Seleksi Plant Growth Promoting Rhizobacteria

BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian
dilaksanakan
di
Laboratorium
Mikologi
Tumbuhan,
Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, dari
bulan Februari sampai bulan Juli 2011.
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel tanah
rizosfer yaitu sekitar perakaran tanaman sehat di antara tanaman yang terserang
embun bulu, media triptone soya agar (TSA), water agar (WA), media luria
bertani (LB), gliserol 40%, KOH 3%, aquades, formulasi komersial PGPR yang
mengandung bakteri Pseudomonas fluorescens dan Bacillus polymixa dengan
merek dagang “Actigrow” produksi PT. Agrotech Sinarindo.
Alat-alat yang digunakan adalah cawan petri, tabung reaksi, labu
erlenmeyer, jarum inokulasi, tabung eppendorf, laminar air flow, autoklaf, vortex,
mikroskop compound, pipet mikro, spektrofotometer, shaker, haemacytometer,
polybag, dan penggaris.
Metode Penelitian
Isolasi Bakteri
Tanah diambil dari perakaran tanaman sehat di sekitar pertanaman yang
terserang penyakit embun bulu. Sampel tanah diambil dari sekitar perakaran
tanaman mentimun, paria, dan jagung. Pengambilan sampel tanah dilakukan pada
tanah yang menempel pada perakaran tanaman. Sampel tanah tersebut lalu
dimasukkan sebanyak 10 g ke dalam labu erlenmeyer yang telah diisi 90 ml air
steril dan dikocok selama 15 menit. Suspensi yang dihasilkan diambil 1 ml
dengan pipet mikro dan diencerkan berseri hingga pengenceran 10-7. Masingmasing seri pengenceran tersebut diambil sebanyak 0,1 ml dan dicawankan pada
media TSA. Koloni bakteri yang tumbuh dimurnikan berdasarkan bentuk dan
warna koloni pada media TSA.
9
Uji Pendahuluan
Penghitungan Kerapatan Bakteri
Bakteri diambil sebanyak 1 lup lalu dibiakkan ke dalam media LB 5 ml.
Kemudian suspensi tersebut dikocok selama 24 jam. Setelah itu suspensi
diencerkan berseri hingga 10-8, masing-masing pengenceran diukur nilai OD
(optical density) menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 610
nm dan dicawankan sebanyak 0,1 ml ke media TSA. Hal ini bertujuan untuk
mengetahui nilai OD saat kerapatan bakteri 107 cfu/ml, sehingga mempermudah
metode percobaan selanjutnya
Seleksi Awal Bakteri Rizosfer terhadap Kecambah Mentimun
Seleksi awal dilakukan dengan merendam benih mentimun ke dalam
suspensi bakteri. Bakteri diambil sebanyak 1 lup dari media TSA, lalu dibiakkan
pada media LB dan dikocok selama 24 jam. Suspensi bakteri diukur tingkat
kekeruhannya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 610 nm hingga
diperoleh OD 0,25 atau kerapatan bakteri ±107 cfu/ml. Benih mentimun direndam
selama 1 jam di dalam suspensi bakteri, lalu ditanam pada media WA di dalam
cawan petri lalu diinkubasi selama lima hari. Masing-masing perlakuan diulang
tiga kali, satu cawan berisi 10 benih mentimun. Selanjutnya dilakukan pengukuran
panjang batang dan panjang akar. Dari uji tersebut, diambil lima bakteri terbaik
yang bersifat nonpatogen dan memacu pertumbuhan batang dan akar. Bakteri
yang menekan daya kecambah dan pertumbuhan kecambah berpotensi menjadi
patogen sehingga tidak digunakan pada uji selanjutnya.
Uji Reaksi Hipersensitif PGPR Terpilih
Pengujian reaksi hipersensitif bakteri dilakukan pada daun tembakau
(Suwanto 1996). Bakteri dibiakkan pada LB dan dikocok 24 jam, lalu disuntikkan
ke daun tembakau sebanyak 1 ml. Bakteri yang mempunyai sifat patogen akan
menimbulkan gejala nekrosis pada daun tembakau. Pengamatan dilakukan 24 jam
setelah inokulasi.
10
Uji Gram dan Penyimpanan PGPR Terpilih
Uji gram pada bakteri digunakan untuk mengetahui jenis gram positif atau
negatif suatu bakteri. Pengujian gram menggunakan KOH 3% yang diletakkan
pada gelas preparat, lalu dicampurkan bakteri sebanyak satu lup. Gram ditentukan
dengan melihat ada atau tidaknya lendir dari campuran bakteri dan KOH 3%. Jika
terdapat lendir maka bakteri tergolong ke dalam gram negatif. Jika tidak terbentuk
lendir maka bakteri tergolong ke dalam gram positif.
Bakteri yang bersifat nonpatogen yaitu T5, T6, T8, J8, P14 (Tabel 2)
dibiakkan ke dalam media LB dan dikocok selama 24 jam. Selanjutnya diambil
sebanyak 0,5 ml ke dalam tabung eppendorf lalu ditambah gliserol 40%.
Selanjutnya biakan disimpan pada suhu -4°C.
Pengaruh PGPR terhadap Pertumbuhan Tanaman Mentimun
tanpa Inokulasi Patogen
Penyiapan Media Tanam
Media untuk perlakuan adalah tanah dan kompos (masing-masing dengan
perbandingan 2:1). Selanjutnya tanah dimasukkan ke dalam polybag dan disiram
terlebih dahulu supaya lembab sebelum digunakan sebagai media tanam.
Perendaman Benih Mentimun
Perlakuan yang diujikan adalah perendaman benih ke dalam suspensi
bakteri T5, T6, T8, J8, dan P14 yaitu bakteri yang diperoleh dari seleksi awal,
sebagai pembanding adalah kontrol tanpa perlakuan bakteri dan PB yaitu PGPR
yang telah diformulasi komersial oleh PT. Agrotech Sinarindo yang merupakan
formulasi kombinasi bakteri Pseudomonas fluorescens dan Bacillus polymixa.
Bakteri diambil sebanyak 1 lup dari media TSA, lalu dibiakkan pada
media LB dan dikocok selama 24 jam. Suspensi bakteri diukur tingkat
kekeruhannya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 610 nm hingga
diperoleh OD 0,25 atau kerapatan bakteri ±107 cfu/ml. Benih mentimun direndam
selama 1 jam di dalam suspensi bakteri. Perlakuan benih dengan PGPR dilakukan
untuk pengolonian PGPR seawal mungkin pada akar, sehingga akan mencegah
pengolonian akar oleh mikroba patogen (Khalimi & Wirya 2009).
11
Penanaman Benih Mentimun
Penanaman dilakukan di dua lokasi, percobaan pertama penanaman
bertujuan untuk mengukur pengaruh perlakuan PGPR terhadap aspek agronomis,
sedangkan percobaan kedua penanaman bertujuan untuk mengetahui pengaruh
perlakuan PGPR terhadap masa inkubasi, kejadian penyakit, keparahan penyakit
embun bulu, dan aspek agronomis.
Benih yang telah direndam di dalam suspensi bakteri dengan kerapatan
7
±10 cfu/ml selama 1 jam lalu ditanam di dalam polybag yang berisi tanah steril.
Pengujian dilakukan dengan 7 perlakuan (Tabel 1). Masing-masing perlakuan
dilakukan dalam 3 blok sebagai ulangan, dan masing-masing ulangan terdiri dari 5
unit tanaman. Pengamatan pertumbuhan tanaman dilakukan setelah tanaman
berumur 12 HST (hari setelah tanam) hingga 32 HST.
Pemeliharaan dilakukan dengan menyiram tanaman setiap hari untuk
menjaga tanah tetap lembab. Ajir dipasang setelah tanaman berumur satu minggu.
Parameter yang diamati yaitu tinggi tanaman, diameter batang, jumlah daun,
panjang daun, volume akar, serta bobot basah dan bobot kering tanaman.
Tabel 1 Perlakuan PGPR yang diujikan
Percobaan
Perlakuan yang diujikan
K
benih tanpa perlakuan bakteri (kontrol)
T5
bakteri T5
T6
bakteri T6
T8
bakteri T8
J8
bakteri J8
P14
bakteri P14
PB
Pseudomonas fluorescens + Bacillus polymixa
Keterangan: T= bakteri dari perakaran tanaman mentimun, J= bakteri dari perakaran tanaman
jagung, P= bakteri dari perakaran tanaman paria, K= kontrol
Pengaruh PGPR terhadap Penyakit Embun Bulu pada Tanaman Mentimun
Inokulum P. cubensis diperoleh dari pertanaman mentimun di Kelurahan
Situgede, Kec. Bogor Barat, Kota Bogor. Inokulasi patogen dilakukan setelah
tanaman berumur 20 HST, dimana daun pertama hingga daun ketiga telah terbuka
sempurna. Daun mentimun yang bergejala dikerok untuk mendapatkan spora dari
12
P. cubensis, lalu dicampur dengan air steril untuk mendapat suspensi spora.
Suspensi diencerkan hingga mendapatkan kerapatan spora 9,25 x 104 spora/ml.
Kerapatan spora dihitung menggunakan haemacytometer.
Suspensi spora dengan kerapatan 9,25 x 104 spora/ml lalu disemprotkan ke
permukaan atas dan permukaan bawah daun mentimun sebanyak 25 ml/10
tanaman. Tanaman diinkubasi dalam suatu ruang yang setelah diukur memiliki
suhu minimum 24,5ºC dan suhu maksimum 35ºC, dengan kelembaban minimun
33% dan kelembaban maksimum 90%. Pengamatan dilakukan setiap hari dengan
parameter yang diamati yaitu masa inkubasi, kejadian penyakit, dan keparahan
penyakit. Sedangkan tinggi tanaman, diameter batang, jumlah daun, dan bobot
tanaman diukur setelah 32 HST atau hari terakhir pengamatan. Rumus-rumus
yang digunakan adalah sebagai berikut (Sinaga 2006):
Kejadian penyakit =
Keparahan penyakit =
∑nivi
x 100%
NV
keterangan: ni = jumlah tanaman dengan skor ke-i
vi = nilai skor penyakit dari i = 0, 1, 2, 3, 4, 5
N = jumlah tanaman yang diamati
V = skor tertinggi
Skor yang digunakan adalah sebagai berikut:
Skor
0
1
2
3
4
5
Luasan bercak (%)
0
0<x≤5
5 < x ≤ 10
10 < x ≤ 25
25 < x ≤ 50
x > 50
x 100%
13
Analisis Data
Percobaan disusun dalam Rancangan Acak Kelompok Lengkap (RAKL).
Data penelitian ditabulasi dengan program Microsoft Office Excel 2007 dan
Statistical Analysis System (SAS) for windows versi 9.1.3, lalu dilanjutkan dengan
uji selang berganda Duncan pada taraf nyata 5%.