BARCODING DNA RANGKONG BADAK
advertisement
BARCODING DNA RANGKONG BADAK SEBAGAI UPAYA KONSERVASI GENETIK SATWA INDONESIA Alivia F.P Pradani*, Sofia Ery Rahayu2, Dwi Listyorini2 1) Program Studi Biologi, FMIPA, Universitas Negeri Malang 2) Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Negeri Malang Jalan Semarang No.5, Malang, Indonesia *Email: [email protected] ABSTRAK: Burung Rangkong Badak merupakan anggota dari genus Buceros yang mempunyai pelindung kepala berbentuk tanduk yang berwarna orange (Poonswad, 1993a). Saat ini di Indonesia populasi Rangkong Badak semakin menurun, hal ini disebabkan berkurangnya habitat burung akibat deforestasi hutan, berkurangnya makanan tempat bersarang, dan perburuan liar. Penelitian ini bertujuan untuk mendeskripsikan burung Rangkong Badak berdasarkan karakter morfologi dan mengetahui sekuen gen Cytochrome-c Oxidase Sub-unit I (COI). Penelitian ini bersifat deskriptif analitik meliputi pengamatan dan pengukuran bagian tubuh dan menganalisis sekuen gen COI. Gen COI diamplifikasi menggunakan primer universal Foward BirdF1 5’-TTC TCC AAC CAC AAA GAG ATT GC AC-3’ dan Primer Reverse Bird2 5’ACT ACA TGT GAG ATG ATT CCG AAT CCA G-3’ (Hebert et al., 2004). Analisis genetik menggunakan sofware MEGA6 dengan metode Maximum Likehood (ML), Neighbor Joining (NJ) dan Minimum Evolution (ME) dengan model perhitungan algoritmik parameter Kimura-2. Hasil identifikasi karakter morfologi menunjukan bahwa spesies yang diteliti adalah Rangkong Badak (Buceros rhinoceros). Hasil analisis genetik menggunakan ketiga metode dan BOLD System menunjukkan Rangkong Badak (Buceros rhinoceros) berkerabat dengan Rangkong Papan (Buceros bicornis) voucher KU08011. Kata Kunci: Rangkong Badak, Karakter Morfologi, DNA Barcode, Cytochrome-c Oxidase Sub-unit I (COI). ABSTRACT: Rhinoceros hornbill is a type the genus Buceros, species which has the character like a horn and have orange protective headgear (Poonswad, 1993). Currently in Indonesia Rhinoceros hornbill population has declined this is due to the reduced area of habitat due to deforestation, reduced food and nesting places, besides more serious threat is poaching. The research focuses to describe the rhinoceros hornbill is based on morphological characters and know the gene sequences Cytochrome c Oxidase Sub-unit I (COI). This is a descriptive exploratory includes observation and measurement parts of Rhinoceros hornbill species identification parameters. COI gene was amplified using universal primers 5'-TTC Foward BirdF1 TCC AAC AAA GAG CAC ATT GC AC-3 'and 5'-Primer Reverse Bird2 ACT ACA TGT GAG CCG AAT CCA ATG ATT G-3' (Hebert et al., 2004). The reconstruction of phylogenetic tree uses MEGA6 sofware using method Maximum likelihood (ML), Neighbor Joining (NJ) and Minimum Evolution (ME) with the algorithmic calculation model parameter Kimura-2. The identification results of morphological characters is known that the species researched were rhinoceros hornbill. The results of genetic analysis using all three methods and BOLD System shows the Rhinoceros hornbill related with Rangkong Papan (Buceros bicornis) KU08011 voucher. Keywords: Rhinoceros hornbill, character morphology, DNA Barcode, Cytochrome-c Oxidase Sub-unit I (COI). 1 2 Burung Rangkong Badak adalah anggota dari genus Buceros, spesies yang mempunyai karakter seperti bentuk tanduk dan mempunyai pelindung kepala yang berwarna orange (Poonswad, 1993). Burung Rangkong Badak merupakan salah satu spesies burung terbesar di Asia. Keanekaragaman burung Rangkong di Indonesia saat ini semakin hari populasi makin menurun. Hal ini disebabkan oleh berkurangnya kawasan habitat sebagai akibat deforestasi hutan, berkurangnya makanan, tempat bersarang, dan perburuan burung Rangkong. Di Indonesia terdapat beberapa jenis subspesies dari burung Rangkong Badak yaitu Buceros rhinoceros rhinoceros (Malay & Sumatera), Buceros rhinoceros borneonsis (Borneo), Buceros rhinoceros silvertris (Java) (Aviabase, 2003). Menurut Daftar Merah IUCN (Internasional Union For Conservation of Nature and Natural Resources), burung Rangkong Badak termasuk spesies yang hampir mengalami kelangkaan. CITES juga mengklasifikasikan satwa burung ini ke dalam kategori Appendix II, yaitu sebagai spesies yang dilarang untuk perdagangan komersial internasional karena hampir mengalami kelangkaan, kecuali jika perdagangan tersebut tunduk pada peraturan ketat, sehingga pemanfaatan yang tidak sesuai dapat dihindari (IUCN, 2008). Saat ini di Indonesia dukungan penuh mengenai konservasi burung Rangkong Badak ini telah dilakukan, konservasi dan upaya pelestarian burung Rangkong Badak dilakukan sebagai dukungan untuk melestarikan dan memelihara habitat Rangkong Badak tersebut, salah satu upaya pelestarian burung Rangkong Badak berada di Eco Green Park diantaranya adalah dengan penangkaran dan rehabilitasi burung Rangkong Badak. Hasil observasi di Eco Green Park terdapat beberapa burung Rangkong Badak dan berdasarkan pengamatan morfologi burung Rangkong Badak mempunyai morfologi yang berbeda seperti bentuk paruh, jenis kelamin, warna iris, ukuran tubuh burung Rangkong Badak, sehingga perlu dilakukan pendekatan secara molekular untuk memastikan apakah burung Rangkong Badak di Eco Green satu sub-spesies atau tidak. Selain itu pendekatan secara molekuler dapat digunakan untuk konservasi secara genetik. Sampai saat ini Eco Green Park belum melakukan konservasi secara genetik pada burung Rangkong Badak, strategi konservasi ini merupakan suatu langkah yang digunakan untuk menyelamatkan sumberdaya genetik suatu spesies dari kepunahan, sehingga perlu dilakukannya pendekatan secara molekular dengan teknik DNA barcode. METODE Penelitian ini menggunakan Rangkong Badak berjumlah 2 individu dan mengunakan darah burung Rangkong Badak di Eco Green Park, Jawa Timur dengan bantuan dokter hewan. Penelitian dilakukan berdasarkan tahap pengamatan morfologi yang di lakukan Eco Green Park, Batu Jawa Timur dan Preparasi DNA di Laboratorium Regulasi Jurusan Biologi UM & Laboratorium Bioteknologi Sentral MIPA Universitas Negeri Malang, dan Tahap sekuensing dilakukan di First BASE Laboratories, Malaysia. Penelitian ini dilaksanakan pada 3 bulan November 2014-April 2015. Alat yang digunakan seperti meteran kain untuk pengamatan morfologi, sedangkan untuk isolasi DNA Centrifuge, waterbath, microcentrifuge tube, high pure filter tube, mesin PCR, cetakan gel agarose, tray, mesin elektroforesis, venojack, microwave oven, Tube berisi Alkohol 96% 3ml, 1,5 PCR tube, , UV transluminator, oven sterilisasi, oven pengering, autoklaf, UV spektrofotometer, refrigerator digunakan untuk PCR dan Elektroforesis. HASIL Hasil Pengamatan Karakter Morfologi Burung Rangkong Badak Identifikasi karakter morfologi burung Rangkong Badak dilakukan dengan mengamati dan mengukur bagian-bagian tubuh yang merupakan parameter identifikasi spesies rangkong. Hasil pengamatan karakter morfologi burung kepala Rangkong Badak ditunjukan dengan Gambar 1.1 dibawah ini B. Paruh C. Iris RB 2 RB1 A. Balung (casque) Gambar 1.1 Karakter Morfologi dan Morfometrik Rangkong Badak bentuk balung (casque) (panah merah), paruh (panah biru) dan iris, (panah kuning). Karakter morfologi balung (casque) pada kedua individu mempunyai warna orange, sedangkan pada paruh keduanya memiliki warna putih, pengamatan morfologi pada iris mempunyai warna yang berbeda, pada Rangkong Badak Individu 1 memiliki warna iris merah, sedangkan pada Rangkong Badak Individu 2 memiliki warna iris putih. Pengukuran morfologi lainnya seperti bulu tubuh, bulu sayap, bulu penutup sayap dapat dilihat pada gambar 2.2 dibawah ini. 4 E. Bulu Sayap Tubuh F. Bulu Penutup Sayap RB 2 RB1 D. Bulu Tubuh Gambar 2.2 Karakter Morfologi dan Morfometrik Rangkong Badak bentuk Bulu Tubuh (panah ijo) Bulu Sayap Tubuh (panah orange ) dan Bulu Penutup Sayap, (panah ungu). RB 2 RB1 Pada pengamatan morfologi bagian bulu tubuh Rangkong badak individu 1 dan Rangkong Badak Individu 2 memiliki bulu tubuh seluruhnya berwarna hitam, dan pada bagian perut berwarna putih, sedangkan pada bulu penutup sayap tubuh (alula) keduanya memiliki pola warna coklat kehitaman. Hasil pengamatan morfologi ekor dan kaki burung dapat dilihat pada gambar 3.3 G. Ekor H. Kaki Gambar 3.3 Karakter Morfologi dan Morfometrik Rangkong Badak bentuk Ekor (panah biru gelap), Kaki (panah biru muda). 5 Pada hasil pengamatan morfologi bentuk ekor pada keduanya memiliki perbedaan pada Rangkong Badak 1 memiliki bentuk ekor yang lengkap memiliki corak pita berwarna hitam dibagian subterminal, sedangkan pada Rangkong Badak individu 2 mempunyai bentuk ekor yang lebih pendek, dikarenakan oleh pihak Eco Green Park ekor burung tersebut digunting. Pada hasil pengamatan morfologi bentuk kaki pada keduanya memiliki 4jari kaki (lengkap) dan mempunyai warna tapak kaki yang berwarna kuning kecoklatan. Pengamatan morfologi burung Rangkong Badak ini juga dilakukan dengan pengukuran morfometrik, hasil pengukuran karakter morfometrik dilakukan pada bagian tubuh tertentu yaitu penimbangan berat badan dan pengukuran dari panjang total tubuh; panjang sayap; rentang sayap; lebar sayap; lebar patagium; panjang ekor; panjang tarsus; diameter tarsus; panjang tapak kaki yang terdiri dari jari bercakar dengan jari tanpa cakar; panjang cakar ruas jari pertama (hallux), kedua (medial), ketiga dan keempat (lateral); panjang paruh ; tingggi paruh; lebar paruh; warna iris; jumlah bulu primer, jumlah bulu sekunder. No Karakter yang diukur Hasil Rangkong Rangkong Badak 1 Badak 2 1 Berat Badan 3,5 Kg 2 Kg 2 Panjang Total Badan 112 cm 82 cm 3 Panjang Sayap 58 cm 43 cm 4 Rentang Sayap 136 cm 86 cm 5 Lebar Sayap 52 cm 37 cm 6 Tinggi Paruh 6,5 cm 6 cm 7 Panjang Balung (Casque) 14 cm 15 cm 8 Panjang Paruh 21 cm 22 cm 9 Jumlah Bulu Primer 7 6 10 Jumlah Bulu sekunder 11 12 11 Panjang Ekor 40 cm 16 cm 12 Panjang Tarsus 14 cm 12 cm 13 Diameter Tarsus 11 cm 8 cm 14 lebar tapak 4,5 cm 12 cm 15 Panjang tapak kaki tanpa cakar 9 cm 8 cm 16 Panjang Tapak kaki dengan Cakar 11,5 cm 12 cm 17 Panjang Cakar Ruas Jari Pertama (hallux) 6 cm 6 cm 18 Panjang Cakar Ruas Jari Kedua (medial) 8 cm 5 cm 19 20 Panjang Cakar Ruas jari Ketiga Panjang Cakar Ruas Jari Keempat (lateral) 9 cm 7 cm 6,5 cm 7 cm 6 Identifikasi Spesies Berdasarkan DNA Barcode Gen COI Isolasi DNA dari darah burung Rangkong Badak dilakukan hingga memperoleh konsenterasi DNA murni dan cukup untuk melakukan ke tahap selanjutnya yaitu Polymerase Chain Reaction (PCR). Isolasi gen COI dilakukan dengan menggunakan sepasang primer universal, Panjang gen COI yang berhasil diamplifikasi sebesar ±700 dp. Setelah mendapatkan pita DNA yang sesuai dengan ukuran gen target, langkah selanjutnya yaitu tahap sekuensing untuk melihat susunan basa nukleotida DNA. Data hasil sekuensing berupa kromatogram yang dapat dibaca dengan menggunakan Software Finch TV. Sekuen gen COI burung Rangkong Badak dianalisis menggunakan software DNA baser dilakukan untuk menggabungkan hasil sekuensing Forward dan Reverse sehingga didapatkan sekuen konsensus untuk sampel individu 1 780 bp dan untuk sampel individu 2 sebesar 800 bp. Selanjutnya, sekuen konsensus dianalisis secara online menggunakan BLAST untuk memastikan sekuen yang di peroleh adalah sekuen gen COI. Sekuen konsensus sampel dibandingkan dengan sekuen spesies-spesies dalam satu genus (Query) yang diperoleh dari BLOD system dan Gen Bank. Berdasarkan analisis dengan menggunakan BLAST, sekuen konsesus yang diperoleh adalah sekuen gen COI. Hal tersebut dibuktikan dari tingkat homologi sekuen sampel dengan sekuen gen COI Buceros bicornis voucher KU08011 yang diperoleh dari Gene Bank sebesar 96%. Sekuen konsensus gen COI Rangkong Badak Individu 1 dan 2 yang diperoleh dianalisis lebih jauh menggunakan Software Clustal X untuk dibandingkan dengan sekuen gen COI spesies lain dalam satu genus dan satu famili yaitu Buceros bicornis voucher GBIR1640-09, Buceros hydrocorax voucher USNME151-11, Penelopides panini voucher USNME150-11, Pitta erythrogaster voucher PBB049-12, Polytelis alexandrae voucher NZPBD088-12. Data spesies-spesies tersebut didapat dari BLOD system dan Gene Bank. Hasil alignment menunjukkan bahwa sekuen gen COI sampel memiliki domain-domain yang conserved dengan semua sekuen spesies pembanding hingga sepanjang 24 basa pada nomor 340-364, 11 basa pada nomor 557-567. Hasil analisis ini menunjukkan adanya tingkat mutasi yang cukup tinggi dengan ditemukannya yang mengalami transisi dan transversi. Hasil aligment tersebut kemudian digunakan untuk membuat rekontruksi topologi pohon filogenetik dengan menggunakan software MEGA 6, Rekontruksi topologi pohon filogenetik dibuat dengan metode Maximum Likehood (ML), Neighbor Joining (NJ), dan Minimum Evolution (ME), dilakukan untuk mengetahui posisi filogenetik burung Rangkong badak diantara spesies pembanding yang berada dalam satu genus dan family dengan sampel. Hasil rekontruksi topologi pohon filogenetik dengan metode Maximum Likehood ( ML) menunjukkan bahwa terdapat dua clade dalam satu cluster yaitu clade yang merupakan kelompok monofiletik terdiri dari spesies Rangkong badak 7 1 & 2 dengan nilai boostrap 99 dan clade kedua merupakan posisi spesies pembanding dengan nilai boostrap 100. Rekontruksi Topologi Pohon Filogenetik dengan Menggunakan Metode Maximum Likehood (ML), Neightboor Joining (NJ), Maximum Evolution (ME) dengan nilai boostrap 1.000 kali Ulangan. Angka pada Cabang Menunjukkan Nilai Boostrap. Berdasarkan analisis menggunakan metode NJ rekontruksi topologi filogenetik dihasilkan tidak adanya perbedaan dengan metode ML sebelumnya, hal yang membedakan pada nilai boostrap nya. Sampel yang diteliti berada dalam satu clade dengan nilai boostrap 99 tetapi keduanya dalam satu cluster, Nilai boostrap pada kelompok monofiletik yaitu 100. Rekontruksi topologi filogenetik dengan menggunakan metode ME (Minimum Evolution) Sampel Rangkong badak individu 1 & 2, berada dalam satu clade dengan nilai boostrap 100, dan berada dalam satu cluster dengan speseies pembanding Buceros bicornis dengan nilai boostrap 99. Hasil rekontruksi pohon filogenetik yang dianalisis secara online berdasarkan BOLD system menunjukkan bahwa burung Rangkong Badak sampel individu 1 & 2 berada dalam clade yang sama dengan Buceros bicornis voucher KU0801. Berdasakan Indeks similaritas BOLD system Rangkong Badak Individu 1 dan Individu 2 dengan burung Rangkong Papan (Buceros bicornis) voucher GBIR140-09 dan ROMC199-07 menunjukkan hasil yang sama, yaitu 99,81% dan 100%. Jarak genetik sampel burung Rangkong Badak individu 1 dan sampel burung Rangkong Badak individu 2 menunjukkan hasil yang sama pada ketiga metode ML,NJ, ME yaitu 0,030/ ±3% Selain itu indeks similaritas menunjukkan hasil yang sama pada setiap metode. Nilai indeks similaritas sampel burung Rangkong Badak individu 1 dan burung Rangkong Badak individu 2 sebesar 8 96,9% sedangkan dengan burung Rangkong Papan (Buceros bicornis) KU08011 dengan metode ML, NJ, ME yaitu 96,9% . Jarak genetik dan indeks similaritas menunjukkan hasil berbanding terbalik, jadi semakin kecil jarak genetik maka semakin tinggi indeks similaritasnya dan begitu sebaliknya. PEMBAHASAN Hasil identifikasi morfologi menunjukan bahwa kedua individu Rangkong Badak (Buceros rhinoceros) yang mempunyai ciri iris berwarna merah pada jantan dan putih pada betina. Ciri tersebut sesuai dengan deskripsi dari (Poonswad, 1993). Tarsus berwarna kuning, mempunyai pelindung kepala yang disebut casque, dahi, tenggorokan berwarna hitam, bagian perut hingga tungging berwarna putih, pada bagian ekor didominasi warna putih dan terdapat pita hitam subterminal, burung Rangkong badak memiliki sayap sepenuhnya berwarna hitam. Jika dibandingkan dengan spesies pembanding yang berkerabat dekat yaitu Rangkong Papan (Buceros bicornis), terdapat perbedaan karakter morfologi diantara keduanya. Rangkong Papan (Buceros bicornis) memiliki ukuran mulai 95-120 cm dan menampilkan lebar sayap 151-178 cm, rata-rata mencapai berat badan 3 kg, Tubuh, kepala, dan sayap terutama hitam, perut dan leher berwarna kuning. Ekor putih dan dilintasi oleh pita hitam subterminal, casque dan paruh berwarna kuning, tenggorokan berwarna kuning, pada sayap tidak sepenuhnya berwarna hitam, terdapat juga pita warna putih, sedangkan perut dan tungging didominasi dengan warna putih (Beauti of Birds, 2015) (Gb.5.1) Hasil analisis morfologi menunjukkan bahwa terdapat perbedaan antara Rangkong Badak (Buceros rhinoceros) dengan Rangkong Papan (Buceros bicornis) pada bagian warna sayap atas. Pada Rangkong Badak (Buceros rhinoceros) sayap berwarna hitam sepenuhnya, sedangkan pada Rangkong Papan (Buceros bicornis) terdapat pita putih di tengah dan di pinggir, bulu ekor kedua jenis ini, terdapat juga kesamaan, didominasi warna putih dan terdapat pita hitam pada bagian subterminal. Untuk mengetahui kekerabatan kedua jenis tersebut dan jenis yang lain dilakukannya adanya kajian tentang filogenetik. 9 Gambar 5.1 Morfologi dari Rangkong Badak (Buceros rhinoceros) (A), Ragnkong Papan (Buceros bicornis) (B). (Gambar A : dokumentasi pribadi 2015, Gambar B: beautyofbirds.com) Analisis filogenetik burung Rangkong Badak (Buceros rhinoceros) dilakukan dengan pembuatan rekontruksi topologi pohon filogenetik d menggunakan metode Maximum Likelihood (ML), Neighbor Joining (NJ), Minimum Evolution (ME). Hasil rekonstruksi dari ketiga metode tersebut menunjukkan bahwa posisi Rangkong Badak (Buceros rhinoceros) satu clade dengan burung Rangkong Papan (Buceros bicornis). Hasil rekontruksi topologi pohon filogenetik dari ketiga metode tersebut tidak berbeda, hanya berbeda pada nilai boostrap saja. Secara berurutan nilai boostrap dari metode ME berbeda dengan nilai boostrap MJ dan NJ. Kelompok monofilogenetik pada MJ,NJ adalah 100, sedangkan pada ME yaitu 99 nilai boostrap nya. Analisis jarak genetik (Pairwise distance) dapat menunjukkan jarak genetik anatara sampel dengan masing-masing individu yang menjadi spesies pembanding. Jarak genetik antara burung Rangkong Badak (Buceros rhinoceros) dan burung Rangkong Papan (Buceros bicornis) voucher KU08011 sebesar 0,030/ ±3% dan bisa dikatakan merupakan satu spesies (intraspesies), jika lebih dari ±3% maka dikatakan interspesies atau beda spesies (interspesies), selain itu indeks similaritas burung Rangkong Badak individu 1 dengan burung Rangkong Badak 2 sebesar 96,9%, Rangkong Badak individu 1 dengan Rangkong Papan (Buceros bicornis) sebesar 96,6%, sedangkan dengan burung Rangkong Badak Individu 2 dengan Rangkong Papan (Buceros bicornis) sebesar 93,6%. Hasil analisis dengan menggunakan BOLD System menunjukkan Rangkong Badak satu cluster dengan Rangkong Papan (Buceros bicornis) voucher GBIR140-09 dan ROMC199-07, hasil analisis rekonstruksi topologi filogenetik, jarak genetik dan BOLD system semakin memperkuat posisi sampel Rangkong Badak (Buceros rhinoceros) kedua sampel yang merupakan sister spesies dari Rangkong Papan voucher GBIR140-09 dan ROMC199-07. Hasil 10 perbandingan sekuen burung Rangkong Badak dengan spesies pembanding, menunjukkan adanya karakter automorfi yang merupakan karakter yang hanya dimiliki oleh Rangkong Badak. Karakter automorfi ini ditunjukkan pada basa nomor 293 (A), dan basa 360 (C). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kedua Rangkong Badak (Buceros rhinoceros) yang diteliti merupakan satu spesies kemungkinan juga keduanya merupakan subspesies, namun saat ini belum bisa dilihat sampai tingkat subspesies karena tidak ada referensi mengenai gen COI Rangkong Badak (Buceros rhinoceros), oleh karena itu perlu adanya analisis sekuen burung Rangkong Badak (Buceros rhinoceros) dengan menggunakan gen mitokondria lainnya misalnya gen 16S, Cytochrome-B, dan D-loop. Berdasarkan penelitian diketahui bahwa kedua sampel adalah burung Rangkong Badak (Buceros rhinoceros) jantan dan betina. Oleh karena itu dapat dipelihara dalam satu kandang untuk memperbanyak keturunannya agar tetap lestari populasi dan genetiknya. Berdasarkan hasil analisis kekerabatannya diketahui burung Rangkong Badak sampel berkerabat dekat dengan burung Rangkong Papan, untuk menghindari terjadinya pencampuran gen dari kedua spesies burung maka dalam pemeliharaanya sebaiknya dipisah dalam kandang yang berbeda. PENUTUP Kesimpulan Berdasarkan hasil identifikasi karakter morfologi dan morfometrik, burung yang diteliti merupakan spesies Buceros rhinoceros (Rangkong Badak). Analisis genetik dengan metode Maximum Likehood (ML), Neighboor Joining (NJ), Maximum Evolution (ME) dan BOLD system menunjukan hasil bahwa burung Rangkong Badak (Buceros rhinoceros) berkerabat dekat dengan burung Rangkong Papan (Bucheros bicornis) voucher GBIR140-09 dan ROMC199-07. Saran Sebaiknya ada penelitian lanjutan mengenai morfometri dan sekuen burung Rangkong Badak ditempat lainnya menggunakan gen COI dengan jumlah individu yang lebih banyak lagi. Selain itu, perlu adanya analisis sekuen burung Rangkong Badak menggunakan gen lain sebagai pendukung seperti gen Cytochrom-B untuk lebih memastikan filogenetik burung Rangkong Badak dengan Rangkong Papan (Buceros bicornis) sampai ketingkat sub-spesies. 11 DAFTAR RUJUKAN Anggraini, K., M. Kinnaird & T. O’Brien. 2000. The Effect of Fruit Availability and Habitat Disturbance on An Assemblage of Sumatran Hornbill. Bird Conservation International 10:189-202. Aviabase, 2003. The world bird database, eoc.org/species.jsp?avibaseid=0D3D9303B6AEB120, tanggal 2 Februari 2015. http://avibase.bsc diakses pada BirdLife International. 2014 Species factsheet: Buceros rhinoceros. The IUCN Red List of Threatened Species. Version 2014.2. International Union for Conservation of Nature. Brinkmand, F. and D. liepie. 2001. Phylogenetic Analysis. In: Bioinformatics: A Practical Guide to the Analisys of Gene and Protein. Baxevanis, A.D. and B.F.F. Ouellette (Eds.). John Willey & Sons. pp. 323–358. Chumatphong S,. Ponglikitmongkol M,. Charoennitikul W., Mudsri. S. & Poonswad. P. 2013. Hybridisation in the Wild Between The Great Hornbill (Buceros Bicornis) and the Rhinoceros Hornbill (Buceros rhinoceros) in Thailand and its Genetic Assessment. The Bulletin of Zoology, National University of Singapore. Hebert, P.D. N, Ratnasingham, S. & de Waard, J.R. 2003. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc R Soc 270: 96–99. IUCN, 2008. IUCN Red List of Threatened Species. Downloaded from http://www.iucnredlist.org. (diakses pada tanggal 8 Feb.2015). Poonswad, P., 1993. Identification of Asian hornbills. In: Poonswad, P. & A. C. Kemp (eds.), Manual to the Conservation of Asian Hornbills. Hornbill Project Thailand, Bangkok. Pp. 26–75. Shannaz J, & Rudyanto. 1995. Burung-Burung Terancam Punah di Indonesia. Jakarta: PHPA/Birdlife International-Indonesian programme. Sulandari, S., Sutrisno, H., Irham, M., Arida, E.A., Haryoko, T., Fitriana, Y.S., Dharmayanthi, A.B. & Natalia, I. 2013. DNA Barcode Fauna Indonesia. Jakarta: Kencana. The Raffles Bulletin of Zoology. 2013. An International Journal of Southeast Asian Zoology. Vol 61 (1): 349 Waugh J. 2007. DNA Barcoding in Animal Species: Progress, Potential and Pitfalls. BioEssays, 29: 188-197.
