TERHADAP BAKTERI P

POTENSI ANTIBAKTERI DARI EKSTRAK KASAR BAKTERI
ASOSIASI KARANG BATU YANG TERINFEKSI PENYAKIT
BROWN BAND (BrB) TERHADAP BAKTERI PATOGEN
Staphylococcus aureus DAN Escherichia coli
SKRIPSI
FUNTY SEPTIYAWATI POLAPA
L111 11 016
Pembimbing :
Dr. Ir. Arniati Massinai, M.Si
Prof. Dr. Ir. Abdul Haris, M.Si
JURUSAN ILMU KELAUTAN
FAKULTAS ILMU KELAUTAN DAN PERIKANAN
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2015
i
ABSTRACT
FUNTY SEPTIYAWATI POLAPA. L 111 11 016. Antibacterial Potential Of Crude
Extract Associated Bacterial From Stony Coral Infected by Brown Band Disease
(BrB) to Staphylococcus aureus And Escherichia coli. Supervised by Arniati
Massinai and Abdul Haris.
An increasing number of cases of pathogenic bacterial resistance to antibiotics is
triggering increased supply of new antimicrobial compounds. One potential source of
antimicrobial compounds is bacterial associated with stony coral infected by Brown
Band Disease (BrB). The purpose of this study is to obtain crude extracts reefassociated bacteria that have antimicrobial activity to Staphylococcus aureus dan
Escherichia coli. This study uses three isolates of Pseudomonas sp, Flavobacterium
sp, and Bacillus sp. The results of the initial screening method using High
Throughput Screening (HTS) indicate only Flavobacterium sp isolated extract having
antibacterial activity. The results of the agar diffusion test indicate crude extract of
Flavobacterium sp is possibly pathogenic to bacteria Staphylococcus aureus with a
clear zone diameter of 0.2-1.3 mm, while against Escherichia coli, it has no activity.
keywords: Antibacterial Compounds, stony coral associated bacteria coral, Brown
Band Disease
ii
ABSTRAK
FUNTY SEPTIYAWATI POLAPA. L 111 11 016. Potensi Antibakteri Dari Ekstrak
Kasar Bakteri Asosiasi Karang Batu Yang Terinfeksi Penyakit Brown Band (BrB)
Terhadap Bakteri Patogen Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Dibimbing
oleh Arniati Massinai dan Abdul Haris.
Peningkatan jumlah kasus resistensi bakteri patogen terhadap antibiotik
akhir-akhir ini memicu peningkatan pencarian sumber senyawa antimikroba baru.
Salah satu sumber potensial penghasil senyawa antimikroba adalah bakteri yang
berasosiasi dengan karang yang terinfeksi penyakit. Tujuan penelitian ini adalah
memperoleh ekstrak bakteri yang berasosiasi dengan karang yang memiliki aktivitas
antimikroba S. aureus dan E. coli. Penelitian ini menggunakan 3 isolat bakteri
asosiasi jenis Pseudomonas sp, Flavobacterium sp dan Bacillus sp. Hasil skrining
awal dengan metode High Throughput Screening (HTS) hanya ekstrak isolat bakteri
Flavobacterium sp yang memiliki aktivitas antibakteri, selanjutnya hasil uji difusi agar
menunjukkan adanya potensi terhadap Staphylococcus aureus dengan diameter
zona bening 0,2 - 1,3 mm, sedangkan terhadap bakteri Escherichia coli tidak
memiliki aktivitas.
Kata Kunci : Senyawa Antibakteri, Bakteri Asosiasi Karang Batu, Brown Band
iii
POTENSI ANTIBAKTERI DARI EKSTRAK KASAR BAKTERI
ASOSIASI KARANG BATU YANG TERINFEKSI PENYAKIT
BROWN BAND (BrB) TERHADAP BAKTERI PATOGEN
Staphylococcus aureus DAN Escherichia coli
Oleh:
FUNTY SEPTIYAWATI POLAPA
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana
pada
Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan
JURUSAN ILMU KELAUTAN
FAKULTAS ILMU KELAUTAN DAN PERIKANAN
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2015
iv
v
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 12 September 1993 di Kota
Makassar,
Sulawesi
Selatan.
Anak
pertama dari
empat
bersaudara dari pasangan Bobby Polapa dan Harianti A. Hasan,
SH. Pada tahun 2005 lulus dari SDN 233 Batara Kota Palopo,
tahun 2008 lulus dari SMPN 3 Kota Palopo dan tahun 2011 lulus
dari SMAN 3 Kota Palopo. Pada tahun 2011, melalui Seleksi Jalur undangan penulis
berhasil diterima pada Program Studi Ilmu Kelautan, Jurusan Ilmu Kelautan,
Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan, Universitas Hasanuddin, Makassar.
Selama kuliah di Jurusan Ilmu Kelautan, penulis aktif sebagai asisten di
beberapa mata kuliah seperti Ekologi Laut, Mikrobiologi Laut, Koralogi, dan
Planktonologi Laut. Selain itu, penulis juga aktif pada berbagai organisasi
diantaranya Himpunan Mahasiswa Ilmu Kelautan, Marine Science Diving Club
(MSDC), dan Unit Kegiatan Mahasiswa Bola Voli Universitas Hasanuddin.
Pada tahun 2014, penulis melaksanakan salah satu tridarma perguruan
tinggi yaitu pengabdian masyarakat dengan mengikuti Kuliah Kerja Nyata (KKN)
gelombang 87, di Desa Lero, Kecamatan Suppa, Kabupaten Pinrang, Sulawesi
Selatan. Pada saat bersamaan, penulis sekaligus melaksanakan Praktik Kerja
Lapang (PKL) di Perairan Desa Lero, Kec. Suppa, Kab. Pinrang dengan judul
Kondisi Air Perairan Desa Lero Kecamatan Suppa Kabupaten Pinrang.
Akhirnya, sebagai salah satu syarat untuk menyelesaikan studi, penulis
melakukan penelitian dengan judul “Potensi Antibakteri Dari Ekstrak Kasar Bakteri
Asosiasi Karang Batu Yang Terinfeksi Peyakit Brown Band (BrB) Terhadap Bakteri
Patogen Staphylococcus aureus Dan Escherichia coli”.
vi
UCAPAN TERIMA KASIH
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat ALLAH SWT atas berkah dan
anugerah-Nya serta kasih sayang-Nya yang tidak henti-hentinya khususnya kepada
penulis dan keluarga penulis, hingga saat ini. Tidak lupa Shalawat kepada junjungan
Nabi dan Rasul Muhammad saw beserta para sahabatnya atas segala
perjuangannya atas segala perjuangannya dalam menyebarkan ajaran Islam.
Pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sangat tulus
kepada pihak-pihak yang telah membantu penulis mulai dari awal perkuliahan
hingga skripsi ini dapat terselesaikan.
1. Kepada kedua orangtuaku, Ayahanda Bobby Polapa dan Ibunda Harianti A.
Hasan, SH yang telah bersedia dengan ikhlas memberikan segala dukungan baik
itu materi dan nonmateri selama kuliah dan mendidik penulis dalam menimbah
ilmu pengetahuan sampai kepada penyelesaian studi di Jurusan Ilmu Kelautan
Universitas Hasanuddin
2. Kepada Pembimbing Ibu Dr. Ir. Arniati Massianai, M.Si dan Bapak Prof. Dr.
Abdul Haris, M.Si yang selalu memberikan nasehat dan memberikan arahan
dalam menyelesaikan tullisan ini.
3. Kepada Penguji Ibu Dr. Ir. Shinta Werorilangi, M.Sc, Bapak Prof. Dr. Akbar
Tahir, M.Sc dan Bapak Prof. Dr. Ir. Chair Rani, M.Si yang memberikan kritik
yang sangat membangun dalam penulisan skripsi ini.
4. Bapak Dr. Ir. Muh. Hatta, M.Si sebagai penasehat akademik yang selalu
memberikan semangat dan saran-saran yang membangun bagi penulis.
vii
5. Kepada Ibu Dr. Ir. Arniati Massinai, M.Si selaku ketua tim Penelitian dari Badan
Operasional Perguruan Tinggi (BOPTN) yang terlah mengikut sertakan saya
dalam penelitian tersebut dan membantu dalam hal dana penelitian.
6. Kepada Saudaraku Irfan, S.Pd, Hardieyanto Polapa, Haryanun Polapa dan
Muh. Randi Polapa yang senantiasa mendukung dan memberi semangat.
7. Kepada sahabatku Raodah Septi Legina, Fajria Sari Sakaria, Ismayanti,
Mustiara Bakri, Endang, Aswin Wardhana dan Suci Rahmadhani Artika,
Muh. Isman, Nizar Ardiansyah, Sartina, Yanuardi Septian, Fajar Pajrin dan
teman-teman KEDUBES lainnya yang selalu memberi warna selama masa
perkuliahan.
8. Teman-teman seperjuangan Wulan Sari Usman, Widyastuti, St. Radiyah
Jasrah, Annisa Z., Asirwan, Robby Nimzet, dan Mustono yang sangat
membantu selama penelitian berlangsung.
9. Teman-teman UKM Bola Voli UH Fitri Mabir Masa, Harvina Mukrim dan Andi
Evi Putri sari.
Masih sangat banyak orang-orang yang membantu dalam menyelasaikan tulisan
ini yang tidak bisa saya sebutkan satu-persatu. Penulis mengetahui jika tanpa
bantuan kalian semua maka tulisan ini tidak angka pernah mencapai akhir yang
baik, oleh karena itu sekali lagi penulis ucapkan TERIMA KASIH setulus-tulusnya,
tanpa kalian semua tidak akan ada artinya.
viii
DAFTAR ISI
Hal.
Abstrak ....................................................................................................................... ii
Sampul ....................................................................................................................... iii
Halaman Pengesahan .............................................................................................. v
Riwayat Hidup ........................................................................................................... vi
Ucapan Terima Kasih ............................................................................................... vii
Daftar Isi ..................................................................................................................... ix
Daftar Tabel ............................................................................................................... xi
Daftar Gambar ........................................................................................................... xii
I.
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang ............................................................................................. 1
B. Rumusan Masalah....................................................................................... 3
C. Tujuan dan Kegunaan ................................................................................. 3
D. Ruang Lingkup Penelitian ........................................................................... 4
E. Manfaat Penelitian ....................................................................................... 4
II.
TINJAUAN PUSTAKA
A. Penyakit Brown Band (BrB) ........................................................................ 5
B. Bakteri Asosiasi Hewan Karang ................................................................. 6
C. Senyawa Aktif Pada Hewan karang........................................................... 7
D. Uji Antimikroba ............................................................................................. 9
E. Bakteri Patogen ........................................................................................... 13
III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat ...................................................................................... 18
ix
B. Alat dan Bahan ............................................................................................ 18
C. Prosedur Kerja ............................................................................................. 19
1. Stok Bakteri............................................................................................ 19
2. Pembuatan Media ................................................................................. 20
3. Peremajaan Stok Bakteri ...................................................................... 21
4. Peremajaan Bakteri Patogen ............................................................... 21
5. Skrining Awal Antibakteri ...................................................................... 22
6. Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode HTS ..................................... 23
7. Penentuan Fase Stationer .................................................................... 23
8. Uji Potensi Ekstrak Bakteri Dengan Metode Difusi Agar ................... 23
D. Analisis Data ................................................................................................ 26
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Skrining Awal Aktivitas Antibakteri ............................................................. 27
B. Karakteristik Bakteri Asosiasi Karang Yang Terinfeksi BrB ..................... 29
C. Potensi Antibakteri Ekstrak Bakteri Asosiasi Karang Yang Terinfeksi
Penyakit BrB ................................................................................................ 29
V. SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 34
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................. 35
x
DAFTAR TABEL
Hal.
Tabel 1. Standar Kekeruan Mc Farland .................................................................. 20
Tabel 2. Diameter zona bening aktivitas antibakteri terhadap
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli ........................................... 28
xi
DAFTAR GAMBAR
Hal.
Gambar 1. Karang Yang terinfeksi Penyakit BrB Pada Karang Acropora sp ...... 6
Gambar 2. Zona bening hasil uji antimikroba dengan difusi agar ......................... 10
Gambar 3. Metode dilusi. ......................................................................................... 11
Gambar 4. Microplate wells. ..................................................................................... 13
Gambar 5. Bakteri Staphylococcus aureus. ........................................................... 15
Gambar 6. Bakteri Escherichia coli ......................................................................... 16
Gambar 7. Biakan Isolat bakteri asosiasi karang yang terinfeksi BrB .................. 19
Gamba 8. Bakteri Uji ................................................................................................. 20
Gambar 9. Pembuatan Medium ............................................................................... 20
Gambar 10. Alat Sentrifuse ...................................................................................... 20
Gambar 11. Metode HTS ....................................................................................... 23
Gambar 12. Alat Shaker-inkubator .......................................................................... 24
Gambar 13. Alat Corong Pemisah ........................................................................... 25
Gambar 14. Pengukuran Zona Bening.................................................................... 26
Gambar 16. Hasil Skrining awal aktifitas antibakteri ekstrak bakteri karang
batu yang terinfeksi BrB dengan Metode HTS .................................... 27
Gambar 17. Uji Daya Hambat terhadap bakteri Staphylococcus aureus ............. 30
Gambar 18. Uji Daya hambat Bakteri Escherichia coli .......................................... 30
xii
I.
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Resistensi bakteri patogen tehadap antibiotik-antibiotik yang ditemukan telah
menjadi masalah besar bagi dunia kesehatan. Pencarian suatu antibakteri sangat
perlu dilakukan untuk menanggulangi patogen penyakit pada manusia. Penelitian
tentang penggunaan bahan aktif yang berasal dari laut telah banyak dilakukan.
Ginting dkk. (2010) melaporkan bahwa ekstrak kasar bakteri yang berasosiasi
dengan spons jenis Acanthostrongylophora sp memiliki aktivitas antibakteri terhadap
Vibrio cholera, Staphylococcus aureus dan Bacillus subtillis. Selanjutnya Lisdayanti
(2013) mendapatkan fraksi dari ekstrak lamun Enhalus acoroides yang berasal dari
Kepulauan Spermonde Makassar dapat menghambat pertumbuhan
bakteri
Staphylococcus aureus. Namun informasi tentang bahan aktif yang berasal dari
karang masih sangat kurang.
Karang merupakan hewan masif yang rentan
terhadap predator dan perubahan parameter lingkungan yang ekstrim. Sehingga
untuk mempertahankan diri karang menghasilkan metabolit sekunder.
Penelitian tentang penggunaan bahan aktif yang berasal dari karang sebagai
antimikroba masih sangat terbatas.
Penelitian Priyatmoko (2008) mengungkap
bahwa ekstrak karang lunak Sinularia sp yang berasal dari Kepulauan Seribu
memiliki potensi sebagai antikanker. Ritchie (2006) mendapatkan bakteri asosiasi
pada lendir karang Acropora palmata yang berasal dari kanal Florida Keys dapat
menghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif dan Gram positif, yaitu Bacillus
subtilis, S. aureus, Salmonella typhimurium, dan Serratia marcescens. S.
marcescens adalah bakteri yang diisolasi dari karang yang terinfeksi penyakit white
pox. Ekstrak yang diambil dari bakteri yang berasosiasi dengan organisme memiliki
1
kelebihan dalam hal jumlah sampel.
Untuk mengekstrak organisme dibutuhkan
jumlah sampel yang lebih banyak dibanding dengan bakteri asosiasi organisme.
Pastra (2011) dalam Rizka (2013) menyatakan bahwa bakteri yang berasosiasi
menghasilkan zat bioaktif yang sama dengan inangnya.
Pengambilan senyawa aktif biasanya diambil dari bakteri asosiasi organisme
sehat, tetapi untuk pengambilan dari organisme yang terinfeksi penyakit belum
pernah dilakukan, padahal bakteri yang berasosiasi dengan organisme yang sakit
untuk bertahan hid up dan berada pada lingkungannya akan mengeluarkan
metabolit sekunder untuk melawan bakteri patogen. Abubakar dkk. (2011)
melakukan skrining bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. sebagai
penghasil senyawa antimikroba dengan hasil senyawa dari bakteri yang didapatkan
dapat mengahambat pertumbuhan beberapa bakteri patogen.
Peningkatan prevalensi resistensi bakteri patogen telah banyak dilaporkan
selama bertahun-tahun di berbagai daerah di dunia termasuk negara-negara
berkembang, dikaitkan dengan perubahan karakteristik mikroba, tekanan selektif
penggunaan antimikroba, perubahan teknologi yang meningkatkan pengembangan
dan transmisi yang resistan terhadap obat organisme (Byarugaba, 2009). Kumala
(2007) melaporkan bahwa jenis bakteri patogen S. aureus dan Escherichia coli telah
menjadi kebal terhadap antibiotik, sehingga perlunya pengembangan suatu zat kimia
yang memiliki kandungan sebagai antibakteri.
S. aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulat yang tersusun
dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur seperti buah anggur.
S. aureus
bersifat patogen yang menyebabkan hemolisis, membentuk koagulase dan mampu
meragikan manitol (Warsa, 1994). Infeksi oleh S. aureus ditandai dengan kerusakan
jaringan yang disertai abses bernanah. Beberapa penyakit infeksi yang disebabkan
2
oleh S. aureus adalah bisul, jerawat, impetigo dan infeksi luka. Infeksi yang lebih
berat di antaranya pneumonia, mastitis, phlebitis, meningitis, infeksi saluran kemih,
osteomielitis dan endokarditis (Ryan dkk.., 1994).
E. coli adalah bakteri yang secara normal hidup di saluran pencernaan
maunusia dan hewan. Bakteri ini berbentuk batang dan termasuk bakteri Gram
negatif (Anonim, 2013). Meskipun bakteri E. coli secara normal hidup di saluran
pencernaan, banyak kasus diare yang disebabkan oleh bakteri ini. Banyak terjadi
kasus EHEC (Enterohaemorrohagic Escherichia coli) terutama disebabkan oleh E.
coli O157:H7. Bakteri ini merupakan satu serotype E. coli yang bersifat patogen dan
berbahaya bagi manusia.
Penemuan antimikroba baru sebagai antibakteri patogen S. aureus dan E. coli
dan lingkungan perairan laut, maka penelitian tentang uji antibakteri asosiasi karang
batu yang terinfeksi penyakit BrB penting untuk dilakukan.
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan uraian di atas, maka diturunkan pertanyaan penelitian “Bagaimana
aktivitas dan potensi antibakteri senyawa dari ekstrak bakteri asosiasi karang batu
yang terinfeksi penyakit BrB terhadap bakteri S. aureus dan E. coli”.
C. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas dan potensi antibakteri
senyawa dari ekstrak bakteri asosiasi karang batu yang terinfeksi penyakit BrB
terhadap bakteri S. aureus dan E. coli.
3
D. Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini memiliki ruang lingkup berupa uji aktivitas dan potensi antibakteri
senyawa dari ekstrak bakteri asosiasi karang batu yang terinfeksi penyakit BrB
terhadap Bakteri S. aureus dan E. coli.
E. Manfaat
Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi bahan acuan untuk penelitian
selanjutnya dan sebagai informasi dasar pada industri farmasi untuk bahan dasar
pembuatan antibiotik.
4
II.
TINJAUAN PUSTAKA
A. Penyakit Brown Band (BrB)
Penyakit Brown Band (BrB) pertama kali ditemukan di Great Barrier Reef
Australia pada tahun 2002.
Penyakit ini dicirikan oleh band (pita) warna coklat
keemasan atau coklat muda yang terdapat antara jaringan yang sehat dengan
jaringan yang sudah mati (Gambar 1), terkadang terdapat jaringan memutih antara
band berwarna coklat keemasan dengan jaringan yang sehat.
Pada pita yang
berwarna coklat ditemukan populasi ciliata yang didalam tubuhnya terdapat
zooxantella.
Borneman (2001) berdasarkan hasil pengamatan penyakit BrB di
aquarium menunjukkan bahwa kemungkinan siliata (Helicostoma nonatum) yang
menghasilkan warna coklat seperti jely pada
karang. Keberadaan
ciliata ini
dikemukakan pula oleh Bourne dkk. (2008) memakan jaringan karang pada
permukaan koloni yang luka. Ciri-ciri penyakit dan adanya siliata pada band warna
coklat ditemukan pula oleh Raymundo dkk. (2006) di Philiphina dan juga ditemukan
oleh Massinai dkk. (2012) di empat pulau yang terdapat pada gugusan Kepulauan
Spermonde yaitu Pulau Kodingarenglompo, Pulau Badi, Pulau Barranglompo dan
Pulau Salemo.
Simanjuntak (2012) melaporkan pertumbuhan Acropora nobilis dengan metode
transplantasi penempelan fragmen karang pada media semen dan pengamatan
dilakukan selama 10 bulan hasil yang didapatkan laju pertumbuhan lebar rata-rata 6,
38 mm per bulan, sedangkan laju pertumbuhan tinggi rata-rata 5,53 mm per bulan.
Pengamatan prevalensi penyakit BrB yang dilakukan oleh Massinai dkk.. (2012)
pada tiga terumbu karang di Kepulauan Spormonde, dengan hasil presentasi Pulau
Salemo (0,07%), Pulau Barranglompo (0,21%) dan Pulau Kodingarenglompo
5
(0,27%).
Penyakit BrB ini laju infeksinya lebih cepat dibanding dengan laju
pertumbuhannya. Data tentang laju infeksi penyakit BrB di beberapa lokasi antara
lain pada karang Acropora sp 1,58 – 6,11 cm per hari di Pulau Barranglompo
Sulawesi Selatan (Massinai dkk., 2013). Sedangkan laju pertumbuhan karang pada
umumnya hanya 0,3 cm per hari (Nash, 2003). Laju infeksi penyakit BrB ini lebih
tinggi 5,4 kali lipat dibanding dengan laju infeksi penyakit Black Band yaitu 0,387 ±
0,309 cm per hari (Boyett, 2006) dan 0,14 cm per hari (Massinai dkk., 2012).
Gambar 1. Karang yang terinfeksi penyakit BrB pada karang Acropora sp. a. Pulau
Badi & b. Pulau Barranglompo (Sumber : Massinai (2012; 2013).
B. Bakteri Asosiasi Hewan Karang
Bakteri yang termasuk dalam organisme prokariot selain memiliki kegunaan,
juga bisa menimbulkan kerugian. Bakteri laut mampu mendiami seluruh bagian laut,
mulai dari permukaan air laut hingga dasar relung terdalam dan menempati berbagai
habitat. Habitat epibiotik (komunitas biofouling) merupakan permukaan benda mati
yang dilekati oleh komunitas bakteri, sedangkan komunitas endobiotik adalah
lingkungan dalam jaringan tubuh organisme inang (host) mungkin menguntungkan
(mutualisme), merugikan karena mengambil sari makanan dari organisme semang,
tapi tidak menyebabkan penyakit (parasitisme), dan membahayakan karena
menimbulkan penyakit yang mematikan (pathogenesis) (Sidharta, 2000).
6
Berbagai jenis bakteri yang berasosiasi dengan karang yang berada pada lokasi
yang berbeda-beda.
Hasil pengamatan Massinai dkk.. (2013) terhadap karang
Acropora sp yang terinfeksi BrB dan 3 jenis karang sehat yang diinvasi dengan BrB
ditemukan Choromobacterium sp, Pseudomonas sp, Flavobacterium sp dan,
Staphylococcus sp, sedangkan pada karang sehat ditemukan Choromobacterium
sp dan Flavobacterium sp. Selanjutnya Boyett (2006) melaporkan ada 9 jenis siliata
yang berasosiasi dengan Acropora brown band yaitu Parauronema longum,
Schizocaryum
dogieli,
Cohnilembus
verminua,
Anophyroides
haemophila,
Miamiensis avidus, Pseudocohnilembus marinus, Metanophrys similis, Paranophrys
magna dan Urenema marinum.
Bakteri asosiasi ada yang sementara dan ada yang menetap pada inangnya.
Bakteri yang menetap pada suatu biota disebut sebagai bakteri simbion. Bakteri
simbion pada umumnya melindungi biota yang ditumpanginya dan dirinya dengan
menghasilkan metabolit sekunder. Metabolit sekunder merupakan golongan
senyawa dengan struktur bervariasi dan khas untuk setiap organisme, memiliki berat
molekul relatif kecil, ditemukan dalam jumlah minor, berfungsi untuk pertahanan diri
organisme, melawan penyakit, pertumbuhan, atau hormon.
C. Senyawa Aktif Pada Hewan Karang
Senyawa bioaktif adalah senyawa kimia aktif yang dihasilkan oleh organisme
melalui jalur biosintetik metabolit sekunder (Khatab, 2008 dalam Romansyah, 2011).
Selain oleh inangnya senyawa aktif juga dapat dihasilkan oleh bakteri yang
berasosiasi dengan organisme tersebut (Pastra, 2011 dalam Rizka, 2013).
7
1. Senyawa Aktif Pada Karang
Metabolit sekunder diproduksi oleh organisme pada saat kebutuhan metabolisme
primer sudah terpenuhi dan digunakan dalam mekanisme evolusi atau strategi
adaptasi lingkungan. Kompetisi ruang dan makanan yang kuat juga mendorong
organisme laut menghasilkan metabolit sekunder (Muniarsih, 2005).
Metabolit
sekunder yang dihasilkan oleh karang lunak memiliki keragaman yang tinggi dan
struktur kimia yang unik. Hal tersebut dipengaruhi oleh tingginya keanekaragaman
organisme laut dan pengaruh lingkungan laut, yaitu salinitas, intensitas cahaya,
arus, dan tekanan. Karang lunak menghasilkan beberapa dari golongan senyawa
hasil metabolit sekunder, antara lain alkaloid, steroid, flavonoid, fenol, saponin, dan
peptida.
Karang lunak Sarcophyton sp dilaporkan memiliki kandungan senyawa
bioaktif alkaloid, steroid, dan flavonoid (Romansyah, 2011).
2. Senyawa Aktif Bakteri Asoiasi Karang
Bakteri diketahui terdapat sangat melimpah dan aktif di sekitar karang. Dinamika
mikrobiota ini dapat berada di sejumlah lekuk/celah karang, pada lapisan permukaan
mukus karang (Ritchie & Smith, 1995; Ritchie & Smith, 2004), di dalam jaringan
karang (Banin dkk., 2000), dan di badan air sekeliling karang (Frias-Lopez dkk.,
2002). Bakteri yang bersimbiosis dengan organisme kemungkinan besar banyak
melakukan interaksi biokimia dengan organisme inangnya.
Interaksi biokimia
tersebut memungkinkan bakteri yang bersimbiosis menghasilkan zat bioaktif yang
sama dengan inangnya (Pastra, 2011 dalam Rizka A., 2013). Bakteri yang memiliki
kemampuan antimikroba dapat menghasilkan senyawa antimikroba.
Senyawa
antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri pada umumnya merupakan metabolit
sekunder yang tidak digunakan untuk proses pertumbuhan (Schlegel, 1993), tetapi
8
untuk pertahanan diri dan kompetisi dengan mikroba lain dalam mendapatkan
nutrisi, habitat, oksigen, cahaya dan lain-lain (Baker dan Cook, 1974).
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mendapatkan senyawa aktif yang
berasal dari bakteri asosiasi karang. Seperti yang dilakukan oleh Huda dkk. (2011)
pada bakteri asosiasi karang lunak Sarcophyton sp, Ritchie (2006) pada bakteri
lendir karang A. palmata, Sabdono (2009) pada mikroba yang berasosiasi dengan
karang Goniastrea asper, dan masih banyak penelitian serupa dengan spesies
karang yang beragam.
D. Uji Antimikroba
Pengujian antibakteri adalah teknik untuk mengukur berapa besar potensi atau
konsentrasi suatu senyawa dapat memberikan efek bagi mikroorganisme. Secara
umum dikenal 3 metode utama untuk uji antimikroba yaitu difusi agar, dilusi dan
bioautografi Brock dan Madigan (1991).
1. Metode Difusi Agar Kirby-Bauer
Metode difusi agar Kirby-Bauer adalah salah satu metode pengujian kerentanan
bakteri terhadap antimikroba atau sering juga dinamakan uji daya hambat. Pertama
kali dikembangkan awal tahun 1950-an pada sebagian besar laboratorium
mikrobiologi klinis di amerika serikat, dan
pada tahun 1956 Kirby dan Bauer
mengusulkan metode disk tunggal untuk menyempurnakan pengujian kerentanan
antimikroba, kemudian pada tahun 1961 dibakukan oleh Organisasi Kesehatan
Dunia. Metode ini digunakan untuk menetukan resistensi atau sensivitas bakteri
aerob dan fakultatif anaerob terhadap bahan kimia tertentu (Hudzicki, 2010).
Metode difusi agar dilakukan dengan bahan uji yang telah dilarutkan dalam
pelarut yang sesuai dimasukkan kedalam sumuran atau diteteskan pada paper disk.
9
Kemudian ditanam dalam medium padat yang telah berisi mikroba uji.
Setelah
inkubasi diamati adanya zona bening di sekitar sumuran atau paper disk.
Kemampuan bahan uji menghambat bakteri uji ditandai dengan terbentuknya zona
jernih disekitar cakram uji dan dievaluasi : >20 mm (strong inhibition), 5-10 mm
(moderate inhibition) and <5 mm (weak inhibition) (Rante dkk., 2010). Hasil dari cara
kerja tersebut dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Zona bening hasil uji antimikroba dengan difusi agar.
2. Metode Dilusi
Metode ini biasanya digunakan untuk menetukan nilai MIC (minimum inhibition
concentration), konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan
mikroba uji metode dilusi dilakukan dengan mencampur sampel, mikroba uji dan
media inokulasi dengan beberapa variasi pengenceran.
Aktivitas yang diamati
dengan kontrol tanpa adanya bahan uji. Microplate titer assay menggunakan prinsip
dalam metode dilusi tapi dengan skala yang lebih kecil (100-250µL) (Gambar 3).
10
Gambar 3. Metode Dilusi.
Sumber : http://aguskrisnoblog.files.wordpress.com/
3. Metode Bioautografi
Bioautografi adalah suatu metode pendeteksian untuk mememukan suatu
senyawa antimikroba yang belum teridentifikasi dengan cara melokalisir aktivitas
antimikroba tersebut pada suatu kromatogram. Metode ini
memanfaatkan
pengerjaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Pada bioautogafi ini didasarkan atas
efek biologi berupa antibakteri, antiprotozoa, antitumor dan lain-lain dari substansi
yang diteliti. Ciri khas dari prosedur bioautografi adalah didasarkan atas teknik difusi
agar, dimana senyawa antimikrobanya dipindahkan dari lapisan KLT ke medium
agar yang telah diinokulasikan dengan merata bakteri uji yang peka. Dari hasil
inkubasi pada suhu dan waktu tertentu akan terlihat zona hambatan di sekeliling
spot dari KLT yang telah ditempelkan pada media agar. Zona hambatan
ditampakkan oleh aktivitas senyawa aktif yang terdapat di dalam bahan yang
diperiksa
terhadap
pertumbuhan
mikroorganisme
uji.
Bioautografi
dapat
dipertimbangkan karena paling efisien untuk mendetekski komponen antimikroba,
sebab dapat melokalisir aktivitas meskipun dalam senyawa aktif tersebut terdapat
11
dalam bentuk senyawa kompleks dan dapat pula diisolasi langsung dari komponen
yang aktif (Akhyar, 2010).
4. HTS (High Throughput Screening)
Metode HTS merupakan salah satu alternatif cara yang paling efektif dan efisien
untuk melakukan penapisan (seleksi) dan mengetahui potensi suatu mikroorganisme
(bakteri, actinomycetes, fungi maupun yeast) dalam jumlah besar serta waktu yang
singkat. Dengan sistem high throughput screening ini kegiatan penelitian sangat
dimudahkan karena seorang peneliti dapat dengan cepat mengendalikan jutaan
reaksi biokimiawi, melakukan analisis genetika atau farmakologi.
Secara umum
metode ini banyak digunakan dalam penelitian ilmiah bidang biokimiawi untuk
pencarian senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh suatu mikroorganisme sebagai
bahan obat baru bagi dunia farmasi dan kesehatan. Sistem HTS ini menyediakan
titik awal untuk melakukan desain obat dan memahami interaksi maupun peranan
dari satu proses biokimia pada suatu fenomena biologis. Teknik HTS ini didukung
oleh beberapa bahan di antaranya: microplate wells (Gambar 4) sebagai pelat
pengujian/ tempat untuk melakukan reaksi biokimiawi antara cairan sampel yang
dianalisis dengan pereaksi kimia dan buffer, software pengolah data dan perangkat
kontrol otomatis, microplate reader yang dilengkapi dengan detektor yang sensitif
terhadap reaksi biokimiawi yang terjadi (reaksi perubahan warna maupun
kekeruhan). Microplate titer yang digunakan untuk analisis HTS umumnya
mempunyai jumlah sumur/ lubang sebanyak 96 dengan ukuran tiap-tiap lubang 8 x
129 mm (Haryo, 2014).
12
Gambar 4. microplate wells.
5. Metode MTT Assay (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide)
Metode MTT Assay merupakan metode kolorimetri, dimana pereaksi MTT ini
merupakan garam tetrazolium yang dapat dipecah menjadi kristal formazan oleh
sistem suksinat tetrazolium reduktase yang terdapat dalam jalur respirasi sel pada
mitokondria yang aktif pada sel yang masih hidup. Kristal formazon ini memberi
warna ungu yang dapat dibaca absorbansinya dengan menggunakan Enzyme-linked
Immunosorbent Assay (ELISA) reader (Pamilih, 2009).
E. Bakteri Patogen
Bakteri Patogen adalah bakteri parasit yang menimbulkan penyakit pada hospes
atau
inang
yang
dihinggapi.
Adapun
contoh
bakteri
patogen
pada
manusia, Misalnya: E. Coli (Penyebab penyakit diare), S. aureus (penyebab infeksi
pada luka), Salmonella thyphosa (penyebab penyakit tifus) dan Vibrio comma
(penyebab penyakit kolera). Pada tumbuhan, misalnya Psedomonas cattleyae
(penyebab penyakit pada anggrek) dan P. Solanacearum (penyebab penyakit pada
pisang), sedangkan pada organisme budidaya, misalnya Vibrio harveii (patogen
pada Udang) dan Aeromonas hydrophila (patogen pada Ikan) (Yusuf, 2008).
13
1. Bakteri Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus merupakan nama spesies yang merupakan bagian dari
genus Staphylococcus. Bakteri ini pertama kali diamati dan dibiakkan oleh Pasteur
dan Koch, kemudian diteliti secara lebih terinci oleh Ogston dan Rosenbach pada
era tahun 1880-an. Nama genus Staphylococcus diberikan oleh Ogston karena
bakteri ini, pada pengamatan mikroskopis berbentuk seperti stangkai buah anggur
(Gambar 5), sedangkan nama spesies aureus diberikan oleh Rosenbach karena
pada biakan murni, kolini bakteri ini terlihat berwarna keemas-emasan. Rosenbach
juga mengungkapkan bahwa S. aureus dikenal secara luas sebagai penyebab
infeksi pada pasien pasca bedah dan pneumonia terutama pada musim dingin/hujan
(Delero dkk., 2009).
Ciri khas infeksi yang disebabkan oleh S. aureus adalah radang supuratif
(bernanah) pada jaringan lokal yang cenderung menjadi abses. Manifestasi klinis
yang paling sering ditemukan adalah furunkel pada kulit dan impetigo pada anakanak. Infeksi superfisal ini dapat menyebar (metastatik) ke jaringan yang lebih dalam
menimbulkan osteomielitis, arthritis, endokarditis dan abses pada otak, paru-paru,
ginjal serta gelenjar mamae.
Pneumonia yang disebabkan S. aureus sering
merupakan suatu infeksi sekunder setelah infeksi virus influenza. S. aureus dikenal
sebagai bakteri yang paling sering mengkontaminasi luka pasca bedah sehingga
menimbulkan kontaminasi.
Sumber pencemaran pada infeksi pasca bedah ini
diantaranya berasal dari penderita carrier yaitu dokter, perawat atau petugas
kesehatan yang terlibat dalam perawatan dan pembedahan pasien dan peralatan
medis yang terkontaminasi. Bila terjadi bakterimia, infeksi dapat bermetastasis ke
berbagai organ (Delero dkk., 2009).
14
Perang dunia kedua merupakan momen penting dalam sejarah resistensi S.
aureus terhadap antimikroba. Berbagai infeksi S. aureus termasuk sepsis, pada
waktu itu dapat diatasi dengan antimikroba penisilin. Tetapi dalam kurun waktu
kurang dari lima tahun telah ditemukan galur (strain) resisten terhadap antimikroba
tersebut. Bahkan pada tahun 1948 di Inggris misalnya, 60% isolat S. aureus telah
resisten terhadap penisilin dan pada akhir tahun 1950-an di berbagai negara Eropa
angka resistensi S. aureus terhadap penisilin telah mencapai 90% lebih (Giesbrecht
dkk., 1998).
Gambar 5. Bakteri Staphylococcus aureus.
Sumber : weareanalyst.blogspot.com
Klasifikasi Bakteri S. aureus menurut Fardiaz (1993) adalah sebagai berikut :
Kingdom : Eubacteria
Divisio : Firmicutes
Classis : Bacili
Ordo : Bacillales
Familia : Staphylococcaceae
Genus : Staphylococcus
Species : S. aureus
15
2. Bakteri Escherichia coli
E. coli adalah bakteri Gram negatif, berbentuk batang dalam sel tunggal atau
berpasangan, merupakan anggota familie Enterobacteriacea dan flora normal
intestinal yang mempunyai kontribusi pada fungsi normal intestine dan nutrisi tetapi
bakteri ini akan menjadi patogen bila mencapai jaringan di luar jaringan intestinal.
Spesies E.coli bersifat motil dengan flagel peritrik yang dimilikinya, tetapi beberapa
ada yang nonmotil. Manifestasi klinis dari infeksi E. coli ini tergantung pada daerah
infeksi dan tidak dapat dibedakan dari gejala yang disebabkan oleh bakteri lainnya
(Noviana, 2014).
E. coli adalah bakteri yang resisten terhadap beberapa antibakteri hal ini
disebabkan karena tiga lapisan dinding sel pada bakteri ini, sehingga beberapa
senyawa tidak mampu merusak jaringan dari dinding sel bakteri E. coli (Gambar 6).
Bakteri ini yang bersifat patogen pada manusia yang menyebabkan gangguan
pencernaan pada manusia dan menganggu system kerja dari organ lambung.
Bakteri ini sangat merugikan bagi manusia sehingga perlu adanya senyawa
penghambat dari bakteri patogen ini (Agung, 2010 dalam Nurfadillah, 2013).
Klasifikasi bakteri Escherichia coli menurut Fardiaz (1993) adalah sebagai berikut :
Kingdom : Eubacteria
Divisio : Proteobacteria
Classis : Gammaproteobacteria
Ordo : Enterobacteriales
Familia : Enterobacteriaceae
Genus : Escherichia
Species : Escherichia coli
16
Gambar 6. Bakteri Esherichia Coli.
Sumber : yalun.wordpress.com
17
III.
BAHAN DAN METODE
A. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei hingga Oktober tahun 2014 di
Laboratorium Mikrobiologi Laut dan Laboratorium Penyakit dan Parasit Ikan Fakultas
Ilmu Kelautan dan Perikanan, Universitas Hasanuddin.
B. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Tabung reaksi sebagai wadah
dalam peremajaan bakteri, Autoclave untuk mensterilkan peralatan basah, oven
untuk mensterilkan peralatan kaca/kering, hot plate with stirrer untuk membuat
medium, timbangan elektrik untuk menimbang bahan, erlen mayer sebagai wadah
medium, spatula digunakan untuk memindahkan bahan serbuk, gelas kimia sebagai
wadah cairan, ose bulat/lurus untuk memindahkan bakteri dari medium lama ke
medium yang baru, tip untuk memindahkan bahan cari dengan volume tertentu,
kertas saring untuk menyaring bahan, well plate 96 sebagai wadah pada proses
screening awal, bunzen untu memanaskan, cawan petri sebagai wadah untuk
menumbuhkan bakteri, sentrifus untuk memisahkan supernatant dan biomassa
sampel, laminar sebagai tempat untuk melakukan penanaman, inkubator digunakan
untuk membiakkan bakteri, sheker inkubator digunakan untuk membiakkan bakteri,
Spektrofotomete digunakan untuk menentukan standar McFarland sampel, gloves
sebagai pengaman tangan, masker sebagai pelindung pernapasan. Sedangkan
bahan yang digunakan dalah Trypticase Soy Agar (TSA) dan Trypticase Soy Broth
(TSB) sebagai medium bakteri, BaCl2(Barium Clorida) 1% dan H 2SO4(Asam Sulfat)
1% larutan untuk pembuatan standar McFarland, Metanol sebagai larutan esktraksi,
bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli, Ciprofloxacin sebagai kontrol
18
positif, DMSO (Dimethyl sulfoxide) sebagai kontrol negatif, larutan MTT {-3(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide} sebagai bahan uji screening
awal, alkohol 70%, aquades, tissue, kapas, almunium poil, kertas saring, dan pentul.
C. Prosedur Kerja
Prosedur kerja yang akan dilakukan pada penelitian ini sebagai berikut :
1. Stok Bakteri
Stok bakteri asosiasi karang yang terinfeksi penyakit BrB diambil di Laboratorium
Mikrobiologi Laut Jurusan Ilmu Kelautan Unhas. Sampel karang berasal dari Pulau
Barranglompo yang diambil pada bulan Mei 2014, titik koordinat pengambilan
sampel 050 3’ 14” BT dan E 1190 19’ 32” L, kemudian sampel diinokulasi dan diuji
biokimia, didapatkan hasil 3 jenis bakteri yaitu Bacillus sp (Kode sampel AF),
Flavobacterium sp (Kode Sampel AO, AM dan AH) dan Pseudomonas sp (Kode
sampel AH). Adapun gambar biakan isolat bakteri dapat dilihat pada Gambar 7. Stok
bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli diperoleh dari laboratorium
Karantina Ikan Makassar, sedangkan Bakteri uji Vibrio harveii dan Aeromonas
Hydrophila diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Laut FIKP UNHAS (Gambar 8).
Gambar 7. Biakan Isolat bakteri asosiasi karang yang terinfeksi BrB (a.
Pseudomonas sp, b. Bacillus sp, c. Flavobacterium sp).
19
Gambar 8. Bakteri Uji (a. Staphylococcus aureus, b. Escherichia coli).
2. Pembuatan Media
a. Tryptic Soy Broth (TSB)
Medium TSB terdiri dari pepton from casein 17 g, pepton from soymeal 3 g,
Glucose monohydrate 2,5, sodium chloride 5 g dan di-potassium hydrogen
phosphate 2,5 g. Pembuatannya dengan cara melarutkan 30 gram/liter medium TSB
dalam akuades steril. kemudian dididihkan, selanjutnya disterilkan dengan autoklaf
pada suhu 1210C selama 15 menit.
b. Triptic Soy Agar (TSA)
Medium TSA terdiri dari pepton from casein 15 g, pepton from soymeal 5 g,
sodium chloride 5 g dan agar 15 g. Pembuatannya dengan cara melarutkan 40
gram/liter medium TSA dalam akuades steril. Kemudian dididihkan (Gambar 9a),
selanjutnya disterilkan di autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit (gambar 9b).
Gambar 9. Pembuatan medium.
20
3. Peremajaan Stok Bakteri
Peremajaan bakteri asosiasi penyakit BrB dilakukan dengan cara mengambil
isolat bakteri dengan ose bulat kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang
berisi Medium TSB, inkubasi dengan suhu 30oC selama 1 x 24 jam. Bakteri yang
telah tumbuh ditandai dengan terjadinya perubahan medium dari jernih menjadi
keruh.
Bakteri asosiasi karang yang telah diremajakan selanjutnya di inokulasi pada
medium TSA, dengan cara mengambil isolat bakteri menggunakan ose bulat
kemudian digoreskan dengan cara zigzag di permukaan medium yang telah
memadat lalu diinkubasi pada suhu 370C selama 1x 24 jam. Bakteri yang telah
tumbuh pada medium TSA selanjutnya diinokulasi kembali ke medium TSB. Hasil
inokulasi tersebut kemudian di sentrifuse pada 6000 rpm selama 20 menit untuk
memisahkan supernatan dan biomassa sel bakteri (Gambar 10).
Gambar 10. Alat Sentrifuse.
4. Peremajaan Bakteri Patogen
Bakteri patogen yang digunakan dalam peneltian ini, yaitu Escherichia coli
(bakteri Gram negatif), Staphylococcus aureus (bakteri Gram positif), Aeromonas
hyrophyla (bakteri patogen pada ikan) dan Vibrio harveii (bakteri patogen pada
udang).
21
Peremajaan bakteri patogen dilakukan dengan cara mengambil isolat bakteri
dengan ose bulat kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi Medium
TSB, inkubasi dengan suhu 30oC selama 1 x 24 jam. Bakteri yang telah tumbuh
ditandai dengan terjadinya perubahan medium dari jernih menjadi keruh.
5. Skrining Awal Antibakteri
a. Penentuan Konsentrasi Bakteri Uji Standar Mc Farland
Bakteri uji diremajakan pada medium TSB, kemudian disiapkan Larutan H2SO4
0,36 N sebanyak 99,5 ml dicampurkan dengan larutan BaCl2.2H2O 1,175% sebanyak
0,05 ml dalam tabung reaksi. Kemudian dikocok sampai terbentuk larutan yang
keruh. Kekeruhan ini dipakai sebagai standar kekeruhan suspensi bakteri uji
(Victor,1980).
Selanjutnya
konsentrasi
bakteri
diukur
menggunakan
spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang 620 µm. Nilai standar untuk uji
Mc Farland dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Standar kekeruan Mcfarland.
Standar
McFarland
CFU (x10 /mL)
1% BaCl2 / 1%
H 2SO4 (mL)
0,5
<300
0.05 / 9.95
1
300
0.1 / 9.9
2
600
0.2 / 9.8
3
900
0.3 / 9.7
4
1200
0.4 / 9.6
5
1500
0.5 / 9.5
6
1800
0.6 / 9.4
7
2100
0.7 / 9.3
8
2400
0.8 / 9.2
9
2700
0.9 / 9.1
3000
1.0 / 9.0
10
Sumber : Sutton, 2011
6
22
6. Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode HTS (High Throughput Screening)
Skrining awal metode HTS menggunakan microwell plate 96 well (gambar 11).
Pelaksanaannya dilakukan dengan cara memasukkan medium TSB sebanyak 40 µl
pada well. Lalu menambahkan supernatant/biomassa bakteri asosiasi karang
sebanyak 40 µl, Bakteri uji S. aureus/E. coli sebanyak 20 µl , kontrol positif dan
negatif sebanyak 40 µl pada well yang telah ditentukan sebelumnya. Well plate
yang telah terisi di inkubasi selama 1x20 jam. Kemudian ditetesi larutan MTT.
Kemampuan aktivitas antimikroba dapat diketahui dengan melihat perubahan warna
setelah pemberian larutan MTT. MTT merupakan indikator pertumbuhan bakteri, bila
terjadi perubahan warna biru-ungu berarti bahan aktif tidak mampu menghambat
pertumbuhan bakteri (tidak ada aktivitas), sedangkan bila tidak terjadi perubahan
warna berarti ada aktivitas dari sampel uji.
Gambar 11. Metode HTS (High Throughput Screening).
7. Penentuan Fase Stasioner Bakteri
Berdasarkan skrining awal didapatkan bakteri asosiasi BrB yang memiliki aktivitas
sebagai antibakteri terhadap S. aereus dan E. coli. Bakteri yang memiliki aktivitas
23
sebelum diekstrak ditentukan fase stationer, menurut Bonang dan Enggar (1982)
pada fase stationer bakteri akan mengeluarkan metabolit sekunder seperti antibiotik
dan polimer. Penentuan fase stationer bakteri dilakukan dengan menginokulasi stok
bakteri asosiasi dengan menggunakan jarum ose kemudian dimasukkan kedalam
erlen mayer 250mL yang berisi medium TSB 100 mL, shaker selama 6 hari (Gambar
12). Isolat bakteri dipanen setiap hari sebanyak 1 mL disentrifus pada 6000 rpm
selama 20 menit untuk memisahkan bagian supernatant dan biomassa sel seperti
yang dilakukan Kumala dkk. (2007). Supernatant dan biomassa sel disimpan di
lemari pendingin. Selanjutnya dilakukan pengujian daya hambat dengan metode
difusi agar. Fase stasioner diketahui dengan mengamati diameter zona bening
terbesar seperti yang dilakukan oleh Massinai dkk.(2012).
Gambar 12. Alat Shaker-inkubator.
8. Uji Potensi Ekstrak Bakteri Dengan Metode Difusi Agar
Sebelum melalakukan uji potensi antinbakteri ekstrask bakteri asosiasi karang
yang terinfekksi karang yang terinfeksi BrB terlebih dahulu dilakukan pembuatan
stok dan ekstraksi bakteri
24
Stok bakteri asosiasi dilakukan dengan mengkultur bakteri dalam medium TSB
dengan memasukkan Inokulum menggunakana jarum ose ke dalam erlen mayer 1 L
yang berisi medium TSB 500 mL, selanjutnya di-sheker suhu 30˚C lama inkubasi
berdasarkan fase stationer masing-masing bakteri. Bakteri yang telah tumbuh
ditandai dengan terjadinya perubahan medium dari jernih menjadi keruh.
Stok bakteri yang telah dikultur disentrifus pada 6000 rpm selama 20 menit untuk
memisahkan supernatant dan sel. Supernatan diambil dan dilarutkan dengan pelarut
metanol 1:1, dimasukkan ke dalam corong pemisah dikocok selama 20 menit,
setelah terjadi pemisahan antara pelarut (lapisan atas berwarna bening) dan
medium (lapisan bawah berwarna kuning) (Gambar 13).
Lapisan bagian atas
diambil dimasukkan ke dalam wadah kaca dan diupkan hingga didapatkan ekstrak
berbentuk pasta. Untuk biosel diekstraksi mencuci telebih dahulu dengan aquades
steril kemudian direndam dengan Etil Asetat 1:10, sebanyak 2 kali ulangan.
Selanjutnya dievaporasi sampai kering seperti yang dilakukan Akhyar (2010).
Gambar 13. Alat corong pemisah.
25
Uji potensi antimikroba dengan metode difusi agar dengan merujuk pada
Zainuddin (2006). Dilakukan dengan mengambil 20µL supernatant/biomassa sel
bakteri dengan konsentrasi 40 ppm,diteteskan pada paper disk (size 6mm) dibiarkan
sampai kering. Bakteri uji yang telah diketahui kepadatannya diambil sebanyak 200
µL dimasukkan ke dalam cawan yang berisi 20 ml medium TSA hangat, dibiarkan
sampai memadat. Paper disk diletakkan dipermukaan medium yang berisi bakteri
uji, selanjutnya diinkubasi suhu 370C selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan
pengamatan dan pengukuran zona bening disekitar paper disk (Gambar 14).
.
Gambar 14. Pengkuran Zona Bening
D. Analisis Data
Data hasil uji aktivitas dan potensi antibakteri dari ekstrak bakteri asosiasi
karang batu yang terinfeksi penyakit BrB terhadap bakteri patogen S. aureus dan
E.coli dianalisis secara deskriptif menggunakan bantuan tabel dan gambar.
26
IV.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Skrining Awal Aktivitas Antibakteri
Skrining
awal
aktivitas
antibakteri
dalam
penelitian ini
menggunakan
metode high throughput screening (HTS). HTS merupakan salah satu alternatif cara
yang paling efektif dan efisien untuk melakukan penapisan (seleksi) dan mengetahui
potensi suatu mikroorganisme (bakteri, actinomycetes, fungi maupun yeast) dalam
jumlah besar serta waktu yang singkat (Haryo, 2014).
Stok isolat bakteri asosiasi karang batu yang terinfeksi penyakit BrB yang
digunakan pada penelitian ini adalah bakteri jenis Pseudomonas sp, Flavobacterium
sp dan Bacillus sp.
Hasil uji aktivitas antibakteri ketiga ekstrak isolat bakteri
terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio harvei dan
Aeromonas Hydrophila dengan metode HTS disajikan pada Gambar 15.
Gambar 15. Hasil skrining awal aktivitas antibakteri ekstrak bakteri karang batu
yang terinfeki BrB dengan metode HTS (High Throughput Screening).
27
Gambar 8 memperlihatkan bahwa dari ketiga isolat yang diuji aktivitasnya
hanya isolat bakteri jenis Flavobacterium sp yang memiliki aktivitas terhadap bakteri
patogen S. aureus dan E. coli, sedangkan terhadap bakteri patogen V. harvei dan
A. Hydrophila tidak memiliki aktivitas. Adanya aktivitas ditandai dengan terjadinya
perubahan warna terhadap ekstrak uji setelah pemberian indikator pertumbuhan
bakteri MTT, sedangkan isolat lainnya tidak memiliki aktivitas yang ditandai terjadi
perubahan warna menjadi biru-ungu setelah pemberian MTT. Hal ini didukung oleh
pernyataan Mosmann (1983) dalam Haris dkk. (2013) bahwa penggunaan indikator
pertumbuhan bakteri MTT dengan metode HTS. Apabila terjadi perubahan warna
sampel menjadi warna biru-ungu menandakan adanya pertumbuhan bakteri berarti
bahan aktif yang diuji tidak memiliki aktivitas, sedangkan apabila tidak mengalami
perubahan warna menandakan tidak ada pertumbuhan bakteri berarti bahan uji
mampu menghambat pertumbuhan bakteri pathogen (bakteri uji).
Penggunaan larutan MTT sebagai indikator pertumbuhan bakteri dilaporkan
oleh Massinai dkk. (2014) untuk menguji aktivitas dari bakteri asosiasi pada karang
Acropora sp sehat dengan hasil dapat mengahambat pertumbuhan bakteri patogen
Aeromonas Hydrophila. Larutan indikator MTT juga digunakan oleh beberapa
penelitian, seperti Penelitian Haris dkk. (2013) tentang Uji Antibakteri
Ekstrak
Sponge terhadap bakteri patogen Salmonella typhii, Aeromonas hydrophila, Vibrio
harveyii, dan Pseudomonas sp didapatkan 8 esktrak yang memiliki aktivitas.
Peneltian Khudry dkk. (2014) juga menggunakan larutan MTT sebagai larutan
indikator tentang aktivitas antibakteri ekstrak daun pohpohan (Pilea trinervia W.)
terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus, didapatkan hasil ekstrak yang
aktif terhadap bakteri Gram positif.
28
B. Karakteristik Bakteri Asosiasi Karang Yang Terinfeksi Penyakit BrB
Karasteristik bakteri asosiasi karang batu yang terinfeksi penyakit BrB yang
memiliki aktivitas sebagai antibakteri yaitu berwarna putih susu, bentuk koloninya
bulat (circular), elevasi convex dengan tepi entire, termasuk ke dalam Gram negatif,
kebutuhan terhadap oksigen termasuk aerob, bersifat non motil, oksidasi positif dan
katalase positif. Karasteristik Flavobacterium sp ini seperti yang dikemukakan oleh
Wahyuni (2011) bakteri Flavobacterium memiliki bentuk sel berupa batang, diameter
koloni mulai dari 0,2-2μm, koloni berwarna kuning tua, termasuk ke dalam Gram
negatif, kebutuhan terhadap oksigen termasuk aerob, rsifat non motil, oksidasi positif
dan katalase positif. Hal ini sejalan dengan pernyataan Jaelani (2014).
Menurut Durborrow et al. (1988), klasifikasi dari jenis bakteri Flavobacterium
adalah sebagai berikut ;
Kingdom: Bacteria
Phylum: Bacteroidetes
Class: Flavobacteria
Order: Flavobacteriales
Family: Flavobacteriaceae
Genus: Flavobacterium
Species: Flavobacterium sp
C. Potensi Antibakteri Ekstrak Bakteri Asosiasi Karang yang Terinfeksi BrB
Sebelum dilakukan uji potensi aktivitas antibakteri dari ekstrak bakteri
Flavobacterium sp dilakukan inkubasi selama 3 hari untuk menentukan fase
stationer. Namun berdasarkan hasil uji difusi tidak ditemukan adanya zona bening di
sekitar paper disk, sehingga digunakan lama inkubasi selama 3 hari berdasarkan
hasil
pengamatan
Massinai
dkk.
(2014)
mendapatkan
fase
stasioner
Champbacterium sp bakteri yang berasosiasi dengan karang Acropora sp sehat
yaitu pada hari ketiga.
29
Hasil pengujian aktivitas antibakteri dari bakteri asosiasi karang batu yang
teinfeksi penyakit BrB terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
ditunjukkan dengan terdapat zona bening di sekitar paper disk (Gambar 16 dan 17).
Diameter zona bening merupakan indikator daya hambat ekstrak Flavobacterium sp
terhadap S. aureus dan E. coli disajikan pada Tabel 2.
Gambar 16. Uji Daya Hambat terhadap bakteri S. aureus (a) Zona Bening (b) Paper
Disk (c) Kode Sampel (1) Ekstrak (2&3) Kontrol negatif (4) Kontrol positif.
Gambar 17. Uji Daya hambat terhadap bakteri E. coli (a) Paper Disk (b) Kode
Sampel(1) Ekstrak (2&3) Kontrol negatif (4) Kontrol positif.
30
Gambar 16-17 menunjukkan terdapat zona bening (0,7 mm) di sekitar paper
disk pada cawan petri yang mengandung bakteri S. aureus. Hal ini membuktikan
bahwa ekstrak Flavobacterium sp memiliki potensi sebagai antibakteri terhadap
bakteri Gram positif, sedangkan cawan petri yang mengandung bakteri E.coli tidak
terdapat zona bening disekitar paper disk, berarti ekstrak uji tidak memiliki potensi
sebagai antibakteri terhadap bakteri Gram negatif. Hal ini didukung dengan
pernyataan Noviani dkk. (2009) bahwa bakteri yang menunjukkan aktivitas daya
hambat ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni bakteri. Zheng
dkk. (2005) juga menemukan bakteri Flavobacterium sp dengan kode sampel NJ2-91 dapat menghambat pertumbuhan bakteri Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus
dan Agrobaceterium tumefaciens. Sedangan pada kode sampel NJ6-10-1, QD1-6
dan QD3-10 dapat menghambat pertumbuhan bakteri S.aureus.
Iskandar dkk. (2009) melakukan Uji aktivitas ekstrak etanol rumput laut yang
memiliki aktivitas terhadap bakteri Gram negatif Escherichia coli dan bakteri Gram
positif Bacillus cereus. Selanjutnya Uji aktivitas bakteri yang berasosiasi dengan
Spons Jaspis sp yang dilakukan oleh Abubakar dkk. (2011) juga dapat
mengahambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan Gram negatif. Penelitian
Lisdayanti (2013) terhadap ekstrak Lamun tidak dapat menghambat pertumbuhan
Bakteri Gram negatif, namun dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif.
31
Tabel 2. Diameter zona bening aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus
aureus dan Escherichia coli.
Kisaran diameter zona bening (mm)
Genus Bakteri
S. aureus
E. coli
Penelitian ini
Zheng (2005)
Penelitian ini
Zheng (2005)
0,2 - 1,3
0 - 0,3
-
-
Bacillus sp.
*
0–5
*
0–3
Pseudomonas sp.
*
0–3
*
-
Flavobacterium sp.
Ket : * tidak dilakukan penelitian
- Tidak menghambat
Tabel 2 menunjukkan bahwa nilai zona bening di sekitar paper disk ekstrak uji,
yaitu 0,2 – 1,3 mm. Hasil penelitian Zheng (2005) mendapatkan ekstrak
Flavobacterium sp diujikan terhadap S. aureus memiliki zona bening antara 0-3 mm
sedangkan pada bakteri uji E. coli tidak memiliki zona bening.
Perbedaan aktivitas dari senyawa anti bakteri dari terhadap kedua bakteri
tersebut kemungkinan disebabkan oleh perbedaan dinding selnya, E. coli
merupakan bakteri Gram negatif yang struktur dinding selnya terdiri dari tiga lapis,
sedangkan bakteri S. aureus adalah bakteri Gram positif yang berdinding sel
berlapis tunggal. Pelczar dan Chan (1988), menyatakan bahwa struktur dinding sel
bakteri S.aureus yang berlapis tunggal dan relatif sederhana akan memudahkan
masuknya zat-zat yang dapat merusak sel bakteri, sedangkan bakteri E. coli struktur
dinding selnya berlapis tiga. Membran luar berfungsi sebagai penyaring molekul dan
merupakan membran asimetrik yang terdiri dari lapisan fosfolipid, lipopolisakarida,
lipoprotein dan protein, sehingga molekul dari luar tidak mudah masuk. Selain itu,
bakteri Gram negatif memiliki endotoksin berupa polisakarida yang pada keadaan
tertentu bersifat toksik yang mampu mengeluarkan molekul yang akan masuk ke sel.
32
Allais dkk. (1986) menyatakan bahwa Bakteri Flavobacterium sp mengandung
enzim β-fructosidase. Enzim ini mengasilkan Asam Lemak Rantai Pendek, yaitu
asam asetat, propionat dan butirat. Senyawa-senyawa ini menurunkan pH
intraluminal dan secara langsung menghambat pertumbuhan mikroorganisme
berbahaya. Nuraida (2013) menyatakan ß-fructosidase dan ß-galaktosidase
menhidrolisis prebiotik. Prebiotik tertentu apabila dikonsumsi dalam jumlah yang
cukup telah menunjukkan manfaat kesehatan antara lain memperbaiki fungsi
saluran pencernaan, memodulasi sistem imun, memperbaiki metabolisme lipida dan
penyerapan mineral serta mengurangi risiko kanker.
33
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Berdasarkan
hasil
penelitian
disimpulkan
bahwa
ekstrak
bakteri
Flavobacterium sp yang merupakan bakteri asosiasi dengan Acropora sp yang
terinfeksi penyakit BrB memiliki aktivitas sebagai antibakteri terhadap bakteri Gram
positif Staphylococcus aureus.
B. Saran
Senyawa isolat bakteri asosiasi karang yang terinfeksi penyakit BrB
mempunyai potensi sebagai antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus,
untuk penerapannya diperlukan penelitian lanjutan.
34
DAFTAR PUSTAKA
Akhyar. 2010. Uji Daya Hambat Dan Analisis Klt Bioautografi Ekstrak Akar Dan
Buah Bakau (Rhizophora Stylosa Griff.) Terhadap Vibrio Harveyi (Skripsi).
Fakultas Farmasi Universitas hasanuddin. Makassar.
Anonim. 2013. Mengenal Bakteri Escherichia coli(Online). (http://www.anneahira.co
m/bakteri-escherichia-coli.htm). [diakses pada tanggal 16 September 2014].
Anonim. 2007. Bioprospecting-Fact Sheet(Online). (http://www.iavascript.history.go)
[diakses tanggal 13 September 2014].
Balai Penelitian Budidaya Air Payau. 2014. Laboratorium penguji. Kementrian
kelautan dan perikanan.
Boyett, H.V. 2006. The Ecology and Microbiology of Black Band Disease and Brown
Band Syndrome on The Great Barrier Reef (Tesis). James Cook University.
Townsville.
Bonang, G. dan S. Enggar. 1982. Mikrobiologi kedokteran untuk Laboratorium dan
Klinik. Gramedia. Jakarta.
Brock, T. D. dan M. T. Madigan. 1991. Biology Of Microorganisme (6). Prentice-Hall
International. inc. New Jersey.
Brown, W.L. 2007. Bioprospecting. Missouri Botanial Garden (Online). (http://www.wl
bcenter.org/bioprospecting.htm). [diakses tanggal 17September 2007].
Byarugaba, D.K. 2009. Department of Veterinary Microbiology and Parasitology.
Faculty of Veterinary Medicine (Jurnal). Makerere University. Kampala.
DeLeo, F.R. dan H.F. Chambers. 2009. Reemergence of antibiotic resistant Staphyl
ococcus aureus in the genomics era. J Clin Invest. 119(9):74.
DeLeo, F.R., Diep B.A, dan Otto M. 2009. Host defense and pathogenesis in
Staphylococcus aureus infections. Infect Dis Clin North Am. 23(1):17-34.
Efendi. 2010. Bioprospecting Senyawa Aktif dari Laut (Online). (http://agoblog.blogs
pot.com/2010/05/bioprospecting-senyawa-aktif-dari-laut.html). [diakses pada
tanggal 14 September 2014].
Fardiaz, S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT. Raja Grafindo Persada. Jakarta.
Giesbrecht, P., Kersten T., Maidhof, and Wecke. 1998. Staphylococcal cell wall: Mor
phogenesis and fatal variations in the presence of penicillin. Microbioly Mol
Biol Rev. 62:1371-1414.
35
Gupta S,1990, Mikrobiologi Dasar, diterjemahkan oleh Julius ES., edisi 3, Peberbit
Binarupa Aksara.
Haris, A., M. Arniati dan W. Shinta. 2013. Uji Antibakteri Patogen Ekstrak Sponge
Menggunakan Metode HighTroughput Screening(HTS) dengan indikator MTT
(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyltetrazolium bromide. Jurnal. Jurusan
Ilmu Kelautan. FIKP. Universitas Hasanuddin.
Haryo, R. 2014. Pemanfaatan Sistem High Throughput Screening (Hts) Untuk
Penapisan Dan Mengungkap Potensi Mikroba Unggulan (Online).
(Http://Haryobimo88.Blogspot.Com/) [Diakses Pada Tanggal 17 September
2014].
Hudzicki, J. 2009. Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test Protocol (Online).
(www.mikrolibrary.org). [Diakses Tanggal 12 September 2014].
Iskandar Y., R. Dewi., dan R. Rini. 2009. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol
Rumput Laut (Eucheuma Cottonii) Terhadap Bakteri Escherichia Coli Dan
Bacillus Cereus. Jurnal. Jurusan Farmasi Fakultas MIPA. Universitas
Padjadjaran. Jatinangor.
Jaelani, I. 2014. Bakteri Asosiasi Pada Karang Pachyseris Sp. Yang Terinfeksi
[Skripsi]. Jurusan Ilmu Kelautan. Fakultas Ilmu Kelautan Dan Perikanan.
Universitas Hasanuddin. Makassar
Kumala, S., E. Agustina, dan P. Wahyudi. 2007. Uji Aktifitas Antimikroba Metabolit
Sekunder kapang Endofit Tanaman trengguli (Jurnal). Bahan alam Indonesia
Vol.6, No.2 : 46-48.
Lisdayanti, E. 2013. Potensi Antibakteri Dari Bakteri Asosiasi Lamun (Seagrass) Dari
Pulau Bonebatang Perairan Kota Makassar (Skripsi). Fakultas Ilmu kelautan
dan perikanan universitas hasanuddin. Makassar.
Massinai, A., Syafiuddin, dan A.R. Jalil. 2013. Laju Infeksi Dan Kemampuan Invasi
Penyakit Brown Band (BrB) Terhadap Beberapa Karang Bercabang Di Pulau
Barranglompo. Progress Brown Band Disease (BrB) And Ivasion Of Same
Branching Coral In Barranglompo Island. Fakultas Ilmu kelautan dan
Perikanan Universitas Hasanuddin. Makassar.
Massinai, A. 2012. Kondisi dan Sebaran Penyakit pada Karang Batu (Stony coral) di
Kepulauan Spermonde Sulawesi Selatan(Disertasi). Program Pasca Sarjana.
Universitas Hasanuddin. Makassar.
Massinai, A., A.R. Tondok, A. Tahir, dan J. Jompa. 2012. Penyakit pada Karang Bat
u di Pulau Kodingareng Lompo Makassar Sulawesi Selatan. Torani, 1: 47-54
Melki., E.P.W. Ayu, dan Kurniati. 2011. Uji Antibakteri Ekstrak Gracilaria sp (Rumput
Laut) Terhadap Bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus(Jurnal).
36
Program Studi Ilmu Kelautan FMIPA Universitas Sriwijaya. IndralayaIndonesia
Muchtar, M. 2001. Bioprospeksi. Indonesian Nature Concervation Newsletter. Hal
11.
Murniasih, T. 2005. Substansi kimia untuk pertahanan diri dari hewan laut tak
bertulang belakang. Oseana. 30(2):19-27.
Nash, K. 2003. Ecological Inportance of Brown Band Syndrome. Master Of Applied
Science Project. James Cook University. Townsville.
Noviana, H. 2004. Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi dari
berbagai spesimen klinis.(jurnal). Jakarta. Vol. 23(4)
Nofiani. R, S. Nurbetty, dan A. Sapar. 2009. Aktivitas Antimikroba EkstrakMetanol
Bakteri Berasosiasi Spons Dari Pulau Lemukutan, Kalimantan
Barat.Pontianak. Universitas Tanjung Pura.
Nurfadillah. 2013. Uji Bioaktifitas Antibakteri Ekstrak dan Fraksi Lamun dari
Kepulauan Spermonde Kota Makassar (Skripsi). Fakultas Ilmu Kelautan dan
Perikanan Universitas hasanuddin. Makassar.
Pelczar, M. J., E.C.S. Chan. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi.Jilid 2. Hadioetomo, R.
S., Imas, T., tjitrosomo, S. S. Angka, S. L., penerjemaah; Jakarta: UI
dariElements of Microbioloy.
Plotkin, M.J. 2007. Searching Nature’s Medicines.American Institute og Biologycal
Science (Online). (http://www.action.bioscience.org/biotech/). [diakses
tanggal 17 September 2014].
Polski, M. 2005. The institutional economics of biodiversity biological materials and b
ioprospecting. Ecological Economics. 53:543–557.
Priyatmoko, W. 2008. Aktivitas Antibakteri Karang Lunak Hasil Transplantasi
(Sinularia Sp.) Pada Dua Kedalaman Berbeda Di Perairan Pulau Pramuka
Kepulauan Seribu, Dki Jakarta (Skripsi). Program Studi Teknologi Hasil
Perikanan Fakultas Perikanan Dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor.
(Repository Ipb).
Rante, H., B. Taebe, dan S. Intan. 2013. Isolasi Fungi Endofit Penghasil Senyawa
Antimikroba Dari Daun Cabai Katokkon (Capsicum Annuum L Var.
Chinensis) Dan Profil Klt Bioautografi. Majalah Farmasi dan Farmakologi Vol.
17, No.2. Makassar.
Reid, W.V., S.A. Laird, R. Gamez, A. Sittenfeld, D.H Janzen, M.A. Gollin, dan C.
Juma. 1993. A new lease on life. In: Biodiversity Prospecting: Using Genetic
Resources for Sustainable Development. World Resources Institute. pp.1–
52.
37
Ritchie, K. 2006. Regulation of microbial populations by coral surface mucus and
mucus-associated bacteria (Artikel). Marine Ecology. 322: 1–14.
Riyadi, I. 2008. Potensi Pengelolaan Bioprospeksi Terhadap Pertumbuhan Ekonomi
Indonesia (Jurnal). Litbang Pertanian. 27(2). Bogor.
Romansyah, Y. 2011. Kandungan Senyawa Bioaktif Antioksidan Karang Lunak
Sarcophyton Sp. Alami Dan Transplantasi Di Perairan Pulau
Pramuka,Kepulauan Seribu (Skripsi). Departemen Ilmu Dan Teknologi
Kelautan Fakultas Perikanan Dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor.
Ryan, K.J., J.J. Champoux, S. Falkow, J.J. Plonde, W.L. Drew, F.C. Neidhardt, dan
C.G. Roy. 1994. Medical Microbiology An Introduction to Infectious
Diseases(3).
Santoso, S. 2005. Metodelogi penelitian kuantitatif & kualitatif. Jakarta. Prestasi
pustaka publisher.
Sidharta, B.R. 2000. Pengantar Mikrobiologi Kelautan (jurnal).
Atmajaya Yokyakarta.
Universitas
Simanjuntak, L.S.M. 2012. Laju Pertumbuhan dan Tingkat Kelangsungan Hidup Kar
ang Acropora nobilis dan Montipora altasepta Hasil Transplantasi di Pulau Ka
rya Kepulauan Seribu(Abstrak).(http://repository.ipb.ac.id/handle/123456789/
55628) Diakses tanggal 16 September 2014.
Sutton, S. 2011. Determination of Inoculum for Microbiological Testing. 15 (3):4953
Syamsinar, S. 2013. Isolasi senyawa bioaktif ekstrak teripang Stichopus hermanii
dan
sebagai antibakteri Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis
(Skripsi). Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan Universitas Hasanuddin.
Makassar.
Tinambunan, H., Melki dan Isnaini. 2012. Efektifitas Ekstrak Bakteri yang
Berasosiasi dengan Spons dan Karang Lunak sebagai Antibakteri dari
Perairan Pulau Tegal Lampung (Jurnal). Program Studi Ilmu Kelautan FMIPA
Universitas Sriwijaya, Indralaya-Indonesia.
Yusuf, I. 2008.Pembagian Parasit.(http://iswadiyusuf.blogspot.com/2008/09/pembagi
an -parasit.html). diakses pada tanggal 26 Desember 2014.
Yulinery, T., I. Y. Petria dan N. Nurhidayat. 2009. Penggunaan Antimikroba Dari
Isolat Lactobacillus Terseleksi sebagai Bahan Pengawet Alami Untuk Mengh
ambat pertumbuhan Vibrio Sp. Dan Staphylococcus Aureus Pada Filletikan
Kakap. Berk. Penel. Hayati: 15 (85–92). Bidang Mikrobiologi, P2B LIPI.
Cibinong.
38
Wahyuni, P. 2011. Bioteknologi. (Makalah). (http://www.academia.edu). Diakses
pada tanggal 11 Januari 2015.
Warsa, U.C. 1994. Staphylococcus dalam Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Edisi
Revisi. Jakarta : Penerbit Binarupa Aksara. hal 103-110.
Zainuddin, E.N. 2006. Chemical and Biological Investigation of
Cyanobacteria (Blue-Green Algae).Thesis, University Greifswald.]
Selected
Zheng li, Xiaotian HAN, Haimin CHEN,Wei LIN dan Xiaojun YAN. 2005. Marine
bacteria associated with marine macroorganisms: the potential
antimicrobial resources. Annals of Microbiology,55 (2)119-124.
39