korelasi antara infeksi human papilloma virus (hpv)

KORELASI ANTARA INFEKSI HUMAN PAPILLOMA VIRUS
(HPV) 18 DENGAN MUTASI GEN K-RAS KODON 12
PADA PENDERITA KANKER KOLOREKTAL DI MAKASSAR
THE CORRELATION BETWEEN
HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) 18 INFECTION
AND K-ras GENE MUTATIONS OF CODON 12 IN PATIENTS
WITH COLORECTAL CANCER
Mujahidah Basarang1 Rizalinda Sjahril2 Nasrum Massi2
1
2
Mahasiswa Mikrobiologi, Biomedik . Pasca sarjana, Unhas Makassar
Bagian Mikrobiologi, Fakultas Kedoketran, Unhas Makasar
Alamat Korespondensi :
Mujahidah Basarang
Villa Taman Madani Blok C 10
Jl. Talasalapang, Kota Makassar
Email : [email protected]
Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui korelasi infeksi HPV 18 dan mutasi gen K-ras kodon 12
pada penderita kanker kolorektal di Makassar. Infeksi HPV 18 dideteksi dengan amplifikasi PCR
menggunakan primer MY9/11 dan primer spesifik untuk HPV tipe 18. Mutasi gen K-ras kodon 12
dideteksi menggunakan amplifikasi PCR menggunakan primer mutan. Analisis statistik
menggunakan chi square dan uji korelasi. DNA HPV tidak ditemukan pada 33 jaringan tumor dan
31 jaringan normal dekat tumor. Mutasi gen K-ras kodon 24 pada 33 jaringan tumor (72,7%) dari
33 pasien. Dan pada jaringan normal dekat tumor 18 (58,1%) dari 31 pasien. Data ini
menunjukkan bahwa infeksi HPV 18 bukan merupakan karsinogenesis kanker kolon dan rektum
dan mutasi gen K-ras kodon 12 sering terjadi sebagai karsinogenesis kanker kolon dan rektum.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada korelasi antara infeksi HPV 18 dan mutasi gen Kras kodon 12 pada pasien kanker kolon dan rektum di Makassar.
Kata Kunci : HPV 18, Mutasi gen K-ras kodon 12, kanker kolorektal
Abstract
This study aims to investigate the correlation between HPV 18 infection and K-ras mutations of
codon 12 in patients with colorectal cancer in Makassar. HPV 18 infection was detected by PCR
amplification using MY9/11 primer and specific type primer of HPV 18. K-ras gene mutations
were detected by PCR amplification by using mutant primer. The study used the Correlation tests.
No DNA of HPV 18 was detected in 33 tumors and 31 normal tissue near the tumors. K-ras gene
mtations at codon 24 were found in 33 tumors (72,7%) of 33 patients; and in 18 normal tissue
near tumors (58,1%) of 31 patients. The data revealed that HPV 18 infection is not carcinogenesis
of colorectal cancer and K-ras gene mutations of codon 12 have significant correlation with
colorectal cancer. There is no correlation between HPV 18 infections in patient and K-ras gene
mutations of codon 12 with colorectal cancer in Makassar.
Key word : HPV 18, K-ras gene mutations of codon 12, colorectal cancer.
PENDAHULUAN
Kanker dapat didefenisikan sebagai pembentukan sel-sel abnormal secara
cepat yang tumbuh melampaui batas-batas pertumbuhan sel pada umumnya
(WHO, 2012). Kanker adalah penyakit pertumbuhan sel yang bersifat ganas. Bisa
mengenai organ apa saja di tubuh manusia. Bila menyerang di kolon, maka
disebut kanker kolon, terletak pada pada bagian kolon desesnden (kanan), kolon
transversum (tengah), kolon asendens (kiri) dan kolon rektosigmoid. Bila
menyerang bagian rektum, maka disebut kanker rektum. Kanker usus besar
merupakan masalah kesehatan utama dan merupakan penyakit yang sangat umum
di negara-negara maju di dunia. Seluruh dunia setiap tahun, lebih dari 900.000
kasus baru didiagnosa, dan hampir 500.000 orang meninggal karena penyakit ini.
Sekitar dua pertiga dari kasus insiden terjadi di negara maju, dimana kanker
kolorektal adalah kanker paling umum ketiga pada pria dan kedua yang paling
umum pada wanita. Di negara berkembang, kanker ini adalah kanker kelima yang
paling umum pada kedua jenis kelamin (Casidy, et. al., 2007). Menurut defenisi
WHO dalam Casidy, et.al. (2007), kanker kolorektal terdiri dari semua tumor
ganas kolon dan rektum, dan secara histologi, hampir semua kanker usus besar
adalah adenokarsinoma (terdiri atas epitel kelenjar) dan dapat menyereksi mukus
dalam jumlah yang berbeda-beda (Price, Wilson, 2002).
Penyebab pasti dari kanker kolorektal belum diketahui secara pasti, namun
beberapa mikroorganisme telah diteliti berasosiasi pada jaringan tumor penderita
kanker kolorektal, salah satunya adalah virus human papillomavirus (Ou, Yen,
2010). dengan hampir 20% penyebab kanker pada manusia (Ou, Yen, 2010).
Human Papillomavirus (HPV) telah lama diketahui sebagai agen penyebab kutil
dan kemungkinan juga HPV berasosiasi dengan beberapa kanker. Telah
dilaporkan bahwa HPV 18 ditemukan pada papillomas genital dan kanker usus
besar (Lee, et al., 2001). HPV ditemukan berasosiasi dengan lesi premalignan dan
malignan pada epithelium squamosa traktus genital dan tumor extragenital. Akan
tetapi karsinogensis spesifik yang menyebabkan kanker kolorektal pada manusia
belum diketahui secara pasti (Cheng, et al., 1993).
Karsinogenesis kolorektal dipengaruhi oleh beberapa faktor yang
kompleks, salah satunya adalah perubahan sekuen genetik. Perubahan genetik
menginaktif supresor tumor dan pasangan gen yang tidak sesuai atau aktifasi
oncogene yang terlibat dalam pertumbuhan sel, ploriferasi atau diferensiasi yang
merupakan implikasi dari perkembangan karsinoma kolon. Salah satu gen target
yang mengalami perubahan adalah ras family yang menyandi protein kecil 21-kD
(p21 ras) yang terlibat dalam transduksi dengan stimulasi eksternal sampai
molekul efektor melintasi membran plasma. Protein ini memiliki aktivitas GTPase
yang selalu menginaktifasi signal transduksi pada kondisi sel normal. Aktifasi
protooncogene K-ras (Kirsten Rat Sarcoma Viral Oncogene) oleh mutasi titik
adalah salah satu perubahan genetik yang berasosiasi dengan kanker pada
manusia. Mutasi oncogen K-ras 20-50% secara sporadis terlibat dalam karsinoma
kolorektal. Berdasarkan penelitian, mutasi gen K-ras menyebabkan 20-50%
kanker kolorektal. Mutasi ini biasa terjadi pada kodon 12 dan 13 pada ekson 1,
kodon ini diidentifikasi sebagai target (Buyru, et. al., 2006).
Dalam penelitian ini, mukosa normal dan jaringan kanker kolorektal
dievaluasi untuk menentukan apakah HPV dan mutasi K-Ras terlibat atau tidak
terlibat dalam pengembangan neoplasma usus secara PCR (Bodaghi, et. al., 2005).
Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi DNA HPV 18 pada kanker kolorektal,
mendeteksi adanya E6 yang disandi HPV 18 penyebab karsinogenesis,
menyelidiki adanya mutasi K-ras pada kanker kolorektal, dan mengetahui adanya
korelasi keberadaan HPV 18 yang dideteksi melalui keberadaan E6 yang disandi
dengan mutasi K-Ras pada kolon penderita kanker kolorektal di Makassar.
BAHAN DAN METODE
Lokasi Penelitian
Pengambilan sampel penelitian ini direncanakan akan dilakukan di bagian
Bedah digestif Instalasi Bedah Sentral Rumah Sakit Umum Dr. Wahidin
Sudirohusodo Makassar, Rumah Sakit Hikmah Makassar, dan Rumah Sakit
Umum Haji Makassar untuk selanjutnya akan dilakukan penelitian di
Laboratorium Unit Penelitian Rumah Sakit Pendidikan Universitas Hasanuddin
Makassar
Desain Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan adalah metode explorative , yaitu
rancangan penelitian yang digunakan untuk menelusuri kemungkinan adanya
hubungan sebab akibat antara dua variabel yang belum pernah diketahui.
Sedangkan desain penelitian menggunakan desain cross sectional yaitu
pengambilan data variabel bebas dan variabel terikat dilakukan pada satu
waktu/bersamaan waktunya.
Populasi dan Sampel
Populasi penelitian adalah pasien penderita yang diduga kanker kolorektal
pada Rumah Sakit Umum Dr. Wahidin Sudirohusodo Makassar, Rumah Sakit
Hikmah Makassar, Rumah Sakit Umum Labuang Baji Makassar, dan Rumah
Sakit Umum Haji Makassar.
Sampel penelitian ini adalah jaringan normal dekat tumor dan jaringan
tumor penderita kanker kolorektal yang telah diangkat pada tindakan operasi
sebanyak 30 sampel.
Jaringan tumor penderita kanker kolorektal yang telah telah direseksi
dipotong sebesar 3 x 2 x 0,5 cm dan dimasukkan ke dalam tabung yang berisi
formalin. Sampel ini akan dikirim ke bagian patologi anatomi untuk ditentukan
stadium tumornya (TNM staging) secara histopatologi. Pada bagian tumor yang
sama, jaringan dipotong lagi untuk selanjutnya dimasukkan ke botol yang berisi
NaCl dan akan dideteksi HPV18 dan mutasi K-Ras secara molekuler dengan PCR.
Sementara pada kolon atau rektum pasien yang telah direseksi, jaringan normal
yang tidak memiliki tumor dipotong untuk selanjutnya dimasukkan ke botol yang
berisi NaCl dan akan dideteksi HPV18 dan mutasi K-Ras secara molekuler
dengan PCR untuk dibandingkan dengan jaringan tumor.
Jaringan kemudian diekstraksi dengan menggunakan mini kit Qiagen.
DNA hasil ekstraksi disimpan pada suhu -200 C.
Untuk mendeteksi HPV, DNA hasil ekstraksi diamplifikasi menggunakan
Genral Primer MY(9/11). MY9 CGTCCMARRGGAWACTGATC dan MY11
GCMCAGGGWCTATAAYAATGG. Produk PCR 450 bp. Sebagai kontrol
kualitas isolasi DNA digunakan primer gen Beta globine GH2O GAA GAG CCA
AGG ACA GGT AC, PCO4 CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC (Damin dkk,
2007).
DNA HPV yang positif pada amplifikasi menggunakan primer MY9/11
selanjutnya diamplifikasi dengan spesifik primer yang mengamplifikasi region E6
dari genome HPV 18. Primer HPV 18 E6 forward dan reverse masing-masing 5'CAC TTC ACT GCA AGA CAT AGA -3' dan 5'- GTT GTG AAA TCG TCG
TTT TTC A -3'. Produk akhir dari PCR dihasilkan 322 bp.
Untuk mendeteksi mutasi gen K-Ras digunakan primer forward K12&13F
ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGCCCT,
primer
reverse
12mt-R
AACAAGATTTACCTCTATTCCTGGATCA untuk kodon 12 (Nagasaka et. al.,
2004). Deteksi mutasi gen K-Ras yang dilakukan sesuai dengan metode yang
dijelaskan oleh Buyru et. al., (2006). Produk PCR dihasilkan 120 bp.
HASIL PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif. Subjek penelitian yang
memenuhi kriteria inklusi dan kriteria eksklusi, didapatkan 33 orang pasien bedah
digestif yang secara histopatologi adalah kanker usus dan rektum. Setiap orang
diambil sampel jaringan hasil reseksi pada dua tempat, yaitu jaringan kanker pada
bagian usus dan rektum yang terdapat massa tumor dan jaringan normal pada
bagian normal usus dekat massa tumor. Sehingga diperoleh 2 kelompok
penelitian, yaitu kelompok jaringan kolon normal dekat tumor (KN) sebanyak 31
sampel dan kelompok jaringan tumor (KT) sebanyak 33 sampel. Sebagai kontrol
digunakan jaringan usus yang secara kolonoskopi tidak menunjukkan kanker usus.
Sampel jaringan pasien kemudian dibawa ke RS UH untuk diekstraksi dan di
amplifikasi dengan mesin PCR menggunakan primer MY 9/11 untuk mendeteksi
HPV dan primer K-ras untuk mendeteksi mutasi gen K-ras.
Pada penelitian ini, usia subjek berkisar 26 -75 tahun dan terdapat 18 laki-laki
(58,1%) dan 31 perempuan (41,9%) pada kelompok KN dan 19 laki-laki (57,6%)
dan 14 perempuan (42,4%) pada kelompok KT yang memenuhi kriteria inklusi
secara histopatologi dan bersedia mengikuti penelitian.
Sampel yang diamplifikasi untuk pemerikasaan DNA virus HPV
menggunakan primer MY9/11 menunjukkan hasil negatif pada smpel kolon
normal dekat tumor dan kolon tumor. Hasil PCR mutasi gen K-ras kodon 12
menunjukkan mutasi sebanyak 18 (58,1%) dari 31 sampel kolon normal dekat
tumor dan 24 (72,7%) dari 33 kolon tumor.
Penelitian ini dilakukan deteksi Human Papilloma Virus (HPV) 18 dan
mutasi gen K-ras kodon 12 pada penderita kanker kolorektal di Makssar. Sampel
jaringan diperoleh dari jaringan kolon hasil reseksi pasien dengan riwayat kanker
kolorektal. Sampel yang diperoleh terlebih dahulu dikonfirmasi dengan
pemeriksaan histopatologi untuk memastikan tipe sel jaringan sampel adalah
karsinoma atau kanker. Jumlah sampel yang terkumpul sebanyak 38 pasien dan
yang termasuk kriteria inklusi adalah 63 yang dikategorikan kedalam 2 kelompok,
yaitu sampel jaringan tumor atau kanker (KT) sebanyak 33, dan sampel jaringan
normal dekat tumor (KN) sebanyak 31. Semua sampel kemudian diperiksa secara
molekuler untuk mencari HPV tipe 18 dan mutasi gen K-ras kodon 12.
Berdasarkan pemeriksaan histopatologi 33 jaringan tumor menunjukkan
keganasan (adenokarsinoma, adenokarsinoma + polip dan adenokarsinoma yang
bermetastasis ke kelenjar getah bening), perkembangan ke arah keganasan
(displasia dan anaplastik), dan polip. Adenokarsinoma diferensiasi baik 1 (3.0%),
adenokarsinoma diferensiasi sedang 23 (70.0%), adenokarsinoma diferensiasi
buruk 2 (6.0%), adenokarsinoma diferensiasi sedang dan polip 2 (6.0%),
Adenokarsinoma metastasis ke getah bening 1 (3.0%), polip 1 (3.0%), displasi 2
(6.0%), dan anaplastik 1 (3.0%). Sedangkan sampel KN menunjukkan sel normal.
Berdasarkan
Price
dan
Wilson
(2002),
KKR
didominasi
oleh
tipe
adenokarsinoma, yang penyebabnya belum diketahui secara pasti. Korelasi antara
adenokarsinoma yang disebabkan oleh virus belum diketahui jelas, akan tetapi
berdasarkan Lopez (1997) dan Fox (2000). HPV-18 berhubungan dengan
adenocarcinoma serviks, tetapi hubungan HPV 18 dengan karsinoma kolorektal
belum diketahui.
HPV merupakan virus yang secara etiologi telah diketahui sebagai
penyebab kanker serviks. Sedangkan pada KKR belum diketahui bagaimana HPV
menyebabkan kanker kolorektal. Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa
pada jaringan kanker kolorektal terdapat HPV. Akan tetapi penelitian lain pun
menunjukkan bukti berbeda bahwa pada kolon dan rektum yang mengalami
kanker, tidak ditemukan HPV dengan metode diagnosis yang sama. Pada
penelitian ini pun tidak dideteksi HPV dengan menggunakan prosedur kerja yang
dijelaskan pada beberapa jurnal (Bodaghi, 2005; Buyru, 2006; Deschoolmeester
V, 2010; Yavuzer, 2010; Damin, 2007). DNA hasil ekstraksi diamplifikasi
menggunakan primer berspektrum luas MY9/11 untuk mendeteksi gen L1 HPV.
Semua sampel jaringan tumor, jaringan normal dekat tumor dan jaringan bukan
tumor menunjukkan hasil negatif. Hal ini menunjukkan bahwa pada sampel
kanker kolorektal tidak ditemukan HPV. Hal ini mungkin disebabkan oleh tipe sel
kolon dan serviks berbeda.
Berdasarkan penelitian, mutasi gen K-ras menyebabkan 20-50% kanker
kolorektal. Mutasi ini biasa terjadi pada kodon 12 yang diidentifikasi sebagai
target (Buyru, et. al., 2006). Untuk deteksi mutasi gen K-ras kodon 12 pada
penderita KKR di Makassar dilakukan sesuai prosedur yang dijelaskan Nagasaka
(2004). DNA hasil ektraksi diamplifikasi dengan menggunakan primer forward
dan reverse yang didesain untuk mengamplifikasi K-ras mutan. Berdasarkan
histopatologi jaringan, terdapat 23 (70.0%) sampel dengan adenocarsinoma
diferensiasi sedang, yang terdiri atas 18 (78.3%) sampel yang mengalami mutasi
gen K-ras kodon 12. Pada tingkatan umur, 9 (27.3%) pasien terbanyak mengalami
kanker pada rentang umur 41 – 50 tahun dan 9 pasien mengalami mutasi pada gen
K-ras. Pada kriteria jenis kelamin, laki-laki lebih banyak mengalami kanker (19
(57.6%)) dibanding perempuan (14 (42.4%)). 12 (63.3%) dari penderita laki-laki
mengalami mutasi pada gen K-ras kodon 12.
Sedangkan pada jaringan normal kolon dekat tumor ditemukan mutasi 18
(58.1%) dari 31 pasien mengalami mutasi. Pada tingkatan umur, mutasi paling
banyak pada rentang 41 – 50 tahun, yaitu 8 (88,9%) dari 9 pasien. Dan pada
tingkat jenis kelamin, mutasi lebih banyak pada pasien laki-laki, yaitu 12 (66.7%)
dari 18 pasien. Sehingga dapat dikatakan bahwa mutasi K-ras pada jaringan yang
secara histopatologi terlihat normal dan pada jaringan kanker pada pasien yang
sama pada bagian kolon atau rektum yang sama tidak memiliki perbedaan
signifikan. Pada kedua jaringan itu ditemukan mutasi dengan tingkat persentasi
yang hampir sama.
KESIMPULAN DAN SARAN
HPV 18 tidak ditemukan pada penderita kanker kolorektal di Makassar.
Mutasi gen K-ras berperan dalam meningkatkan angka kejadian kanker kolorektal
di Makassar. Tidak ada korelasi antara infeksi HPV 18 dengan mutasi gen K-ras
pada penderita kanker kolorektal di Makassar.
Untuk peneliti selanjutnya perlu dilakukan penelitian terhadap agen
mikroba yang lain yang mungkin mempengaruhi mutasi gen K-ras dan gen-gen
lainnya yang mungkin mempengaruhi atau memperparah terjadinya kanker
kolorektal
DAFTAR PUSTAKA
Bodaghi S, Yamanegi K, Xiao SY, Costa MD, Palefsky JM, Zheng ZM.
Colorectal papillomavirus infection in colorectal cancer
patients. Clin cancer Res. 2005 April 15; 11 (8): 2862-2867.
Buyru N, Tezol A, Dalay N. Coexistence of K-ras mutations and
HPV infection in colon cancer. BMC cancer 2006, 6:115.
Casidy J, Johnston P, Cutsem. 2007. Colorectal Cancer. Informa
Healthcare USA, Inc.
Cheng JY, Meng CL, Chao CF, Gau SD, Lin JC. Human
papillomavirus 16 DNA in NIH3T3 cells transformed by
colonic cancer celluler DNA. Gut 1993; 34: 1710-1713.
Damin et al. Evidence for an association of human papillomavirusinfection
and colorectal cancer EJSO 33 (2007) 569e574
Deschoolmeester V, Marck VV, Baay M, Weyn C, Vermeulen P, Marck
EV, Lardon F, Fontaine V, Vermorken JB. Detection of HPV and
the role of p16INK4a overexpression as a surrogate marker for
the presence of functional HPV oncoprotein E7 in Colorectal
cancer. BMC cancer 2010, 10:117.
Lee YM, Leu SY, Chiang H, Fung CP, Liu WT. Human Papillomavirus
type 18 in Colorectal Cancer. J Microbial Immunol Infect. 2001
Jun; 34(2):n87-91.
Nagasaka, T., et., al. 2004. Colorectal Cancer With Mutation in
BRAF, KRAS and Wild-type with respect to Both Oncogenes
Showing Different Patterns of DNA Methylation. Jc0 volume
22.
Number
22.
November
15
2004.
Doi:
10.1200/JCO.2004.02.154.
Ou, J. J., Yen, T. S. B. 2010. Human Onkogenic Viruses. World
Scientific Publishing Co. Pte. Ltd.
Price SA. Dan Wilson LM. 2002. Patofisiologi. Penerbit Buku
Kedokteran EGC. Jakarta.
WHO. 2012. Cancer.
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/.
Yavuzer, D. et. al. Investigation of human papillomavirus DNA in colorectal
carcinomas and adenomas. Med Oncol (2011) 28:127–132
LAMPIRAN
Gambar 1. Hasil amplifikasi gen L1 HPV 18 (1-17 adalah sampel jaringan
kolon normal dekat tumor)
Gambar 2. Hasil amplifikasi gen L1 HPV 18 (1-13 adalah sampel jaringan
kolon tumor)
Gambar 3. Hasil PCR gen K-ras sampel jaringan normal dekat tumor
(KN14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 23, 24, 27, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37)
Gambar 4. Hasil PCR gen K-ras sampel jaringan tumor (KT17, 18, 19, 21,
22, 23, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 37)
Tabel 1. Hubungan antara histopatologi jaringan, umur, jenis kelamin
dengan HPV 18 dan mutasi gen K-ras pada sampel jaringan normal dekat
tumor (KN)
Kriteria
N
HPV 18
Mutasi K-ras
31 (100%)
0
18 (58,1%)
20 – 30
0
0
0
31 – 40
4 (12,9%)
0
3 (75%)
41 – 50
9 (29,0%)
0
4(44,5%)
51 – 60
7 (22,6%)
0
3(42,9%)
61 – 70
6 (19,4%)
0
4 (42,9%)
71 – 80
5 (16,1%)
0
4 (80%)
Laki-laki
18 (58,1%)
0
12 (66,7%)
Perempuan
13 (41,9%)
0
6 (46,2%)
Histopatologi jaringan
Normal
Umur
Jenis Kelamin
Tabel 1. Hubungan antara histopatologi jaringan, umur, jenis kelamin
dengan HPV 18 dan mutasi gen K-ras pada sampel jaringan tumor (KT)
Kriteria
N
HPV 18
Mutasi K-ras
31 (100%)
0
18 (58,1%)
20 – 30
1 (3,0%)
0
1 (100%)
31 – 40
4 (12,1%)
0
2 (50%)
41 – 50
9 (27,3%)
0
9(100%)
51 – 60
7 (21,2%)
0
6(85,7%)
61 – 70
7 (21,2%)
0
5 (71,4%)
71 – 80
5 (16,1%)
0
1 (20%)
Laki-laki
19 (57,6%)
0
12 (63,3%)
Perempuan
14 (42,4%)
0
12(85,7%)
Histopatologi jaringan
Normal
Umur
Jenis Kelamin