AMPLIFIKASI GEN PENYANDI DNA POLIMERASE I

AMPLIFIKASI GEN PENYANDI DNA POLIMERASE I TERMOSTABIL
DARI Brevibacillus sp ASAL KAWAH SIKIDANG DIENG
AMPLIFICATION GENE ENCODING THERMOSTABLE DNA POLYMARASE I OF
Brevibacillus sp ISOLATED FROM SIKIDANG DIENG CREATER
D. Andang Arif Wibawa, Ratno Agung Samsumaharto
Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Setia Budi, Surakarta
ABSTRAK
DNA polimerase termostabil memiliki peran penting dalam penelitian biologi molecular,
yaitu untuk mengamplifikasi DNA dalam proses polymerase chain reaction (PCR). DNA
polimerase termostabil diekspresikan oleh mikroorganisme termofilik. Bakteri termofilik
Brevibacillus sp. berhasil diisolasi dari sumber air panas kawah Sikidang Dieng, Jawa
Tengah. Penelitian awal menunjukkan bahwa crude protein dari isolat Brevibacillus sp.
diketahui dapat digunakan dalam PCR. Seperti halnya enzim termostabil alamiah,
DNA polimerase pada isolat disintesis dalam jumlah yang sedikit dan membutuhkan
teknik purifikasi yang rumit. Tujuan penelitian ini adalah melakukan isolasi gen DNA
polymerase dari Brevibacillus sp. Penelitian diawali dengan melakukan amplifikasi
bagian gen DNA polimerase pada genom isolat menggunakan primer spesifik.
Fragmen yang teramplifikasi kemudian diisolasi, dimurnikan. Hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa gen DNA Pol I termostabil berhasil diamplifikasi dari DNA genom
Brevibacillus sp menghasilkan fragmen berukuran ± 2,7 kb.
Kata kunci : DNA Pol I termostabil, PCR, Brevibacillus sp., termofilik,
ABSTRACT
Thermostable DNA polymerase has an important role in molecular biology research to
amplify small amount of DNA through polymerase chain reaction (PCR). Thermostable
enzymes are expressed by thermophillic microorganisms. Thermophillic bacteria
Brevibacillus sp. has been isolated from Sikidang Crater, Dieng Plateu, Central Java.
Previous study showed that crude protein of the isolate could be used in PCR.
Unfortunately, like most native thermostable enzymes, the thermostable DNA
polymerase of the isolate is synthesized in a very low level and therefore is
cumbersome to purify. The purpose of this research is to clone thermostable DNA
polymerase gene of the isolate. The DNA polymerase gene of the isolate was
amplified by PCR method using spesific primers. The amplified fragment was then
isolated, purified. The result showed that the DNA Pol I gene was successfully be
amplified from the isolate DNA genom, resulting in ± 2,7 kb sequence in length.
Keywords : Thermostable DNA Pol I, PCR, Brevibacillus sp , thermophilic
PENDAHULUAN
Mikroorganisme tahan panas, termofil dan hipertermofil berpotensi sebagai penghasil
enzim termostabil yang berguna dalam berbagai bidang industri, kesehatan dan penelitian.
Salah satu enzim termostabil yang berpotensi komersial dalam era pasar global adalah DNA
polimerase termostabil. DNA polimerase termostabil merupakan enzim yang sangat luas
penggunaannya dalam biologi molekuler di bidang kesehatan, peternakan, pertanian,
industri, dan penelitian. Enzim ini digunakan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR) yaitu
metode in vitro untuk mensintesis urutan DNA yang spesifik secara enzimatis menggunakan
dua primer oligonukleotida yang melakukan hibridisasi pada rangkaian dan arah berlawanan
dari daerah DNA target (Erlich, 1992). Metode PCR dapat digunakan untuk diagnosis awal
penyakit sel sabit penyebab anemia pada manusia. Metode ini telah dikembangkan juga
untuk melakukan analisis berbagai penyakit genetik, mendeteksi agen penyebab penyakit
infeksi, mengidentifikasi orang berdasar polimorfisme genetik pada loci, digunakan untuk
memecahkan kasus kriminal dan menentukan hubungan orang tua dan anak. Bidang
peternakan menggunakan PCR untuk menganalisis garis keturunan sehingga dalam
perkawinan (sexing) didapatkan hasil keturunan yang diinginkan. Bidang pertanian
menggunakan PCR untuk mendeteksi penyakit tanaman dan sifat genetik yang diinginkan
yang masih dalam rangka pengawasan. Sejumlah mutasi gen tunggal selama
perkembangan organisme dapat dianalisis dengan PCR tanpa melakukan kloning. Jumlah
DNA yang sedikit yang diperoleh dari beberapa tempat dapat juga digunakan untuk analisis
filogenetik, migrasi dan interbreeding pada manusia maupun organisme yang lain berdasar
hasil PCR (Daniel, 1991).
Hingga sekarang ini semua DNA polimerase termostabil komersial yang digunakan
untuk PCR diproduksi oleh negara-negara maju. Oleh karena itu penelitian ini diarahkan
untuk menemukan dan memproduksi DNA polimerase baru melalui teknologi kloning.
Disamping memberikan hasil kajian secara ilmiah, penelitian ini juga akan menghasilkan
suatu produk yang dapat dimanfaatkan dalam biologi molekuler di bidang kesehatan,
peternakan, pertanian, industri, dan penelitian serta memberi keuntungan secara komersial.
DNA polimerase termostabil Taq dari bakteri termofilik Thermus aquaticus
merupakan yang pertama yang diisolasi, dikarakterisasi dan digunakan untuk PCR. Enzim
serupa telah berhasil diisolasi dari genus Thermus yang lain yaitu T. flavus, T. thermophilus
HB-8, T. caldophilus GK24, T. filiformis (Choi dkk.,1999). Sejumlah DNA polimerase dari
arkaea juga telah dapat ditemukan dan dikarakterisasi misalnya dari Methanococcus
jannaschii (Jokela dkk., 2004), Aeropyrum pernix (Cann dkk., 1999), Pyrococcus horikoshii
(Shen dkk., 2001), P. abysii (Gueguen dkk., 2001), dan P. furiosus (Uemori dkk., 1997).
Semua DNA polimerase termostabil komersial dihasilkan oleh negara-negara maju. Fakta
menunjukkan bahwa kebutuhan dan harga DNA polimerase termostabil untuk PCR sangat
tinggi sehingga masih terbuka peluang secara komersial. Hal ini mendorong upaya untuk
mencari alternatif memanfaatkan potensi keanekaragaman hayati Indonesia sebagai sumber
DNA polimerase termostabil. Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan crude protein dari
Brevibacillus sp. yang berasal dari kawah Sikidang Dieng dapat digunakan untuk PCR
(Wibawa, 2008). Penelitian tersebut mengalami kesulitan dalam isolasi DNA polimerase
yang dilakukan terhadap protein isolat Brevibacillus sp mengalami kesulitan karena
sebagian besar merupakan protein tahan panas. Tujuan utama penelitian ini melakukan
isolasi gen penyandi DNA polimerase I isolat Brevibacillus sp yang selanjutnya pada
penelitian lanjutan akan dilakukan kloning pada vektor ekspresi.
METODE PENELITIAN
Bahan:
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah :
Medium. Bahan penyusun media Luria Bertani yang dimodifikasi mengandung bacto
tryptone, ekstrak khamir, NaCl, MgSO4.7H2O, CaCl2, H3BO3, Na2MoO4.2H2O. Bahan untuk
PCR, Kloning dan Sekuensing Gen Penyandi DNA polimerase. Tris Base, SDS (Sodium
Dodecyl Sulfate), bahan-bahan : bromophenol blue, xylene, xyanol, EDTA (asam etilen
diamina tetraasetat), kloroform, isopropanol, etanol, agarose phenol, Na-asetat, NaCl, CTAB
(Hexadecyltrimethyl ammonium bromide), dan ficol type 400, etidium bromide, bead Ready
to Go PCR, primer sebagai berikut : primer eksternal FPEXT (primer forward) = 5’-YCG
AGG AGG GAT GAG ATT G-3’ dan RPEXT (primer reverse) = 5’-TTATTT SGC RTC RTA
CCAYG-3’, dan primer internal dan Reversed 5’-ATTTCGCGTCATACCATG TC’-3, Natrium
asetat, MgCl2, KCl, pipes, KOH, NaOH, CaCl2, dimethyl formamide, MgSO4, glukosa,
aquadest, marker DNA 100 bp,
Alat:
Beberapa alat yang digunakan adalah sentrifus, vorteks, waterbath shaking, hot plate, UV
transilluminator, mini gel migration through, spektrofotometer, thermocycler .
Prosedur kerja:
Analisis gen `penyandi DNA polimerase termostabil
Isolasi DNA. DNA genom diisolasi menggunakan metode preparasi mini (Ausubel
dkk., 1992) yang sudah dimodifikasi. Metode ini menggunakan 1,5 ml biakan sel yang
disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. Pelet yang diperoleh
kemudian diresuspensikan ke dalam 500 µl TE (0.1 M Tris-HCl, 0.1 M EDTA; pH 8) yang
ditambah 40 µl lisosim (50 mg/ml) dan diinkubasi pada 37 oC selama 60 menit. Ke dalam
suspensi kemudian ditambahkan lagi 200 µl SDS 10 %, 100 µl NaCl 5 M, dan 80 µl CTAB,
dihomogenkan dan inkubasi dilanjutkan pada suhu 68 oC selama 30 menit. Kloroform
kemudian ditambahkan dengan perbandingan volume yang sama 1:1, dicampur dengan
hati-hati dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 5 menit. Lapisan atas yang terbentuk
dipindahkan ke dalam tabung mikro baru, ditambah isopropanol 0.6 x volume lapisan atas
yang dipindahkan dan disentrifugasi kembali pada 13.000 rpm selama 5 menit. Pelet yang
terbentuk dicuci dengan mengalirkan etanol 70 % dan dikeringanginkan, kemudian
diresuspensi dalam 20 µl TE. Untuk visualisasi DNA, dilakukan elektroforesis menggunakan
gel agarosa 1 %, pada tegangan 100 Volt selama 25 menit. Visualisasi pita DNA yang
terbentuk dilakukan dengan perendaman gel agarosa dalam larutan etidium bromida dan
kemudian diiluminasi menggunakan UV transilluminator.
Pemurnian DNA. Hasil isolasi DNA dimurnikan dengan menambahkan TE hingga volume
mencapai 100 µl. Kemudian ditambah 100 µl campuran fenol: kloroform:isoamilalkohol
(25:24:1) dan dihomogenkan. Campuran disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 5 menit.
Lapisan atas yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung mikro baru, kemudian ditambah
Na-asetat 3 M dan etanol absolut, masing-masing 0.1x dan 2x volume lapisan atas yang
dipindahkan. Campuran disentrifugasi kembali pada 13.000 rpm selama 5 menit, pelet yang
terbentuk dicuci dengan etanol 70 %, dikering-anginkan dan kemudian diresuspensi ke
dalam 20 µl TE. Untuk visualisasi DNA, dilakukan elektroforesis menggunakan elektroforesis
gel agarosa 1 %, pada tegangan 100 Volt selama 25 menit. Pita DNA dilihat menggunakan
UV transilluminator setelah perendaman dalam larutan etidium bromida.
Amplifikasi Gen Penyandi DNA Polimerase. Pada tahap amplifikasi gen penyandi DNA
polymerase termostabil digunakan PCR dengan komposisi 1 (satu) bead Ready to Go, 2 μl
primer forward (20 pmol), 2 μl primer reverse (20 pmol), 2,5 μl template DNA (<1 μg) untuk
volume larutan PCR 25 μl.. Daur PCR berlangsung pada kondisi denaturasi awal 94 oC,
selama 5 menit dan proses selanjutnya sebanyak 25 daur yang terdiri dari denaturasi (94oC
selama 45 detik), penempelan primer (50 oC selama 45 detik) dan polimerisasi (72 oC selama
2 menit 45 detik). Setelah akhir daur, polimerisasi dilanjutkan pada suhu 72 oC selama 7
menit kemudian proses dihentikan pada suhu 4 oC. DNA hasil PCR dielektroforesis pada gel
agarosa 2% dan pita yang terbentuk dilihat menggunakan UV transluminator setelah
perendaman dalam larutan etidium bromida.
Pemurnian produk PCR
Pemurnian produk PCR dilakukan dengan menggunakan QIAQuick Gel Extraction Kit
(Qiagen).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Lumpur kawah Sikidang Dieng, Jawa Tengah dengan suhu 90°C dan pH 4,0 telah
dipilih sebagai sumber bakteri dalam penelitian ini. Bakteri dari lumpur kawah ini telah
berhasil ditumbuhkan secara optimum pada media LB yang dimodifikasi pada suhu 70°C,
walaupun dapat tumbuh pada suhu 80°C. Hasil identifikasi bakteri hipertermofilik isolat asal
kawah Sikidang Dieng lalui pendekatan filogenetik gen 16S RNA menunjukkan bahwa gen
16S rRNAbakteri ini mempunyai kedekatan sangat tinggi dengan gen 16S rRNA genus
Brevibacillus yang tergolong mesofilik (Wibawa, 2008).
Isolasi DNA genom bakteri hipertermofilik isolat Brevibacillus sp. dilakukan untuk
mendapatkan DNA genom yang digunakan sebagai cetakan DNA dalam proses PCR.
Adapun primer eksternal yang digunakan sebagai berikut : FPEXT (primer forward) = 5’YCG AGG AGG GAT GAG ATT G-3’ dan RPEXT (primer reverse) = 5’-TTATTT SGC RTC
RTA CCAYG-3’. Primer ini memiliki homologi dengan primer gen DNA polimerase dari
Bacillus caldotenax.
Elektroforesis produk PCR gen DNA polimerase isolat Brevibacillus sp. dengan
menggunakan primer forward FPEXT dan prime reverse RPEXT disajikan pada gambar 1.
Berdasarkan hasil amplifikasi dengan metode PCR gen DNA polimerase Brevibacillus sp.
memiliki ukuran + 2700 bp. Hasil elektroforesis ini menunjukkan bahwa gen penyandi DNA
polimerase Brevibacillus sp. telah berhasil diisolasi. Hal ini ditunjukkan dengan ukuran basa
nukleotida berukuran + 2700 bp, hampir sama dengan ukuran basa nukleotida DNA
polimerase I sepanjang 2634 bp dari Geobacillus caldoxylosilyticus (Sandalli, dkk., 2009),
DNA polymerase berukuran 2616 bp dari Thermoanaerobacter yonseiensis (Kim, dkk.,
2002) dan kelompok bakteri hipertermofilik maupun termofilik yang telah berhasil diketahui
urutan basanya melalu penelusuran di Gen Bank NCBI (ww.ncbi.nlm.nih.gov)
bp
10.000
8.000
6.000
4.000
3.000
2.000
1.500
1.000
750
500
400
300
M
1
2
3
2700 bp
Gambar 1. Elektroforesis produk amplifikasi gen DNA polimerase isolat Brevibacillus sp.
menggunakan primer FPEXT (primer forward) = 5’-YCG AGG AGG GAT GAG ATT G-3’ dan
RPEXT (primer reverse) = 5’-TTATTT SGC RTC RTA CCAYG-3’. Elektroforesis dilakukan
pada gel agarose 1% (g/v), voltase 100 volt. Lajur 1: DNA Ladder 1kb Perfect DNATMMarker
(Novagen), Lajur 2, 3, 4 = produk amplifikasi gen DNA Pol I Brevibacillus sp.
Kloning membutuhkan insert gen yang bersih dari pengotor, untuk itu produk PCR
yang diperoleh dimurnikan. Pemurnian produk PCR dilakukan dengan menggunakan
QIAQuick Gel Extraction Kit (Qiagen). Gambar 2 menunjukkan elektroforesis produk PCR
gen DNA Pol dari Brevibacillus sp. yang akan dimurnikan.
Gambar 2. Produk PCR gen DNA Pol I isolat DS3.
bp
M
1
2
3
10.000
8.000
6.000
4.000
3.000
2.000
1.500
1.000
750
500
400
300
2700 bp
Gambar 3 . Produk PCR gen DNA Pol I isolat DS3 yang sudah dimurnikan dengan
QIAQuick Gel Extraction Kit.
Gambar 3 memperlihatkan pita DNA gen DNA polimerase isolat Brevibacillus sp
lebih tipis dari gambar pita DNA pada gambar 1 dan 2, walaupun perlakuan yang dikenakan
sama. Hal ini disebabkan pengenceran dalam purifikasi terlalu encer. Presipitasi dengan
menggunakan isopropanol akan dapat membuat konsentrasi DNA menjadi lebih tinggi (lebih
pekat).
KESIMPULAN
Berdasarkan pada penelitian ini dapat disimpulkan gen penyandi DNA Pol I bakteri
hipertermofilik Brevibacillus sp. berhasil diisolasi. Gen DNA Pol I Brevibacillus sp. berukuran
+ 2700 bp.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini dilakukian atas pembiayaan dari Direktorat Pembinaan Penelitian dan
Pengabdian kepada Masyarakat, Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi tahun 2010.
DAFTAR PUSTAKA
1. Ausubel, F, M., Brent, R., Kingstone, R. E., More, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A.,
dan Struhl, K. 1995. Short Protocol In Molecular Biology: A Compendium of Methods
from Current Protocol in Molecular Biology. 3 th Edition. John Wiley & Sons, Inc. New
York. USA.
2. Choi, J. J., Jung, S. E., Kim, H. K., dan Kwon, S. T. 1999. Purification and properties of
Thermus filiformis DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Biothechnol. Appl.
Bochem. 30 :19-25.
3. Erlich, H. A., 1992. PCR Technology. W. H. Freeman and Company. New York.
4. Gueguen Y, Rolland JL, Lecompte O, Azam P, Le Romancer G, Flament D, Raffin JP,
Dietrich J. 2001. Characterization of two DNA polymerases from the hyperthermophilic
euryarchaeon Pyrococcus abyssi. Eur. J. Biochem. 268(22):5961-9.
5. Ishino, Y., Komori, K., Cann, I. K .O., dan Koga, Y. 1998. Novel DNA polymerase family
found in Archaea. J. Bacteriol. 180:2232-2236.
6. Jokela M., Eskelinen, A., Pospiech, H., Rouvinen, J., dan Syvaoja, J. E. 2004.
Characterization of the 3’ exonuclease subunit DP1 of Methanococcus jannaschii
replicative DNA Polymerase D. Nucleic Acids Res. 32:2430-2440.
7. Kim, D. J., Jang, H.J., Pyun, Y . R., dan Kim, Y. S. 2002. Cloning, expression, and
characterization of thermostable DNA polymerase
from Thermoanaerobacter
yonseiensis. J. Biochem. Mol. Biol. 35: 320-329.
8. Sandalli, C., Sigh, K., Modak, M. J., Ketkar, A., Canakei, S., Demir, I., dan Belduz , A. O.
2009. A new DNA polymerase I from Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 : cloning,
characterization, and mutational analysis of two aromatic residues. Appl. Microbiol.
Biothechnol. DOI 10.1007/s00253-009-1962-3.
9. Shen, Y., Musti, K., Hiramoto, M., Kikuchi, H. Kawarabayashi, Y. dan Matsui,j. 2001.
Invariant Asp-1122 and Asp-1124 are essential residues for polymerization catalysis of
family D DNA polymerase from Pyrocccus horikoshii. J. Biol. Chem. 276:273376-27383.
10. Uemori , T., Ishino, Y., Toh, H., Asada, K., dan Kato, I. 1993. Organisation and
nucleotide sequence of the DNA polymerase gene from the archaeon Pyrococcus
furiosus. Nucleic Acids Res. 21: 259-265.
11. Uemori, T., Sato, Y., Kato, I., Doi, H., dan Ishino, Y. 1997. A Novel DNA Polymerase in
the hyperthermophilic archaeon, Pyrococcus furiosus : gene cloning, expression and
characterization. Gene Cells 2: 499-512.
12. Wibawa, D., A. A., 2008. DNA Polimerase dari bakteri hipertermofilik hasil isolasi dari
kawah Sikidang Dieng, Jawa Tengah. Tesis. Sekolah Pascasarjana Universitas Gadjah
Mada. Yogyakarta.