VARIASI ALEL DARI GEN 5-HTT (PENYANDI AGRESIVITAS) PADA

i
VARIASI ALEL DARI GEN 5-HTT (PENYANDI AGRESIVITAS)
PADA Macaca nemestrina
IKKA ERNIASARI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
ii
VARIASI ALEL DARI GEN 5-HTT (PENYANDI AGRESIVITAS)
PADA Macaca nemestrina
IKKA ERNIASARI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
iii
ABSTRAK
IKKA ERNIASARI. Variasi Alel dari Gen 5-HTT (Penyandi Agresivitas) pada Macaca
nemestrina. Dibimbing oleh R.R DYAH PERWITASARI dan ACHMAD FARAJALLAH.
Macaca nemestrina merupakan jenis primata yang agresif. Agresivitas ini dipengaruhi
oleh berbagai faktor di antaranya oleh gen. Gen yang berperan yaitu 5-HTT yang merupakan
penyandi transporter serotonin yang bekerja meregulasi sistem serotonergik dan reseptornya
melalui modulasi konsentrasi serotonin di dalam cairan ekstraselular. Variasi yang terjadi pada
daerah promotor dan intron dapat mengubah regulasi transkripsi gen 5-HTT. Variasi ini terutama
dapat mengurangi ekspresi dari transporter dan pengambilan serotonin. Perubahan ekspresi dari
transporter dapat berpengaruh terhadap agresivitas, emosi, fungsi motorik dan beberapa sifat
kognitif pada primata. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen 5-HTT
(penyandi agresivitas) pada M. nemestrina. Sampel yang digunakan adalah 56 ekor M. nemestrina
yang berasal dari satu kelompok. Amplifikasi gen 5-HTT dilakukan secara in vitro dengan
menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Amplifikasi di daerah promotor
menunjukkan adanya variasi yang diwakili oleh dua macam alel dan tiga macam genotip dengan
frekuensi alel L sebesar 88,18% dan 11,82% untuk alel S. Sementara variasi pada daerah intron 3
diwakili oleh alel l dan s dengan frekuensi masing-masing sebesar 55,4% dan 44,6%. Tidak
ditemukan adanya genotip s/s pada daerah intron 3. Alel S merupakan alel yang dominan terhadap
alel L, keberadaaan dari setidaknya satu macam alel S dapat menyebabkan penurunan aktivitas
transkripsi. Amplifikasi daerah promotor menghasilkan satu individu dengan genotip S/S yang
kemungkinan merupakan jantan alfa dalam kelompok ini.
ABSTRACT
IKKA ERNIASARI. Allelic variation of the 5-HTT Gene (Encoding Aggresivity) in Macaca
nemestrina. Supervised by R.R DYAH PERWITASARI and ACHMAD FARAJALLAH.
Macaca nemestrina is an aggressive primate. The aggresivity is influenced by many
factors, one of them is by a gene. The 5-HTT gene encodes the serotonin transporter that affects
the regulation of serotonergic system and its receptor by modulating the concentration of serotonin
in extracellular fluid. Variation in promoter and intron region can change the transcriptional
activity of the 5-HTT gene, mainly the activity of the transporter and serotonin uptake. The
transporter change activity influenced aggressivity, emotion, motor function, and some cognitive
traits in primates. This research aimed to determine alelles variant of 5-HTT gene (encoding
aggresivity) in M. nemestrina. Samples used in this research consisted of 56 M. nemestrina. The
gene was amplified by the Polymerase Chain Reaction (PCR) method. Amplification in promoter
region revealed two alleles and three genotypes with the frequencies of L and S alleles were
88,18% and 11,82%, respectively. Amplification of the third intron region showed two alleles with
the frequency of l and s alleles were 55,4% and 44,6%, respectively. None of the individual had s/s
genotype in the third intron region. Short allele was dominant to long allele. The presence of at
least one short allele decreased transcription activity. There was one individual with S/S genotype
in promoter region that was possibly to be the alpha male in the group.
iv
Judul Skripsi : Variasi Alel dari Gen 5-HTT (Penyandi Agresivitas) pada
Macaca nemestrina
Nama
: Ikka Erniasari
NIM
: G34051374
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
(Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc.)
NIP. 19660403 199003 2 001
(Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si.)
NIP. 19650427 199002 1 002
Mengetahui:
Ketua Departemen Biologi
(Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.)
NIP. 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus:
v
PRAKATA
Alhamdulillahirobbil’alamiin
Puji dan syukur Penulis panjatkan kepada ALLAH SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya
sehingga penulis diberi kekuatan, kesabaran, dan kemampuan untuk menyelesaikan karya ilmiah
ini.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Ibu
Dr. R. R. Dyah Perwitasari dan Bapak Dr. Achmad Farajallah selaku pembimbing yang telah
memberikan saran, kritik, motivasi dan bantuan yang tak terhingga sehingga penelitian ini berjalan
dengan lancar. Ucapan terima kasih juga diberikan kepada Pusat Studi Satwa Primata (PSSPLPPM, IPB) atas sampel DNA Macaca nemestrina yang telah digunakan dalam penelitian ini serta
kepada Bapak Dr. Ir. Miftahudin sebagai penguji yang telah memberikan saran dan perbaikan
dalam laporan ini. Selain itu, penghargaan penulis sampaikan kepada seluruh staf pengajar
Zoologi, Ibu Tini, Pak Adi dan Mba Ani selaku staf laboratorium Biosains Hewan atas bantuannya
sehingga penelitian ini dapat berjalan dengan lancar.
Penulis juga ingin mengucapkan terima kasih kepada Bapak Khoirul, Ibu Bibah, Wildan N.,
atas latihan-latihannya. Kepada sahabat-sahabat tercinta: Sylvia NP, Jazirotul F, Nur ACD, Ika
Rezza, Gilang H, Apria W, Vina V, Diaz S, Femi Aprilia Z, Darojatul U, Kanthi AW, Puji Rianti,
Ruth Martha W, R. Fadillah Yassin dan warga zoologi atas persahabatan dan kebersamaannya
selama penelitian ini. Serta kepada teman-teman Wisma Mega1 Umi C, Henny W, Dede W,
Kartika SH, Nur S, dan Biologi 42 yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
Penghargaan terbesar penulis haturkan untuk Ayah, Ibu dan adik-adikku Ryan Ryawan dan
Putri Nurmalasari atas segala dukungan, kasih sayang yang tercurah dan hantaran do’a yang
senantiasa diberikan.
Penulis berharap semoga laporan masalah khusus ini dapat bermanfaat.
Bogor, Januari 2010
Ikka Erniasari
vi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 31 Maret 1987 dari ayahanda Dalimun dan
ibunda Ngatiyem. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara.
Tahun 1999 penulis lulus dari SDI Al-ma’ruf Jakarta, tahun 2002 lulus dari SMP Negeri
233 Jakarta, kemudian melanjutkan ke SMA Negeri 99 Jakarta. Tahun 2005 penulis lulus dari
SMA Negeri 99 Jakarta dan di tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa tingkat
persiapan bersama Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru
(SPMB). Penulis kemudian terpilih masuk ke Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam IPB Bogor.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah
Perkembangan Hewan pada tahun 2007/2008, Biologi Dasar pada tahun ajaran 2008/2009 dan
2009/2010, Struktur Hewan pada tahun ajaran 2008/2009, Pengantar Genetika Molekuler pada
tahun ajaran 2008/2009, Genetika Dasar pada tahun ajaran 2009/2010, dan Vertebrata pada tahun
ajaran 2009/2010. Pada tahun 2007 penulis melakukan studi lapang di Wana Wisata Cangkuang
dengan judul Distribusi Primata di Wana Wisata Cangkuang. Pada tahun 2008, penulis menjadi
pengajar biologi di bimbingan belajar B-Expert dan pada tahun yang sama penulis melakukan
praktik lapangan di PT Saung Mirwan dengan judul Budidaya Bunga Kalanchoe (Kalanchoe sp.)
dalam pot di PT Saung Mirwan.
vii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................................viii
PENDAHULUAN............................................................................................................................. 1
Latar Belakang ............................................................................................................................. 1
Tujuan........................................................................................................................................... 2
Waktu dan Tempat ....................................................................................................................... 2
BAHAN DAN METODE ................................................................................................................. 2
Bahan ............................................................................................................................................ 2
Metode.......................................................................................................................................... 2
Ekstraksi dan Isolasi DNA ....................................................................................................... 2
Amplifikasi Gen 5-HTT ........................................................................................................... 2
Visualisasi Produk PCR ........................................................................................................... 3
Analisis Data ............................................................................................................................ 3
HASIL ............................................................................................................................................... 3
Amplifikasi dan Visualisasi Gen 5-HTT ...................................................................................... 3
Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotip Gen 5-HTT pada Macaca nemestrina............................. 3
PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 4
Amplifikasi dan Visualisasi Gen 5-HTT ...................................................................................... 4
Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotip Gen 5-HTT pada Macaca nemestrina............................. 4
SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................................................. 5
Simpulan....................................................................................................................................... 5
Saran ............................................................................................................................................. 6
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 6
viii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
Hasil amplifikasi gen 5-HTT menggunakan pasangan primer DPF12 berdasarkan Lesch et
al. (1997) dan Inoue-Murayama et al. (2000)…………………………………………………4
2.
Hasil amplifikasi gen 5-HTT menggunakan pasangan primer DPF11 berdasarkan InoueMurayama et al. (2008)………………………………………………………………………..4
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Beruk (Macaca nemestrina) merupakan
spesies primata yang banyak ditemukan di
Indonesia. Hewan ini termasuk ke dalam
subordo
Anthropoidae
dan
famili
Cercopithecidae (Napier & Napier 1967;
Dolhinow & Fuentes 1999). Spesies ini
merupakan genus Macaca berbadan besar
dan tegap yang memiliki rambut berwarna
coklat keabu-abuan sampai agak keemasan;
sekeliling wajahnya terdapat rambut coklat
yang mengembang dan lebih terang
(Lekagul & McNeely 1977).
Macaca nemestrina dapat hidup di hutan
primer dan sekunder, daerah pedalaman dan
pesisir, hutan dataran rendah dan dataran
tinggi. Wilayah Asia yang menjadi habitat
alami dari spesies ini meliputi wilayah Asia
Selatan dan Asia Tenggara. Sementara di
Indonesia, habitat alami spesies ini berada di
pulau Sumatera, Kalimantan, dan kepulauan
Mentawai (Fooden 1987).
Berdasarkan aktivitas hariannya, M.
nemestrina digolongkan ke dalam hewan
diurnal (Napier & Napier 1967) yang
melakukan perpindahan secara terestrial
karena ukuran tubuhnya yang besar dan ekor
yang pendek. Seperti kebanyakan jenis
primata lainnya, M. nemestrina hidup
berkelompok dalam hirarki sosial yang
beranggotakan banyak jantan dan banyak
betina. Beberapa alasan jenis primata ini
hidup berkelompok di antaranya adalah
sebagai perlindungan diri dari predator,
sumberdaya, efisiensi dalam pencarian
pakan, dan peningkatan perawatan terhadap
keturunan (Else & Lee 1987). Eimerl dan De
Vore (1980) menyatakan bahwa pada saat
istirahat, M. nemestrina lebih menyukai
kegiatan menyelisik (grooming) dibandingkan kegiatan lainnya. Kegiatan ini selain
untuk membersihkan badan, juga sarana
untuk menjalin hubungan sosial antar
individu di dalam kelompok.
Hirarki sosial yang ada pada M.
nemestrina jelas. Individu yang menempati
hirarki tinggi merupakan pemimpin dalam
kelompok dan biasa disebut alfa dan
individu di bawahnya merupakan individu
subordinan yang disebut beta, gamma dan
seterusnya. Perbedaan tingkat sosial dari
primata ini dipengaruhi oleh banyak faktor.
Faktor tersebut di antaranya adalah ukuran
tubuh, dimorfisme seksual, umur, kesehatan,
keturunan, lingkungan, dan demografi
kelompok (Dolhinow & Fuentes 1999).
Agresivitas adalah istilah umum yang
dikaitkan dengan segala bentuk tingkah laku
yang secara langsung maupun tidak
langsung bertujuan untuk menyakiti atau
melukai mahluk hidup lain dengan tujuan
tertentu (Baron & Richardson 1994).
Tingkah laku agresif didefinisikan sebagai
tingkah laku yang ditujukan pada
keberhasilan menyakiti atau melukai
mahkluk hidup lain. Tingkah laku agresif ini
merupakan tindakan yang sengaja dilakukan
oleh pelaku untuk mencapai tujuan tertentu
seperti menakuti dan menyakiti orang lain
(Zeanah 2005).
Agresivitas merupakan sifat umum yang
dimiliki oleh primata. Sifat ini biasanya
dipengaruhi oleh hirarki. Individu yang
menempati hirarki tinggi biasanya lebih
agresif dibanding dengan individu di
bawahnya (Napier & Napier 1985; Drea &
Kim 1999; Miller-Butterworth et al. 2007).
Agresivitas pada individu jantan lebih tinggi
dibandingkan dengan pada betina (Smuts et
al. 1987).
Agresivitas pada suatu individu juga
berkaitan dengan habitat dan makanan yang
tersedia di habitat. Miller-Butterworth et al.
(2007) menyebutkan bahwa spesies yang
hidup di habitat alami memiliki agresivitas
yang lebih tinggi dibandingkan dengan
spesies dalam penangkaran. Kelangkaan
makanan, air, dan tempat perlindungan di
alam bebas dapat memicu konflik dan
kompetisi antar individu yang dapat
menimbulkan dominansi antara satu individu
dengan yang lainnya (Dolhinow & Fuentes
1999). Kemiripan habitat dan sumber pakan
juga menyebabkan M. nemestrina dapat
hidup berdampingan dengan spesies primata
dan hewan lain yang mempunyai relung
ekologi sama sehingga dapat berpengaruh
terhadap agresivitasnya (Iskandar 1998).
Macaca nemestrina merupakan hewan
yang bersifat agresif baik terhadap sesama
jenis maupun terhadap satwa yang berbeda
jenisnya (Oi 1990). Perkelahian merupakan
salah satu penanda agresivitas yang ada pada
primata. Aktivitas ini ditandai dengan
ancaman mimik muka atau gerakan badan,
menyerang dan memburu lawannya, baku
hantam, dan diakhiri dengan kekalahan
lawannya (Else & Lee 1987). Individu yang
memenangkan konflik akan menjadi
superior dibanding dengan yang lainnya dan
menjadi pemimpin dalam kelompok atau
biasa disebut sebagai jantan alfa. Sikap
subordinan ditandai dengan perilaku
menunjukkan bagian belakang tubuh kepada
2
individu dominan, sedangkan sifat agresif
ditandai dengan perilaku menggoyangkan
dahan pohon.
Gen 5-HTT (5-hydroxytritaminetransporter) merupakan penyandi transporter
serotonin yang berpengaruh terhadap
agresivitas (Barr et al. 2003), emosi, fungsi
motorik, dan beberapa sifat kognitif pada
primata dan manusia (Heils et al. 1996). Gen
ini diketahui dapat meregulasi sistem
serotonergik dan reseptornya melalui
modulasi konsentrasi serotonin di dalam
cairan ekstraselular (Murphy et al. 2004;
Izquierdo et al. 2007). Gen 5-HTT terdiri
dari daerah promotor yang merupakan
daerah polimorfik pada banyak spesies
primata.
Analisis in vitro daerah promotor pada
gen 5-HTT menunjukkan penurunan
aktivitas transkripsi yang berasosiasi dengan
alel S dan L pada manusia dan beberapa
primata. Alel S merupakan alel yang
mempunyai aktivitas transkripsi lebih rendah
dibandingkan dengan alel L (MillerButterworth 2007). Variasi juga terdapat
pada intron 3 gen 5-HTT (Inoue-Murayama
et al. 2008).
Varian di daerah promotor dan intron
pada manusia dapat mengubah regulasi
transkripsi dari gen 5-HTT, terutama dapat
mengurangi ekspresi dari transporter dan
pengambilan serotonin (Lesch et al. 1996;
Heils et al. 1996; Miller-Butterworth et al.
2007). Keberadaan setidaknya satu macam
alel S pada daerah promotor maupun intron
dapat berpengaruh terhadap mekanisme
regulator yang mengatur ekspresi dari gen 5HTT (Inoue-Murayama et al. 2008).
Alel S pada manusia berkaitan dengan
tingkat kecemasan, depresi, dan stres
sebagai respon otak terhadap emosi
(Izquierdo et al. 2007). Varian ini juga
berpengaruh terhadap ekspresi dari gen 5HTT antara lain mempengaruhi emosi dan
beberapa kelainan kejiwaan lainnya.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi
keragaman alel gen 5-HTT (penyandi
agresivitas) pada Macaca nemestrina.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Maret 2009 sampai September 2009 di
Bagian Sistematika dan Ekologi Hewan,
Departemen Biologi, FMIPA IPB.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Sampel darah beruk yang digunakan
dalam penelitian ini adalah sampel darah
yang diawetkan dalam alkohol koleksi Pusat
Studi Satwa Primata (PSSP-LPPM, IPB).
Sebanyak 56 sampel yang digunakan dipilih
dari satu populasi yang terdiri dari 11 jantan
dan 45 betina.
Metode
Ekstraksi dan Isolasi DNA
Ekstraksi dan isolasi DNA dari darah
dilakukan menggunakan Qiagen DNeasy
Blood & Tissue Kits. Sel-sel darah
disuspensikan ke dalam 180 µl bufer pelisis
ATL dan 20 µl proteinase-K 5 mg/ml,
kemudian diinkubasi pada suhu 55oC selama
3 jam sambil dikocok pelan. Selanjutnya
campuran ditambah dengan 200 µl bufer
purifkasi AL dan diinkubasi pada suhu 70°C
selama 10 menit. Selanjutnya campuran
ditambahkan dengan 200 µl etanol absolut
dan dipindahkan ke kolom pemisah.
Molekul-molekul DNA diendapkan dengan
cara disentrifugasi 8000 rpm selama 1 menit.
Sisa garam dalam sampel DNA dicuci
dengan bufer pencuci AW sebanyak 500 µl.
Endapan DNA disuspensikan dengan 400 µl
bufer elusi AE (10 mM Tris-Cl; 0.5 mM
EDTA; pH 9.0).
Sampel DNA yang diperoleh diuji
kualitasnya
dengan
spektrofotometer
GeneQuantpro
(Amersham
Phamarcia
Biotech) pada panjang gelombang 260 nm
dan 280 nm.
Amplifikasi Gen 5-HTT
Amplifikasi gen 5-HTT dilakukan secara
in vitro dengan menggunakan metode
Polymerase
Chain
Reaction
(PCR).
Amplifikasi
pada
bagian
promotor
menggunakan primer DPF12 yang disusun
berdasarkan fragmen DNA gen 5-HTT pada
manusia (GenBank EF126284) yaitu
forward primer 5'-GGCGTTGCCGCTCTGAATGC-3’ dan reverse primer 5’-GAGGGACTGAGCTGGACAACCAC-3’ (Lesch
et al. 1997; Inoue-Murayama et al. 2000).
Amplifikasi daerah intron 3 menggunakan primer DPF11 yang disusun berdasarkan fragmen DNA gen 5-HTT pada M.
fascicularis (GenBank NC_000017) yaitu
forward primer 5'-TCTGGCGCTTCCCCTACATAT-3' dan reverse primer 5'-TGTTCCTAGTCTTACGCCAGTG-3' (InoueMurayama et al. 2008). Panjang DNA hasil
3
amplifikasi yang diharapkan yaitu antara
500-700 bp.
Komposisi 25 µl reaksi PCR untuk
mengamplifikasi gen 5-HTT terdiri dari 10100 ng DNA, masing-masing primer 25 nM,
serta Greenmix (Promega) yang terdiri dari
dNTP, Taq polymerase dan bufer. Kondisi
reaksi PCR dalam mesin TaKaRa PCR
Thermal Cycler MP (TaKaRa Biomedicals)
dirancang dengan suhu pra-denaturasi 94°C
selama 5 menit, denaturasi 94°C selama 1
menit, penempelan primer pada suhu 6063°C selama 30 detik, pemanjangan pada
suhu 720C selama 1 menit, akhir pemanjangan pada suhu 72°C selama 4 menit
dan pendinginan pada suhu 4°C. Untuk
perbanyakan, siklus diulang sebanyak 30
kali.
Visualisasi Produk PCR
Produk PCR dimigrasikan pada PAGE
(Polyacrilamide gel electrophoresis) 6 %
dalam bufer 1x TBE (Tris-Borat EDTA)
dengan voltase 200 V selama 50 menit. Gel
diwarnai dengan pewarnaan perak menurut
Tegëlstrom (1986). Penanda yang digunakan
adalah Ready-Load™ 1 Kb DNA Ladder
(Invitrogen).
Analisis Data
Frekuensi alel dihitung berdasarkan
jumlah individu genotip homozigot (LL dan
SS) dan heterozigot (LS) dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
XL = (2nLL +nLS)/2n
Keterangan:
XL
= frekuensi alel L
nLL
= jumlah individu bergenotip LL
nLS
= jumlah individu bergenotip LS
n
= jumlah total individu
(Nei 1987)
Frekuensi genotip dihitung berdasarkan
rumus sebagai berikut:
XLL = (nLL/N) x 100%
Keterangan:
XLL
= frekuensi genotip LL
nLL
= jumlah individu bergenotip LL
N
= total individu
HASIL
Amplifikasi dan Visualisasi Gen 5-HTT
Gen 5-HTT pada Macaca nemestrina
berhasil diamplifikasi dengan menggunakan
teknik PCR. Primer yang digunakan didisain
berdasarkan Lesch et al. (1997) dan InoueMurayama et al. (2000). Primer DPF12
digunakan untuk mengamplifikasi daerah
promotor 5-HTT di genus Macaca. Dari 56
sampel yang diamplifikasi, satu sampel tidak
berhasil diamplifikasi yaitu pada sampel
dengan nomor urut 35. Amplifikasi dengan
menggunakan
pasangan
primer
ini
menghasilkan dua buah pita berukuran
sekitar 648 bp dan 561 bp (Gambar 1).
Amplifikasi kedua menggunakan pasangan primer DPF11 berhasil mengamplifikasi
daerah intron 3 dari gen serotonin transporter. Sampel yang berhasil diamplifikasi
yaitu sebanyak 37 sampel dari 56 sampel
yang tersedia. Amplikon yang terbentuk dari
hasil PCR juga menghasilkan dua buah pita
berukuran 623 bp dan 575 bp (Gambar 2).
Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotip
Gen 5-HTT pada Macaca nemestrina
Adanya dua alel (L dan S) dan tiga
macam genotip pada sampel yang diamplifikasi dengan menggunakan pasangan
primer DPF12 yaitu L/L, L/S, dan S/S.
Masing-masing genotip ditentukan berdasarkan banyak dan ukuran pita DNA dalam
PAGE 6%. Amplikon dengan ukuran 648 bp
mewakili alel L dan amplikon dengan
ukuran 561 bp mewakili alel S. Sebanyak 43
sampel dari 56 sampel yang ada bergenotip
L/L, 11 sampel bergenotip L/S dan 1 sampel
bergenotip S/S. Frekuensi untuk genotip L/L
sebesar 78,2%, L/S sebesar 20%, dan S/S
sebesar 1,8%. Sementara frekuensi untuk
alel L sebesar 88,18% dan 11,82% untuk alel
S.
Pada amplifikasi dengan menggunakan
pasangan primer DPF11 ditemukan dua alel
yang diwakili oleh dua pita yang bermigrasi
pada gel elektroforesis. Pita dengan panjang
632 bp mewakili alel l dan pita dengan
ukuran 575 bp mewakili alel s. Dari kedua
alel ini diperoleh dua jenis genotip yaitu l/l
dan l/s.
Sebanyak empat sampel dari 56 sampel
bergenotip l/l, dan 33 sampel bergenotip l/s
dengan frekuensi masing-masing alel yaitu
sebesar 55,4% untuk alel l dan 44,6% untuk
alel s. Tidak ditemukan adanya genotip s/s
dan sebanyak 19 sampel tidak teramplifikasi
dengan menggunakan pasangan primer
4
DPF11. Frekuensi genotip l/l sebesar 10,8%
dan l/s sebesar 89,2%.
M
2
1
3
4
648 bp
512 bp
300 bp
200 bp
Gambar 1
Hasil amplifikasi gen 5-HTT
menggunakan
pasangan
primer DPF12 berdasarkan
Lesch et al. (1997) dan InoueMurayama et al. (2000).
Keterangan: M= penanda,
nomor 1dan 3= L/S; nomor 2=
L/L; nomor 4= S/S
M 1
2
3 4
623 bp
575 bp
400 bp
Gambar 2 Hasil amplifikasi gen 5-HTT
menggunakan pasangan primer
DPF11 berdasarkan InoueMurayama et al. (2008).
Keterangan:
M=
penanda,
nomor 1= l/l; nomor 2-4= l/s
PEMBAHASAN
Amplifikasi dan Visualisasi Gen 5-HTT
Lesch et al. (1997) berhasil mengamplifikasi gen 5-HTT M. mulatta menggunakan
pasangan primer DPF12 dengan produk
PCR sebesar 419 bp yang mewakili alel L
dan 398 bp yang mewakili alel S. Sementara
amplifikasi yang dilakukan pada sampel M.
nemestrina menghasilkan amplikon dengan
ukuran 648 bp dan 561 bp. Amplikon yang
diharapkan yaitu sebesar 500-700 bp. Target
ini didapatkan dari hasil penempelan primer
pada beberapa genus Macaca di beberapa
penelitian sebelumnya. Hal ini sesuai dengan
penelitian yang dilakukan Lesch et al.
(1996) pada manusia yang menyatakan
daerah polimorfik pada gen ini yaitu pada
daerah
promotor
dapat
mengalami
penyisipan ataupun delesi sebanyak 44 bp
atau lebih. Penyisipan maupun delesi ini
dapat terjadi secara acak di daerah promotor.
Pada M. nemestrina penyisipan maupun
delesi ini juga dapat terjadi. Perkiraan
amplikon yang terbentuk jika tidak terjadi
penyisipan maupun delesi adalah 506 bp
sampai 528 bp.
Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotip
Gen 5-HTT pada Macaca nemestrina
Suatu lokus dinyatakan polimorfik apabila jumlah alel bersama dalam populasi
lebih dari satu dengan frekuensi alel yang
paling umum kurang atau sama dengan 0,99
(Nei 1987). Frekuensi alel pada populasi M.
nemestrina yaitu sebesar 88,18% untuk alel
L dan 11,82% untuk alel S. Dapat dikatakan
bahwa lokus tempat gen serotonin transporter ini berada merupakan daerah polimorfik. Hal ini diperkuat dengan frekuensi
alel pada M. mulatta yaitu sebesar 66%
untuk alel L dan sebesar 34% untuk alel S
(Lesch et al. 1997).
Studi keragaman genetik dalam penelitian ini dilakukan dengan menggunakan
VNTR atau keragaman alel pada jumlah
salinan DNA berulang dari daerah
hipervariabel. Variable Number Tandem
Repeated (VNTR) merupakan urutan
nukleotida pendek antara 14-100 nukleotida
yang terorganisasi ke dalam kelompok yang
terdiri dari dua pasangan berulang. Dalam
setiap kali peristiwa VNTR, terdapat empat
sampai 40 kali perulangan. Urutan nukleotida berulang ini dapat ditemukan pada
banyak kromosom dan memiliki panjang
yang bervariasi antar individu. Varian ini
dapat digunakan untuk mempelajari keragaman genetik, analisis forensik, penentuan pola persilangan atau perkawinan pada
hewan, dan lain sebagainya (Kasai et al.
1990; Ting Ting et al. 2009).
Sampel M. mulatta yang diamplifikasi
oleh Lesch et al. (1997) memiliki frekuensi
genotip untuk L/L, L/S, dan S/S masingmasing sebesar 44%, 45%, dan 11%.
Frekuensi genotip pada 154 sampel
menunjukkan tingginya keragaman. Berbeda
halnya dengan frekuensi genotip pada
populasi M. nemestrina yang menunjukkan
keragaman yang rendah karena frekuensi
genotip L/L yang lebih besar yaitu sebesar
78,18% dibandingkan frekuensi kedua
genotip lainnya sebesar 20% untuk genotip
L/S dan 1,82% untuk genotip S/S.
Inoue-Murayama et al. (2000) juga
berhasil mengamplifikasi gen 5-HTT pada
5
beberapa spesies kera, Hylobates, dan
manusia. Amplikon berukuran 484 bp
mewakili alel dengan 14 daerah perulangan,
sedangkan amplikon 528 bp mewakili alel
dengan 16 daerah perulangan. Produk
sebesar 484 bp mewakili alel S sementara
produk lainnya mewakili alel L. Frekuensi
genotip pada sampel kera ini juga
menunjukkan adanya keragaman.
Penelitian yang dilakukan menggunakan
sampel M. fascicularis oleh MillerButterworth et al. (2007) tidak menemukan
adanya variasi genotip walaupun ditemukan
adanya dua macam alel pada produk hasil
PCR. Semua sampel yang diamplifikasi
dengan menggunakan primer yang sama
pada M. nemestrina menunjukkan hasil
homozigot.
Amplifikasi
dengan
menggunakan
pasangan primer DPF11 sebelumnya telah
berhasil dilakukan oleh Inoue-Murayama et
al. (2008) pada beberapa primata. Simpanse,
gorila, dan orangutan merupakan spesies
yang memiliki variasi alel yang tinggi.
Sementara pada sampel dari genus Macaca
seperti Macaca fuscata dan Erythrocebus
patas yang diamplifikasi, tidak ditemukan
adanya variasi. Pada sampel M. nemestrina
ditemukan adanya variasi genotip pada
daerah intron 3 ini.
Penelitian terdahulu yang dilakukan oleh
Higley et al. (1996) menyebutkan bahwa
adanya hubungan positif antara dominansi
dengan aktivitas serotonergik pada M.
fascicularis. Keberadaan dari setidaknya
satu macam alel S pada daerah promotor gen
5-HTT (dapat berupa genotip S/S atau L/S)
dapat mengurangi aktivitas dari promotor
dan penurunan aktivitas transkripsi. Alel ini
juga terdapat di daerah intron 3 gen 5-HTT,
keberadaannya bersama daerah promotor
menyebabkan terjadinya penurunan ekspresi
dari transporter (Lesch et al. 1996; Heils et
al. 1996; Miller-Butterworth et al. 2007).
Transporter berfungsi mengatur neurotransmisi serotonergik dengan cara menentukan besar dan lamanya respon serotonin di
cairan ekstraselular. Individu dengan alel S
memiliki kemampuan yang lebih rendah
dalam mentransportasikan kembali serotonin
ke dalam sel.
Daerah promotor pada gen 5-HTT
merupakan daerah yang bertanggung jawab
terhadap awal, tempo, dan waktu dari proses
transkripsi atau merupakan daerah yang
berfungsi sebagai regulator. Variasi atau
perbedaan yang ada pada daerah ini akan
berpengaruh terhadap kerja dari transporter
secara keseluruhan. Individu dengan
sedikitnya satu alel S cenderung memiliki
tingkat kecemasan dan ketakutan yang tinggi
serta menunjukkan perilaku sosial yang
rendah seperti tingkat agresivitas yang tinggi
dan interaksi sosial yang rendah, umumnya
perilaku bermain, dibandingkan dengan
individu dengan genotip L/L (Barr et al.
2003).
Dari hasil amplifikasi menggunakan
pasangan primer DPF12 hanya ada satu
individu mempunyai genotip S/S, sehingga
dapat dikatakan individu ini merupakan
individu yang dominan dibandingkan
individu lainnya. Pada primata, individu
yang dominan menempati hirarki yang lebih
tinggi dan biasa disebut alfa. Sampel dengan
nomor urut 38 merupakan individu jantan,
kemungkinan individu ini merupakan jantan
alfa di kelompok tersebut.
Amplifikasi kedua dengan menggunakan
pasangan primer yang didisain untuk
mengamplifikasi daerah intron 3 pada gen 5HTT menunjukkan tidak adanya individu
yang bergenotip s/s. Walaupun tidak ada
individu dengan genotip tersebut, tidak dapat
dikatakan bahwa dalam populasi yang
diteliti tidak ada individu yang agresif.
Interaksi antara variasi yang ada pada daerah
promotor dan intron 3 dapat menyebabkan
adanya perbedaan sifat agresif dan tingkat
sosial dari individu.
Hirarki sosial tidak selalu dapat diamati
dari ekspresi satu gen saja. Ada banyak
faktor yang berpengaruh terhadap hirarki
dari primata. Kemungkinan ada efek
pleiotropi antara promotor dan intron gen 5HTT, maupun antara promotor gen 5-HTT
dan gen-gen lain yang bersifat memacu.
Faktor lingkungan dan efek dari gen lain
seperti dopamin D4 reseptor juga berpengaruh terhadap hirarki sosial dari seekor
hewan (Miller-Butterworth et al. 2007).
Meskipun begitu tidak diragukan bahwa
variasi genetik dari gen serotonin transporter
juga berpengaruh di beberapa fenotip pada
Macaca yang mungkin berpengaruh pada
status sosial.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Variasi gen 5-HTT (penyandi agresivitas) berhasil diidentifikasi pada satu kelompok M. nemestrina. Varian di daerah
promotor dan intron 3 gen ini diwakili oleh
alel S dan alel L. Terdapat satu individu
dengan genotip S/S.
6
Saran
Ekspresi dari satu gen belum tentu
berpengaruh terhadap suatu sifat dari
organisme tertentu. Kombinasi antar gen
mungkin dapat dijadikan alternatif yang baik
dalam penentuan sifat agresivitas pada jenis
primata.
DAFTAR PUSTAKA
Barr CS et al. 2003. The utility of nonhuman primate model for
studying gene by environment interactions in behavioral research.
Genes Brain Behav 2:336-340.
Baron RA, Richardson DR. 1994. Human
Aggression. 2nd Edition. New
York: Plenum.
Dolhinow P, Fuentes A. 1999. The
Nonhuman Primates. California:
Mayfield Publishing Company.
Drea CM, Kim W. 1999. Low-status
monkeys “play dumb” when
learning in social groups. PNAS
22:12965-12969.
Eimerl S, De Vore I. 1980. Primates.
Jakarta: Pustaka Alam Life.
Else JG, Lee PC. 1987. Primate Ontogeny,
Cognition and Social Behavior.
London: Cambridge University.
Fooden J. 1975. Taxonomy and Evolution of
Liontail and Pigtail Macaques
(Primates: Cercopithecidae). Field
Museum of Natural History:
Chicago.
Heils A et al. 1996. Allelic variation of
human serotonin transporter gene
expression. J Neurochem 6: 26212624.
Higley JD et al. 1996. Stability of
interindividual differences in
serotonin functions and its
relationship to severe aggression
and competent social behavior in
rhesus macaque females. Neuropsychopharmacology 14:67-76.
Inoue-Murayama et al. 2000. Allelic
variation of the serotonin transporter gene polymorphic region in
apes. Primates 41(3): 267-273.
Inoue-Murayama et al. 2008. Interspecies
and intraspecies variations in the
serotonin transporter gene intron
3 VNTR in nonhuman primates.
Primates 49: 139-142.
Iskandar E. 1998. Studi tingkah laku seksual
pasangan Macaca nemestrina dan
Macaca fascicularis dewasa di
pusat studi satwa primata LP-IPB,
Bogor [tesis]. Bogor: Program
Pascasarjana. Institut Pertanian
Bogor.
Izquierdo A et al. 2007. Genetic modulation
of cognitive flexibility and
socioemotional behavior in rhesus
monkeys. PNAS 104: 1412814133.
Kasai K, Nakamura Y, White R. 1990.
Amplification of variable number
of tandem repeats (VNTR) locus
(pMCT118) by the polymerase
chain reaction (PCR) and its
application to forensic science. J
Forensic Sci 35 (5): 196-200.
Lekagul B, McNeely JA. 1977. Mammals of
Thailand. Bangkok: Assosiation
for Conservation of Wild Life.
Lesch et al. 1996. Association of anxietyrelated traits with a polymorphism
in the serotonin transporter gene
regulatory region. Science 274:
1527-1531.
Lesch et al. 1997. The 5-HT transporter
gene-linked polymorphic region
(5-HTTLPR) in evolutionary
perspective: alternative biallelic
variation in rhesus monkeys. J
Neural Transm 104: 1259-1266.
Miller-Butterworth CM et al. 2007.The
serotonin transporter: sequence
variation in Macaca fascicularis
and its relationship to dominance.
Behav Genet 37:678-696.
Murphy DL et al. 2004. Serotonin
transporter:
gene,
genetic
disorder, and pharmacogenetic.
Mol Interv 4(2):109-123.
Napier JR, Napier PH. 1967. A Handbook of
Living
Primates.
London:
Academic.
Napier JR, Napier PH. 1985. The Natural
History of Primates. Massachusetts:
The MIT press.
Nei M. 1987. Molecular Evolutionary
Genetics. New York: Columbia
University.
Oi T. 1990. Patterns of dominance and
affiliation in wild pig-tailed
macaque in Sumatra Barat.
International
Journal
of
Primatology 11 (4): 339-356.
7
Smuts BB et al. 1987. Primate Societies.
Chicago: The University of
Chicago.
Tegëlstrom H. 1986. Mitochondrial DNA in
natural populations: An improved
routine for the screening of genetic
variation based on sensitive silver
staining. Electrophoresis 7:226229.
Ting-Ting L, En-Min Y, Kirk Lin Y. 2009.
Social and Genetic Mating Systems
of the Asian Lesser White-toothed
Shrew, Crocidura shantungensis, in
Taiwan. J Mammal 90 (6): 13701380.
Zeanah CH. 2005. Handbook of Infant
Mental Health. 2nd Edition. New
York: The Guilford.