teknik isolasi kuman mikoplasma gallisepticum pada ayam

Lokakarya Fungsiona/ Non Peneli6 1997
TEKNIK ISOLASI KUMAN MIKOPLASMA
GALLISEPTICUM PADA AYAM
Zulqoyah Layla
Balai Penelitian Veteriner, Jalan R .E . Martadinata 30, Bogor 11614
PENDAHULUAN
Mycoplasma gallisepticum (MG) adalah kuman yang menyebabkan
terjadinya penyakit pernafasan menahun (PPM) pada ayam atau dikenal
dengan penyakit chronic respiratory disease (CRD) . Masa inkubasi penyakit
berkisar antara 7 - 21 hari . PPM pada ayam dapat menyebabkan kematian
yang tinggi apabila diikuti dengan infeksi sekunder, khususnya bakteri
Escherichia coli, tetapi jika tidak diikuti dengan infeksi sekunder tingkat
kematiannya rendah (Jordan, 1979 ; Yoder, 1991) . Pada kondisi kompleks
umumnya isolasi kuman MG sangat sulit dilakukan . Diagnosa yang termudah
dapat dilakukan dengan serologi untuk mengetahui antibodi MG .
Kuman MG pertama kali diisolasi oleh Nelson pada tahun 1935 dari
seekor ayam yang terkena infeksi saluran pernafasan . Selanjutnya Adler dan
(amamoto pada tahun 1956 menyatakan kombinasi Haemophilus gallinarum
dan MG dapat menghasilkan penyakit yang menyerang saluran pernafasan
dengan cepat dan bertahan untuk waktu yang lama .
Menurut Razin dan Freundt (1984), kuman MG merupakan prokaryotik
yang sangat kecil yang tidak memiliki dinding sel, tetapi selnya dikelilingi oleh
membran plasma yang tipis . Diameter sel bervariasi antara 300 - 500 nm dan
jika diberi pewarnaan gram akan menyerap warna gram negatif (Yoder, 1991) .
Untuk mengisolasi kuman MG diperlukan media spesifik yang memenuhi
syarat pertumbuhannya, yaitu media yang kaya akan protein dan kolesterol,
sedang untuk identifikasi kuman dapat dilakukan berbagai macam cara antara
lain dengan uji biokimia atau uji hambatan pertumbuhan dengan menggunakan antisera MG .
Pada tulisan ini akan diuraikan teknik isolasi kuman MG dari ayam dan
cara pengidentifikasiannya dengan menggunakan uji hambatan pertumbuhan .
BAHAN DAN METODE
Sampel
Sampel diperoleh dari ayam hidup yang diduga menderita PPM .
Caranya yaitu dengan menggunakan kapas lidi steril untuk mengambil
eksudat dari rongga hidung .
221
Lokakatya Fungsional Non Peneliti 1997
Antisera MG
Antisera yang dipergunakan yaitu antisera MG dari kelinci . Caranya
dengan menyuntikan antigen MG di bawah kulit pada beberapa tempat dan
dilakukan beberapa kali sampai titer antibodi MG yang diharapkan cukup
tinggi . Pembuatan antisera menggunakan isolat MG S6 yang diperoleh dari
Australia dan dilakukan di Balai Penelitian Veteriner .
Media
Media yang dipergunakan terdiri dari media padat dan cair . Formulanya
merupakan modifikasi dari Frey dkk . (1968) . Media cair dibuat dari campuran
Mycoplasma broth base (Difco), cystein HCI (BDH), thallous acetate (BDH),
merah phenol dan aquabides . Campuran media ini sebelum disterilkan, diatur
derajad keasamannya hingga mencapai pH 7,8 . Untuk media padat,
digunakan agar Nobel (Difco) tanpa penambahan glukosa dan merah phenol .
Selanjutnya baik media cair maupun padat diperkaya dengan larutan
penyubur yang sudah steril yaitu serum babi yang sudah diinaktifkan pada
suhu 56 ° C selama 30 menit, larutan ekstrak yeast (Difco) dan larutan DNA
(Koch Light) . Selain penyubur tersebut juga ditambahkan antibiotika
amoxycilin (Beecham P .I .) yang berfungsi untuk menghindari kontaminasi
bakteri . Pada media padat selain diberi antibiotika juga ditambahkan aktidion
(Up John) untuk menghindari kontaminasi jamur .
Media cair yang telah komplit campurannya kemudian didistribusikan
dalam botol Bijou's sebanyak 2 ml per botol, sedangkan media padat yang
telah komplit campurannya didistribusikan pada cawan petri dengan isi 20 ml
tiap petrinya . Media yang telah dibuat disimpan di dalam lemari pendingin
sampai saat diperlukan .
Peralatan
Alat yang dipergunakan adalah kapas lidi steril, dawai platina, penyaring
millipore, kapas, pembakar bunsen, kertas cakram steril yang telah diberi
"digitonin" 1,5% dan kertas cakram steril yang telah diberi antisera MG, tabung
yang kedap udara (dapat menggunakan bekas kaleng roti), lilin, mikroskop
"disekting ", pengocok, botol bijou's, cawan petri, kabinet ruang steril dan
inkubator dengan suhu 37 °C .
Cara Kerja
Sampel diambil dari rongga hidung ayam hidup yang dicurigai
menderita infeksi PPM dengan menggunakan kapas steril, kemudian dibiakkan dalam media cair dan diinkubasikan pada suhu 37 ° C . Setiap had diamati
perubahan wama yang terjadi . Media biakan yang berubah warna dari merah
menjadi merah kekuningan dan tidak keruh kemudian dibiakkan kembali pada
media padat dengan diteteskan atau dengan menggunakan dawai . Jika biakan
22 2
Lokakarya Fungsionai Non Pene66 1997
pada media cair berubah warna menjadi merah kekuningan tetapi keruh,
kemudian disaring dengan menggunakan penyaring "Millipore" dengan ukuran
300 nm . Setelah disaring kemudian sebanyak 0,2 ml dibiakkan kembali ke
dalam media cair dan media padat . Media cair diinkubasikan langsung dalam
inkubator dengan suhu 37° C, sedang biakan media padat dimasukkan ke
dalam kaleng roti yang diberi kapas berair dan nyala lilin . Setelah kaleng
ditutup rapat-rapat kemudian diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu
37 ° C selama 5 sampai 14 hari .
Pengamatan pertumbuhan koloni mikoplasma dapat dilakukan dengan
menggunakan mikroskop "disekting " . Bentuk koloni MG kecil dengan penampang kurang dad 1 mm, berbentuk bundar dengan bagian tengah juga bundar
berwarna lebih gelap yang disebut "bleb" berfungsi untuk perlekatan pada
media . Bentuk ini sangat spesifik yang dikenal seperti telur mata sapi . Koloni
ini terdiri dari ribuan sel mikoplasma, sehingga jika ingin dimurnikan diperlukan teknik kioning dengan cara mengambil satu koloni dengan menggunakan
pipet Pasteur . Koloni yang sudah diambil ini kemudian ditanam kembali pada
media cair, dikocok hingga merata denganmenggunakan pengocok kemudian
ditanam pada media padat . Untuk mendapat koloni yang murni diperlukan
sedikitnya 3 kali kioning .
Deteksi Kuman Mikoplasma
Untuk mengetahui apakah koloni yang dihasilkan mikoplasma atau
"acholeplasma" maka koloni mikoplasma yang tumbuh diambil kembali satu
koloni, kemudian dibiakan dalam media cair . Setelah tumbuh kemudian
diencerkan dalam media cair lalu dituangkan pada media padat . Biakan pada
media padat dibiarkan mengering di dalam kabinet ruang steril selama kurang
lebih 5 menit . Setelah 5 menit, kertas cakram yang berisi "digitonin" diletakkan
pada biakan media padat, kemudian dimasukkan di dalam kaleng roti lalu
diinkubasikan pada suhu 37 ° C selama 5 - 7 hari . Jika terjadi hambatan lebih
dari 5 mm maka koloni yang dibiakkan adalah kuman mikoplasma .
Uji Hambatan Pertumbuhan
Uji hambatan pertumbuhan dilakukan dengan cara seperti pada uji
deteksi kuman mikoplasma, bedanya pada pengujian ini kertas cakram yang
digunakan berisi antisera MG . Jika terjadi hambatan pertumbuhan Iebih dari 2
mm, maka koloni yang ditumbuhkan adalah kuman MG .
HAS IL DAN PEMBAHASAN
Isolasi kuman MG sering dikatakan menjengkelkan, karena tidak mudah
berhasil untuk mengisolasinya . Teknik isolasi kuman mikoplasma yang
diterapkan di laboratorium mikoplasma Balai Penelitian Veteriner sudah sering
mengalami perubahan baik dari komposisi media maupun jenis media dasar .
Saat ini tehnik isolasi mikoplasma boleh dikatakan sudah dapat dibakukan dan
223
Lokakarya Fungsional Non Peneliti
1997
keberhasilannya cukup tinggi . Pada penelitian ini isolasi kuman MG dilakukan
dengan cara pengambilan eksudat dari rongga hidung ayam hidup dengan
menggunakan kapas lidi steril . Kapas lidi ini kemudian dipupukkan pada
media cair dan media padat . Dari hasil isolasi sering dijumpai kontaminasi
bakteri sehingga diperlukan pemupukan ulang dengan cara disaring dengan
menggunakan saringan Millipore ukuran 300 nm . Tehnik penyaringan ini juga
tidak selalu memberikan hasil yang balk karena kuman mikoplasma yang
ukurannya lebih besar dari 300 nm tidak dapat lolos lubang saringan . Hasil
pengujian dapat dilihat pada Tabel 1 . Darl 95 sampel yang diuji yang berasal
dari 4 peterakan ayam potong komersial diperoleh 52 kuman mikoplasma
yang belum diuji spesiesnya, diantaranya 17 memperlihatkan fermentasi
glukosa . Dari 17 isolat tersebut setelah dilakukan uji hambatan pertumbuhan
yang menggunakan antisera MG diperoleh 3 isolat MG . Kuman MG umumnya
kecil, bulat dengan permukaan yang halus (Gambar 1) .
Tabel 1 . Hasil isolasi kuman MG dad beberapa petemakan ayam
Jumlah
sampel
Asal
sampel
Uji deteksi
mikoplasma*
Fermentasi
glukosa
22
28
17
38
A
B
C
D
7/22
19/28
12/17
14/38
1/7
4/19
7/12
5/14
Uji hambatan
pertumbuhan dengan
antisera MG
0/1
1/4
0/7
2/14
positif mikoplasma/jumlah sampel
Gambar 1 . Gambaran koloni Mycoplasma gallisepticum
224
Lokakarya Fungsional Non Penelid 1997
KESIMPULAN
Dari hasil studi ini dapat ditarik kesimpulan bahwa tehnik isolasi
mikoplasma dengan menggunakan kapas lidi steril yang dimasukkan ke dalam
rongga hidung ayam hidup yang kemudian ditumbuhkan pada media
mikoplasma cair dan agar dapat mengisolasi kuman mikoplasma . Hasil studi
ini juga memperlihatkan bahwa tehnik uji hambatan pertumbuhan dapat
mendeteksi 3 kuman Mycoplasma gallisepticum dari 17 kuman mikoplasma
yang fermentasi glukosa .
DAFTAR BACAAN
Adler, H .E . and R . Yamamoto . 1956 . Preparation of new pleuropneumonia like
organism antigen for the diagnosis of chronic respiratory diseases by
the agglutination test . Am. J. Vet. Res . 17 : 290 - 293 .
Frey, M .C ., R .P . Hanson and D .P . Anderson . 1968 . A medium for the isolation
of avian mycoplasma . Am . J. Vet. Res . 29 : 2164-2171 .
Jordan, F .T .W . 1979 . Avian Mycoplasmas. In : The Mycoplasmas volume II .
Human and Animal Mycoplasmas . J .G . Tully and R .F . Whitcomb . Academic Press, New York, San Francisco, London . pp .1-40 .
Nelson, J .B . 1935 . Cocco-bacilliform bodies associated with an infectious fowl
cholera . Science 82 : 43 - 44 .
Razin, S . and E.A . Freundt . 1984 . The Mycoplasmas . In : Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology. Vol .1 . Ed .by N .L . Krieg and J .G . Holt . Williams
and Wilkins . Baltimore/ London . pp .740 - 793 .
Yoder, H .W .Jr . 1991 . Mycoplasma gallisepticum infection . In : Diseases of
poultry . 9th ed . B .W . Calnek, H .J . Barnes, C .W. Beard W.M . Reid and
H .W . Yoder Yr., eds . Iowa State Univ .Press, Ames, Iowa . pp . 198 - 212 .
225