bio.unsoed.ac.id

9
III. METODE PENELITIAN
A. Lokasi, Waktu, dan Materi Penelitian
1. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler, Balai
Besar Penelitian Bioteknologi dan Pemuliaan Tanaman Hutan (BBPBPTH),
Purwobinangun, Pakem, Sleman, Yogyakarta. Penelitian dilaksanakan
selama 3 bulan dari bulan April hingga Juni 2013.
Sampel berupa daun Jabon Putih N. cadamba berasal dari kebun
koleksi yang di tanam di Magelang, sedangkan Jabon Merah N.
macrophyllus berasal dari kebun koleksi di persemaian (BBPBPTH). Aksesi
jabon yang digunakan dalam penelitian ini adalah 9 sampel Jabon Putih dan
20 sampel Jabon Merah. Koleksi materi Jabon Putih berasal dari Sumatera
Selatan sementara sampel Jabon Merah berasal dari Sulawesi Utara.
2. Materi
2.1. Alat
Alat yang digunakan adalah sebagai berikut : timbangan analitik,
mikrotube 1,5 dan 2 ml, bedbeader, small rotator, sentrifugator 1500
rpm (rotasi per menit), mikropipet 0,5 µl, 2 µl, 10 µl , 20 µl, 100 µl,
1000 µl, dan 5 ml, pipet tip sekali pakai, aspirator, microwave,
desikator, lemari pendingin, vortex, sendok kimia, gunting, gel tray,
bak elektroforesis, well plate 96 thermocycler, BIO-RAD Gel DocTM
EQ), jas lab serta sarung tangan dan masker.
2.2. Bahan
Bahan yang digunakan adalah sampel daun Jabon Putih dan Jabon
bio.unsoed.ac.id
Merah, buffer (1M Tris pH 9,0 ; 05M NaCl), Agarose, 0,5M EDTA
(Ethidium Tetraasetat), 10% CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl
Ammonium Bromide), β-mercaptoetanol, Aquades, Chlorofrm, NaOAc
(Natrium Acetat), Isopropanol, Etanol 70% dan 100% New Wash,
larutan NaI (Natrium iodide), silica, ddH2O, 10x Stoffel Buffer, dNTP
10
(deoksinukleotida), MgCl2, enzim Amplitaq DNA polymerase (Kapa),
dan primer yang diproduksi oleh Operon Technologies (Vivantis).
B. Bagan Alir Penelitian
Tahapan kerja yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi ekstraksi DNA,
purifikasi DNA, kuantifikasi DNA, amplifikasi DNA melalui PCR-RAPD,
elektrophoresis, dan analisis hasil PCR. Ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan
metode CTAB menurut Doyle and Doyle (1990) yang kemudian dimodifikasi
oleh Shiraishi and Watanabe (1995). Ekstraksi menhasilkan DNA Crude yang
kemudian dipurifikasi untuk mendapatkan DNA yang murni. Selanjutnya
dilakukan kuantifikasi untuk menghitung konsentrasi DNA sehingga dapat
disiapkan DNA template sebanyak 10 ng/µl. Amplifikasi DNA dilakukan
menggunakan primer RAPD, dan hasilnya kemudian dianalisis. Diagram tahapan
kerja dapat dilihat pada Gambar 3.1.
bio.unsoed.ac.id
11
Tahapan kerja
Hasil yang diperoleh
Ekstraksi DNA
Crude DNA
Purifikasi DNA
DNA murni
Kuantifikasi DNA
Konsentrasi DNA sampel
Dilusi DNA
Pengenceran dengan
penambahan H2O
PCR
Amplifikasi DNA
Elektroforesis
Profil RAPD
Analisis profil
RAPD
Data biner
Pogram POPGENE 1.32
Data Keragaman genetik dan jarak
genetik
Gambar 3.1. Diagram tahapan kerja
C. Cara Kerja
1. Ekstraksi DNA
bio.unsoed.ac.id
Metode ekstraksi yang dilakukan adalah metode CTAB. Ekstraksi
ini bertujuan untuk mendapatkan total DNA dari sampel daun yang diuji.
DNA yang diperoleh disebut crude DNA, yaitu DNA yang masih
tercampur dengan RNA dan senyawa kontaminan seperti metabolit
sekunder. Adanya metabolit sekunder dalam tanaman ditandai dengan
kekentalan pada hasil isolasi DNA. Hal ini menyebabkan kesulitan dalam
12
reaksi PCR akibat penghambatan aktivitas Taq polymerase. Salah satu
metabolit sekunder yang banyak ditemukan pada tanaman adalah senyawa
fenol. Pemberian β-mercaptoetanol dalam proses ekstraksi DNA dapat
mencegah proses oksidasi senyawa fenolik yang menghambat aktifitas
radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat.
Prosedur ekstraksi menggunakan metode CTAB :
a. Sampel daun jabon ditimbang seberat 100 mg, kemudian dipotong kecilkecil, setelah itu dimasukkan ke dalam mikrotube 2 ml, kemudian
tambahkan larutan buffer CTAB sebanyak 1,5 ml (Tabel 3.1.). Sampel
dihaluskan dengan menggunakan mini beadbeater selama 5 menit atau
kira-kira sampel halus dan homogen dengan larutan buffer.
Tabel 3.1. Buffer metode CTAB (1,5 ml untuk 1 sampel)
No.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Bahan kimia
Dd H2O
1 M Tris, pH 9.0
5 M NaCl
0,5 M EDTA
10% CTAB
Β-mercaptoetanol
1 x reaksi (µl)
570
150
420
60
300
7,5
b. Sampel diinkubasi pada suhu 650C selama 60 menit, kemudian larutan
dipisahkan sebanyak 1 ml dari ampas daun dipindahkan ke mikrotube
baru, setelah itu ditambahkan chloroform sebanyak 800 µl dan diputar
menggunakan rotator selama 20 menit. Kemudian larutan disentrifugasi
pada 12,000 rpm (rotasi per menit) selama 10 menit. Cairan terbagi
menjadi 2 bagian, yaitu larutan bagian bawah berupa chloroform dan
bagian atas berupa supernatan yang mengandung DNA tanaman, bagian
atas diambil sebanyak 700 µl dan dipindahkan ke mikrotube baru.
Setelah itu, ditambahkan 700 µl chloroform kedalam larutan, kemudian
bio.unsoed.ac.id
supernatan diputar kembali selama 20 menit sampai homogen dan
disentrifugasi pada 15,000 rpm selama 10 menit.
c. Supernatan diambil sebanyak 600 µl dan dipindahkan ke mikrotube baru,
ditambahkan 25 µl NaOAc (Natrium Asetat) dan 650 µl isopropanol.
Selanjutnya larutan dibolak-balik untuk mendapatkan DNA.
13
d. Larutan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Lalu disentrifugasi
pada 15,000 rpm selama 30 detik. Setelah itu supernatan dibuang dengan
aspirator, lalu ditambahkan etanol 70 % (dingin) sebanyak 1 ml untuk
mencuci pellet dan dinding tabung. Larutan disentrifugasi kembali pada
15,000 rpm selama 5 menit, kemudian supernatan kembali dibuang
dengan aspirator, langkah diatas diulang dengan menggunakan etanol
100 % (dingin) sebanyak 1 ml.
e. Supernatan dibuang dengan aspirator, kemudian pellet DNA dikeringkan
dengan vacum centrifuge MILLI-DRY selama 10 menit, setelah itu pellet
DNA dilarutkan dengan 200 µl dd H2O. sampel DNA disimpan dalam
refrigerator pada suhu 40C. pada tahap ini diperoleh sampel DNA (crude
DNA) yang belum bersih, sehingga perlu dilakukan proses purifikasi
(pemurnian) untuk mendapatan DNA murni.
2. Purifikasi DNA
DNA hasil ekstraksi dipurifikasi untuk meminimalkan senyawasenyawa kontaminan yang dapat mengganggu reaksi PCR. Adanya
kandungan metabolit sekunder seperti fenol dapat menurunkan kemurnian
DNA dan menghambat menempelnya primer pada saat PCR.
Tahapan purifikasi menggunakan Gene Clean III Kit (Q-bio) :
1. Crude DNA (DNA kasar) sebanyak 50 µl dimasukkan ke dalam mikrotube
1,5 ml, kemudian ditambahkan NaI sebanyak 50 µl (3 x volume larutan
DNA), setelah itu ditambahkan 5 µl silica ( silica di vortex sebelum
digunakan), kemudian mikrotube diletakkan pada suhu ruangan selama 5
menit dan dihomogenkan setiap 1 menit (diusahakan tidak terbentuk
endapan), setelah itu disentrifugasi pada 10,000 rpm selama 30 detik, dan
supernatan dibuang menggunakan aspirator, sehingga menyisakan pellet
bio.unsoed.ac.id
DNA, kemudian pellet dicuci dengan 375 µl New Wash, disentrifugasi pada
13,000 rpm selama 30 detik, lalu supernatan dibuang.
2. Langkah diatas diulang sebanyak 3 kali; disentrifugasi pada 14,000 rpm dan
supernatan dibuang ; disentrifugasi pada 15,000 rpm supernatan dibuang.
Selanjutnya, pellet DNA dikeringkan dengan vacum MILLY-DRY selama
10 menit, kemudian ditambahkan 65 µl H2O dan divortex, setelah itu
14
disentrifugasi pada 15,000 rpm selama 2 menit. Terakhir supernatan diambil
sebenyak 57 µl dan dipindahkan ke mikrotube yang baru, setelah itu
konsentrasi DNA dihitung menggun Nano Vuo.
3. Kuantifikasi DNA
Kuantifikasi DNA merupakan prosedur untuk mengetahui konsentrasi
dan kualitas DNA setelah proses ekstraksi. Kuantifikasi menggunakan alat
Nano Vuo (Heathcare Bio Science AB). Prinsip kerja Nano Vuo ini adalah
menghitung rasio dan konsentrasi DNA pada penyerapan/absorbansi
beberapa macam gelombang cahaya (230 nm, 260nm, 280 nm, dan 320 nm).
DNA dinyatakan murni jika memiliki nilai rasio À260/À280 berkisar antara
1,8–2,0 (Muladno, 2002). Menurut Devereux dan Wilkinson (2004) rasio
À260/À280 < 1,8 menunjukkan adanya kontaminasi fenol atau protein pada
hasil ekstraksi. Khosravinia et al. (2007) juga menjelaskan bahwa DNA
dikatakan terkontaminasi RNA jika memiliki rasio À260/À280 > 2,0.
4. Dilusi DNA
Dilusi merupakan pengenceran DNA untuk memudahkan penggunaan
konsentrasi larutan DNA sesuai dengan kebutuhan. Penghitungan dilusi
menggunakan rumus :
V1xM1 = V2xM2.............................................................................. (3.1)
Keterangan:
V1 : Volume akhir hasil purifikasi (µl)
M1 : Konsentrasi DNA hasil kuantifikasi (ng/µl)
V2 : Volume akhir pengenceran (µl)
M2 : Konsentrasi DNA yang dibutuhkan (ng/µl).
5. Amplifikasi PCR-RAPD
5.1. Pembuatan PCR mix
bio.unsoed.ac.id
a. Disiapkan 96 well reaction plate.
b. Dimasukkan larutan DNA sebanyak 4 µl, kemudian disiapkan PCR mix
dengan mencampurkan ddH2O, 10x Stoffel Buffer, MgCl2, dNTP
(dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP), dan Ampli Taq polymerase kedalam
mikrotube sesuai dengan kebutuhan. Kebutuhan senyawa kimia untuk
reaksi PCR dihitung dan disesuaikan dengan jumlah sampel. Galat
15
untuk kesalahan pipet ditera sebesar 1,05. Volume standar yang
digunakan untuk satu reaksi adalah 10 µl, sehingga untuk 12 reaksi
misalnya, kebutuhan PCR mix dapat dilihat pada Tabel 3.1.
c. Sebanyak 6 µl dimasukkan kedalam plate PCR mix. reaksi plate
ditutup, selanjutnya divortex.
d. Langkah terakhir plate dimasukkan ke dalam mesin PCR.
Tabel 3.2. Volume senyawa untuk running PCR.
Komponen Reaksi
ddH2O
10x Stoffel Buffer
MgCl2
dNTPs (2,5 mM)
Amplitaq DNA
polymerase
Primer
DNA (Conc. 2,5 ng/ µl)
1x reaksi (µl)
2,45
1
1,2
0,8
0,05
x 1,05x 12 (µl)
30,87
12,6
15,12
10,08
0,63
0,5
4
6,3
5.2. Reaksi PCR (Polymerase Chain Reaction)
Amplifikasi PCR dilakukan menggunakan Applied Gene Amp PCR
system 9700 dengan tahapan pre-heating selama 3 detik pada suhu 940C,
lalu inkubasi selama 60 detik pada suhu 950C, kemudian diikuti dengan
45 siklus denaturasi selama 30 detik pada suhu 940C, annealing selama
30 detik pada suhu370C, dan extension selama 90 detik pada suhu 720C.
Final extension dilakukan selama 5 menit pada suhu 720C, dan storage
pada suhu 40C. Primer yang digunakan pada tahap seleksi berjumlah 16
buah (Tabel 3.2.). Keenambelas primer yang digunakan dalam penelitian
ini ditentukan berdasarkan informasi dari penelitian pada Kopi Robusta
yang termasuk family Rubiaceae (Lashermes et al. 1993 dan Tshilenge et
al. 2009).
bio.unsoed.ac.id
Tabel 3.3. Daftar primer yang digunakan dalam skrining primer untuk analisis
RAPD
No Primer
1.
2.
3.
4.
5.
6.
OPA 1
OPA 3
OPA 4
OPA 5
OPA 7
OPA 11
Sekuens
(5’-3’)
CAGGCCCTTC
AGTCAGCCAC
AATCGGGCTG
AGGGGTCTTG
GAAACGGGTG
CAATCGCCGT
No
Primer
9.
10
11.
12.
13.
14.
OPA 14
OPA 16
OPA 17
OPA 19
OPA 20
OPQ 14
Sekuens
(5’-3’)
TCTGTGCTGG
AGCCAGCGAA
GACCGCTTGT
CAAACGTCGG
GTTGCGATCC
GGACGCTTCA
16
No Primer
7.
8.
Sekuens
(5’-3’)
TCGGCGATAG
CAGCACCCAC
OPA 12
OPA 13
No
Primer
15.
16.
OPQ 15
OPQ16
Sekuens
(5’-3’)
GGGTAACGTG
AGTGCAGCCA
4.3.Elektrophoresis
Elektroforesis bertujuan memisahkan fragmen-fragmen DNA hasil
amplifikasi PCR. Keberadaan fragmen DNA atau lokus gen terlihat
berupa pita setelah pewarnaan gel dan dilihat dibawah pendaran sinar UV
(BIO-RADGel DocTM EQ). Tahapan proses elektroforesis adalah sebagai
berikut :
4.3.1. Pembuatan Gel Agarose
Gel agarose digunakan sebagai media elektroforesis. Pembuatan
gel agarosa 1,2% adalah sebagai berikut :
a. Agarose sebanyak 0,96 gram dilarutkan ke dalam 4 ml 20x TBE
(Tris-Borac EDTA) dan ditambahkan 76 ml dd H2O, kemudian
campuran dipanaskan dalam microwave.
b. Larutan diletakkan pada suhu ruang dan dibiarkan menjadi hangat,
lalu ditambahkan 5 µl Ethidium Bromide (Et Br) sebagai pewarna,
kemudian larutan dituangkan ke dalam cetakan dengan ketebalan 3-5
mm, agarose siap digunakan setelah 1 jam.
4.3.2. Proses elektroforesis
Tahapan proses elektroforesis adalah sebagai berikut :
a. Sampel DNA hasil PCR dicampur dengan 2 µl Gel loading (GL3)
yang berfungsi sebagai pewarna atau penanda laju DNA dan
pemberat saat elektroforesis berlangsung.
b. DNA dimasukkan ke dalam sumuran yang terdapat dalam gel.
bio.unsoed.ac.id
c. Pada ujung kiri dan kanan sampel dimasukkan 2,5 µl DNA ladder.
d. Gel dielektroforesis pada tegangan 120 volt selama ± 3 jam.
4.3.3. Visualisasi
Visualisasi pita hasil amplifikasi pada gel dilakukan menggun BIORAD Gel DocTM EQ dengan menggunakan sinar UV. Gambar dapat
dilihat pada layar computer untuk kemudian disimpan dan dicetak.
17
D. Analisis Data
Pita-pita hasil amplifikasi DNA diubah menjadi data biner berupa nilai,
yaitu 1 apabila muncul pita dan 0 apabila tidak muncul pita. Ukuran molekul
fragmen DNA ditentukan dengan DNA ladder 100 bp. Data dianalisis
menggunakan program POPGENE 1. 32 (Yeh et al. 1999) dan program Gen AlEx
v6. POPGENE 1. 32 menghitung nilai keragaman genetik (genetic diversity) dan
jarak genetik (genetic distances) berdasarkan Nei’s Gene Diversity (1972) dan
Nei’s Original Measures of Genetic Distance (1992) dengan memanfaatkan
perbedaan frekuensi alel (frekuensi pita amplifikasi). Gen AlEx v6 untuk
menghitung Alel spesifik menggunakan frekuensi alel (AFP dan APT).
bio.unsoed.ac.id