. Selain
RPMI-1640, terdapat juga RPMI-1630 dan RPMI-1629 ( Davis, 1994 ).
Hal lain yang perlu diperhatikan dalam metode kultur sel adalah
konsentrasi sel yang akan dikulturkan. Limfosit tidak dapat bertahan hidup
13
dan tumbuh pada konsentrasi sel yang rendah (kurang dari 105 sel/ml).
Jumlah sel limfosit yang akan dikultur sebaiknya sekitar 1-4 x 106 sel/ml.
Saat dikulturkan, sel ditambahkan serum sebesar 10%. Serum merupakan
suplemen peningkat pertumbuhan yang efektif untuk semua jenis sel karena
kompleksitas dan banyak faktor pertumbuhan, perlindungan sel, dan faktor
nutrisi di dalamnya. Jenis serum yang biasa digunakan dalam kultur sel
adalah serum hewan. Fetal Bovine Serum telah digunakan sebagai suplemen
standar. Pada umumnya, serum ditambahkan dengan konsentrasi 5-20 %
(Walum et al., 1990).
Pada pembuatan medium untuk kultur sel, dilakukan penambahan
buffer dan antibiotik. Buffer ditambahkan dengan tujuan menjaga
keseimbangan pH agar tetap memiliki nilai 7.4. Menurut Freshney (1992),
pertumbuhan sel memerlukan pH 7.4. Bila pada proses pertumbuhan, pH
lingkungan sekitar lebih rendah dari 7, maka pertumbuhan sel akan
terhambat. Buffer yang biasa digunakan adalah NaHCO3. Penambahan
antibiotik pada medium bertujuan mencegah kontaminasi pada medium.
Faktor utama untuk memilih jenis antibiotik adalah tidak bersifat toksik,
memiliki spektrum antimikroba yang luas, ekonomis, dan kecenderungan
minimum untuk menginduksi pembentukan mikroba yang kebal.
Sel limfosit membutuhkan O2 untuk bertahan hidup. Kondisi rendah
O2 dapat mendorong proses proliferasi, tetapi pertumbuhan tidak berlangsung
lama dalam kondisi anaerob. Suhu kultur dipertahankan 370C dengan
konsentrasi CO2 5% dan O2 95% untuk menyamakan dengan kondisi di dalam
tubuh. Selain memberikan pengaruh langsung terhadap pertumbuhan sel,
temperatur juga mempengaruhi pH melalui peningkatan kelarutan CO2 dan
melalui perubahan ionisasi dan dari pH buffer (Freshney, 1994).
F. Eritrosit dan Hemolisis Eritrosit
Eritrosit atau sel darah merah merupakan komponen yang menyusun
darah sekitar 99%. Komponen lain penyusun darah adalah leukosit dan
platelet. Fungsi utama eritrosit adalah untuk membawa oksigen dari paru-paru
dan karbondioksida hasil metabolism sel. Eritrosit tersusun oleh hemoglobin
14
dalam jumlah besar. Hemoglobin dapat berikatan dengan oksigen sehingga
oksigen dapat didistribusikan ke seluruh sel. Konsentrasi rata-rata dari
hemoglobin di dalam darah adalah 14g/100ml darah pada wanita dan
16g/100ml darah pada pria dewasa (Vander et al., 2004).
Eritrosit atau sel darah merah adalah suatu sel yang berisi hemoglobin
dan membawa oksigen dari paru-paru ke seluruh tubuh. Sel ini berbentuk
lempeng bikonkaf yang meningkatkan area permukaan sel sehingga
memudahkan difusi oksigen dan karbondioksida. Bentuk ini dipertahankan
oleh suatu sitoskeleton yang terdiri atas berberapa protein. Diameter eritrosit
ini kira-kira 7.8 µm, dengan ketebalan 2.5 µm pada bagian paling tebal dan
kurang kebih 1 mikrometer pada bagian tengah. Volume rata-rata eritrosit
adalah 90 sampai 95 µm3 (Guyton dan Hall, 1997). Persentase jumlah eritrosit
di dalam volume darah dikenal dengan istilah hematocrit. Dalam keadaan
normal kadarnya sekitar 45% yang dapat diukur dengan teknik sentrifugasi
dengan mengendapkan eritrosit dan diukur volumenya (Vander et al., 2004).
Eritrosit merupakan sel yang sangat terdiferensiasi, berupa kantungkantung dikelilingi oleh membran plasma yang mengandung hemoglobin.
Sebesar 33% berat sel eritrosit manusia merupakan hemoglobin. Eritrosit yang
telah dewasa, selain tidak mengandung nukleus, ribosom, dan mitokondria,
juga telah kehilangan kemamupan untuk mensintesis protein dan metabolisme
aerobik. Selain itu eritrosit yang telah dewasa juga telah kehilangan
kemampuannya untuk mensintesis membran yang baru (Weiss et al., 1977).
Eritrosit yang tidak memiliki nukleus, membuat lebih banyak ruang
bagi hemoglobin. Selain itu, bentuknya yang bikonkaf meningkatkan rasio
volume permukaan dan sitoplasma. Karakteristik ini membuat difusi oksigen
lebih mudah pada eritrosit. Dengan menggunakan mikroskop elektron,
eritrosit dapat memiliki bermacam-macam bentuk, yaitu normal (disciocyte),
crenated, echinochyte, codocyte, oat, bulan sabit, helmet, pinched, pointed,
berlekuk, poikilocyte, dan sebagainya. Paruh hidup eritrosit sendiri adalah
sekitar 120 hari.
Fungsi utama eritosit adalah mengangkut hemoglobin dan seterusnya
oksigen dari paru-paru ke jaringan. Jika hemoglobin ini terbebas dalam plasma
15
manusia, kurang lebih 3 % bocor melalui membran kapiler masuk ke dalam
ruang jaringan atau membran glomerolus pada ginjal terus masuk ke dalam
saringan glomerolus setiap kali darah melewati kapiler. Oleh karena itu, agar
hemoglobin tetap berada dalam aliran darah, hemoglobin tersebut harus tetap
berada dalam eritrosit. Selain mengangkut hemoglobin, eritrosit juga
mempunyai fungsi lain. Eritrosit banyak sekali mengandung karbonik
anhidrase, yang mengkatalis reasksi antara karbondioksida dan air sehingga
meningkatkan kecepatan reaksi bolak-balik ini berberapa ribu kali lipat.
Kecepatan reaksi ini yang tinggi ini membuat air dalam darah dapat bereaksi
dengan banyak sekali karbon dioksida, dan dengan demikian mengangkutnya
dari jaringan menuju paru-paru dalam bentuk ion bikarbonat (HCO3-).
Hemoglobin yang terdapat dalam sel juga merupakan dapar asam basa (seperti
kebanyakan protein), sehingga eritrosit bertanggung jawab untuk sebagian
daya pendaparan sel darah (Guyton dan Hall, 1997).
Hemoglobin, pigmen merah yang membawa oksigen dalam eritrosit,
merupakan suatu protein yang mempunyai berat molekul 64.450 dan terdiri
dari empat subunit, di mana masing-masing sub unit mengandung satu bagian
heme yang berkonjugasi dengan suatu polipeptida. Heme adalah suatu derifat
porifirin yang mengandung Fe2+ yang dapat mengikat oksigen. Eritrosit
mengandung sekitar 270 juta molekul hemoglobin di mana tiap sel
mengandung tepat 29 pg hemoglobin dengan masing-masing membawa empat
kelompok heme. Dengan demikian, didapatkan sekitar 3x1013 sel darah merah
dan sekitar 900 g hemoglobin di dalam darah seorang laki-laki dewasa
(Ganong, 1990).
Eritrosit memiliki berberapa sistem membran yang dapat melindungi
dirinya dari kerusakan oksidatif dan hemolisis, antara lain superoksida
dismutase (SOD), glutation peroksidase, dan katalase. Juga terdapat asam
askorbat dan asam urat yang berfungsi sebagai penangkap radikal bebas larut
air (berada di plasma) dan tokoferol yang berfungsi sebagai penangkap radikal
bebas larut lemak yang terdapat di membran eritrosit (Zhu et al., 2002).
Hemolisis adalah pecahnya membran eritrosit, sehingga hemoglobin
bebas ke dalam medium sekelilingnya (plasma). Kerusakan membran eritrosit
16
dapat disebabkan oleh antara lain penambahan larutan hipotonis, hipertonis ke
dalam darah, penurunan tekanan permukaan membran eritrosit, zat/unsur
kimia tertentu, pemanasan dan pendinginan, rapuh karena ketuaan dalam
sirkulasi darah serta adanya radikal bebas yang berinteraksi dengan membran.
Membran eritrosit tersusun atas polisakarida dan protein spesifik yang berbeda
antara satu orang dengan orang lainnya.
Penggunaan eritrosit sebagai model pada penelitian sudah banyak
dilakukan, seperti yang dilakukan oleh Mrowczynska (2001) yang
menggunakan
eritrosit
sebagai
model
untuk
membandingkan
dan
menghubungkan aktivitas hemolitik terhadap sifat sitotoksik garam empedu,
Zhu et al. (2005) yang mengukur pengaruh flavonoid kakao terhadap
ketahanan membran eritrosit yang dioksidasi dengan AAPH, Suwalsky (2007)
yang mengukur sifat antioksidan tumbuhan Ugni molinae dan pengaruhnya
pada eritrosit manusia dalam menanggulangi stress oksidatif yang dipicu
dengan HClO, dan Karimi (2008) yang mengukur efek perlindungan eritrosit
oleh silimarin.
G. Limfosit dan Proliferasi Limfosit
Limfosit adalah sel darah putih (leukosit) yang mampu menghasilkan
respon imun spesifik terhadap berbagai jenis antigen yang berbeda. Limfosit
berukuran kecil, berbentuk bulat dengan diameter 7-15 µm, dan banyak
terdapat pada organ limfoid seperti limfa dan timus. Leukosit dibagi ke dalam
dua kelas, yaitu yang mengandung granula dalam sitoplasmanya (granulosit)
dan agranulosit yang tidak mengandung granula (Ganong, 1990). Limfosit
merupakan sel kunci dalam proses respon imun spesifik untuk mengenali
antigen melalui reseptor antigen dan mampu membedakannya dari komponen
tubuh (Kuby, 1992).
Terdapat tiga kelompok limfosit yang dibedakan berdasarkan
fungsinya, yaitu :
1. Limfosit B
Limfosit B merupakan sel yang berasal dari sel stem di dalam sumsum
tulang dan tumbuh menjadi sel plasma, yang menghasilkan antibodi.
17
Jumlah sel B limfosit adalah 25% dari total keseluruhan limfosit tubuh.
Limfosit B mampu menghasilkan berbagai jenis antibodi yang digunakan
untuk melawan antigen. Sel ini memiliki reseptor-reseptor pada
permukaannya untuk antigen tertentu.
2. Limfosit T
Sel ini terbentuk jika sel stem dari sumsum tulang pindah ke kelenjar timus
dan mengalami pembelahan dan dewasa di dalam kelenjar timus. Limfosit
T dewasa meninggalkan kelenjar timus dan masuk ke dalam pembuluh
getah bening dan berfungsi sebagai bagian dari sistem pengawasan
kekebalan. Sel T diproduksi oleh kelenjar timus, jumlahnya mencapai 70%
dari seluruh sel limfosit di dalam tubuh.
Di bawah mikroskop, morfologi Limfosit T dan B tidak dapat dibedakan.
Ada tiga bentuk sel T, yaitu sel Thelper ( Th), Tsupresor ( Ts ), dan T
cytotoksik
(Tc) (Baratawidjaja, 1991). Sel Thelper atau sel T penolong merupakan sel T
yang berperan dalam stimulasi sintesis antibodi dan aktivasi makrofag
dengan cara mengsekresikan molekul yang disebut sitokinin. Sel ini
bekerja bersama dengan aktivitas antibodi sel B. Sel Tsupresor berperan
menekan aktivitas sel T yang lain. Sel ini mempunyai aktivitas dapat
menurunkan produksi antibodi. Sel Tcytotoksik (Tc) memiliki kemampuan
untuk menghancurkan sel alogenik dan sel sasaran yang terinfeksi patogen
intraseluler (Baratawidjaja, 1991).
3.
Limfosit NK ( Natural Killer )
Limfosit ini memiliki ukuran yang agak lebih besar daripada limfosit T
dan B. Limfosit ini juga dikenal sebagai Large Granular Lymphocyte
(LGL) karena merupakan sel dengan sejumlah besar sitoplasma dengan
granula azurofilik (Kuby, 1992).
Sel ini dinamai sel pemusnah karena sel ini membunuh mikroba dan selsel kanker tertentu. Istilah alami digunakan karena mereka siap membunuh
sejumlah sel target segera setelah mereka terbentuk, tidak perlu melewati
pematangan dan proses belajar seperti pada limfosit T dan limfosit B
(Anonim, 2006)
18
Uji aktivitas sel limfosit dapat dilakukan secara in vitro dan
menggunakan indikator respon imun. Uji ketoksikan suatu senyawa dapat juga
dilakukan dengan menggunakan limfosit. Limfosit digunakan dalam uji
ketoksikan karena sel ini sangat rentan terhadap kerusakan yang diakibatkan
oleh senyawa atau benda asing. Proliferasi merupakan proses diferensiasi dan
pembelahan sel secara mitosis. Respon proliferasi sel limfosit yang diuji pada
sistem in vitro dapat digunakan untuk menggambarkan fungsi limfosit dan
status imun individu. Proliferasi merupakan fungsi biologis mendasar pada sel
limfosit, yaitu meliputi proses diferensiasi dan pembelahan sel. Aktivitas
proliferasi limfosit merupakan salah satu parameter yang dapat digunakan
untuk mengukur status imunitas karena proses proliferasi menunjukkan
kemampuan dasar dari system imun (Roit dan Delves, 2001).
Proliferasi sel limfosit dapat diinduksi oleh suatu senyawa yang
disebut mitogen. Tidak seperti immunogen yang hanya mengaktivasi reseptor
spesifik pembawa limfosit, aktivitas mitogen adalah tidak spesifik. Beberapa
mitogen hanya mampu menginduksi proliferasi sel limfosit B, sedangkan
beberapa yang lain hanya mampu menginduksi sel limfosit T, tetapi ada juga
sebagian kecil yang mampu menginduksi keduannya secara bersamaan.
Pengujian terhadap kemampuan fungsional limfosit dapat dilihat dari
kemampuan memberikan respon terhadap mitogen, kemampuan membentuk
immunoglobulin atau limfokin, dan kemampuan sitotoksisitas sel NK
(Tejasari et al., 2000).
Sejumlah mitogen yang umumnya digunakan adalah lektin. Lektin
memiliki afinitas terhadap gula pada permukaan sel limfosit. Beberapa contoh
mitogen yang berasal dari lektin adalah PHA (Phytohaemagglutinin ) dan
PWM (Pokeweed). Akan tetapi tidak semua mitogen merupakan lektin, ada
beberapa jenis senyawa yang biasa digunakan sebagai mitogen yaitu
Concanavalin A (Con A). Senyawa ini berasal dari ekstrak tanaman kacang
jack (Conavalin ensiformis). Mitogen ini menginduksi proliferasi sel limfosit
T. Senyawa lain yang berperan sebagai mitogen adalah pokeweed (PWM),
senyawa ini diekstrak dari tanaman pokeweed (Phytolacca americana).
Mitogen pokeweed dapat menginduksi proliferasi sel limfosit T dan B secara
19
bersama-sama. PWM mampu berikatan dengan di-N-asetyl kitobiose dan
mampu menginduksi sel B dan sel T (Kuby, 1992).
Pengamatan jumlah sel yang mati dan tingkat proliferasi sel limfosit
yang telah ditambahkan mitogen dapat diamati menggunakan pewarna MTT
(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium
bromide)
atau
terazole. Prinsip dari metode ini adalah konversi dari garam tetrazolium
(MTT) yang berwarna kuning menjadi senyawa formazan yang berwarna biru
oleh aktivitas enzim suksinat dehidrogenase oleh mitokondria sel hidup
(Kubota et al., 2003). Senyawa yang terbentuk kemudian dihitung
absorbansinya
menggunakan
microplate
reader.
Enzim
suksinat
dehidrogenase merupakan enzim yang disintesis hanya pada sel hidup.
Jumlah formazan yang dihasilkan proporsional dengan jumlah sel limfosit
yang hidup sehingga dengan metode pewarnaan MTT dapat diketahui jumlah
sel limfosit hidupnya. Metode MTT ini menggunakan enzim atau substrat
yang spesifik (Davis, 1994).
H. Antioksidan
Kochhar dan Rossel (1990) mendefinisikan antioksidan sebagai
senyawa berberat molekul rendah yang bereaksi dengan oksidan sehingga
tidak menimbulkan reaksi yang membahayakan. Antioksidan bersifat dapat
menunda, memperlambat, dan mencegah proses oksidasi sehingga antioksidan
memiliki peranan yang sangat penting dalam memerangi radikal bebas.
Tubuh memiliki beberapa mekanisme untuk meminimalisasi kerusakan
akibat radikal bebas sekaligus memperbaiki kerusakan yang ditimbulkannya.
Enzim antioksidan yang dihasilkan tubuh contohnya glutation peroksidase,
glutation reduktase, katalase, dan superoksida dismutase. Antioksidan kimiawi
menetralkan radikal bebas dengan menerima atau menyumbangkan elektron
untuk mengeliminasi elektron tak berpasangan (Muchtadi, 2000).
Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan dibagi menjadi dua,
yaitu antioksidan primer dan antioksidan sekunder. Antioksidan primer
merupakan zat yang dapat menghentikan reaksi radikal bebas melalui
mekanisme penangkapan radikal bebas sehingga dapat menghambat tahap
20
inisiasi serta memutus tahap propagasi. Antioksidan sekunder atau antioksidan
preventif berfungsi untuk menekan atau menghambat pembentukan radikal
bebas dengan cara mengkelat metal dalam cairan ekstraselular dan
mendegradasi radikal dalam cairan intraselular oleh berbagai jenis enzim
(Muchtadi, 2000).
Antioksidan yang terdapat pada pepes berasal dari komponen bioaktif
bumbu atau rempah-rempah yang ditambahkan ke dalam pepes. Bumbu atau
rempah-rempah yang ditambahkan ke dalam pepes diantaranya adalah bawang
putih, kunyit, lemon, dan jahe. Komponen bioaktif bawang putih diantaranya
adalah alisin atau asam diallil tiosulfinat (Whitmore dan Naidu, 2000).
Komponen bioaktif yang terdapat pada kunyit diantaranya adalah kurkumin.
Kurkumin merupakan senyawa fenolik sehingga dapat berfungsi sebagai
antioksidan. Lemon mengandung vitamin C yang dapat berfungsi sebagai
antioksidan. Jahe merupakan rempah-rempah yang mengandung antioksidan
tinggi. Kikuzaki dan Nakatani (2000) juga meyakini dalam jahe terkandung
sejumlah senyawa fenolik yang bersifat antioksidan.
21