PENGUJIAN AKTIVITAS TRANSGLIKOSILASI

11
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteri
fitopatogenik
Xanthomonas
campestris ialah suatu anggota bakteri aerobik
famili
Xanthomonadaceae,
penyebab
kebusukan tanaman cruciferous, seperti cabai,
brokoli, dan kubis (Gambar 1, Onsando 1992).
Ciri dan karakterisasi X. campestris ialah
jumlah flagella satu, tidak dapat mereduksi
NO3- menjadi NO2-, tidak mendekarbosilasi
lisin, membutuhkan metionin atau sistein
dalam pertumbuhannya, bentuk mukoid pada
media tumbuh agar-agar nutrien yang
mengandung 5% glukosa, menghidrolisis
gelatin dan pati, menghidrolisis eskulin dan
protein, menghasilkan H2S dari pepton,
terdapat aktivitas pektinase dalam kultur, suhu
maksimal pertumbuhan 35-39oC, toleran
terhadap salinitas 2,0 – 5,0 promil,
memproduksi asam serta patogen pada
tumbuhan
terutama
pada
kelompok
cruciferous (John et al. 1994). Bakteri X.
campestris menghasilkan berbagai enzim
ekstraseluler seperti amilase, endoglukanase,
poligalakturonate liase dan protease (Dow &
Daniels 1994) .
Gambar 1 Serangan X. campestris pada
bagian permukaan atas daun
kubis
(Sumber:
http://www.apsnet.org/publication
s/apsnetfeatures/Pages/PDDiagno
sis.aspx).
Bakteri ini pun dapat menghasilkan
polisakarida ekstraseluler yang dikenal
dengan gum xanthan, suatu biopolimer yang
dapat digunakan dalam pengolahan makanan.
Aplikasi gum xanthan
dalam industri
digunakan sebagai viscosifying, bahan
pengental, penstabil, dan agen suspensi
(Kennedy & Bradshaw 1984, Rosalam &
England 2006).
Gum xanthan ialah heteropolisakarida
larut air yang dihasilkan oleh bakteri Gram
negatif X. campestris (Borges et al. 2009).
Gum xanthan merupakan jenis biopolimer
yang memiliki prospek cerah baik di dalam
negeri maupun luar negeri karena memiliki
nilai komersial yang tinggi. Gum xanthan
digunakan sebagai suspending agent untuk
menghilangkan pulp, dan bahan-bahan yang
dapat membuat keruh dalam beberapa
minuman. Gum xanthan juga dipakai sebagai
penstabil untuk emulsi minyak dalam
beberapa minuman tertentu, makanan beku
dan digunakan dalam industri nonpangan
sebagai oil welldrilling
fluid additive
terutama
pada
industri
tekstil
dan
pertambangan. Harga komersial gum xanthan
sangat mahal karena diproduksi dengan bahan
dasar glukosa dan sukrosa (Yoo & Harcum
1999). Produksi tahunan gum xanthan dunia
diperkirakan 25000 ton (Galindo 1994).
Gum xanthan berwujud butiran saat
kering dan mampu meningkatkan viskositas
air dengan konsentrasi hanya 0,01%. Gum
xanthan memiliki berat molekul bervariasi
antara 2000 – 62000 kDa. Lebarnya selang
ini disebabkan oleh pengaruh ikatan hidrogen
yang menstabilkan agregat-agregat polimer
dalam air. Satu monomer gum xanthan
mengandung 5 satuan yang terdiri atas 2
satuan glukosa, 2 satuan manosa, dan 1
satuan asam glukoronat (Kennedy &
Bradshaw 1984).
Proses pembentukan gum xanthan sangat
rumit dan belum banyak diketahui.
Mekanisme
pembentukannya
secara
sederhana
melalui
reaksi
enzimatik
transglikosida.
Enzim siklodekstrin glukanotransferase
(1,4-α-D-1,4-glukano-transferase,
EC
2.4.1.19) disingkat menjadi CGTase ialah
enzim yang mengkatalisis sintesis pati
menjadi reaksi siklisasi. Enzim ini tergolong
enzim transferase yang berperan dalam
pemindahan gugus glikosidik pada reaksi
siklisasi dekstrin menjadi siklodekstrin
(Kometani et al. 1994, Mori et al. 1994).
CGTase merupakan enzim multifungsi
yang berperan dalam proses siklisasi, yaitu
mengubah pati dan α-1,4 glukan menjadi
siklodekstrin melalui reaksi transglikosilasi
intramolekuler. Enzim ini juga mampu
mengkatalisis reaksi penggabungan yaitu
membuka
cincin
siklodekstrin
dan
mentransfer maltooligosakarida linear melalui
reaksi transglikosilasi intermolekuler pada
akseptor. CGTase tidak hanya mengkatalisis
secara intramolekuler yang mengubah pati
menjadi siklodekstrin dan intermolekuler yang
mentransfer gugus glukosil ke akseptor yang
sesuai, tetapi dapat juga menghidrolisis pati
dan siklodekstrin menjadi senyawa yang lebih
sederhana
(Kometani
et
al.
1996).
Siklodekstrin glukanotransferase (CGTase)
dihasilkan oleh berbagai macam bakteri
seperti Bacillus macerans, B. megaterium, B.
2
circulans,
B. cereus (Tankova 1998), dan
diduga juga terdapat pada X. campestris. Oleh
karena itu, dalam penelitian awal, biakan X.
campestris ditumbuhkan pada media dan
dilakukan pengujian untuk mengetahui
kemampuan biakan X. campestris dalam
menghasilkan enzim CGTase.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
kemampuan biakan X. campestris dalam
mensintesis produk transfer secara reaksi
transglikosilasi menggunakan enzim CGTase
pada berbagai sumber karbohidrat.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai
bulan April 2010 sampai bulan November
2010
di
Laboratorium
Bioprospeksi,
Mikrobiologi LIPI Cibinong.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan
yaitu X.
campestris FNCC 0089 yang merupakan
koleksi Mikrobiologi Cibinong Science
Center (CSC) LIPI-Bogor.
kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8030
g
selama 15 menit pada suhu 4 oC.
Selanjutnya supernatannya digunakan sebagai
sumber enzim CGTase kasar (Sulistyo et al.
2002).
Uji Aktivitas Hidrolitik, Optimasi pH dan
suhu CGTase
Penentuan kondisi optimum aktivitas
enzim CGTase dilakukan pada berbagai pH
dan suhu. Campuran reaksi terdiri atas 100 µl
larutan enzim CGTase kasar dan 450 µl bufer
Na-fosfat 50mM yang mengandung 0,5 % pati
dapat larut (soluble starch) diinkubasi pada
suhu 45oC selama 10 menit. Reaksi dihentikan
dengan penambahan HCl 0,5N sebanyak 1 ml.
Campuran reaksi kemudian direaksikan
dengan pewarna iodin 2,5 ml (KI 0,05% yang
mengandung I2 0,005%). Serapan warna
diukur dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 660 nm. Satu unit aktivitas enzim
dinyatakan sebagai jumlah enzim yang dapat
menurunkan unit serapan sebanyak 0,5 pada
panjang gelombang (λ) 660 nm (Sulistyo et al.
2002). Selanjutnya dilakukan pengukuran
berseri selama lima hari tiap 24 jam.
Media Kultur X. campestris. Bahanbahan media standar (NH)2SO4 3 g, MgSO4
0,5 g, CaSO4 0,1 g, MnSO4 0,01 g, FeSO4 0,1
g, malt ekstrak 3 g, pepton 0,5 g dilarutkan
dalam takaran 1 L bufer Na-fosfat 0,05 mM
pH 7 dan glukosa 1 % sebagai substrat.
Media standar yang sudah dilarutkan
kemudian dituang
ke dalam 5 tabung
erlenmeyer ukuran 500 ml masing-masing
100 ml dan ditambah masing-masing satu
jenis substrat pati dari mulai singkong,
kentang, ubi, jagung dan beras masing-masing
2 %, kemudian disterilisasi menggunakan
autoklaf suhu 121oC tekanan 1 atm.
Uji Kepekatan Karbohidrat
Uji karbohidrat ditentukan dengan
menggunakan kaidah asam sulfat-fenol
(Dubois et al. 1956). Sebanyak 0,5 ml fenol
5% ditambah 2,5 ml H2SO4 pekat, kemudian
ditambahkan 0,5 ml sampel yang telah
diencerkan 10 kali dengan akuades. Campuran
reaksi dibiarkan selama 20 menit pada suhu
ruang.
Selanjutnya
ditentukan
nilai
absorbansinya pada panjang gelombang 490
nm. Kepekatan karbohidrat ditentukan melalui
kurva standar pati dapat larut (Lampiran 1).
Kurva standar karbohidrat dibuat dengan cara
mengukur absorbansi kandungan karbohidrat
yang diketahui konsentrasinya. Konsentrasi
standar dibuat dengan melarutkan pati dapat
larut dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50
µg dilarutkan masing-masing ke dalam
akuades hingga volume larutan mencapai 5
ml. Larutan kemudian direaksikan dengan 0,5
ml fenol dan 2,5 ml H2SO4 pekat. Kemudian
campuran reaksinya diukur absorbansinya
pada panjang gelombang 490 nm mulai dari
konsentrasi terkecil hingga konsentrasi
terbesar.
Produksi Enzim CGTase
Media produksi enzim CGTase yang telah
ditambah kultur X. campestris diinkubasi
selama 72-120 jam di dalam inkubator goyang
dengan kecepatan 240 rpm, suhu 37 oC
Uji Aktivitas Transglikosilasi
Campuran reaksi sebanyak 2 ml, yang
terdiri atas 1,5 ml bufer Na-fosfat 0,05 M pH
7 yang mengandung 5% pati dapat larut dan
resorsinol 2% serta 0,5 ml enzim CGTase
Metode
Pembuatan Media
Media Lauria Broth agar (LA). Bahanbahan seperti ekstrak khamir 5 g, tripton 10 g,
NaCl 5 g, dan agar-agar 15 g dilarutkan dalam
takaran 1 L akuades kemudian disterilisasi
pada suhu 121 oC tekanan 1 atm.