26 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian

BAB III
METODE PENELITIAN
A.
Jenis Penelitian
Penelitian ini bersifat eksperimen. Menurut Nazir (1999),
penelitian eksperimental adalah penelitian yang dilakukan dengan
mengadakan manipulasi terhadap objek penelitian serta adanya kontrol.
B.
Desain Penelitian
Desain penelitian yang digunakan pada Uji Antagonisme adalah
Rancangan Acak Lengkap (RAL), karena dilakukan di Laboratorium
dengan kondisi yang relatif homogen. Jumlah perlakuan yang digunakan
adalah 2 perlakuan dengan menggunakan variasi isolat yang berbeda
dengan 1 kontrol. Adapun isolat
Pseudomonas spp. yang digunakan
dalam penelitian ini sebanyak 2 isolat, satu isolat berasal dari isolasi
rizosfer bawang daun dan diberi nama Isolat B1 serta isolat yang berasal
dari kultur murni yang sudah tersedia di Laboratorium Balitsa dan diberi
nama Isolat G1.
Banyaknya
pengulangan
untuk
setiap
perlakuan
diperoleh
berdasarkan rumus pengulangan Gomez dan Gomez (1995), dengan rumus
T ( r-1 ) ≥ 20, dimana T adalah perlakuan atau treatment dan r adalah
banyaknya replikasi (pengulangan).
26
27
T(r -1) ≥ 20
3(r-1) ≥ 20
3r –3 ≥ 20
3r
≥ 23
r ≥ 7.6
r~8
Berdasarkan perhitungan di atas, setelah nilai akhirnya dibulatkan
maka banyaknya pengulangan yang harus dilakukan paling sedikit
delapan kali. Oleh sebab itu, dalam penelitian ini dilakukan pengulangan
sebanyak delapan kali. Pada penelitian ini terdapat dua variabel yaitu
variasi isolat bakteri sebagai variabel bebas dan pertumbuhan diameter
jamur yang ditumbuhkan pada medium PDA yang telah diinokulasikan
dengan suspensi bakteri sebagai variabel terikat.
C. Populasi dan Sampel
1. Populasi yang digunakan dalam penelitian adalah jamur Fusarium sp.
yang ditumbuhkan dalam medium PDA pada cawan Petri.
2. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari isolasi
biakan jamur Fusarium sp. yang akan diberi perlakuan dengan variasi
isolat bakteri Pseudomonas spp.
28
D. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Desember 2007 sampai
bulan Juni 2008 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan
Pendidikan Biologi UPI, Jl. Setiabudhi no. 229 – Bandung.
E. Alat dan Bahan Penelitian
Peralatan
yang digunakan
pada penelitiaan
ini
terdapat
di
Laboratorium Mikrobiologi Universitas Pendidikan Indonesia. Alat-alat
yang digunakan selama penelitian ini terdapat pada Tabel 3.1, sedangkan
daftar bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini terdapat pada
Tabel 3.2.
Tabel 3.1. Daftar alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian
Nama Alat
Jumlah
Spesifikasi
1.
Mikroskop binokuler
1 buah
2.
Hot plate and Magnetic stirrer
1 buah
Merk Shimadzu S12 –
D180 F
Merk EYELA, RSCH - 3
3.
1 buah
UVP Upland, CA.
4.
High Performance UV
Transilluminator
Autoclave
1 buah
5.
Vorteks
1 buah
Merk Hirayama Mode
HC36At
Merk SIBATA
6.
Waterbath shaker
1 buah
7.
Timbangan Analitik
1 buah
8.
Spectrophotometer
1 buah
9.
Transfer box
1 buah
Milton Roy Spectronic
20D
PT 25.221.03.019BM
10.
Penggaris
1 buah
Milimeter (mm)
11.
Cawan Petri
30 buah
Pyrex;
No.
UNI Thermoshaker NTS1300
Merk AND, HF 300
= 9 cm
29
12.
Lup inokulasi
1 buah
P = 22,5 cm; = 5 mm
13.
Tabung reaksi
50 buah
Pyrex
14.
Rak tabung
3 buah
-
15.
Gelas ukur 10 mL
1 buah
Pyrex
16.
Gelas ukur 50 mL
1 buah
Pyrex
17.
Gelas kimia 500 mL
1 buah
Pyrex
18.
Makropipet 1 ml
30 buah
Merk SIBATA
19.
Lemari pendingin
1 buah
PT25.221.03.021.BM
20.
Batang pengaduk
2 buah
P = 29,5 cm
21.
Spatula
2 buah
Logam
22.
Pelubang gabus
1 buah
23.
Botol sampel
4 buah
= 6 mm
Volume 100 ml
Tabel 3.2 Daftar bahan-bahan penelitian
No.
Nama Bahan
Jumlah
1.
Alkohol 70 %
1 liter
2.
Akuades
5 liter
3.
Medium King’s B
4.
Kristal violet
3 ml
5.
Lugol
3 ml
6.
Safranin O
3 ml
7.
Gelatin
5 gram
8.
Pati
5 gram
9.
H2O2
1 ml
10.
Nutrien Agar (NA)
11.
Kultur jamur Fusarium sp.
12.
Kultur bakteri Pseudomonas spp.
8 tabung
13.
Medium PDA (Potato Dextrose Agar)
39 gram
10 gram
10 gram
1 cawan Petri
30
14.
Medium PDB (Potato Dextrose Broth)
250 ml
F. Prosedur Penelitian
1. Persiapan Penelitian
Persiapan awal penelitian ini meliputi penyediaan kultur murni
bakteri Pseudomonas spp. dan kultur murni jamur Fusarium sp.
dari Balitsa, Lembang, Bandung. Penyediaan alat-alat yang
dibutuhkan penelitian, pembuatan berbagai jenis medium yang
dibutuhkan dalam penelitian (medium PDA, PDB, King’s B, NA,
kaldu laktosa, kaldu sukrosa, kaldu dekstrosa, medium pati, medium
gelatin,medium lipid). Pembuatan larutan zat warna dan reagen
(larutan zat warna lugol, safranin O, crystal violet, reagen uji
katalase dan reagen uji oksidase). Subkultur jamur Fusarium sp.
pada medium PDA dan subkultur beberapa isolat bakteri murni dari
Balitsa pada medium NA miring.
2. Isolasi Bakteri
Salah satu isolat
yang akan digunakan dalam penelitian ini
berasal dari tanah di sekitar akar (rizosfer) tanaman bawang daun.
Pengisolasian mikroba diutamakan untuk memperoleh bakteri
Pseudomonas spp. yang berpendar jika ditanam pada medium
Kings’B. Isolasi mikroba ini dilakukan dengan teknik pengenceran
dan menanam langsung sampel pada medium (Machmud et al.,
2003). Untuk isolasi dengan teknik pengenceran diambil sebanyak 1
31
gram tanah di sekitar tanaman bawang daun dimasukkan ke dalam
botol yang berisi akuades steril dan divorteks selama satu menit,
sehingga membentuk suspensi bakteri. Kemudian diencerkan dari
10-1 sampai 10-6, serta diambil 1 ml suspensi bakteri untuk di
tuangkan pada medium Kings’B. Bakteri diinkubasi pada suhu ruang
selama 1-2 x 24 jam dan dari koloni yang berpendar ketika disinari
di bawah UV dibuat kultur murninya.
3. Penapisan Bakteri
Metode yang digunakan untuk menguji kemampuan isolatisolat bakteri dalam menghambat pertumbuhan jamur secara in vitro
adalah uji biakan ganda, dimana semua isolat bakteri diuji
kemampuan antagonistiknya dalam menghambat pertumbuhan
jamur pada medium PDA (Johnson & Curl, 1972). Uji biakan ganda
pada penelitian ini meliputi uji penapisan dan uji antagonisme.
Untuk uji penapisan, metode uji biakan ganda didasarkan pada
penelitian yang dilakukan oleh Maria dan Widodo (2004). Potongan
medium PDA berdiameter 6 mm yang telah ditumbuhi jamur
Fusarium sp. umur 7 hari diletakkan di tengah - tengah cawan Petri
dan diinkubasi selama dua hari pada suhu kamar. Selanjutnya pada
empat sisi yang berlawanan dengan koloni jamur digoreskan koloni
bakteri dari contoh isolat yang berbeda dengan jarak 2 cm dari tepi
32
koloni jamur. Perkembangan jamur diamati dengan melihat ada
tidaknya zona bening selama dua minggu.
Daya hambat isolat bakteri yang diuji dikelompokkan
berdasarkan pada tidak menunjukkan kemampuan antibiosis yang
ditandai dengan simbol negatif (-). Kemampuan antibiosis rendah
yang ditandai dengan adanya zona bening diantara koloni bakteri dan
jamur Fusarium sampai satu minggu, kemudian koloni jamur
Fusarium mampu melewati koloni bakteri yang ditandai dengan
simbol positif satu (+) dan kemampuan antibiosis tinggi yang
ditandai dengan adanya zona bening di antara koloni bakteri dan
Fusarium, koloni jamur Fusarium tidak mampu melewati koloni
bakteri sampai dua minggu yang ditandai dengan simbol positif dua
(++). Gambar 3.1 menunjukkan uji penapisan yang dilakukan.
Isolat B3
Gambar 3.1 Isolat B3 dengan kriteria ++ pada inkubasi dua minggu
Pada uji selanjutnya, bakteri yang mempunyai kemampuan
untuk menghambat jamur dengan kriteria ++ , diuji kembali untuk
menghitung persentase daya hambat dan lebar zona beningnya.
Potongan medium PDA berdiameter 6 mm yang telah ditumbuhi
33
jamur Fusarium sp. diletakkan pada cawan Petri yang berisi medium
PDA dengan jarak 3 cm dari pinggir cawan yang berdiameter 9 cm
dan diinkubasi selama dua hari pada suhu kamar, selanjutnya satu
isolat bakteri digoreskan pada sisi yang berlawanan dengan jarak 3
cm dari pinggir cawan, lalu diinkubasikan pada suhu kamar. Sebagai
kontrol, ditumbuhkan hanya jamur tanpa bakteri. Setelah salah satu
sisi koloni jamur pada kontrol ke arah 3 cm telah mencapai pinggir
cawan (± 7 hari), dilakukan pengukuran zona bening antara koloni
jamur dan bakteri. Hasil uji lanjut ini dapat dilihat pada gambar 3.2
berikut :
Kontrol
Isolat B2
Gambar 3.2 Uji lanjut Isolat B2 umur 7 hari
Persentase penghambatan tertinggi, baik dari isolat bakteri
koleksi Balitsa maupun hasil isolasi sendiri akan digunakan dalam
uji antagonisme selanjutnya. Isolat terpilih bakteri hasil isolasi
sendiri yang diuji antagonisme selanjutnya akan diidentifikasi.
4. Identifikasi Bakteri
34
Metode yang digunakan untuk mengetahui karakteristik dari
bakteri yang akan diuji yaitu metode yang dikemukakan oleh
Cappucino dan
Sherman (1983). Uji-uji yang dilakukan adalah
sebagai berikut :
a. Pewarnaan Gram
Membuat sediaan mikroskopik untuk biakan bakteri yang akan
diwarnai. Sediaan bakteri tersebut ditetesi dengan crystal violet,
diamkan selama 3 menit. Zat warna yang berlebihan dibuang
dengan menggunakan akuades yang mengalir. Sediaan bakteri
tersebut diteteskan dengan larutan lugol, diamkan selama 45-60
detik. Kemudian sediaan bakteri dimasukkan ke dalam staining jar
yang berisi alkohol 96 %, lalu digoyang-goyangkan selama 1
menit. Sediaan bakteri dibilas dengan menggunakan akuades yang
mengalir kemudian dikeringkan dengan menggunakan kertas isap.
Setelah itu, sediaan diteteskan larutan Safranin O, diamkan selama
3 menit, lalu dibilas dengan akuades dan dikeringkan, biakan
diamati di bawah mikroskop.
b. Uji Hidrolisis Pati
Menginokulasikan
bakteri
pada
medium
pati,
kemudian
diinkubasikan pada suhu 22-28 oC selama 24 jam. Setelah terlihat
adanya pertumbuhan, larutan Lugol dituangkan dan biarkan
beberapa menit, perubahan warna yang terjadi diamati. Uji positif
35
ditandai dengan tampaknya area jernih di sekitar pertumbuhan
bakteri yang diinokulasikan.
c. Hidrolisis Lipid
Menginokulasikan
bakteri
pada
diinkubasikan pada suhu 22-28
medium
lipid,
kemudian
o
C selama 24 jam, amati
perubahan warna koloni bakteri. Uji positif ditandai dengan warna
medium di sekitar koloni bakteri yang berwarna merah.
d. Uji Hidrolisis Gelatin
Menginokulasikan bakteri pada medium gelatin, kemudian
diinkubasikan pada suhu 22-28 oC selama 24 jam, simpan di
inkubator suhu 4 0C selama 30 menit, cair tidaknya medium
diamati. Uji positif ditandai dengan cairnya medium gelatin
setelah diinokulasikan bakteri.
e. Uji Produksi Katalase
Bakteri diinokulasikan pada medium NA miring. Kemudian
diinkubasikan pada suhu 28 oC selama 24 jam, di atas permukaan
kultur diteteskan 3 tetes H2O2 3%, uji positif ditandai oleh
terbentuknya gelembung udara di atas permukaan kultur.
f. Uji Produksi Oksidase
Bakteri diinokulasikan pada medium NA miring. Kemudian
diinkubasikan pada suhu 28 oC selama 24 jam, setelah itu
digenangi dengan reagen uji oksidase, uji positif ditandai dengan
36
berubahnya koloni bakteri menjadi merah muda, lalu merah tua,
merah gelap dan akhirnya hitam.
g.
Uji Fermentasi Karbohidrat
Bakteri diinokulasikan pada medium :
a. Kaldu laktosa 10 ml bersama tabung Durham yang terbalik
b. Kaldu
dekstrosa 10 ml bersama tabung Durham yang
terbalik
c. Kaldu sukrosa 10 ml bersama tabung Durham yang terbalik
Masing-masing medium
yang telah diinokulasi bakteri
diinkubasikan selama 24 jam. Uji positif ditandai dengan
berubahnya warna media menjadi kuning serta diikuti oleh
terbentuknya gas yang dapat diamati pada tabung Durham.
5. Pembuatan Kurva Tumbuh dan Kurva Baku Bakteri
Pseudomonas spp. Isolat B1 dan Isolat G1
Metode yang digunakan untuk membuat kurva tumbuh
adalah metode Turbidimetri (Cappucino dan Sherman, 1983), dengan
cara melihat kekeruhan bakteri (Optical Density / OD), dengan
menggunakan alat Spectrofotometer.
Sebelum melakukan pengukuran terhadap kekeruhan bakteri
bakteri, diperlukan pengaktifan kultur terlebih dahulu. Aktivasi
dilakukan secara bertahap dengan menggunakan medium PDB.
37
Masing-masing isolat bakteri diinokulasikan sebanyak satu ose ke
dalam 10 ml medium PDB dan dikocok pada kecepatan 120 rpm
selama 24 jam pada suhu 28 0C dengan menggunakan Waterbath
shaker.
Kultur cair pada masing-masing isolat bakteri yang
digunakan untuk membuat kurva tumbuh adalah kultur hasil aktivasi
pada 10 ml medium PDB yang telah dikocok selama 24 jam,
kemudian dimasukkan ke dalam 90 ml medium PDB, dikocok pada
kecepatan 120 rpm pada suhu 28 0C. Setiap interval waktu 2 jam
diambil sampel kultur sebanyak 5 ml untuk mengetahui harga OD
masing-masing isolat bakteri yang terlarut dalam medium biakan,
kemudian dimasukkan ke dalam kuvet. Kekeruhan bakteri pada kuvet
diukur
dengan
menggunakan
Spectrofotometer
pada
panjang
gelombang 620 nm. Kurva tumbuh dapat dibuat berdasarkan hasil
korelasi antara harga OD (sumbu Y) terhadap selang waktu tertentu
(sumbu X).
Kurva baku dibuat berdasarkan waktu logaritmik bakteri
yang dapat diketahui dari kurva tumbuh. Masing-masing isolat bakteri
diaktivasi terlebih dahulu dengan cara menginokulasikan satu ose
biakan bakteri ke dalam 10 ml medium PDB dan dikocok pada
kecepatan 120 rpm selama 24 jam pada suhu 28
0
C dengan
menggunakan Waterbath shaker. Setelah 24 jam, sampel kultur 10 ml
dimasukkan ke dalam 90 ml medium PDB, dikocok kembali pada
38
kecepatan 120 rpm selama waktu yang diperlukan bakteri untuk
mencapai fase log, kemudian ditentukan batas waktu yang akan
ditentukan harga OD-nya. Berdasarkan kurva tumbuh masing-masing
isolat bakteri, batas waktu yang ditentukan harga OD-nya adalah
sebagai berikut :
a. Untuk bakteri isolat B1 , batas waktu yang digunakan untuk
menentukan harga OD-nya yaitu pada jam ke-2, jam ke-4 dan
jam ke-6.
b. Untuk bakteri isolat G1 , batas waktu yang digunakan untuk
menentukan harga OD-nya yaitu pada jam ke-6, jam ke-8 dan
jam ke-10.
Pada jam-jam tersebut di atas, diambil sebanyak 5 ml kultur
ke dalam kuvet untuk diukur absorbansinya dengan menggunakan alat
Spectrofotometer. Pada waktu yang sama, kultur diambil juga
sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9
ml akuades steril untuk pengenceran 10-1, begitu seterusnya sampai
pengenceran 10-10, dilakukan secara berurutan. Pada pengenceran 10-8,
10-9 dan 10-10, diambil 1 ml untuk ditumbuhkan pada medium PDA
dengan menggunakan metode cawan tuang. Biakan diinkubasi selama
24 jam pada suhu kamar, kemudian koloni bakteri yang tumbuh
dihitung dengan menggunakan alat Colony counter. Dengan diketahui
jumlah bakteri dan harga OD-nya maka dapat dibuat kurva baku.
39
Kurva
baku
merupakan
hasil
regresi
linier
yang
menghubungkan antara kerapatan optik (optical density) suspensi
bakteri sebagai sumbu X dengan hasil perhitungan jumlah koloni
bakteri yang tumbuh pada medium PDA sebagai sumbu Y.
6. Membuat Suspensi Bakteri Pseudomonas spp. Isolat B1 dan
Isolat G1 sebagai Sumber Inokulum
Konsentrasi suspensi bakteri sebagai sumber inokulum yang
akan digunakan untuk perlakuan adalah 1011cfu/ml. Konsentrasi ini
diperoleh dari perhitungan persamaan regresi linear pada kurva baku,
dengan memasukan harga OD pada persamaan linear tersebut, maka
akan diperoleh konsentrasi yang diperlukan. Masing-masing isolat
bakteri diinokulasi berdasarkan kurva tumbuh, yaitu pada fase
stasioner. Pengambilan pada fase ini dikarenakan pengeluaran
antibiotik sebagai metabolit sekunder bakteri biasanya dieksresikan
pada
fase
stasioner.
Suspensi
bakteri
dibuat
dengan
cara
menginokulasikan satu ose koloni bakteri pada 10 ml medium PDB,
dan dikocok pada kecepatan 120 rpm selama 24 jam pada suhu 28 0C
dengan menggunakan Waterbath shaker.
Setelah 24 jam, sampel kultur 10 ml dimasukkan ke dalam 90
ml medium PDB, dikocok kembali pada kecepatan 120 rpm selama
waktu yang diperlukan bakteri untuk mencapai fase stasioner,
40
tepatnya pada jam ke – 14. Penentuan waktu ini didasarkan pada
kurva baku dari kedua bakteri tersebut.
7. Uji Antagonisme
Metode uji biakan ganda pada uji antagonisme didasarkan
pada penelitian yang dilakukan oleh Yusriadi (2004) yang telah
dimodifikasi. Uji antagonisme bakteri Pseudomonas spp. dengan
jamur Fusarium sp. dilakukan dengan cara meletakkan biakan murni
jamur Fusarium sp. yang berumur 7 hari (Djatnika dan Nuryani,
1993) pada medium PDA dengan menggunakan pelubang gabus
berdiameter 6 milimeter dan diletakkan pada tengah-tengah
permukaan medium PDA pada cawan petri yang sebelumnya
diinokulasi suspensi bakteri, dengan konsentrasi inokulum sebesar
1011 cfu/ ml. Perlakuan ini diinkubasi selama 7 hari. Peubah yang
diamati adalah diameter pertumbuhan koloni jamur yang terbentuk
dengan menggunakan mistar.
G. Analisis Data
1. Penentuan Kurva Tumbuh dan Kurva Baku
Data yang diperoleh pada kurva tumbuh berupa harga OD bakteri
yang menunjukkan fase-fase pertumbuhan populasi bakteri. Fase – fase
pertumbuhan bakteri tersebut adalah fase lag, fase eksponensial, fase
stasioner dan fase kematian.
41
Hasil kurva tumbuh berupa grafik pertumbuhan hasil korelasi antara
harga OD (sumbu Y) pada selang waktu tertentu (sumbu X). Data ini
diolah dengan menggunakan software Microsoft Excel sehingga dapat
ditentukan fase-fase pertumbuhan bakteri, selain itu dapat diketahui
umur biakan pada saat mencapai fase stasioner untuk pembuatan
inokulum.
Pada penentuan kurva baku, data yang diperoleh berupa korelasi
antara harga OD sebagai variabel bebas (sumbu X) terhadap jumlah
bakteri yang dilogaritmakan sebagai variabel terikat (sumbu Y).
Hubungan kedua variabel ini dapat dimodelkan dalam persamaan
matematik, yaitu : y = bx + a. Dengan menggunakan software Microsoft
Excel dapat ditentukan persamaan regresinya.
2. Uji Daya Hambat pada Penapisan Bakteri
Data yang diperoleh berupa data kualitatif dapat menghambat
atau tidaknya dari semua isolat bakteri yang diujikan dan data
kuantitatif uji lanjut yang berupa persentase daya hambat yang
didasarkan pada rumus Fokkema dan van deur Meulen (1976, dalam
Maria dan Widodo, 2004), yaitu :
I = R1- R 2 X 100 %
R1
Keterangan :
I
= persentase hambatan
R1 = jari-jari koloni jamur Fusarium sp. pada kontrol
42
R2 = jari-jari koloni jamur Fusarium sp. yang berhadapan dengan
goresan bakteri
3. Analisis Data Uji Antagonisme
Data yang diperoleh berupa pertumbuhan diameter jamur
Fusarium sp. setelah diberi perlakuan suspensi bakteri yang berbeda
setelah diinkubasi selama 7 hari. Data yang diperoleh dianalisis
menggunakan analisis statistika dengan program
SPSS 12.0 for windows. Uji
software statistika
pertama yang dilakukan adalah uji
homogenitas varians dengan menggunakan uji Levene’s statistik,
kemudian dilanjutkan dengan uji normalitas Kolmogorov-Smirnov.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa data homogen dan berdistribusi
normal maka pengujian hipotesis dilanjutkan dengan menggunakan one
way ANOVA. Hasil uji one way ANOVA menjelaskan bahwa terdapat
perbedaan yang signifikan antara variasi isolat bakteri dengan diameter
pertumbuhan jamur Fusarium sp. Untuk membandingkan perbedaan
signifikan antara kelompok data yang satu dengan kelompok data yang
lainnya, maka uji lanjut yang digunakan adalah Uji Tukey.
43
H. Alur Penelitian
Persiapan penelitian :
1. Penyediaan kultur murni bakteri
2. Penyediaan kultur murni jamur
3. Pembuatan medium yang
diperlukan
4. Pembuatan larutan zat warna dan
reagen yang diperlukan
5. Subkultur jamur dan bakteri
Isolasi bakteri dari rizosfer
bawang daun
Uji penapisan bakteri
Pseudomonas spp.
Identifikasi bakteri
Pseudomonas spp.
Pembuatan kurva tumbuh
dan kurva baku bakteri
Pseudomonas spp.
Uji Antagonisme
Pseudomonas spp.
terhadap Fusarium sp.
pada cawan petri
44
..........
Lanjutan bagan
Uji Antagonisme
Pseudomonas spp.
terhadap Fusarium sp.
pada cawan petri
Pengamatan
Analisis Data
Penyusunan Laporan
Gambar 3.3 Bagan alur penelitian