BAB III METODELOGI PENELITIAN 3.1 JENIS PENELITIAN

BAB III
METODELOGI PENELITIAN
3.1 JENIS PENELITIAN
: Eksperimental Laboratoris
3.2 LOKASI PENELITIAN
: Laboratorium Fatokimia Fakultas
Farmasi UH & Laboratorium
Mikrobiologi FK UH
3.3 WAKTU PENELITIAN
: Maret – April
3.4 DEFENISI OPERASIONAL
:
a. Bakteri Streptococcus mutans merupakan isolat yang telah tersedia
diperoleh dari Labolatorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran UH.
b. Ekstrak Buah Kaktus Pir Berduri (Opuntia ficus-indica) adalah buah
yang dipetik dari tanaman mengkudu yang tumbuh di daerah Jawa
Timur
c. Daya Hambat diketahui dari uji kadar hambat antimikroba sari buah
kaktus pir berduri (Opuntia ficus-indica) berupa konsentrasi dari sari
buah kaktus pir berduri (Opuntia ficus-indica) yang dapat menghambat
pertumbuhan Streptococcus mutans secara nyata pada medium kultur
setelah inkubasi.
d. Zona Inhibisi adalah luas daerah bening pada biakan medium bakteri
setelah diinkubasi yang diukur diameternya dengan menggunakan
jangka sorong (mm).
25
e. Konsentrasi sampel adalah konsentrasi dari sari buah kaktus pir berduri
yang dibuat dengan memotong – motong buah tersebut dengan
menggunakan pisau dan dicampurkan dengan aquades kemudian
disaring dan diambil sarinya. Konsentrasi dibuat dalam 4 jenis yaitu
25%, 50%, 75%, 100%.
f. Medium adalah Natrium Agar (NA) yang dibuat dari sediaan yang
disediakan dari labolatorium ini digunakan sebagai media untuk
melihat daya hambat bakteri.
3.5 POPULASI dan SAMPEL
Sampel dalam penelitian ini adalah biakan murni Streptococcus mutans
dan ekstrak buah kaktus pir berduri (Opuntia ficus-indica) dalam 4 kali
pengenceran, masing – masing 25%, 50%, 75%, 100%. Pada setiap kelompok
konsentrasi dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
3.6 KRITERIA PENILAIAN:
a. Pada uji Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) dilakukan dengan
menggunakan metode dilusi. Tabung dengan berbagai konsentrasi
diamati kekeruhannya, pada tabung dengan konsentrasi terendah yang
pertama kali terlihat jernih merupakan Konsentrasi Hambat Minimal
(KHM)
b. Pada uji efek antibakteri, menggunakan metode difusi, yang diukur
adalah zona inhibisi/Diameter Daya Hambat (DDH). Luas zona
26
inhibisi merupakan diameter daerah yang bening yang diukur dengan
menggunakan jangka sorong dalam satuan mm (millimeter).
3.7 ALAT DAN BAHAN PENELITIAN
A. ALAT:
1. Autoklaf
10. Jangka sorong
2. Batang pengaduk
11. Labu erlenmeyer
3. Botol fial
12. Ose bulat
4. Bunsen
13. Pinset
5. Cawan petri
14. Pisau
6. Cawan porselen
15. Rotavavor
7. Corong
16. Tabung reaksi
8. Gelas Ukur
17. Toples
9. Inkubator
B. BAHAN:
1. Aluminium foil
2. Aquades
3. Ekstrak buah kaktus pir berduri (Opuntia ficus-indica)
4. Handscoen
5. Isolat murni Streptococcus mutans dari laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Kedokteran UH
6. Kapas
27
7. Kertas label
8. Masker
9. Spritus
3.8 PROSEDUR KERJA
a. Pembuatan Ekstrak buah kaktus pir berduri (Opuntia ficus-indica)
1. Untuk pembuatan ekstrak kaktus pir berduri (Opuntia ficus-indica)
disiapkan buah kaktus sebanyak 3 kg yang sudah dicuci bersih.
2. Setelah itu, buah kaktus pir berduri (Opuntia ficus-indica) dipotong
menjadi potongan – potongan yang kecil.
3. Selanjutnya, buah kaktus pir berduri (Opuntia ficus-indica) di ekstrak
menggunakan cara maserasi, yaitu dengan merendam buah kaktus pir
berduri ke dalam bejana maserasi yang terbuat dari toples kaca
kemudian diberi larutan etanol 96%.
4. Bejana maserasi tersebut ditutup rapat dan didiamkan selama 3 hari
sambil diaduk satu kali setiap hari.
5. Setelah 3 hari, rendaman kaktus disaring dan ampasnya direndam
dengan cairan penyaring yang baru.
6. Hasil penyaringan yang diperoleh dikumpul dan diuapkan dengan
menggunakan rotavavor. Proses ini bertujuan untuk menguapkan
etanol sehingga diperoleh ekstrak buah kaktus pir berduri yang padat
dan kering.
28
b. Strerilisasi alat
Sterilisasi alat yang digunakan dalam penelitian ini dilakukan dengan
cara sebagai berikut:
1. Labu erlenmeyer diisi dengan aquades sebanyak 250 ml lalu ditutup
dengan kapas yang dipadatkan sedemikian rupa dan ditutup dengan
aluminium foil dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama
25 menit.
2. Cawan petri, pinset, batang pengaduk, dan tabung reaksi dibungkus
dengan aluminium foil dan disterilkan dengan oven.
3. Bahan yang disterilkan adalah medium pembenihan. Cara sterilisasi
adalah medium NA yang telah dimasukkan ke dalam erlenmeyer
kemudian disterilkan ke dalam autoklaf selama 25 menit pada suhu
121oC
c. Penentuan Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) ekstrak buah
kaktus pir berduri (Opuntia ficus-indica) yang dapat menghambat
pertumbuhan Streptococcus mutans
1. Ekstrak buah kaktus pir berduri diencerkan dengan rumus:
m=MxV
m : massa buah kaktus pir berduri (gram)
M: Konsentrasi larutan (gr/ml)
V: Volume Larutan (ml)
29
2. Untuk memperoleh ekstrak buah kaktus pir berduri konsentrasi 25%,
50%, 75%, 100%. Maka ekstrak buah kaktus pir berduri ditimbang
sebanyak 5 gram, 7,5 gram , 10 gram kemudian dilarutkan dengan
aquades sebanyak 10 ml.
3. Setelah itu dimasukkan kedalam tabung dan diberi label sesuai
konsentrasinya.
4. Dilakukan pengenceran suspensi bakteri.
5. Sebanyak delapan buah tabung disiapkan dan diisi dengan medium
BHIB sebanyak 5 ml. Kemudian 0,02 ml bakteri Streptococcus mutans
dimasukkan pada 6 tabung.
6. Pada lima tabung, masing – masing dimasukkan ekstrak buah kaktus
pir berduri 25%, 50%, 75%, 100%, sebanyak 5 ml. Satu tabung
dimasukkan 5 ml ekstrak daun sirih 100%, serta tabung berikutnya
dimasukkan 5 ml aquades
dan pada tabung terakhir hanya berisi
medium BHIB dan bakteri yang digunakan sebagai kontrol kuman
(kontrol bakteri) .
7. Semua tabung diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam dan kemudian
dilakukan pemeriksaan ada tidaknya pertumbuhan bakteri yang
ditandai dengan terjadinya kekeruhan dalam tabung.
8. Konsentrasi Hambat Minimal ditentukan dengan memperhatikan
konsentrasi pertama yang terlihat jernih. Tabung yang terlihat keruh
menunjukkan masih adanya pertumbuhan bakteri.
30
d. Pembuatan Medium
1. Komposisi NA (Nutrirnt Agar)
- Beef extract 3 gr
- Pepton 5 gr
- Agar 15 gr
- Aquadest 1000 ml
2. Cara membuat
Medium NA dilarutkan sebanyak 38g ke dalam 1 liter aquadest.
Kemudian sterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C
selama 25 menit. Biarkan hingga suhunya turun sampai 40°C kemudian
tuangkan ke dalam tabung reaksi.
e. Pengenceran
Pengenceran bertujuan menghasilkan beberapa konsentrasi ekstrak
buah kaktus (Opuntia ficus-indica) yang akan digunakan untuk Kadar
Hambat Minimum dari ekstrak buah kaktus yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. Dalam penelitian ini dibuat
pengenceran sebanyak 4 konsentrasi yaitu : 25%, 50%, 75%, dan 100%.
f. Uji daya hambat
1. Persiapkan 6 buah cawan petri steril
2. Ketiga cawan petri tersebut diisi dengan medium NA yang telah
disterilkan. Tunggu medium hingga memadat
31
3. Ambil isolate murni yang telah dipersiapkan dengan menggunakan ose
bulat. Kemudian dimasukkan kedalam tabung yang berisi aquadest
steril.
4. Isolat yang telah bercampur dengan aquadest tersebut kemudian di
goreskan ke medium NA dengan menggunakan cotton buds
5. Lakukan hal yang sama pada cawan petri kedua sampai keenam
6. Ambil beberapa paper disk dan kemudian direndam pada tabung yang
berisi konsentrasi ekstrak buah yang berbeda
7. Untuk cawan petri pertama sampai cawan petri ketiga masing – masing
diberikan paper disk yang telah direndam dengan ekstrak buah kaktus
pada konsentrasi 2,5% sampai 100%
8. Masukkan kedalam inkubator selama 1x24 jam
g. Pengamatan zona inhibisi
Daya hambat diketahui berdasarkan pengukuran diameter zona
inhibisi (zona bening) yang terbentuk disekitas paper disc. Pengukuran
tersebut menggunakan jangka sorong. Daya hambat minimal diketahui dari
konsentrasi terkecil yang sudah dapat menghambat pertumbuhan
streptoccus mutans secara nyata.
32
3.9 ALUR PENELITIAN
Pembuatan
bahan uji
Pengenceran
bahan uji
Konsentrasi
Ekstrak Buah
Kaktus Pir berduri
25%
50%
75%
100%
Pemurnian
Streptoccus
mutans
Pembuatan
Medium Kultur
Uji Daya
Hambat
Inkubasi
Pengamatan
zona inhibisi
Analisis Data
Gambar 4: Skema alur penelitian
33