Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler

KARAKTERISASI FISIOLOGI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER
ISOLAT-ISOLAT Bacillus spp PENGHASIL BAKTERIOSIN
ASAL HUTAN WANA WISATA CANGKUANG
ADE SATRIA SOPYAN
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
ABSTRAK
ADE SATRIA SOPYAN. Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler Isolat-isolat Bacillus
spp Penghasil Bakteriosin Asal Hutan Wana Wisata Cangkuang. Dibimbing oleh IMAN
RUSMANA dan ALINA AKHDIYA.
Isolat-isolat Bacillus spp diisolasi dari tanah Hutan Wana Wisata Cangkuang seperti isolat
A21, F13, dan G3 diketahui dapat menghambat pertumbuhan Xanthomonas oryzae pv. oryzae,
Escherichia coli, dan Staphylococcus aureus. Dalam penelitian ini dilakukan verifikasi daya
hambat, uji fisiologi secara manual maupun menggunakan MicrogenTM GN-ID A+B Panel dan
analisis sekuen gen 16S rRNA dari ketiga isolat tersebut. Isolat A21 memiliki IP paling besar
terhadap S. aureus dan E. coli, sedangkan isolat G3 memiliki IP paling besar terhadap X. oryzae
pv. oryzae. Isolat Bacillus spp memiliki kemampuan dalam mereduksi nitrat (kecuali F13),
menghidrolisis pati dan gelatin, dapat memfermentasi glukosa, dan memproduksi ß-galaktosidase.
Berdasarkan sekuen 16S rRNA, isolat A21 dan G3 masing-masing memiliki kemiripan sebesar
94% dan 95% dengan Bacillus cereus, sedangkan isolat F13 memiliki kemiripan sebesar 96%
dengan Bacillus subtilis. Kekerabatan antara ketiga isolat pada pohon filogenetik berada pada satu
kelompok.
ABSTRACT
ADE SATRIA SOPYAN. Physiological Characterization and Molecular Identification of
Bacteriocin Producer Bacillus spp Isolated from Cangkuang Forest. Supervised by IMAN
RUSMANA and ALINA AKHDIYA.
Bacillus spp from Cangkuang’s forest (A21, F13, and G3 isolates) were able to inhibit the
growth of Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Escherichia coli, and Staphylococcus aureus.
Determination of inhibition activity, physiologycal, and sequences of 16S rRNA gene were
conducted in this research. A21 isolate had the biggest inhibition index against S. Aureus and E.
coli. G3 isolate had the biggest inhibition index against X. oryzae pv. oryzae. All Bacillus isolates
showed a positive reaction for nitrates (exept F13), starch, gelatine, glucose, and O-nitrophenyl-βD-galactopyranoside. 16S rRNA sequences of A21 and G3 isolates showed 94-95% similarity to
Bacillus cereus, while F13 isolate had 96% similarity to Bacillus subtilis. Phylogenetic tree
showed that all isolates were placed in the same group.
KARAKTERISASI FISIOLOGI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER
ISOLAT-ISOLAT Bacillus spp PENGHASIL BAKTERIOSIN
ASAL HUTAN WANA WISATA CANGKUANG
ADE SATRIA SOPYAN
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Skripsi
Nama
NIM
: Karakterisasi Fisiologi dan Identifikasi Molekuler Isolat-isolat
Bacillus spp Penghasil Bakteriosin Asal Hutan Wana Wisata
Cangkuang
: Ade Satria Sopyan
: G34050208
Menyetujui :
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr.Ir. Iman Rusmana, M.Si.
NIP 196507201991031002
Alina Akhdiya, M.Si.
NIP 080130418
Mengetahui :
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr.Drh. Hasim, DEA
NIP 196103281986011002
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada ALLAH SWT atas segala kemudahan yang
diberikan sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian yang
dilaksanakan sejak bulan Februari 2009 hingga Juli 2009 ini ialah Karakterisasi Fisiologi dan
Identifikasi Molekuler Isolat-Isolat Bacillus spp Penghasil Bakteriosin Asal Hutan Wana Wisata
Cangkuang.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr.Ir. Iman Rumana, M.Si. dan Ibu Alina
Akhdiya, M.Si. selaku dosen pembimbing yang telah memberi bimbingan, kritik, dan saran selama
penelitian dan penulisan laporan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada
Bapak Ir. Hadisunarso yang telah memberi saran dan masukan.
Penulis juga sampaikan terima kasih dan syukur kepada IR crew, Aren, Mba Ari, Mba
Ratna, Mba Rika, keluarga besar Lab mikrobiologi FMIPA-IPB, OWA-Biologi, dan teman-teman
Biologi angkatan 42 yang telah membantu selama berlangsungnya kegiatan karya ilmiah. Serta
pihak-pihak yang secara tidak langsung telah membantu dalam pengumpulan data karya ilmiah ini.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Orang Tua, serta seluruh keluarga atas segala doa
dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2009
Ade Satria Sopyan
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 5 September 1987 dari ayah Judin Sofyan dan ibu
Cicih Sukaesih. Penulis merupakan anak ketiga dari empat bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus
dari SMA Negeri 5 Bogor dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui Undangan
Seleksi Masuk IPB. Penulis terpilih masuk Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Perkembangan Hewan
pada tahun ajaran 2007/2008 dan mata kuliah Mikrobiologi Dasar pada tahun ajaran 2009/2010.
Penulis aktif sebagai staff OWA Biologi pada tahun 2006-2007 dan ketua OWA Biologi pada tahun
2007-2008.
Pada saat mengikuti perkuliahan, penulis melakukan studi lapang di Kawasan wana Wisata
Cangkuang Sukabumi, dengan judul makalah “Bacillus sp. Penghasil Zat Antimikrob dari Tanah
Hutan Wana Wisata Cangkuang”. Penulis juga melakukan praktik lapangan di Taman Safari
Indonesia Cisarua-Bogor pada bulan Juli-Agustus 2008, dengan judul makalah “Konservasi Exsitu Tapir (Tapirus indicus) di Taman Safari Indonesia Cisarua-Bogor”.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .......................................................................................................................... vi
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................................................... vi
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................................. vi
PENDAHULUAN
Latar Belakang .......................................................................................................................... 1
Tujuan Penelitian ...................................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat ....................................................................................................................
Bahan dan Alat .........................................................................................................................
Metode Penelitian
Pemurnian dan Peremajaan Isolat .......................................................................................
Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus spp Terhadap Bakteri Indikator ............................
Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat .......................................................................................
Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA Genom ..............................................................
Sekuensing DNA .................................................................................................................
Analisis Filogenetik .............................................................................................................
1
1
1
1
1
2
2
2
HASIL
Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus spp Terhadap Bakteri Indikator .................................
Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat ............................................................................................
Isolasi, Amplifikasi, dan visualisasi DNA Genom ...................................................................
Sekuensing DNA ......................................................................................................................
Analisis Filogenetik ..................................................................................................................
2
2
3
3
4
PEMBAHASAN ............................................................................................................................ 4
SIMPULAN ................................................................................................................................... 6
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................................................... 6
LAMPIRAN .................................................................................................................................. 8
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Indeks penghambatan isolat Bacillus spp Penghasil antimikrob terhadap bakteri indikator
dengan metode cawan tuang …................................................................................................
2 Ciri-ciri fisiologi isolat-isolat Bacillus sp …............................................................................
3 Indeks hidrolisis pati ................................................................................................................
4 Indeks proteolitik (24 jam) …...................................................................................................
5 Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA dengan menggunakan program BLAST-N …................
2
3
3
3
4
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Hasil elekroforesis dari amplifikasi gen 16S rRNA menunjukan pita DNA berukuran
~1.3 kb …................................................................................................................................... 3
2 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dari isolat-isolat Bacillus spp yang
dibandingkan dengan sekuen gen 16S rRNA dari beberapa spesies Bacillus lainnya dan
bakteri uji …............................................................................................................................... 4
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Hasil Pewarnaan Gram isolat-isolat Bacillus spp …................................................................... 9
2 Hasil Pewarnaan endospora isolat-isolat Bacillus spp …........................................................... 10
3 Hasil sekuen gen 16S rRNA dan BLAST-N isolat-isolat Bacillus spp ….................................. 11
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Genus Bacillus merupakan bakteri yang
sangat baik digunakan sebagai agen
biokontrol (Jack et al. 1995). Bakteri ini
merupakan bakteri gram positif berbentuk
batang, bersifat aerobik, serta dapat
menghasilkan endospora (Schilinger 1990;
Kone & Fung 1992; Klaenhammer 1993; Irina
et al. 2001).
Bakteriosin
dapat
menghambat
pertumbuhan bakteri dan telah digunakan
sebagai biopreservative dan terapeutik (Janes
et al. 1999). Bakteriosin adalah zat antimikrob
polipeptida atau protein yang diproduksi oleh
mikroorganisme dan bersifat bakterisida
maupun
bakteriostatik.
Bakteriosin
membunuh sel targetnya dengan menyisip
pada membran target dan mengakibatkan
fungsi membran sel menjadi tidak stabil
sehingga menyebabkan lisis sel (Atlas &
Bartha 1998).
Beberapa isolat Bacillus yang diisolasi
dari tanah Hutan Wana Wisata Cangkuang
seperti isolat A, B, D, E, F, G, J, dan N
diketahui dapat menghambat pertumbuhan
Escherichia coli dan Staphylococcus aureus
(Sopyan & Findy 2007). Identifikasi isolatisolat Bacillus tersebut secara morfologi,
fisiologi, dan molekular penting dilakukan
untuk mengetahui spesies dan karakter
fisiologi dari isolat-isolat tersebut. Spesies
yang telah teridentifikasi karakter fisiologinya
memungkinkan dilakukannya kajian lebih
mendalam tentang bioprospeksi hingga
peluang rekayasa genetikanya.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengkarakterisasi
ciri-ciri fisiologi dan mengidentifikasi secara
molekular isolat-isolat Bacillus spp asal tanah
Hutan Wana Wisata Cangkuang yang
memiliki potensi menghasilkan bakteriosin.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan
Februari 2009 sampai dengan bulan Juli 2009 di
Laboratorium
Mikrobiologi,
Departemen
Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan, yaitu isolat
Bacillus spp asal tanah Hutan Wana Wisata
Cangkuang, Sukabumi, Jawa Barat. Media
agar nutrisi, agar pati, dan agar susu skim.
Peralatan yang digunakan, yaitu PCR (Perkin
Elmer Biosystem, USA), Laminar Air Flow,
autoklaf, sentrifuse, elektroforesis mini-gel
(BioRad Mini-Sub Cell GT, CA, USA), UV
Transluminator (Hoefer Scientific Instruments,
San Fransisco, USA), dan peralatan lainnya
yang biasanya digunakan di laboratorium
mikrobiologi.
Metode Penelitian
Pemurnian dan Peremajaan Isolat
Isolat-isolat Bacillus spp dimurnikan dan
diremajakan pada media agar nutrisi dan
diinkubasi pada suhu ruang selama dua hari.
Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus spp
terhadap Bakteri Indikator
Verifikasi daya hambat isolat-isolat
Bacillus spp terhadap bakteri target dilakukan
dengan mengamati zona bening yang
terbentuk menggunakan metode cawan tuang
(Lisboa et.al 2006). Bakteri uji yang
digunakan
ialah
Escherichia
coli,
Staphylococcus aureus, dan Xanthomonas
oryzae pv. oryzae. Besarnya indeks
penghambatan (IP) dihitung dengan rumus:
IP =
diameter zona (mm) - diameter koloni (mm)
diameter koloni (mm)
Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat
Isolat-isolat Bacillus spp yang telah
murni dan berumur kurang dari 24 jam dan
±72 jam secara berurutan diamati bentuk dan
morfologinya melalui pewarnaan Gram dan
spora (Hadioetomo 1993). Selanjutnya
dilakukan karakterisasi fisiologi dengan
menggunakan MicrogenTM GN-ID A+B Panel.
Sedangkan uji pati dan aktivitas proteolitik
dilakukan
masing-masing
dengan
menggunakan media agar pati dan agar susu
skim (Hadioetomo 1993).
Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA
Genom
Isolasi DNA genom dilakukan dengan
metode Lazo (Lazo et al. 1987). DNA genom
hasil isolasi digunakan untuk amplifikasi gen
16S rRNA. Amplifikasi gen 16S rRNA
dilakukan dengan mesin Polymerase Chain
Reaction (PCR) menggunakan kit Ready To
Go PCR Beads (Pharmacia-Biothec) dan
primer spesifik 16S rRNA untuk prokariot,
yaitu 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA
2
GTC) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA
CAA GGC) (Marchesi et al. 1998).
Kondisi PCR yang digunakan meliputi
pradenaturasi (94oC, 2 menit), denaturasi
(95oC, 30 detik), Annealing primer (55oC, 30
detik), Elongation atau perpanjangan primer
(72oC, 1 menit), dan post PCR (75oC, 5
menit), dengan jumlah siklus sebanyak 30
siklus.
Pemisahan DNA produk PCR dilakukan
pada
Elektroforesis
mini-gel
dengan
menggunakan agarose 1% pada tegangan
listrik 70 volt selama 45 menit. Agarose
direndam dalam Ethidium Bromida (EtBr)
lalu diamati di atas UV Transluminator.
Sekuensing DNA
DNA hasil amplifikasi lalu dilakukan
sekuensing di Charoen Phokphand-Jakarta
untuk mengetahui urutan basa DNA-nya. Hasil
sekuen kemudian dijajarkan dengan data
GenBank menggunakan program BLAST-N
(Basic Local Alignment Search ToolNucleotide) dari situs NCBI (National Center
for
Biotechnology
Information)
untuk
mengetahui kemiripan spesies dari isolat yang
diuji.
Analisis Filogenetik
Konstruksi pohon filogenetik dilakukan
dengan menggunakan program MEGA 4.0
(Tamura et al. 2007), metode Neighbor
Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x.
HASIL
Verifikasi Daya Hambat Isolat Bacillus spp
terhadap Bakteri Indikator
Isolat-isolat Bacillus spp penghasil
antimikrob dari hasil studi lapang di Hutan
Wana Wisata Cangkuang, Sukabumi, Jabar
diverifikasi daya hambatnya terhadap E. coli,
S. Aureus , dan X. oryzae pv. oryzae dengan
menggunakan metode cawan tuang (Lisboa et
al. 2006). Tahap ini dilakukan untuk
mengetahui bahwa isolat yang digunakan
ialah isolat Bacillus spp yang menghasilkan
zat antimikrob. Tiga isolat dipilih untuk
menunjukkan aktivitas penghambatan terbaik
dengan membentuk zona bening terhadap
ketiga bakteri indikator tersebut yaitu isolat
A21, F13, dan G3.
Besarnya daya hambat Bacillus spp
A21, F13, dan G3 terhadap ketiga bakteri uji
ditunjukkan pada Tabel 1. Kisaran IP isolat
Bacillus spp yang diuji pada X. oryzae pv.
oryzae, E. coli, dan S. aureus secara berurutan
pada kisaran 1-3.3, 1-2.25, dan 0.25-1.67.
Isolat G3 memiliki IP terbesar terhadap X.
oryzae pv. oryzae. yaitu 3.3, isolat A21
memiliki IP terbesar terhadap E. coli dan S.
aureus yaitu 2.25 dan 1.67. Isolat F13
memiliki IP yang cukup besar terhadap X.
oryzae pv. oryzae yaitu 2.67.
Tabel 1 Indeks penghambatan isolat Bacillus
spp penghasil antimikrob terhadap
bakteri uji dengan metode cawan
tuang
Aktivitas penghambatan terhadap
Staphylococcu
Esherichi
X. oryzae pv.
s aureus
a coli
oryzae
Isolat
IP
IP
IP
A21
1,67
2,25
1
F13
1
1
2,67
G3
0,25
1
3,3
Keterangan: IP= Indeks Penghambatan
Uji Morfologi dan Fisiologi Isolat
Semua isolat Bacillus spp bersifat Gram
positif, berbentuk batang pendek hingga
batang sedang dengan penataan tunggal, dan
membentuk endospora. Endospora yang
dimiliki isolat-isolat Bacillus spp berbentuk
bulat dengan posisi sentral.
Uji
fisiologi
dilakukan
dengan
menggunakan MicrogenTM GN-ID A+B Panel,
sedangkan uji pati dan aktivitas proteolitik
dilakukan secara manual masing-masing
menggunakan media agar pati dan agar susu
skim. Setelah diinkubasi selama semalam
maka didapatkan hasil seperti pada Tabel 2.
Isolat-isolat Bacillus spp yang diuji
menunjukkan hasil positif terhadap uji pati, uji
proteolitik,
glukosa,
O-nitrophenyl-β-Dgalaktopiranosa
(ONPG),
Tryptophan
Deaminase (TDA), gelatin, nitrat (kecuali
F13), Xilosa (kecuali A21), indol (kecuali
G3), urease (hanya A21), (VP) VogesProskauer (hanya A21), dan inositol (hanya
A21). Sedangkan uji-uji fisiologi seperti lisin,
ornitin, H2S, sitrat, manitol, sorbitol, malonat,
ramnosa, laktosa, arabinosa, adonitol, salisin,
rafinosa,dan arginin menunjukkan hasil
negatif untuk semua isolat. Semua isolat
Bacillus sp. mempunyai kemampuan untuk
menghidrolisis pati yang ditunjukkan pada
Tabel 3. Indeks hidrolisis yang dihasilkan
semakin meningkat dengan bertambahnya
waktu inkubasi. Ketiga isolat Bacillus dapat
menghasilkan enzim protease, dilihat dari
terbentuknya zona bening pada media agar
3
susu skim (Tabel 4). Isolat A21 memiliki
indeks proteolitik terbesar dari isolat yang
lainnya, yaitu sebesar 0,68.
Tabel 2 Ciri-ciri fisiologi isolat-isolat Bacillus spp
Uji Fisiologi
Nitrat
Lisin
Ornitin
H2S
Glukosa
Manitol
Xilosa
ONPG
Indol
Urease
VP
Sitrat
TDA
Gelatin
Malonat
Inositol
Sorbitol
Rhamnosa
Sukrosa
Laktosa
Arabinosa
Adonitol
Raffinosa
Salisin
Arginin
Pati
Isolat Bacillus spp
A21
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
F13
+
+
+
+
+
+
+
G3
+
+
+
+
+
+
+
Tabel 3 Indeks hidrolisis pati
Indeks hidrolisis
Indeks hidrolisis
pada 24 jam
pada 48 jam
Isolat
Ø
koloni
(mm)
A21 7
F13
5
G3
7
Keterangan:
Ø
zona
bening
(mm)
IH
3
koloni
(mm)
Ø
zona
bening
(mm)
IH
24.8
8.5
25.1
2.18
0.42
1.44
0.93
13.5
7.8
6
0.2
6
1.03
14.2
10.3
Ø = Diameter
IH= Indeks Hidrolisis
Tabel 4. Indeks proteolitik (24 jam)
Indeks proteolitik
Ø zona bening
Isolat Ø koloni
A21
F13
G3
(mm)
(mm)
14,7
7,4
14
24,7
11,6
23
IP
0,68
0,57
0,64
Isolasi, Amplifikasi, dan Visualisasi DNA
genom
Isolasi DNA genom isolat-isolat Bacillus
spp dengan menggunakan metode Lazo (Lazo
et al. 1987) dapat dilakukan dengan baik,
yang dibuktikan dengan terbentuknya satu pita
untuk tiap DNA genom isolat-isolat Bacillus
spp setelah dielektroforesis dan diamati di atas
UV transluminator.
Amplifikasi
gen 16S rRNA dari
3
ketiga
isolat
Bacillus
spp
dengan
menggunakan primer universal 63f dan 1387r
yang spesifik untuk prokario. Hasil
amplifikasi pada gel elekroforesis yang
diamati
di
atas
UV
transluminator
memperlihatkan adanya pita DNA penyandi
gen 16S rRNA dengan ukuran ~1.3 kb setelah
dibandingkan dengan DNA marker (1 kb DNA
ladder) (Gambar 1).
1
2
3
M
10 kb
1.5 kb
1 kb
M: marker 1 kb DNA ladder
Sumur 2: Isolat F13
Sumur 1: Isolat A21
Sumur 3: Isolat G3
Gambar 1 Hasil elektroforesis dari amplifikasi
gen 16S rRNA menunjukkan pita
DNA berukuran ~1.3 kb.
Sekuensing DNA
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA
kemudian disekuen untuk mengetahui urutan
nukleotidanya. Hasil sekuen gen 16S rRNA
tiap isolat kemudian dianalisis similaritasnya
dengan data di GenBank menggunakan
program BLAST-N (Basic Local Alignment
Search Tool-Nucleotida). Berdasarkan analisis
program BLAST-N diketahui homologi
spesies dari isolat yang diuji (lampiran 3 ).
Isolat A21 dan G3 masing-masing
memiliki kemiripan sebesar 94% dan 95%
dengan Bacillus cereus, sedangkan isolat F13
memiliki kemiripan sebesar 96% dengan
Bacillus subtilis (Tabel 5). Hasil sekuen ketiga
isolat tersebut termasuk ke dalam kingdom:
Bacteria, Filum: Firmicutes, kelas: Bacili,
ordo: Bacillales, dan famili: Bacillaceae.
4
Tabel 5 Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA
dengan menggunakan program BLAST-N
Isolat
A21
F13
G3
Spesies
Bacillus
homolog
B.cereus
galur
HDYM-5
B.subtilis
galur
YC-11B
B.cereus
isolat
NH12-2
%
identitas
No.akses
94 %
EF428235.2
96%
EU240964.1
95%
EF690431.1
oryzae pv. oryzae, E. coli, dan S. aureus
dilakukan untuk membuktikan bahwa isolatisolat yang digunakan masih memiliki
aktivitas penghambatan antimikrob terutama
terhadap
bakteri
patogen.
Genus
Xanthomonas merupakan bakteri patogen
pada tanaman. Bakteri ini termasuk dalam
famili Pseudomonadaceae dan merupakan
bakteri gram negatif. X. oryzae pv. oryzae
merupakan bakteri patogen pada tanaman
yang dapat menyebabkan penyakit bacterial
blight pada padi. Serangan yang dihasilkan
menyebabkan kerusakan pada daun padi dan
mempunyai efek yang serius pada produksi
tanaman ini. Bakteri ini masuk melalui luka
atau pori-pori air (Hydathodes) pada daun dan
menyerang sistem transportasi xilem tanaman
( Dath & Devadath 1983).
Bakteri E. coli dan S. aureus digunakan
sebagai bakteri uji untuk melihat kisaran
spektrum dari zat antimikrob dihasilkan dari
ketiga isolat Bacillus tersebut. Escherichia
coli dan Staphylococcus aureus merupakan
bakteri standar yang digunakan dalam
pengujian bakteri penghasil antimikrob
(Suparnika 2007). Pada umumnya bakteriosin
lebih efektif menghambat galur-galur bakteri
yang berkerabat dekat dengan bakteri
penghasil bakteriosin (Jack et al. 1995).
Semua isolat Bacillus yang diuji juga dapat
menghambat pertumbuhan X. oryzae pv.
oryzae. Hal ini menunjukkan zat antimikrob
yang dihasilkan oleh ketiga isolat Bacillus spp
memiliki spektrum yang luas, ini dibuktikan
dengan terbentuknya zona hambat terhadap
ketiga bakteri uji.
Bacillus sp. merupakan bakteri Gram
Analisis Filogenetik
Data sekuen gen 16S rRNA dari ketiga
isolat kemudian dibandingkan dengan
beberapa data sekuen gen 16S rRNA dari
beberapa spesies Bacillus lainnya seperti B.
subtilis galur YC11-B dan B. cereus galur
HDYM-5. Hasil perbandingan sekuen ini
kemudian divisualisasikan dalam bentuk
pohon filogenetik yang dapat menunjukkan
kekerabatan (Gambar 2). Isolat A21 dan G3
yang diuji berada satu kelompok dengan B.
cereus galur HDYM-5, sedangkan isolat F13
berada satu kelompok dengan B. subtilis galur
YC11-B. Angka pada cabang menunjukkan
nilai bootstrap.
PEMBAHASAN
Verifikasi daya hambat isolat-isolat
Bacillus spp terhadap bakteri indikator X.
33
99
Isolat A21
B. cereus galur HDYM-5
58
Isolat G3
B. pumilus
99
93
98
B. circulans galur A8
S. aureus
Isolat F13
100
B. subtilis galur YC11-B
E. coli
X. oryzae
Gambar 2 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dari isolat-isolat Bacillus spp
yang dibandingkan dengan sekuen gen 16S rRNA dari beberapa spesies Bacillus lainnya
dan bakteri uji.
5
positif, berbentuk batang tunggal atau rantai,
motil dengan flagela, bersifat aerob atau
anaerob fakultatif, kemoorganotrof dengan
metabolisme fermentatif dan respiratif. Genus
ini memiliki kemampuan membentuk
endospora di dalam sel vegetatifnya.
Endospora adalah struktur berdinding tebal,
sangat refraktif, dan hanya mengandung
sedikit air sehingga resisten terhadap cekaman
fisik (panas, kekeringan, UV) ataupun kimia
(desinfektan, antibiotik, asam, dan basa)
(Black 1999). Genus Bacillus memiliki
endospora berbentuk oval dan kadang-kadang
bundar atau silinder (Holt et al. 1994). Sifat
endospora yang sangat resisten terhadap
berbagai cekaman dan kondisi lingkungan
dapat dijadikan bahan pertimbangan dalam
mempermudah distribusi suatu produk yang
berasal dari mikroorganisme hidup.
Kemampuan fisiologi ketiga isolat
Bacillus sangat beragam antara lain peka
terhadap panas, pH, dan salinitas, uji katalase
dan VP positif, mampu mereduksi nitrat, dan
menghidrolisis pati (Holt et al. 1994). Nilai
positif pada uji nitrat menunjukkan bahwa
isolat dapat mereduksi nitrat (NO3-) menjadi
nitrit (NO2-) dengan menggunakan enzim
nitrat reduktase. Kemampuan isolat Bacillus
sp. dalam menghasilkan senyawa yang tidak
bersifat asam atau produk akhir netral seperti
asetilmetil karbinol dari asam organik (asam
piruvat) sebagai hasil fermentasi glukosa
ditunjukkan dengan hasil VP positif. Uji
glukosa
yang
positif
menunjukkan
kemampuan isolat Bacillus sp. dalam
melakukan fermentasi karbohidrat dan
menghasilkan produk akhir berupa asam. Uji
ONPG
dilakukan
untuk
mengetahui
kemampuan isolat dalam memproduksi enzim
ß-galaktosidase yang dapat menghidrolisis
substrat ONPG yang mengandung laktosa dan
bersifat kromogenik, hasil positif akan
mengubah warna media yang tidak berwarna
menjadi kuning.
Kemampuan isolat dalam menghidrolisis
makromolekul ditunjukkan oleh uji pati, uji
gelatin, dan uji proteolitik yang bernilai
positif. Uji pati positif menujukkan
kemampuan isolat dalam menghidrolisis pati
yang merupakan polisakarida menjadi
oligosakarida dan monosakarida dengan
menggunakan
enzim
amilase.
Indeks
hidrolisis yang dihasilkan oleh semua isolat
semakin meningkat dengan bertambahnya
waktu inkubasi. Hal ini terjadi karena isolat
Bacillus terus memanfaatkan pati dengan
menghidrolisisnya untuk digunakan sebagai
sumber karbon.
Uji gelatin dan uji proteolitik yang positif
menunjukkan
bahwa
isolat
dapat
menghidrolisis gelatin ataupun protein yang
merupakan molekul berukuran besar menjadi
polipeptida dan kemudian menjadi asam
amino dengan menggunakan enzim proteolitik
ekstraseluler berupa gelatinase dan protease
(Aronson et al. 1971).
Analisis sekuen gen 16S rRNA
menunjukkan dua isolat yaitu isolat A21 dan
G3 memiliki kemiripan terdekat dengan
Bacillus cereus, sedangkan isolat F13
memiliki kemiripan terdekat dengan Bacillus
subtilis. Analisis gen 16S rRNA dengan
sekuen oligonukleotida adalah cara yang
efektif untuk mengetahui taksonomi prokariot
termasuk bakteri genus Bacillus dan dapat
dihubungan secara langsung dengan data
filogenetik (Fox et al. 1977).
Bacillus subtilis merupakan salah satu
anggota genus Bacillus yang diketahui mampu
memproduksi berbagai macam zat antimikrob,
spesies ini dapat memproduksi lebih dari 24
jenis antibiotik dengan berbagai struktur dan
bakteriosin.
Bakteriosin
yang
banyak
diproduksi oleh B. subtilis ialah subtilin,
ericin, mersacidin, sublancin, dan subtilosin A
(Stein et al. 2004; Stein 2005). Spesies ini
juga mampu memproduksi berbagai macam
enzim ekstraseluler seperti protease, lipase,
amilase, nuklease, dan fosfatase (Slepecky &
Henphill 1992) sehingga dapat digunakan
sebagai agen bioremidiasi bahan organik di
perairan. Agen bioremidiasi yang baik yaitu
dapat memperbanyak diri dengan cepat dan
memiliki kemampuan enzimatik yang baik.
Bacillus subtilis diketahui tidak bersifat
patogen baik terhadap tumbuhan, hewan, dan
manusia karena memiliki virulensi dan
toksisitas yang rendah (Claus & Berkeley
1986). Selain itu B. subtilis juga dapat
bertahan
pada
kondisi
yang
tidak
menguntungkan
dengan
membentuk
endospora dan mampu hidup secara anaerobik
dengan kehadiran glukosa dan nitrat (Claus &
Berkeley 1986; Slepecky 1992).
Seperti halnya B. subtilis, Bacillus cereus
juga mampu memproduksi antibiotik dan
6
antimikrob.
Bakteri
ini
juga
dapat
menghasilkan enzim ektraseluler yaitu
protease ( Aronson et al. 1971). Bacillus
cereus diketahui dapat bersifat patogen
terhadap makanan karena memiliki virulensi
dan toksisitas yang cukup tinggi (Jekti 1990),
namun untuk strain tertentu dari Bacillus
cereus
dapat
menghasilkan
senyawa
antimikrob yang dapat dimanfaatkan sebagai
agen pengendali hayati. Senyawa antimikrob
yang dihasilkan dapat berupa bakteriosin dan
antibiotik.
Senyawa
antimikrob
yang
dihasilkan oleh ketiga isolat hanya merupakan
bakteriosin ( Findy 2009).
SIMPULAN
Isolat Bacillus spp penghasil
bakteriosin asal Hutan Wana Wisata
Cangkuang
mampu
menghambat
pertumbuhan X. oryzae pv. oryzae., E. coli,
dan S. aureus. Isolat A21 memiliki IP paling
besar terhadap S. aureus dan E. coli,
sedangkan isolat G3 memiliki IP paling besar
terhadap X. oryzae pv. oryzae. Semua isolat
merupakan bakteri gram positif dengan
endospora berbentuk bulat. Isolat Bacillus spp
memiliki kemampuan dalam mereduksi nitrat
(kecuali F13), menghidrolisis pati dan gelatin,
dapat
memfermentasi
glukosa,
dan
memproduksi ß-galaktosidase.
Berdasarkan sekuen 16S rRNA,
isolat A21 dan G3 masing-masing memiliki
kemiripan sebesar 94% dan 95% dengan
Bacillus cereus, sedangkan isolat F13
memiliki kemiripan sebesar 96% dengan
Bacillus subtilis. Kekerabatan antara ketiga
isolat pada pohon filogenetik berada pada satu
kelompok.
DAFTAR PUSTAKA
Aronson AI, Angelo N, Holt SC. 1971.
Regulation of extracelular protease
production in Bacillus cereus T:
characterization of mutans producing
altered amounts of protease. J
Bacteriol 133:1016-1025.
Atlas RM, Bartha R. 1998. Microbial Ecology
Fundamentals and Applications. Ed.
ke-4. California: Benjamin.
Black JG. 1999. Microbiology Principles and
Exploration. Ed ke-4. New York:
John Wiley & Sons.
Claus D, Berkeley RCW. 1986. Genus
Bacillus. Di dalam: Sneath PHA et
al., eds. Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology. Volume ke2. Baltimore: Lippincott Willians &
Wilkins. hlm 1105-1139.
Dath AP, Devadath S. 1983. Role of inoculum
in irrigation water and soil in the
incidence of bacterial blight of rice.
Indian Phythopathol 36: 142-144.
Findy K. 2009. Aktivitas penghambatan
Bacillus sp. Terhadap Xanthomonas
oryzae pv. oryzae, Pseudomonas
syringae
pv.
glycines,
dan
Pseudomonas fluorescens [Skripsi].
Bogor : Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Fox GE, Pechan KR, Woese CR. 1977.
Comparative cataloging of 16s
ribosomal
ribonucleic
acid:
molecular approach to prokaryotic
systematics. J Syst Bacteriol 27:4-57.
Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar
dalam Praktek. Jakarta: Gramedia
Pustaka Utama.
Holt JG, Kreig NR, Sneath PHA, Stanley JT,
Williams ST. 1994. Bergey’s Manual
of Determinative Bacteriology. Ed
ke-9. Baltimore: Lippincott Willians
& Wilkins.
Irina VP, Philippe B, Bernard V, Bernard F.
2001. In Vitro anti Heliobacter pylori
activity of the Probiotic strain B.
subtilis is due to secreation of
Antibiotic. J
Antimicrob Agent
Chemother 45:3156-3161.
Jack RW, Tagg JR, Ray B. 1995. Bacteriocin
of Gram positive bacteria. Microbiol
Rev 59:171-200.
Janes ME, Nannapanemi R, Johnson MG.
1999.
Identification
and
characterization of two bacteriosin
producing bacteria isolated from
garlic and ginger root. J Food
Protect 62:899-904.
Jekti RP. 1990. Cermin Dunia Kedokteran.
Jakarta : Pusat Penelitian Penyakit
Menular, Badan Penelitian Dan
pengembangan
Kesehatan,
7
Departemen Kesehatan RI.
Klaenhammer TR. 1993. Genetics of
bacteriosin produced by latic acid
bacteria. FEMS Microbiol Rev 12:3986.
Kone K, Fung YC. 1992. Understanding
bacteriosin and their uses in foods.
Dairy, Food and Enviromental
Sanitation 12:282-285.
Lazo GR, Roffey R, Gabriel DW. 1987.
Conservation of plasmid DNA
sequences and pathovar identification
of strain Xanthomonas campestris.
Pytopathol 77: 1461-1467.
Lisboa MP, Bonato D, Bizani D, Henriques
JAP,
Brandelli
A.
2006.
Characterization of a bakteriosin-like
substance produced by Bacillus
amyloliquefaciens isolated from the
Brazillian
atlantic
forest.
Int
Microbial 9:111-118.
Marchesi JR et al. 1998. Design and
evaluation of useful bacterium
specific PCR primer that amplify
genes coding for bacterial 16SrRNA. App Environ Microbiol
64:795-799.
Schillinger U. 1990. Bacteriocins of latic acid
bacteria. Biotechnol. Food Quality. p.
55-74.
Slepecky RA, Henphill HR. 1992. The Genus
Bacillus-nonmedical. Di dalam:
Balows A, Trupper HG, Dworkin M,
Harder W, Schleifer KH, editor. The
Prokaryotes. Ed. ke-2. New York:
Springer-Verlag. hlm 1663-1696.
Sopyan AS, Findy K. 2007. Bacillus Sp.
Sebagai Penghasil Zat Antimikrob
Dari Tanah Hutan wana Wisata
Cangkuang [Studi Lapang]. Bogor :
Program Sarjana, Institut Pertanian
Bogor.
Stein T, Dusterhus S, Stroh A, Entian KD.
2004. Subtilosin production by two
Bacillus subtilis subspecies and
variance of the sbo-alb cluster. Appl
Environ Microbiol 70:2349-2353.
Stein T. 2005. Bacillus subtilis antibiotics:
structures, syntheses and specific
functions. Mol Microbiol 56:845–
857.
Suparnika I. 2007. Aktivitas antimikrob
Bacillus sp. yang diisolasi dari
tambak udang [skripsi]. Bogor:
Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007.
MEGA 4 : Molecular evolutionary
genetics analysis (MEGA) software
version 4.0. Mol Biol Evol 24: 15961599.
LAMPIRAN
9
Lampiran 1 Hasil pewarnaan Gram isolat-isolat Bacillus spp
Pewarnaan Gram
Isolat A21
Perbesaran : 100x10
Isolat F13
Perbesaran : 100x10
Isolat G3
Perbesaran : 100x10
Keterangan :
(
) = Morfologi sel Isolat Bacillus spp
10
Lampiran 2 Hasil pewarnaan endospora isolat-isolat Bacillus spp
Pewarnaan Spora
Isolat A21
Perbesaran : 100x10
Isolat F13
Perbesaran : 100x10
Isolat G3
Perbesaran : 100x10
Keterangan :
(
) = Endospora
11
Lampiran 3 Hasil sekuen gen 16S rRNA dan BLAST-N isolat-isolat Bacillus spp
A) Isolat A21
Urutan nukleotida hasil sekuen gen 16S rRNA isolat A21 (forward)
GNTGNGNCAGCTCTCANNANTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTACTGCC
CATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGC
ATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATT
AGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGG
GTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA
GGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAG
GCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTG
GCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGT
AATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAGCGCGCGCAGGTGGTTT
CTTAAGTCTGATGTGAANGCCCNCGGCTCACCCGTGGAGGGTCNTNGNAACTGGNAA
NTTGAGTGCAAAAGAANTGGATTCCCTGTGTACCGGTGAATGCNTAANATTTGGAGAA
CCCCNTGNCAANGCACTTTCTGTCTGTACTGACCTGAGGCCNAAGCTGGGAACAACNG
ATAAAACCTGGTATCCCCCCTAACANAANGCTAATGTTAAGGTTCCCCNTTATGTAANTA
CCNTAACNNCCCTGGGAATCGCCCAAGTNAACCAAGATNAGGGCCCCCANCGNGACT
GNTTTTNNAAACCNAACTNCGGTNACCNTGAACCANANGGTTCCTNGGANAAAAGGG
GAGTTNCCCCCNNGGATNGGTACCCCANCCCTTTTTCCTNTTGNCCNGGGCGGGACNA
AGGGAAAATNCCTNNGNCCCNTAGGNAAANACNGGGATNACNTNTTNGNCCCA
Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat A21
>gb|EF428235.2| Bacillus cereus strain HDYM-5 16S ribosomal RNA
gene, partial
sequence
Length=1532
Score = 1016 bits (1126), Expect = 0.0
Identities = 647/687 (94%), Gaps = 17/687 (2%)
Strand=Plus/Plus
Query 10
GCTCTCANNAN-TTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTA-CCTGCCCATAAGACT
||||||| | |||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||
Sbjct 79
GCTCTCAAGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACT
Query 68
GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 139
GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAA
Query 128
ATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 199
ATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGT
Query 188
GAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 259
67
138
127
198
187
258
247
12
GAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC
318
Lampiran 3 (lanjutan)
Query 248
TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 319
TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG
Query 308
GACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 379
GACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTC
Query 368
TGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 439
TGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCA
Query 428
GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 499
GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATC
Query 488
CGGAATTATTGGGCGT-AAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAANGCCCNC
|||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||| |
Sbjct 559
CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCAC
Query 547
GGCTCACCCGTGGAGGGTC-NTNGNAACTGGNA-ANTTGAGTGCAAAAAAG--AANTGG|||||| |||||||||||| | | |||||| | | ||||||||| || || || |||
Sbjct 619
GGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGA
Query 602
ATTCCCTGTGTACCGGTG-AATGCNTA-ANATTTGGA-GAAC-CCCNTGNC-AANGC-AC
||||| |||||| ||||| ||||| || | || |||| |||| || || | || || ||
Sbjct 679
ATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGAC
Query
656
Sbjct
739
TTTCT-GTCTGT-ACTGAC-CTGAGGC
||||| |||||| |||||| |||||||
TTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGC
679
765
307
378
367
438
427
498
487
558
546
618
601
678
655
738
13
Lampiran 3 (lanjutan)
B) Isolat F13
Urutan nukleotida hasil sekuen gen 16S rRNA isolat F13 (reverse)
GTTAGGNGGANGATCCGCGATTACTANCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGA
CTGCGATCCGAACTGAGAAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGC
CCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTG
ACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGA
ATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCAC
GACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAANGGGACGTC
CTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGA
ATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTC
TTGCGACCGTACTCCCCANGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCG
GAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGNGTGGACTACNAGGGTATCTANTC
CTGTTCGCTCCCCACGCTTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACANACANAAAGTCGCCTNC
GCCACTGGNGTTCTCNAATNTCTACGCATTTCACGCTACCCGTGNAATCCACTCCCCTC
TTTTGCACTCANTTCCCNAGTTTCAATGACCCNCCCGGTNGANCNGGGGTTTNCATNA
NAATTAAAAACCCCTGNGANCCTTTACCCCANANTTCGNAAAGCTTGCCCNTAGTNTA
CCNGGTGGGGNNNTATTACCNGGNTTNGGTAGACNNAAGAACNCCNTNAANGATTTTT
TCNTAAAAATTTANCNAACTNTCNCCGGGTNNCCNAATTNCTTGGAANCNAGNNCCCA
AANGGNGTCCCNNGGAACNNNGGGNNCTTNTGAATNCNANAAGGNGNCTNGGGACC
TTTTANGNANCGTACCTGNNCTAGNCCTCCCCAAAAANCCCTNTTNGGG
Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat F13
>gb|EU240964.1| Bacillus subtilis strain YC-11B 16S ribosomal RNA
gene, partial
sequence
Length=800
Score = 1141 bits (1264), Expect = 0.0
Identities = 676/700 (96%), Gaps = 7/700 (1%)
Strand=Plus/Plus
Query 336
TTCTCCCCTCACCT-AANGTGCCCATCGC-ACTTTACGCATCTNTA-ANCTC-TTGNGGT
|||||| ||||||| || |||| |||||| ||||||||||||| || | ||| ||| |||
Sbjct 3
TTCTCCTCTCACCTTAAGGTGCACATCGCCACTTTACGCATCTCTACACCTCCTTGTGGT
Query 392
CACCGCNTCCGCTGAAANAC-ANACATTGACTGCGACTCCTCGCTTTTCGCACCCCTCGC
|||||| |||||||| | || | |||||||||||||||||||||||| ||||||||||||
Sbjct 63
CACCGCTTCCGCTGAGAGACCAGACATTGACTGCGACTCCTCGCTTT-CGCACCCCTCGC
Query 451
TTGTCCTNATCTATGGGANCATCAGGTGNGGCATTTGCTACTCACGATTCACAATCCCCC
||||||| |||||||||| ||||| ||| |||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 122
TTGTCCTAATCTATGGGACCATCAAGTGCGGCATTTGCTACTCACGATTCACAATCCCCC
Query 511
AAAGGCGGGGAATCACGACGTCGATTGCGTAATTCGTGAGGCGNACCCCTCATGCCAGCG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||
391
62
450
121
510
181
570
Sbjct 182
AAAGGCGGGGAATCACGACGTCGATTGCGTAATTCGTGAGGCGGACCCCTCATGCCAGCG
14
241
Lampiran 3 (lanjutan)
Query 571
TTCTGACTTTGAGTTTCCTTAACTGCCCCCGGGCGTGTTCGCCACCTCGTACACCAAATT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 242
TTCTGACTTTGAGTTTCCTTAACTGCCCCCGGGCGTGTTCGCCACCTCGTACACCAAATT
Query 631
AAGCTTCGTTGCGCTTCTTGGAATGGTCCAGAACTGTAGGAGACTGTTAGGATCTCTATC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 302
AAGCTTCGTTGCGCTTCTTGGAATGGTCCAGAACTGTAGGAGACTGTTAGGATCTCTATC
Query 691
CTGCAGGGNAAGCCCCCGTCTCACTGTCCACCACGTACCAACAGCAGTCGAGCACAGCAC
|||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 362
CTGCAGGGGAAGCCCCCGTCTCACTGTCCACCACGTACCAACAGCAGTCGAGCACAGCAC
Query 751
TCTACAACCCAATTCAGGGCGTTGCTCGCGTTGGGAACTAGAATCAACGGTCGTAAGTCA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 422
TCTACAACCCAATTCAGGGCGTTGCTCGCGTTGGGAACTAGAATCAACGGTCGTAAGTCA
Query 811
ACCCGTGAGATTCCACTGACGGCCACTGTTTGGCCTCCTTCCACCCCTACTGCAGTTTAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 482
ACCCGTGAGATTCCACTGACGGCCACTGTTTGGCCTCCTTCCACCCCTACTGCAGTTTAG
Query 871
TAGTACGGGGAATACTGGACCCGATGTGTGCACGATGTTACCTGTCTTGTTTCCCGTCGC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 542
TAGTACGGGGAATACTGGACCCGATGTGTGCACGATGTTACCTGTCTTGTTTCCCGTCGC
Query 931
TTTGGCGCTCCAATTCGGTTAGGGTGTTTAGACAAAGAGTCAAGCCTAGCGTCAGACGTT
||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 602
TTTGGCGCTCCAATTCGGTTAGGGTGTTTAGAC-AAGAGTCAAGCCTAGCGTCAGACGTT
Query
991
Sbjct
661
GAGCTGACGCACTTCGACCTTAGCNATCATTAGCGCCTAG
|||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||
GAGCTGACGCACTTCGACCTTAGCGATCATTAGCGCCTAG
1030
700
630
301
690
361
750
421
810
481
870
541
930
601
990
660
15
Lampiran 3 (lanjutan)
C) Isolat G3
Urutan nukleotida hasil sekuen gen 16S rRNA isolat G3 (forward)
AGCTCTCATAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGA
CTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACTGCATGGTTC
GAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGT
TGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCG
GCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATC
TTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCG
GGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTT
GACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGT
AGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAA
GTCTGATGTGAAAGCCCNCGGCTCANCCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGANACTTG
AGTGCAAAAAAAGAAAGTGGANTCCNTGTGTANCGGTGAATGCGTAAANATTTGGAG
AACCCCATNGGGNANGCNANTTTTGGTCTGTACTGACCTGAGNCCNAAACNTGGGGG
CAACAGGATTAATACCTGGTATCCCCCCTAACAATNNTGCTAANGTAAAGGTTNCCCCN
TTATGTGANTTACCNTAANNNCCCTGGGATCGCCCAGGTTAANTCAAGATTGCGGGNCC
CCANCGGANNTGTTTNTNAAAACNAAACTTCGGNTGATCTTNAACNAAAAGTTCNTCG
ANAANANGGGGNNTCCCCNGCGATNGTACCCACNCCTTTTTCCTTTGCTAGGCGANCN
ANGGAAATTNCTNCGCCCTAGGAAAACGGATNACCTTTGNCNAAT
Hasil BLAST-N sekuen gen 16S rRNA parsial dengan data GenBank isolat G3
>gb|EF690421.1| Bacillus cereus isolate NH11-2 16S ribosomal RNA
gene, partial
sequence
Length=1481
Score = 1108 bits (1228), Expect = 0.0
Identities = 690/727 (94%), Gaps = 14/727 (1%)
Strand=Plus/Plus
Query 2
GCTCTCAT-AAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACT
||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 86
GCTCTCAAGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACT
Query 61
GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACTGCATGGTTCGAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 146
GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACTGCATGGTTCGAA
60
145
120
205
Query 121
ATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGT 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||||
Sbjct 206
ATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGT 265
Query 181
GAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
240
Sbjct 266
GAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC
16
325
Lampiran 3 (lanjutan)
Query 241
TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 326
TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG
Query 301
GACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 386
GACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTC
Query 361
TGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 446
TGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCA
Query 421
GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 506
GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATC
Query 481
CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCNC
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |
Sbjct 566
CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCAC
Query 541
GGCTCANCCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGANACTTGAGTGCaaaaaaaGAAAGTGG|||||| |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| || | ||||||||
Sbjct 626
GGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGA
Query 600
ANTCCNTGTGTANCGGTG-AATGCGTAAANATTTGGA-GAACCCCA-TNGGGNANGCNAN
| ||| |||||| ||||| |||||||| | || |||| |||| ||| | | | | || |
Sbjct 686
ATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGAC
Query 657
TTT-TGGTCTGT-ACTGAC-CTGAGNC-CNAAA-CNTGGGG-GC-AACAGGATTA-ATA||| |||||||| |||||| ||||| | | ||| | ||||| || |||||||||| |||
Sbjct 746
TTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATAC
300
385
360
445
420
505
480
565
540
625
599
685
656
745
707
805
Query
708
Sbjct
806
CCTGGTA
|||||||
CCTGGTA
714
812