11 III. METODE PENELITIAN A. Tahap Laboratorium 1. Uji

III. METODE PENELITIAN
A. Tahap Laboratorium
1. Uji Kemampuan Isolat
a. Tempat dan Waktu Penelitian
Uji kemampuan 40 isolat bakteri dilaksanakan di laboratorium Biologi dan
Bioteknologi Tanah, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Pengujian dilakukan pada bulan Juli 2014 – Desember 2014.
b. Bahan dan Alat
1) Bahan
Bahan yang dibutuhkan pada tahap ini meliputi 40 isolat bakteri awal,
media YMA (Yeast extract mannitol agar), media Jensen, dan media
Pikovskaya.
2) Alat
Alat yang digunakan antara lain petridish, autoclave, jarum ose, tabung
reaksi, dan kaca pembesar.
c. Pelaksanaan Penelitian
Isolat-isolat bakteri yang digunakan telah melewati pengujian antagonistik
terhadap Foce secara in vitro. Berdasarkan pengujian tersebut, diketahui 28
diantaranya mampu menghambat perkembangan Foce. Dua puluh delapan
isolat tersebut, yaitu B1, B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9, B11, B12, B13, B18,
B20, B21, B22, B23, B24, B25, B26, B27, B29, B31, B34, B35, B36, B37,
B38, B40.
Empat puluh isolat bakteri awal diuji secara in vitro pada media selektif
untuk mengetahui kemampuan menyediakan unsur hara. Pengujian menambat
nitrogen menggunakan media tanpa nitrogen yaitu media YMA dan media
Jensen. Pengujian melarutkan fosfat menggunakan media dengan fosfat tidak
terlarut yaitu media Pikovskaya. Setiap isolat bakteri tersebut digoreskan pada
masing-masing media selektif sebanyak dua ulangan. Pengamatan dilakukan
dua hari kemudian.
11
12
d. Pengamatan Peubah
1) Bakteri penambat nitrogen
Isolat bakteri yang mampu hidup dengan baik pada media selektif bebas
nitrogen (YEMA dan/atau Jensen) merupakan bakteri penambat nitrogen
secara in vitro
2) Bakteri pelarut fosfat
Isolat bakteri yang mampu melarutkan fosfat akan membentuk zona
bening di sekeliling koloni.
e. Analisis Data
Data yang diperoleh dari uji kemampuan isolat bakteri digunakan untuk
mengelompokkan
bakteri
sebagai
acuan
rancangan
perlakuan
tahap
selanjutnya.
2. Uji Viabilitas pada Carrier
a. Tempat dan Waktu Penelitian
Uji viabilitas pada berbagai macam carrier dilakukan di laboratorium
Biologi dan Bioteknologi Tanah, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas
Maret, Surakarta pada bulan Desember 2014-Maret 2015.
b. Bahan dan Alat
1) Bahan
Bahan yang digunakan antara lain: 40 isolat bakteri awal, media NA
(Nutrient agar), zeolit, gambut, limbah budidaya jamur, dan media Nutrient
Broth.
2) Alat
Alat yang digunakan meliputi: petridish, tabung reaksi, autoclave,
timbangan analitis, mikropipet, stoples inkubasi, hand colony counter, dan
kaca pembesar.
c. Perancangan Penelitian
Penelitian dilaksanakan menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap
dengan dua faktor, yaitu konsorsium bakteri dan komposisi carrier. Masingmasing formulasi diulang 2 kali, sehingga terbentuk rancangan perlakuan
sebagai berikut:
13
B0C1
B0C2
B0C3
B1C1
B1C2
B1C3
B2C1
B2C2
B3C2
B3C1
B3C2
B3C3
Keterangan
B0 : Kontrol (tanpa inokulasi bakteri)
B1 : Konsorsium bakteri antagonis terhadap Foce
B2 : Konsorsium bakteri penyedia unsur hara
B3 : Konsorsium bakteri multifungsi
C1 : Carrier zeolit dan gambut
C2 : Carrier zeolit , gambut dan limbah budidaya jamur
C3 : Carrier cair (Nutrient Broth)
d. Pelaksanaan Penelitian
Tahap ini terdiri dari beberapa langkah, yaitu persiapan konsorsium
bakteri, persiapan carrier, inokulasi konsorsium bakteri pada carrier, dan uji
viabilitas. Persiapan konsorsium bakteri dilakukan dengan memperbanyak
seluruh isolat bakteri pada media miring dalam tabung reaksi, kemudian
disimpan selama 3 hari atau hingga seluruh permukaan media tertutup koloni
bakteri. Koloni yang terbentuk merupakan koloni tunggal, jika terjadi
kontaminasi maka akan dilakukan perbanyakan ulang.
Langkah selanjutnya, yaitu menimbang bahan-bahan carrier yang akan
digunakan, lalu memasukkannya dalam stoples penyimpanan formulasi. Setiap
stoples berisi 100 gram carrier dengan perbandingan berat 1:1 dan 100 ml
untuk carrier NB. Stoples tersebut ditutup menggunakan kain, kemudian
disterilisasi
menggunakan
autoclave.
Sterilisasi
carrier
dan
stoples
penyimpanan ini dilakukan saat semua perbanyakan isolat telah berhasil.
Isolat-isolat bakteri dan carrier telah siap, maka selanjutnya melakukan
inokulasi konsorsium bakteri pada carrier. Isolat-isolat bakteri tersebut
dikelompokkan sesuai perlakuan, kemudian setiap kelompok bakteri tersebut
dicampur dalam 10 ml garam fisiologis (10% dari berat carrier). Garam
fisiologis yang berisi konsorsium tersebut dituangkan dalam carrier dan
14
dicampur merata. Semua langkah-langkah tersebut dilakukan secara aseptis.
Stoples-stoples tersebut ditutup dan disimpan pada suhu ruang.
Setelah semua formulasi telah terbentuk, selanjutnya melakukan uji
viabilitas. Viabilitas mikroba selama masa penyimpanan diuji berdasarkan
kepadatan populasi mikroba per gram atau ml contoh pupuk yang dihitung
dengan teknik pengenceran bertingkat (101– 107). Mikroba dalam larutan yang
sudah diencerkan ditumbuhkan dalam media agar NA dengan metode spread
plate. Seri pengenceran yang ditumbuhkan adalah 10-3, 10-5, 10-7 (untuk masa
simpan 0 hari) dan 10-1, 10-3, 10-5 (untuk masa simpan 3 dan 6 minggu). Setiap
seri pengenceran yang ditanam, diulang 2 kali. Koloni yang tumbuh pada
media NA dihitung sebagai nilai kepadatan dan diamati sebagai perhitungan
indeks keragaman. Pengujian ini dilakukan sebanyak tiga kali, yaitu langsung
setelah konsorsium bakteri diinokulasikan, 3 minggu setelah inokulasi, dan 6
minggu setelah inokulasi.
e. Pengamatan Peubah
1) Kepadatan populasi bakteri
Kepadatan populasi dapat diketahui dengan cara menghitung jumlah
koloni bakteri yang tumbuh pada media NA (pada setiap seri pengenceran).
Jumlah koloni yang memenuhi syarat yaitu antara 30-300 koloni, jika
memenuhi syarat tersebut maka selanjutnya dihitung dalam bentuk CFU/g,
kemudian angkat tersebut diubah dalam bentuk logaritma.
2) Keragaman bakteri
Keragaman bakteri diketahui dengan cara mengidentifikasi kolonikoloni yang tumbuh pada media NA dan dihitung jumlah koloni yang
memiliki morfologi sama. Jumlah koloni tersebut dihitung menggunakan
metode Shannon-indeks (H). Perhitungan indeks keragaman ShannonWiener (H’) menggunakan rumus:
;
f. Analisis Data
Data yang diperoleh dari hasil pengamatan dianalisis menggunakan
ANOVA, lalu dilanjutkan dengan uji duncan 5% untuk mengetahui signifikansi
dari setiap perlakuan.
15
B. Uji In Vivo pada Lahan Degradatif
1. Tempat dan Waktu Penelitian
Persiapan formulasi perlakuan pada uji in vivo pada lahan degradatif
dilaksanakan di laboratorium Biologi dan Bioteknologi Tanah, Fakultas Pertanian,
Universitas Sebelas Maret pada bulan Mei 2015. Aplikasi formulasi-formulasi
tersebut dilakukan pada lahan degradatif yang teretak di desa Gondosuli,
Tawangmangu, Karanganyar pada bulan Mei 2015 sampai dengan Oktober 2015.
2. Bahan dan Alat
a. Bahan
Bahan yang digunakan meliputi: 40 isolat bakteri awal, media NA, media
NB, zeolit, gambut, limbah budidaya jamur, benih Bawang Putih varietas
Tawangmangu Baru, tanah dari desa Pancot.
b. Alat
Alat yang diperlukan antara lain: autoclave, shaker, botol kultur bakteri,
pot inkubasi, dan peralatan budidaya Bawang Putih.
3. Perancangan Penelitian
Penelitian pada tahap ini merupakan pengaplikasian formulasi-formulasi pada
tahap uji viabilitas pada lahan degradatif terhadap tanaman bawang. Selain
formulasi-formulasi tersebut juga ditambahkan beberapa perlakuan kontrol yang
menjadi perbandingan. Penelitian dilaksanakan dengan metode Rancangan Acak
Kelompok Lengkap. Setiap petak formulasi diulang 3 kali, setiap petak terdiri dari
10 tanaman dengan jarak tanam 15 cm × 15 cm. Sehingga, terbentuk rancangan
perlakuan:
Kontrol
KG
KP
B0C1
B0C2
B0C3
B1C1
B1C2
B1C3
B2C1
B2C2
B2C3
B3C1
B3C2
B3C3
Keterangan
Kontrol : Tanpa masukan carrier
KG : Cara budidaya petani Bawang Putih desa Gondosuli
KP : Tanah dan cara budidaya petani Bawang Putih desa Pancot
B0 : Kontrol (tanpa inokulasi bakteri)
16
B1 : Konsorsium bakteri antagonis terhadap Foce
B2 : Konsorsium bakteri Penyedia Unsur Hara
B3 : Konsorsium bakteri multifungsi (penambat nitrogen dan/atau pelarut fosfat
dan/atau antagonis terhadap Foce)
C1 : Carrier zeolit dan gambut
C2 : Carrier zeolit, gambut, dan limbah budidaya jamur
C3 : Carrier cair (Nutrient Broth)
4. Pelaksanaan Penelitian
Penelitian diawali dengan persiapan formulasi yang akan diaplikasikan.
Perbanyakan konsorsium bakteri dilakukan dengan cara membuat konsorsium
bakteri dalam media NB (suspensi bakteri) dan diperbanyak secara bertingkat.
Mula-mula membuat 3 konsorsium bakteri (antagonis terhadap Foce, penyedia
unsur hara, dan multifungsi) dalam 10 ml NB. Konsorsium-konsorsium tersebut
diletakkan pada alat shaker selama satu jam/ hari selama 3 hari, kemudian 10 ml
konsorsium tersebut dicampur dalam 90 ml NB, sehingga terbentuk 100 ml
larutan NB yang berisi konsorsium bakteri.
Persiapan carrier yang dilakukan sama seperti pada tahap uji viabilitas,
namun dengan skala yang lebih besar yaitu 700 gram. Carrier yang telah siap,
dicampur dengan 70 ml larutan NB yang berisi konsorsium bakteri. Formulasiformulasi tersebut disimpan dalam pot inkubasi untuk carrier padat dan tabung
erlenmeyer untuk carrier cair. Formulasi-formulasi tersebut diinkubasi selama 3
minggu.
Setelah 3 minggu inkubasi, formulasi-formulasi tersebut diaplikasikan pada
petakan seberat 225 gram/petak serta mengolah tanah. Persiapan perlakuan cara
budidaya petani Bawang Putih desa Gondosuli (KG) dilakukan aplikasi pupuk
SP36, Phonska, dan pupuk kandang berasal dari kotoran ayam. Persiapan
perlakuan tanah dan cara budidaya petani Bawang Putih desa Pancot (KP),
dilakukan dengan membuat lubang petakan sedalam 50 cm, kemudian diisi
dengan tanah berasal dari desa Pancot (lahan produktif-supresif) serta dipupuk
menggunakan kompos kotoran kambing dengan rumput kering, dan pupuk urea.
17
Perlakuan-perlakuan tersebut didiamkan selama satu minggu, sebelum ditanam
benih Bawang Putih.
Penanaman dilakukan tepat 7 hari setelah pengolahan tanah. Penyulaman
masih dilakukan hingga 7 hari setelah tanam. Pengamatan yang dilakukan selama
masa tanam, meliputi insiden penyakit dan tinggi tanaman. Pengamatan insiden
penyakit dilakukan dengan cara menghitung tanaman yang mati akibat BPB per
petak perlakuan. Selama masa tanam juga dilakukan perawatan, penyiraman dan
penyiangan, namun tidak dengan pemupukan susulan. Pada saat panen akan
dilakukan pengamatan umbi sehat, umbi busuk, berat umbi, diameter umbi,
panjang akar, berat basah tanaman, dan berat kering tanaman.
5. Pengamatan Peubah
a) Insiden penyakit
Insidens penyakit diamati pada setiap minggu selama masa tanam. Nilai
insiden penyakit dihitung per petak perlakuan. Insiden penyakit dihitung
dengan rumus:
Insidens penyakit =
b) Tinggi tanaman
Tinggi tanaman diukur pada saat panen. Pengukuran dilakukan terhadap 5
tanaman sampel dari 10 tanaman per petak perlakuan. Tinggi tanaman diukur
pada bagian pangkal batang semu hingga daun terpanjang.
c) Berat brangkasan (tanaman atas dan akar)
Tanaman bawang putih yang dipanen dipisahkan antara batang (bagian
atas), umbi, dan akar. Batang dan akar ditimbang sesaat setelah dicabut dari
tanah, sebagai berat basah tanaman. Bagian batang dan akar terbut dikeringkan
dalam oven selama ±48 jam dengan suhu ±80˚C. Setelah beratnya konstan,
brangkasan ditimbang kembali untuk mengetahui nilai berat kering tanaman.
Tanaman yang ditimbang untuk berat brangkasan hanya 5 tanaman sampel dari
10 tanaman per petak.
d) Berat umbi
18
Umbi pada setiap tanaman dipisahkan dari batang dan akar. Umbi-umbi
tersebut ditimbang sesaat setelah dicabut dari tanah. Penimbangan berat umbi
dilakukan dua kali, yaitu berat umbi 5 tanaman sampel dari 10 tanaman per
petak dan 10 tanaman per petak.
6. Analisis Data
Data yang diperoleh dari hasil pengamatan dianalisis menggunakan ANOVA,
lalu dilanjutkan dengan uji duncan 5% untuk mengetahui signifikansi dari setiap
perlakuan.