Analisis Kandungan Pigmen Karotenoid yang Diproduksi oleh

Bab III
Materi dan Metode
A. Materi
Sampel yang digunakan adalah bakteri simbion
dari lamun Enhalus acoroides yang ditumbuh di
perairan Teluk Awur, Jepara. Isolasi bakteri simbion
di laksanakan di laboratorium mikrobiologi, marine
Station, Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro,
Jepara.
Seleksi
dan
kultur
bakteri
simbion
dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Laut Tropis,
Laboratorium
Terpadu,
Universitas
Diponegoro,
Semarang. Ekstraksi dan analisa kandungan pigmen
di
pusat
studi
karotenoid
dan
antioksidan,
Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga. Bahan
kimia uang digunakan dalam proses ekstraksi dan
analisis kandungan pigmen alami adalah methanol,
asetonitril, gas N2 dan akuades.
B. Metode
1. Persiapan Sampel Lamun
Sampel lamun dari jenis Enhalus acoroides yang
diambil dari laut dicuci dengan air laut steril untuk
menghilangkan
mikroorganisme
kotoran,
epifit
pasir,
yang
lumpur
menempel
dan
pada
permukaan daun. Selanjutnya sampel dimasukkan
ke dalam kantong plastik hitam dan dimasukkan ke
15
dalam cool box. Sampel di bawa ke laboratorium
untuk diisolasi bakteri simbionnya.
2. Pembuatan Medium
Pembuatan 1000 ml medium Zobell 2216E half
strength dilakukan dengan mencampurkan 2,5 gr
bacto-pepton, 0,5 gr ekstrak yeast dan 15 gr bactoagar ke dalam 1000 ml air laut, panaskan dan aduk
hingga homogeny. Selanjutnya medium distrilisasi
menggunakan autoclave pada suhu 121 0C selama
15
menit.
Medium
yang
telah
disterilkan
dituangkan ke dalam cawan petri kurang lebih
sebanyak
20
ml.
Medium
tersebut
digunakan
sebagai medium untuk isolasi dan kultur bakteri
simbion dari lamun.
3. Metode Isolasi Bakteri Simbion
Sampel lamun E. acoroides yang diperoleh dari
laut ditempatkan pada cawan petri steril kemudian
dipotong dan dihaluskan menggunakan pisau steril.
Proses
selanjutnya
pengenceran
adalah
terhadap
melakukan
sampel
yang
seri
telah
dihaluskan. Sebanyak 1 gr sampel dimasukkan ke
dalam erlemnayer yang berisi 9 ml air laut steril,
diperoleh seri pengenceran 10-1. Seri pengenceran
10-1 diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke
dalam tabung reaksi berisi 9 ml air laut steril
16
sehingga
diperoleh
Pengenceran
seri
dilakukan
pengenceran
sampai
10-2.
diperoleh
seri
pengenceran 10-3, 10-4 dan 10-5. Dari setiap seri
pengenceran diambil 35 µl sampel dan dimasukkan
ke dalam cawan pertri berisi medium Zobell 2216E,
ratakan sampel menggunakan spreader. Cawan
petri tersebut diinkubasi pada suhu 30 0C selama 4
x 24 jam.
4. Seleksi dan Pemurnian Isolat
Seleksi bakteri dilakukan dengan cara mengambil
koloni yang berbeda dari masing – masing cawan
petri pada tiap seri pengenceran (Radjasa et al.,
2007). Bakteri yang tumbuh dipermukaan agar
diseleksi berdasarkan warna, bentuk dan tektur
koloninya(Radjasa et al., 2013). Koloni bakteri yang
berbeda dipisahkan menggunakan teknik goresan
(streak method) kemudian dipindahkan ke medium
yang
baru.
Selanjutnya
cawan
petri
tersebut
diinkubasi pada suhu 37 0C selama 3 x 24 jam dan
diamati
pertumbuhannya.
Proses
pemurnian
berhasil jika bakteri sudah tumbuh dalam bentuk
koloni tunggal. Apabila belum terbentuk koloni
tunggal
bakteri
harus
dimurnikan
lagi
menggunakan metode goresan hingga didapatkan
kultur
murni
dalam
bentuk
koloni
tunggal
(Marhaeni et al., 2011). Koloni yang sudah murni
17
diamati dan dicatat warna, bentuk dan tektur
koloninya.
5. Kultur Bakteri
Kultur bakteri dilakukan untuk memperbanyak
jumlan
biomassa
sel
bakteri
sebelum
analisa
pigmen. Kultur bakteri yang sudah murni ditanam
pada cawan petri yang berisis medium padat,
kemudian inkubasi cawan petri tersebut pada suhu
35 0C selama 4 x 24 jam. Setelah sel bakteri target
tumbuh memenuhi permukaan agar, sel dipanen
dengan cara dikerok menggunakan Scalpel. Sel
bakteri yang didapatkan siap untuk diekstraksi dan
dilakukan analaisa pigmen.
6. Ekstraksi Pigmen
Sel bakteri berwarna yang didapatkan diekstraksi
kandungan
pigmennya
menggunakan
Sampel
metanol
dididamkan
dengan
cara
(Radjasa
et
hingga
pigmen
direndam
al.,
2009).
tengangkat
dengan sempurna, hingga pelet sel bakteri menjadi
tidak
berwarna
atau
pucat.
Ekstrak
pigmen
dipisahkan dari pelet sel, kemudian ekstrak pigmen
yang didapatkan
disaring menggunakan
kertas
saring. Proses selanjutnya ektrak pigmen yang
didapatkan
dievaporasi
menggunakan gas nitrogen (N2).
18
dan
dikeringkan
7. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kandungan
menggunakan
pigmen
pada
ekstrak
dianalisis
Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi
(KCKT) Shimadzu LC 20-AB dengan kolom fase
terbalik ODS, C18, 250 x 4 mm, 5 µm. Fase gerak
menggunakan
perbandingan
metanol:asetonitril
70:30 (v/v).
8. Uji Aktivitas Ekstrak Pigmen
 Uji Aktivitas Antioksidan
Uji aktivitas antioksidan mengacu pada metode
1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) (Molyneux, 2004).
Ekstrak pigmen dan β – Karoten sebagai kontrol
positif dibuat dalam serial konsentrasi 100, 250,
500, 750, 1000 ppm. Setiap 1 ml ekstrak dan
larutan
β – Karoten dengan berbagai konsentrasi
dikontakkan dengan 4 ml dengan konsentrasi 0,1
mM. Sampel diinkubasi pada ruang gelap selama 30
menit. Selanjutnya sampel diukur absorbasninya
menggunakan
spektrofotometer
pada
panjang
gelombang 516 nm. Untuk mengetahui aktivitas
antioksidan digunakan rumus :
% Peredaman =
DPPH o−[DPPH ]s
19
[DPPH ]o
x 100 %
Keterangan :
[DPPH]o = Absorbansi larutan kontrol positif
(DPPH 0,1 mM)
[DPPH]s = Absorbasi Larutan Sampel
 Uji Aktivitas Antimikrobial
Ekstrak pigmen yang diperoleh dibuat dalam
serial konesntrasi 100, 250, 500, 750, 1000 ppm,
selanjutnya ekstrak pigmen diuji potensi aktivitas
antimikrobialnya.
adalah
Bakteri
bakteri
Multi
Escherichia
coli
dan
sedangkan
jamur
uji
uji
Drug
yang
digunakan
Resistance
Staphylococcus
yang
digunakan
jenis
aureus,
adalah
Aspergilus flavus dan Candida albicans. Uji potensi
ekstrak
pigmen
sebagai
senyawa
antimikrobial
dilakukan dengan menggunakan metode difusi agar
(Radjasa et al., 2007). 100 µl kultur cair bakteri dan
jamur
patogen
dengan
kepadatan
108
sel/ml
diinokulasikan ke permukaan medium agar Zobell
2216E. Enam buah paper diks (8 mm, Advantec,
Toyo Roshi, Ltd, Japan) diletakkan dipermukaan
medium agar. Lima buah paper disk ditetesi dengan
30 µl ekstrak pigmen dengan konsentrasi 100, 250,
500, 750, 1000 ppm dan satu paper disk ditetesi
dengan metanol sebagai kontrol negatif. Hasil uji
diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu ruangan.
20
Aktivitas
antimikrobial
ditunjukkan
dengan
terbentuknya zona bening disekitar paper disk.
9. Identifikasi Molekuler Bakteri Simbion Lamun
E. acoroides
 Ekstraksi DNA
Ekstraksi
DNA
dilakukan
menggunakan
Kit
Chelex 100. Sel bakteri yang telah ditumbuhkan
selama 24 jam dimasukkan ke dalam tabung
eppendorf 1,5 ml yang berisi 100 µl aquabides,
kemudian
ditambahkan
saponin
0,5%
dan
didiamkan selama 24 jam pada suhu 4 0C. Sampel
disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama
10 menit, supernatan hasil sentrifugasi dibuang.
Sebanyak 1 ml Phospate Buffer Saline (PBS 1x)
ditambahkan
ke
dalam
tabung
eppendorf,
kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan
12.000 rpm selama 15 menit, supernatan hasil
sentrifigasi dibuang. Selanjutnya sebanyak 100 µl
akuabides dan 50 µl Chelex 100 ditambahkan ke
dalam tabung. Sampel direbus selama 10 menit
(sampel
divortex
pada
5
menit
pertama).
Sentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm
selama 10 menit. Supernatan yang mengandung
DNA dipindahkan ke dalam tabung eppendorf yang
baru dan siap untuk proses Amplifikasi DNA.
21
 Amplifikasi DNA
Amplifikasi
Polymerase
DNA
Chain
menggunakan
Reaction
(PCR)
metode
16s
rDNA.
Perlakuan temperatur yang digunakan pada proses
Amplifikasi DNA adalah : denaturasi awal pada 95
0C
selama 3 menit, kemudian 30 siklus (denaturasi
pada suhu 95 0C selama 1 menit, annealing pada
suhu 55 0C selama 1 menit dan ekstensi pada suhu
72
0C
selama 1 menit), kemudian ekstensi pada
suhu 72 0C selama 7 menit dan terakhir 4 0C ~ (Lee,
2006). Primer yang digunakan untuk PCR 16S rDNA
adalah primer universal untuk bakteri 27F (5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') dan primer spesifik
eubacteria
1492R
(5'-
TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') (Isnansetyo dan
Kamei,
2003).
Campuran
bahan-bahan
yang
digunakan yaitu kit Promega (25 µl) primer 27 F (2,0
µl), primer 1492 R (2,0 µl), DNA template (2,5 µl) dan
aquabides (18,5 µl) sehingga total volume 50 µl.
Bahan-bahan tersebut dicampur dalam tabung
PCR.
 Visualisasi Hasil Amplifikasi DNA
Visualisasi
hasil
amplifikasi
DNA
dilakukan
melalui elektroforesis dengan cara memasukkan 5
22
μl produk PCR ke dalam sumur gel agarose 1 %.
Pembuatan gel agarose
1 % dilakukan dengan
melarutkan 1 gram agarose dalam 100 ml larutan
TAE buffer 1x, lalu dipanaskan menggunakan oven
sampai
homogen
(jernih).
Sebanyak
5,33
µl
Ethidium Bromide dimasukkan ke dalam larutan gel,
kemudian digoyang – goyang supaya homogen.
Larutan gel dituang dalam cetakan dengan sisir
cetakan yang dipasang dengan posisi tegak hingga
melewati
sisir
sesuai
dengan
ketebalan
yang
diinginkan. Gel dibiarkan beberapa saat sampai
mengeras. Langkah selanjutnya gel direndam dalam
larutan buffer TAE 1x, gel kemudian dielektroforesis
dengan voltase sebesar 100 V selama ± 30 menit.
Terakhir, band DNA hasil amplifikasi dapat dilihat
dengan menggunakan alat Gel Documentation.
 Purifikasi Hasil Amplifikasi DNA
Purifikasi dilakukan untuk mendapatkan DNA
murni hasil amplifikasi PCR 16S rDNA. Metode yang
digunakan adalah metode konvensional. Langkah
pertama, hasil PCR disentrifugasi dengan kecepatan
12.000 rpm selama 7 menit. Supernatan dibuang
dengan menggunakan micropipet, pastikan DNA
benar – benar murni (tidak ada primer yang
23
tertinggal).
Sebanyak
50
µl
akuabides
steril
ditambahkan pada pelet DNA, diamkan selama 5
menit. Hasil DNA murni dapat disekuensing untuk
mengetahui urutan basa DNAnya.
 Sekuensing DNA
Sekuensing
dilakukan
menurut
siklus
PCR
sekuensing menggunakan Big Dye Terminator v.3.1.
Formula untuk reaksi PCR sekuensing yaitu: 2 μl
big dye, 2 μl buffer 10x, 4 μl templet DNA, 1 μl
primer dengan konsentrasi 3,2 pmol, ddH2O hingga
volume akhir 10 μl. Amplifikasi DNA dilakukan
dengan siklus sebagai berikut: denaturasi awal (96
°C selama 2 menit), kemudian denaturasi (96 °C
selama 10 detik); annealing (50 °C selama 5 detik);
dan ekstensi (60 °C selama 4 menit) sebanyak 25
siklus.
Hasil
PCR
dipurifikasi
dan
disekuen
menggunakan primer 27F. Sekuen dianalisis secara
otomatis (ABI 3130XL, Applied Biosystem).
 BLAST Homologi
Analisis
sekuen
DNA
isolat
bakteri
terbaik
kemudian dibandingkan dengan sekuen DNA pada
basis data (database) DNA. Penelusuran dilakukan
dengan menggunakan internet melalui program
pelacakan database Basic Local Alignment Search
Tool (BLAST) pada National Center for Biotechnology
24
Information,
National
Institute
for
Health,
USA
(www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al., 1997).
 Analisa Filogenetik
Analisa
filogenetik bakteri dilakukan
dengan
membandingkan sekuen 20 bakteri terdekat dengan
haisl sekuensing bakteri EAEJ 1 pada database Gen
Bank. Hasil sekuen bakteri EAEJ 1 dan sekuen 20
bakteri
terdekat
diambil
lalu
diolah
dengan
menggunakan program Bioedit dan Mega 5. Dari
hasil analisis akan didapatkan pohon filogenetik
dari
bakteri
EAEJ
1
yang
kekerabatan dari bakteri tersebut.
25
menggambarkan