(Boesenbergia rotunda) SECARA IN VITRO SKRIPSI
advertisement
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI PRODUK NANOPARTIKEL ALGINAT EKSTRAK ETANOL TEMU KUNCI (Boesenbergia rotunda) SECARA IN VITRO SKRIPSI Diajukan kepada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Yogyakarta untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Guna Memperoleh Gelar Sarjana Sains Kimia Oleh: Hajar Nur Afifah 13307141012 PROGRAM STUDI KIMIA JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA 2017 i UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI PRODUK NANOPARTIKEL ALGINAT EKSTRAK ETANOL TEMU KUNCI (Boesenbergia rotunda) SECARA IN VITRO Oleh: Hajar Nur Afifah NIM. 13307141012 Pembimbing : Prof. Dr. Sri Atun ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri dan untuk mengetahui konsentrasi yang optimal pada variasi konsentrasi produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci (Boesenbergia rotunda) terhadap bakteri Streptococcus mutans. Uji aktivitas antibakteri dilakukan secara in vitro. Produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci diencerkan dengan pelarut DMSO (Dimethylsulfoxide) hingga berkonsentrasi 0,5 ppm, 5 ppm, 50 ppm, 250 ppm, 500 ppm. Penelitian dilakukan dengan metode difusi agar, kloramfenicol digunakan sebagai kontrol positif dan DMSO sebagai kontrol negatif. Parameter yang diukur adalah besarnya diameter zona bening atau daya hambat yang terbentuk disekitar disckblank yang telah direndam dalam produk nanopartikel alginat. Dilakukan 3 pengulangan pada setiap konsentrasi dan dilakukan pengamatan selama 24 jam. Hasil analisis statistik menggunakan SPPS versi 16, pada uji Anova menunjukkan bahwa produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci berpengaruh secara signifikan dalam menghambat pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. Semakin tinggi konsentrasi produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci, maka semakin luas zona bening terbentuk, yaitu konsentrasi 0,5 ppm (8,05 mm) ; 5 ppm (8,40 mm) ; 50 ppm (8,42 mm) ; dan 500 ppm (10,02 mm). Konsentrasi yang menunjukkan aktivitas terbesar dalam variasi konsetrasi yang digunakan adalah 500 ppm. Penghambatan yang terjadi pada bakteri Streptococcus mutans tersebut menunjukkan bahwa produk nanopartikel alginat ektrak etanol temu kunci mengandung senyawa aktif yang bersifat anti bakteri. Kata kunci : uji aktivitas antibakteri, nanopartikel alginat, ekstrak temu kunci, Streptococcus mutans, difusi agar, zona bening. ii IN VITRO ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF ALGINATE NANOPARTICLE PRODUCTS FROM TEMU KUNCI (Boesenbergia rotunda) ETANOL EXTRACT. By : Hajar Nur Afifah 13307141012 Supervisor : Prof. Dr. Sri Atun ABSTRACT This research aimed to test antibacterial activity and to know the optimal concentration of alginate nanopartcle product from temu kunci (Boesenbergia rotunda) against Streptococcus mutans. Antibacterial activity performed in vitro. Alginate nanoparticle product from temu kunci etanol extract, diluted with DMSO solvent (Dimethylsulfoxide) to concentration 0.5 ppm, 5 ppm, 50 ppm, 250 ppm, and 500 ppm. This research performed agar diffusion method with kloramfenicol as positive control and DMSO as negative control. Parameters measured is width of clear zone diameter or inhibitory power, which is formed around a blank disc that has been soaked in alginate nanoparticle product. 3 repetitions were performed at each concentration and conducted observations in 24 hours. Statistical analysis result using SPSS version 16. On the Anova test showed that alginate nanoparticle product from temu kunci etanol extract have a significant effect in the inhibiton Streptococcus mutans bacteria. The higher concentration alginate nanoparticle product from temu kunci etanol extract, then the wider clear zone is formed, le at concentration 0.5 ppm (8.05 mm); 5 ppm (8.40 mm); 50 ppm (8.42 mm); and 500 ppm (1.02 mm). Concentrations that show the greatest activity in concentration variations is 500 ppm. The inhibition that occurs in Streptococcus mutans bacteria shows that alginate nanoparticle product from temu kunci etanol extract, contain active compounds that are antibacterial. Key Word : antibacterial activity, alginate nanoparticle, fingerroot extract, Streptococcus mutans, agar diffusion, clear zone. iii PERNYATAAN Yang bertanda tangan dibawah ini, saya: Nama : Hajar Nur Afifah NIM : 13307141012 Prodi : Kimia Fakultas : MIPA Judul : Uji Aktivitas Antibakteri Produk Nanopartikel Alginat Ekstrak Etanol Temu Kunci (Boesenbergia rotunda) Secara In Vitro. Menyatakan bahwa penelitian ini merupakan hasil dari pekerjaan saya yang tergabung dalam Penelitian Payung yang berjudul “Eksplorasi dan Pengembangan Senyawa Bioaktif dari Tumbuhan Zingiberaceae” yang diketuai oleh Prof. Dr. Sri Atun. Sepanjang pengetahuan saya skripsi ini tidak berisi karya atau pendapat yang ditulis atau diterbitkan orang lain, kecuali sebagai acuan atau kutipan dengan mengikuti tata penulisan karya ilmiah yang lazim. Tanda tangan dosen penguji yang tertera dalam halaman pengesahan adalah sah. Jika tidak sah, saya siap menerima sanksi ditunda yudisium periode berikutnya. Yogyakarta, 22 Juni 2017 Yang menyatakan, Hajar Nur Afifah NIM. 13307141012 iv v vi MOTTO ”Yang baik akan datang bagimereka yang percaya, yang lebih baik akan datang bagi mereka yang bersabar, dan yang terbaik akan datang bagi mereka yang tidak pernah menyerah” vii PERSEMBAHAN Alhamdulillahi robbil’alamin, kupanjatkan segala puji dan syukur kepada Allah SWT yang selalu memberikan petunjuk, rizki, dan pertolongan sehingga karya tulis ini dapat selesai tepat waktu. Saya persembahkan karya ini untuk : Kedua orang tua saya Bapak Widodo dan Ibu Suratmi, terima kasih atas segala doa, pengorbanan, kerja keras dan harapan yang telah Bapak dan Ibu berikan, semoga suatu hari anakmu bisa menjadi pribadi yang berguna dan membanggakan. Adikku Muhammad Ilham yang menjadi alasan supaya tetap bersemangat dan pantang menyerah, agar kelak bisa menjadi contoh dan panutan di masa depan. Teman-teman dikehidupan perantauan, pada saat suka maupun duka, Nur ihda, Lucky Enjang, Arumina, dan Mahardhika, Terima kasih banyak telah menjadi keluarga kedua di Yogyakarta. Team skripsi dan penelitian payung, Amel, Fitri, Billa, Putri, Wulan, Hajidah, Mbak Erna, Mbak Ninung, dan Mbak Ervi, terimakasih sudah menjadi team yang kompak dan selalu menyenangkan. Teman-teman Kimia B 2013, terimakasih telah menemaniku melewati 4 tahun ini dengan penuh kenangan, semoga kelak kita semua menjadi orang yang beruntung. Semua pihak yang telah mendukung dan membantu proses studi saya selama 4 tahun ini. viii KATA PENGANTAR Puji Syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat serta hidayah-Nya sehingga Tugas Akhir Skripsi dengan judul “Uji Aktivitas Antibakteri Produk Nanopartikel Alginat Ekstrak Etanol Temu Kunci (Boessenbergia rotunda) secara In Vitro” ini dapat diselesaikan walaupun masih terdapat banyak kekurangan. Penulis menyadari bahwa dalam penyelesaian tugas akhir skripsi ini tidak dapat lepas dari bimbingan, bantuan serta doa dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan segala ketulusan dan kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih kepada : 1. Bapak Dr. Hartono, selaku Dekan FMIPA UNY yang telah memberikan ijin dan fasilitas dalam penelitian ini. 2. Bapak Jaslin Ikhsan, M.AppSc., Ph.D, selaku Kajurdik dan Kaprodi Kimia FMIPA UNY. 3. Ibu Prof. Dr. Endang Widjajanti L. FX M.S, selaku Pembimbing Akademik 4. Ibu Prof. Dr. Sri Atun, selaku pembimbing yang telah memberikan fasilitas dalam penelitian ini, waktu, masukan, kritikan, saran, dan kesabarannya dalam membimbing penulis. 5. Ibu Prof. Dr. Indyah Sulistyo Arty, M.S, selaku penguji skripsi yang telah memberikan saran, kritik dan masukan sehingga skripsi ini menjadi lebih baik. 6. Ibu C Budimarwanti, M.Si, selaku penguji skripsi yang telah memberikan saran, kritik dan masukan sehingga skripsi ini menjadi lebih baik. ix 7. Segenap dosen dan staf karyawan Jurusan Pendidikan Kimia yang telah memberikan banyak ilmu pengetahuan selama menjalani studi di Jurusan Pendidikan Kimia. 8. Semua pihak yang telah membantu baik moril maupun materiil, baik langsung maupun tidak langsung kepada penulis dalam penulisan skripsi ini. Penulis menyadari sepenuhnya bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari kata sempurna, sehingga perlu kritik dan masukan yang bersifat membangun guna perbaikan selanjutnya. Akhirnya penulis berharap semoga skripsi ini memberikan manfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan dapat digunakan sebagaimana mestinya. Yogyakarta, Juni 2017 Penulis x DAFTAR ISI ABSTRAK .............................................................................................................. ii ABSTRACT ........................................................................................................... iii PERNYATAAN..................................................................................................... iv PERSETUJUAN .................................................... Error! Bookmark not defined. PENGESAHAN ..................................................... Error! Bookmark not defined. MOTTO ................................................................................................................. vi PERSEMBAHAN ................................................................................................ viii KATA PENGANTAR ........................................................................................... ix DAFTAR ISI .......................................................................................................... xi DAFTAR TABEL ................................................................................................ xiv DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xv DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xvi BAB I PENDAHULUAN ....................................................................................... 1 A. Latar Belakang .......................................................................................... 1 B. Identifikasi Masalah .................................................................................. 4 C. Pembatasan Masalah ................................................................................. 4 D. Perumusan Masalah .................................................................................. 5 E. Tujuan Penelitian ...................................................................................... 5 xi F. Manfaat Penelitian .................................................................................... 5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA............................................................................. 7 A. Deskripsi Teori.......................................................................................... 7 1. Temu Kunci (Boesenbergia rotunda) ....................................................... 7 2. Nanopartikel Alginat ............................................................................... 11 3. Streptococcus mutans.............................................................................. 13 4. Uji Antibakteri ........................................................................................ 15 B. Penelitian yang Relevan .......................................................................... 17 C. Kerangka Berpikir ................................................................................... 17 BAB III METODE PENELITIAN........................................................................ 20 A. Subjek dan Objek Penelitian ................................................................... 20 1. Subjek Penelitian .................................................................................... 20 2. Objek Penelitian ...................................................................................... 20 B. Variabel Penelitian .................................................................................. 20 1. Variabel Bebas ........................................................................................ 20 2. Variabel Terikat ...................................................................................... 20 C. Instrument Penelitian .............................................................................. 20 1. Alat :........................................................................................................ 20 2. Bahan : .................................................................................................... 21 3. Prosedur Penelitian ................................................................................. 21 xii D. Teknik Analisis Data............................................................................... 23 E. Diagram Alir Prosedur Penelitian ........................................................... 24 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 26 A. Nanopartikel ............................................................................................ 26 B. Uji Aktivitas Antibakteri......................................................................... 26 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 44 A. Kesimpulan ............................................................................................ 44 B. Saran........................................................................................................ 44 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 46 LAMPIRAN .......................................................................................................... 50 xiii DAFTAR TABEL Tabel 1. Nilai Optical Density pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans.............................................................................................. Tabel 2. Aktivitas antibakteriStreptococcus mutans terhadap nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci........................................................ Tabel 3. Tabel 4. 31 35 Hasil uji Anova terhadap diameter zona bening Streptococcus mutans.............................................................................................. 37 Aktivitas antibakteri Streptococcus mutans terhadap kloramfenicol.. 40 xiv DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Rimpang temu kunci................................................................. 8 Gambar 2. Senyawa dalam ekstrak temu kunci.......................................... 11 Gambar 3. Struktur poliguluronat dan polimanuronat pada alginatBakteri 12 Gambar 4. Streptococcus mutans................................................... Gambar 5. Sketsa petridisck berisi bakteri Streptococcus mutans dan 14 disckblank dengan 3 ulangan................................................... 25 Gambar 6. Struktur kimia CMC dan DMSO.............................................. 27 Gambar 7. Suspensi nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci......... 28 Gambar 8. Bakteri Streptococcus mutans pada media NA......................... 29 Gambar 9. Kurva Pengukuran bakteri Streptococcus mutans..................... 32 Gambar 10. Penanaman bakteri Streptococcus mutans dan disckblankpada media MHA (Mueller Hinton Agar)............................... Gambar 11. Kurva aktivitas antibakteri Streptococcus mutans terhadap produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci............ Gambar 12. 34 36 Kurva aktivitas antibakteri Streptococcus mutans terhadap kloramfenicol (kontrol positif).................................................. 39 Gambar 13. Lebar zona bening dengan 3 pengulangan, pada konsentrasi 0,5 ppm...................................................................................... 41 xv DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Kurva pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans..................... Lampiran 2. Diameter zona bening (mm) produk nanopartikel ekstrak etanol temu kunciterhadap bakteri Streptococcus mutans..................... Lampiran 3. 49 50 Diameter zona bening (mm) kloramfenicolterhadap bakteri Streptococcus mutans.................................................................. 53 Lampiran 4. Uji statistik ANOVA................................................................... 56 Lampiran 5. Dokumentasi penelitian................................................................ 62 xvi BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penggunaan tanaman herbal untuk obat-obatan memang sudah sangat dikenal mulai dari jaman nenek moyang. Khasiat tanaman herbal yang efektif menjadi alasan mengapa tanaman herbal terus dibudidayakan hingga saat ini. Selain itu cara penanaman yang mudah dan tidak membutuhkan lahan yang besar sangat cocok untuk dijadikan tanaman dilingkungan rumah atau yang lebih umum disebut dengan TOGA (tanaman obat keluarga). Dijaman modern seperti sekarang ini banyak produk terutama obat-obatan yang dijual dipasaran dengan bahan dasar tanaman herbal. Salah satu tanaman herbal yang bermanfaat dan berkhasiat adalah temu kunci dengan nama latin Boesenbergia rotunda.Temu kunci dapat tumbuh disembarang tempat dengan syarat tidak pada genangan air dan terkena sinar matahari secara langsung, oleh karena itu temu kunci banyak dibudidayakan dipekarangan rumah. Kandungan kimia yang ada dalam temu kunci adalah minyak atsiri (terdiri dari kamfer, sineol, metil sinamat, dan hidromirsen), damar, pati, saponin, flavonoid pinostrolerin, dan alipinetin. Manfaat dari temu kunci adalah sebagai obat batuk, berkhasiat untuk meluruhkan dahak, untuk obat kurang gizi yang berkhasiat untuk menambah nafsu makan, obat sakit perut yang berkhasiat meluruhkan kentut, obat urine yang berkhasiat melancarkan kencing, dapat mengurangi rasa gatal dan menyembuhkan kurap (Hieronymus, 1998). 1 Penghantaran obat menggunakan produk nanopartikel merupakan teknologi yang relatif baru namun potensinya cukup besar. Kemampuan nanopartikel dalam menghantar protein serta menjaga keutuhan dan fungsi protein yang dihantarkan memberikan nilai lebih sehubungan dengan cepatnya protein terapeutik bermunculan dipasaran (Hurkat et al., 2012; Sarmento et al,. 2007). Nanopartikel menawarkan stabilitas protein yang lebih tinggi dan dapat membantu menghantarkan protein menembus membran sel menuju sitoplasma. (Hurker et al., 2012;Singh & Lillard, 2009). Pengembangan produk nanopartikel memerlukan material nanopartikel dan senyawa pentarget yang sesuai. Material yang digunakan harus bersifat biodegradabel, biokompatibel, dan dapat membentuk nanopartikel yang stabil dan mampu mengangkut protein. Karakteristik tersebut ada pada alginat maupun kitosan (Amidi et al,. 2006; Saether et al., 2008; Sarmanto et al., 2007). Pada jaman modern yang semakin berkembang seperti saat ini terdapat berbagai masalah kesehatan yang beragam, angka penderitanya juga semakin meningkat. Salah satu masalah kesehatan yang mengkhawatirkan adalah penyakit gigi dan mulut yang dipengaruhi oleh berbagai faktor. Penyakit karies gigi dan penyakit periodental merupakan dua penyakit gigi dan mulut yang paling sering ditemukan dan merupakan penyebab utama pasien kehilangan gigi. Karies gigi merupakan suatu penyakit infeksi yang dapat menular, penyakit ini menyerang jaringan keras gigi, sehingga terjadi kerusakan pada jaringan keras gigi yang disebabkan oleh bakteri. Terdapat berbagai spesies bakteri yang berkoloni di dalam rongga mulut terutama pada plak gigi. Salah satu spesies bakteri yang 2 dominan dalam mulutyaitu bakteri Streptococcus mutans. Jenis bakteri ini diketahui merupakan bakteri penyebab utamatimbulnya karies gigi. Telah banyak penelitian yangmembuktikan adanya korelasi positif antara jumlah bakteriStreptococcus mutans pada plak gigi dengan prevalensi karies gigi,hal ini disebabkan beberapa karakteristik dari bakteriStreptococcus mutans yaitu mampu mensintesis polisakaridaekstraseluler glukan ikatan α (1–3) yang tidak larut darisukrosa, dapat memproduksi asam laktat melalui proseshomofermentasi, membentuk koloni yang melekat denganerat pada permukaan gigi, dan lebih bersifat asidogenikdibanding spesies Streptococcus lainnya. Oleh karena itubakteri ini telah menjadi target utama dalam upayamencegah terjadinya karies gigi (Sabir, 2005). Uji aktivitas antibakteri untuk mengukur berapa besar potensi atau konsentrasi suatu senyawa dapat memberikan efek bagi mikroorganisme(Dart, 1996). Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada zat yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri yang dikenal sebagai bakteriostatik dan bersifat membunuh bakteri yang dikenal sebagai bakterisida(Ganiswara 1996). Ada berbagai macam uji aktivitas antibakteri salah satunya adalah dengan menggunakan metode In vitro. Metode In vitro adalah uji aktivitas antibakteriyang menggunakan media buatan sesuai dengan lingkungan atau habitat lingkungan yang diperlukan oleh mikroba untuk tumbuh dan bekembang biak. Dengan pembuatan media tumbuh bakteri pada sebuah agar, yang diinkubasi dan diberi perlakuan sesuai habitat aslinya. 3 B. Identifikasi Masalah Dari latar belakang yang telah diuraikan, maka dapat diidentifikasi beberapa masalah sebagai berikut : 1. Metode uji aktivitas antibakteri produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci. 2. Bakteri yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci. 3. Variasi konsentrasi produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci. 4. Spesifikasi produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri. C. Pembatasan Masalah Berdasarkan identifikasi masalah diatas, maka perlu diberikan pembatasan masalah yaitu: 1. Uji aktivitas antibakteri produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci menggunakan metode in vitro dengan cara difusi agar. 2. Bakteri yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteriadalah Streptococcus mutans. 3. Konsentrasi pemberian produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci dilarutkan dengan DMSO yaitu 0,5 ppm, 5 ppm, 50 ppm, 250 ppm, dan 500 ppm. 4. Spesifikasi produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri yaitu produk nanopartikel yang diteliti sebelumnya oleh Ghabby Maharani Putri (2015). 4 D. Perumusan Masalah Berdasarkan pembatasan masalah diatas, maka dapat ditentukan rumusan masalah sebagai berikut: 1. Bagaimana aktivitas antibakteri produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci terhadap Streptococcus mutans? 2. Berapakah konsentrasi yang menunjukkan aktivitas terbesardalam variasi konsentrasi yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteriproduk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunciterhadap bakteri Streptococcus mutans? E. Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah: 1. Mengetahui aktivitas antibakteriproduk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci terhadap bakteriStreptococcus mutans. 2. Mengetahui konsentrasi yang menunjukkan aktivitas terbesar dalam variasi konsentrasi untuk uji aktivitas antibakteriproduk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci terhadap bakteri Streptococcus mutans. F. Manfaat Penelitian Adapun manfaat yang dapat diharapkan dari penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Bagi peneliti a. Menambah pengetahuan tentang kegunaan produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci. 5 b. Mempelajari metode uji aktivitas produk nanopartikelalginat ekstrak etanol temu kuncisebagai antibakteri secara In vitro. 2. Bagi masyarakat Hasil penelitian ini diharapkan akan memberikan informasi bagi masyarakat mengenai produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci dalam rangka upaya pembuatan obat-obatanpada rongga mulut yang disebabkan oleh bakteri Streptococcus mutans. 3. Bagi akademisi Hasil penelitian ini dapat dijadikan sebagai referensi untuk penelitian selanjutnya terkait uji aktivitas antibakteri secara in vitro dan kegunaan produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci. 6 BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Deskripsi Teori 1. Temu Kunci (Boesenbergia rotunda) Tanaman temu kunci merupakan salah satu tanaman obat berupa rimpang, yang termasuk dalam famili Zingiberaceae. Selain dimanfaatkan untuk obatobatan temu kunci juga digunakan untuk rempah-rempah, dan bumbu pelengkap masakan. Temu kunci adalah tumbuhan pohon rendah atau semak, dan tumbuh didalam tanah. Ukuran pertumbuhannya dalam setahun setinggi 0,3-0,9 cm. Batangnya tumbuh didalam tanah berupa rimpang, berwarna kuning kecoklatan, berbau, dan tebalnya berkisar antara 5-30 cm x 0,52-2 cm. Batang diatas tanah berupa pelepah daun, umumnya sebanyak 2-7 helai, berupa daun merah tanpa pisau daun, teksturnya beralur, tidak berbulu, sepanjang 7-16 cm, lidahnya berbentuk segitiga melebar menyerupai selaput dengan panjang 1-1,15 cm. Tangkai daun hampir sama panjangnya dengan pelepah daun, daunnya tegak, lebar agak elips atau meruncing pada sisinya, permukaannya halus namun berbulu pada bagian bawah, terutama disepanjang tulang daunnya, warna daun hijau muda dengan lebar 5-11 cm. Bunganya mirip dengan butiran yang jumlahnya tak terbatas, panjang batang 41 cm, umumnya tangkai tersembunyi di dalam 2 daun yang paling ujung. 3 potong kelopak longgar dan runcing. Mahkota bunga 7 sebanyak 3 buah, berwana merah muda atau kuning putih, tubular 50-52 mm (Plantus, 2008). Bentuk dari temu kunci seperti yang terlihat pada Gambar 1: Gambar 1. Rimpang temu kunci Nama ilmiah temu kunci adalah Boesenbergia rotunda, dan klasifikasi tumbuhan sebagai berikut : Divisi : Magnoliophyta Kelas : Liliopsida Ordo : Zingiberales Famili : Zingiberaceae Genus : Boesenbergia Sinonim : Gastrochilus panduratum (Roxb) Kaempferia rotunda (Roxb) Boesenbergia pandurata Nama umum : Temu kunci Nama lokal : temu kunci (Indonesia), koncih (Sumatera), tamu kunci (Minangkabau), konce (Madura), Kunci (jawa tengah), dumu kunci (Bima), tamu konci (Makasar), tumu kunci (Ambon), anipa wakang (Hila-Alfuru), aruhu konci (Haruku), sun (Buru) rutu kakuzi (Seram), tamputi (Ternate) 8 Nama asing :fingerroot (Inggris), krachai (Thailand), chinese key (Cina). Temu kunci merupakan tumbuhan yang tumbuh didaerah tropis, tepatnya tumbuh liar didataran rendah hutan jati atau pada hutan lebat pada dataran tinggi. Berbunga pada bulan Januari-Februari dan pada bulan April-Juni. Distribusi dan habitat daerah tanaman ini tumbuh liar di dataran, di hutan jati. Tanaman ini tumbuh dengan baik di iklim yang panas dan lembab di tanah yang relatif subur dengan pertukaran udara dan tata air yang baik. Di tanah dengan kelola air yang buruk (sering banjir, atau berlumpur, pertumbuhannya akan terganggu dan rimpang membusuk lebih cepat) (Plantus, 2008). Penanaman temu kunci bisa dilakukan dengan cara memotong rimpang menjadi beberapa bagian (masingmasing bagian paling sedikit 2 kuncup) dan ditanam pada jarak 3000 cm ( Fina Aryani et al, 2014). Rimpang temu kunci memiliki khasiat memperkuat lambung, berkhasiat untuk mengobati batuk kering dan peringitis, obat sakit perut serta obat keseringan kencing pada anak-anak. Temu kunci juga berkhasiat sebagai obat pembengkakan kandungan serta obat infeksi alat reproduksi pada wanita. (Heyne 1987). Selain itu juga dapat digunakan sebagai obat diare, disentri batu, pelangsing dan obat keputihan (Nugraheni, 2001). Pada pengujian invitro yang telah dilakukan temu kunci dapat meningkatkan jumlah limfosit, antibodi spesifik, dan dapat membunuh sel kanker (Hartono, 1999). Dan beberapa hasil pengkajian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa tanaman daerah tropis memiliki potensi yang cukup besar untuk dikembangkan sebagai obat (Sukara, 2002). 9 Temu kunci berasal dari Cina Selatan dan Asia Tenggara. Awalnya rimpang ini dikenal sebagai obat Cina kuno dan jarang digunakan sebagai bumbu masakan. Setelah menyebar ke Yunna, Indonesia, India, dan Sri Lanka barulah tanaman ini digunakan sebagai penyedap masakan. Penyebaran temu kuncipun begitu cepat ke penjuru Asia. Aktivitas biologi temukunci dapat diperoleh dari komponen-komponen aktif fitokimia yang terdapat dalam temukunci. Komponen-komponen kimia tanaman temu-kunci ditemukan pada bagian rizoma. Menurut Kardono et al. (2003). Rimpang temu kunci mengandung minyak atsiri 1,2% (pada rimpang segar 0,06% - 0,32% minyak atsiri). Komponen utama minyak atsiri terdiri dari monoterpen, seskuiterpen, turunan fenilpropana antara lain : geranial, neral, kamfora, zingiberen, d-pinen, kamfen, 1,8-sineol (eucaliptol), d-borneol, geraniol, osimen, dimetoksi-4(-2-propenil), miristin, linalil propanoat, asam sinamat, kamfen hidrat, propenil guaikol, dihidrokarveol, linalool, etil-sinamat, etil p-metoksi sinamat, panduratin A. Struktur kimia senyawa-senyawa yang terkandung dalam temu kunci dapat dilihat pada Gambar 2. Senyawa-senyawa yang mempunyai prospek cukup baik biasanyaberasal dari golongan flavonoid, kurkumin, limonoid, vitamin C, vitamin E (tokoferol), dan katekin yang bisa digunakansebagai obat antikanker. Senyawa-senyawa tersebut biasa-nya bermanfaat pula sebagai antioksidan (Aldi et al. 1996). 10 Gambar 2. Senyawa dalam ekstrak temu kunci 2. Nanopartikel Alginat Alginat termasuk dalam kelompok polisakarida yang awalnya banyak terbuat dari rumput laut coklat seperti Laminaria hyperborean, Marcrocystis pyrifera, dan Ascophylhum nodosu. Alginat ditemukan sebagai campuran garam asam alginat seperti kalsium, kalium, atau natrium yang terdapat pada dinding sel atau lingkungan interselular. Rumus molekul alginat yaitu C76H76O22(NH2). Pada tahun 1950-an, asam alginat diketahui sebagai polimer dari anhidro-1-4-β-D-manuronat, dan sekitar tahun1960-an, diketahui keberadaan asam L-guluronat. Alginat merupakan polisakarida yang linear dan tidak bercabang yang mengandung rantai dari guluronat dan asam mannuronat (Tonnesen, et al., 2002). Struktur kimia Poliguluronat dan Polimanuronat tersaji dalam Gaambar 3. Berat molekul alginat adalah 32–200 kDa, berhubungan erat dengan derajat polimerisasi 180–930. Nilai pK gugus karboksil adalah 3,4–4,4. Alginat bersifat larut air dalam bentuk garam alkali, magnesium, amonia atau amin (Belitz 11 &Grosch, 2004). Alginat tidak larut air dalam bentuk garam kalsium alginat atau asam alginat (Winarno, 1990 dalam Syahrul, 2005). Gambar 3. Struktur poliguluronat dan polimanuronat pada alginat. Viskositas larutan alginat dipengaruhi oleh berat molekul dan keberadaan ion dalam larutan. Pada kondisi larutan tanpa kation bervalensi dua atau tiga atau dengan adanya bahan pengkelat, viskositas larutan alginat rendah. Sebaliknya, dengan peningkatan kation multivalen (misalnya kalsium) terjadi peningkatan viskositas yang bersifat paralel. Oleh karena itu, viskositas larutan alginat dapat diatur sesuai keinginan. Proses freezing dan thawing larutan Na-alginat yang mengandung ion Ca2+ dapat menghasilkan peningkatan viskositas (Belitz & Grosch, 2004). Nanopartikel didefinisikan sebagai dispersi partikulat atau partikel padat dengan jarak ukuran 1 - 1000 nm. Desain nanopartikel disesuaikan agar sistem penghantaran dapat bekerja optimal, karena ukurannya yang terkontrol, sehingga permukaannya dapat bersifat aktif secara farmakologi dalam pelepasan untuk mencapai aksi spesifik target dari obat dengan kecepatan terapeutik dan dosis yang regimen.Alasan pemilihan alginat sebagai carrier dalam formulasi nanopartikel yaitu karena alginat memiliki karakteristik yang unik dan sering digunakan sebagai carrier berbagai zat atau agen biologis seperti gen, antigen, 12 dan obat yang melindunginya dalam tubuh. Selain itu, alginat memiliki sifat biokompatibel, biodegradable, dan polimer mukoadhesif yang tidak memproduksi toksik dalam tubuh (Squalen, 2010). 3. Streptococcus mutans Plak gigi terus- menerus terbentuk dari mikroorganisme dan bahan organik yang berada pada permukaan gigi. Pembentukan plak dimulai dari kerusakan gigi dan penyakit gigi. Ketelitian dan frekuensi pembersihan gigi tidak sepenuhnya mencegah pembentukan plak. Plak mulai terbentuk dalam 24 jam setelah pembersihan, kecuali jika dilakukan pembersihan secara teratur oleh ahlinya. Namun plak akan kembali terbentuk bahkan ketika baru saja keluar dari ruangan seorang dokter gigi. (Jackquelyn G. Black, 1904). Streptococcus mutans merupakan bakteri yang paling berperan dalam pembentukan plak dan terjadinya karies gigi(Sidarningsih,2000; Nomura dkk., 2004).Bakteri ini diisolasi pertama kali dari plak gigi pada tahun 1924 oleh Clark, memiliki kecenderungan berantai panjang dengan bentuk kokus apabila ditanam pada medium Brain Heart Infusion (BHI) Broth, sedangkan jika ditanam pada media agar akan memperlihatkan rantai pendek dengan sel yang tidak teratur. Streptococcus mutans tumbuh dalam suasana fakultatif anaerob (Michalek dan Mc Ghee, 1982; Gronroos dkk., 1998). Bakteri Streptococcus mutans jika diperbesar akan tampak pada Gambar 4. Streptococcus mutans merupakan bakteri gram positf (+), bersifat non motil (tidak bergerak), berdiameter 1-2 μm, bakteri anaerob fakultatif. Memiliki bentuk bulat atau bulat telur, tersusun seperti rantai 13 dan tidak membentuk spora(Samaranayake, 2002; Regina, 2007; Manton,2010). Bakteri ini tumbuh secara optimal pada suhu sekitar 18ºC – 40ºC (Ari, 2008). Gambar 4. Bakteri Streptococcus mutans Klasifikasi ilmiah bakteri Streptococcus mutans: Kingdom : Monera Divisio : Firmicutes Class : Bacilli Order : Lactobacilalles Family : Streptococcaceae Genus : Streptococcus Species : Streptococcus mutan Ada beberapa hal yang menyebabkan karies gigi bertambah parah seperti gula, air liur, dan juga bakteri pembusuknya. Setelah mengkonsumsi sesuatu yang mengandung gula, terutama gugus sukrosa, glikoprotein yang lengket (kombinasi molekul protein dan karbohidrat) bertahan pada gigi untuk mulai pembentukan plak pada gigi. Pada waktu yang bersamaan berjuta-juta bakteri lain selainStreptococcus mutans juga bertahan pada glikoprotein tersebut. Walaupun 14 banyak bakteri lain yang juga melekat, hanya Streptococcus mutans yang dapat menyebabkan rongga atau lubang pada gigi (Jackquelyn G. Black, 1904). 4. Uji Antibakteri Bahan antibakteri adalah bahan yang mengganggu pertumbuhan dan metabolisme bakteri, sehingga bahan tersebut dapat mengganggu pertumbuhan dan metabolisme bakteri bahkan dapat membunuh bakteri. Cara kerjanyayaitu dengan merusak dinding sel, merubah permeabilitas sel, merubah molekul protein dan asam nukleat, menghambat kerja enzim, serta menghambat sintesis asam nukleat dan protein (Pelczar dan Chan, 1998). Ketentuan kekuatan antibakteri diukur dengan lebar daerah hambatan sebesar 20 mm berarti sangat kuat, daerah hambatan 10-20 mm berarti kuat, 5-10 mm berarti sedang, dan daerah hambatan 5 mm atau kurang berarti lemah (Davis Stout, 2007). Ada dua metode umum yang dapat digunakan, yaitu penetapan dengan lempeng-silinder dan penetapan dengan cara tabung atau turbidimetri. Metode pertama berdasarkan difusi antibakteri dari silinder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar padat dalam cawan petri atau lempeng, sehingga bakteri yang ditambahkan dihambat pertumbuhannya pada daerah berupa lingkaran atau “zona” di sekeliling silinder yang berisi larutan antibiotik. Sedangkan metode turbidimetri berdasarkan atas hambatan pertumbuhan biakan bakteri dalam larutan yang sama dengan antibiotik, dalam media cair yang dapat menumbuhkan mikroba dengan cepat bila tidak terdapat antibiotik. Berdasarkan jenis yang digunakan, metode difusi agar dibagi sebagai berikut (Nester et al, 1973): 15 a. Teknik Perforasi Lubang-lubang pencadang pada plat agar dibuat dengan perforator berdiameter tertentu. Untuk pencadang berdiameter 8 mm, dapat menampung 50 µL zat antimikroba. b. Teknik cakram kertas Pencadang berupa cakram-cakram kertas yang ditetesi zat antimikroba dalam jumlah dan konsentrasi tertentu, lalu diletakkan di atas permukaan plat agar. c. Teknik silinder Pencadang berupa silinder-silinder gelas berdiameter tertentu yang dibenamkan sebagian dalam plat agar. Silinder-silinder tersebut dimasukkan zat antimikroba dengan jumlah dan konsentrasi tertentu. Proses uji antibakteri perlu mempertimbangkan banyak faktor seperti (Irianto, 2006) : a. pH lingkungan b. Komponen-komponen medium c. Stabilitas obat d. Takaran inokulum Semakin besar inokulum bakteri, maka kesensitifan organisme akan semakin rendah. e. Lama inkubasi Semakin lama waktu inkubasi semakin besar kemungkinan timbulnya mutan yang resisten. f. Aktivitas metabolisme mikroorganisme. 16 B. Penelitian yang Relevan Temu kunci (Boesenbergia rotunda) memang sudah banyak diteliti sebelumnya, mengingat sejak jaman nenek moyang temu kunci sangat bermanfaat dan berkhasiat. Penelitian yang relevan terutama yang berfokus pada uji aktivitas antibakteri menggunakan metode secara in vitro salah satunya adalah penelitian atas nama Muhammadd Fiqrie Rahman yang menggunakan ekstraks daun pepaya untuk mengetahui pengaruh dan efektifitas konsentrasi ekstrak daun pepaya (Carica papaya Linn.) terhadap kelangsungan hidup ikan gurami (Osphronemus gouramy Lac.) yang diinfeksi bakteri Aeromonas hydrophila. Penelitian ini dilakukan melalui dua tahap uji, yaitu uji invitro dan uji in vivo. Pada uji in vitro metode yang digunakan adalah antibiogram Kirby-Bauer dan metode sumur dengan lima perlakuan dan dua kali pengulangan. Penelitian lain tentang manfaat nanopartikel dari ekstrak temu kunci (Boesenbergia rotunda) menyatakan bahwa panduratin A menghambat kuat pertumbuhan sel kanker HepG2 yang diinduksi dengan tert-Butylhydroperoxide (t-BHP). tert-Butylhydroperoxide (t-BHP) merupakan senyawa yang biasa digunakan untuk menginduksi kanker dengan mekanisme pembentukan intermediet radikal bebas. Panduratin A memproteksi sel HepG2 melalui perbaikan kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh t-BHP dengan cara menangkap radikal bebas (Sohn et al, 2005). C. Kerangka Berpikir Penelitian mengenai temu kunci yang telah membuktikan berbagai manfaat zat kimia didalamnya, serta macam–macam zat kimia dalam temu kunci yang 17 telah teridentifikasi, menjadikan temu kunci sebagai bahan dasar obat herbal hingga modern yang terus berkembang. Saat ini jenis produk yang paling digemari adalah produk nanopartikel dari berbagai ekstrak yang berasal dari bahan alam. Keunggulan dari produk nanopartikel adalah memiliki kualitas yang lebih baik dalam sistem penghantaran obat, karena memiliki ukuran partikel kecil. Nanopartikel mulai dikembangkan pada abad ke-21 baik dari kalangan peneliti maupun industri sehingga banyak produk-produk berbasiskan nanomaterial dan nanoteknologi dalam berbagai bidang kehidupan. Uji aktivitas antibakteri produk nanopartikel dilakukan untuk mengetahui apakah suatu produk nanopartikel mempunyai sifat menghambat atau bahkan dapat membunuh bakteri. Dari hasil uji aktivitas antibakteri maka produk nanopartikel dapat dikembangkan sebagai bahan obat-obatan. Masalah yang sering ditemukan pada kesehatan manusia salah satunya adalah masalah kesehatan gigi dan mulut. Carries gigi terus menerus terkikis dan menimbulkan lubang pada gigi, penyebab utamanya adalah plak gigi yang tersusun dari sisa-sisa makanan yang mengandung bakteri. Bakteri yang sangat berperan dalam pembentukan plak gigi adalah Streptococcus mutans. Berdasarkan masalah tersebut maka dilakukan penelitian mengenai uji aktivitas antibakteri produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci terhadap bakteri Streptococcus mutans secara in vitro. Metode in vitro dipilih karena menggunakan media buatan yang sesuai dengan lingkungan atau habitat yang diperlukan oleh mikroba untuk tumbuh dan berkembang. 18 Produk nanopartikel ekstrak etanol temu kunci dalam bentuk serbuk dibuat suspensi pada berbagai konsentrasi yang bervariasi. Variasi konsentrasi produk nanopartikel digunakan untuk membandingkan efek produk nanopartikel terhadap uji aktivitas antibakteri Streptococcus mutans. 19 BAB III METODE PENELITIAN A. Subjek dan Objek Penelitian 1. Subjek Penelitian Subjek penelitian ini adalah produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci. 2. Objek Penelitian Objek penelitian ini adalah aktivitas bakteri Streptococcus mutansterhadap produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci. B. Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalahperbandingan konsentrasi produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci. 2. Variabel Terikat Variabel terikat dalam penelitian ini adalah lebar zona bening bakteri Streptococcus mutansyang telah diberi produk nanopartikel. C. Instrumen Penelitian 1. Alat : Alat yang digunakan untuk proses pengukuran kurva pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans dan uji aktivitas antibakteri produk nanopartikel alginat 20 ekstrak etanol temu kuncisecara in vitro terhadap bakteri Streptococcus mutans adalah gelas ukur, timbangan analitik, erlemeyer, beker gelas, batang pengaduk, cawan petri, tabung reaksi, botol media, jarum ose, shaker, pinset, drygalski, mikropipet (ecopipette), autoclave, inkubator (ecocell), lampu bunsen, mortar porselen,colony counter, dan LAF (Laminar Air Flow). 2. Bahan : Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci (Boesenbergia rotunda) yang berupa serbuk. Bahan kimia yang digunakan untuk pengukuran kurva bakteri dan uji aktivitas antibakteri adalah DMSO ( dimethylsulfoxide), alkohol 70 %, akuades, alumunium foil, plastic wrap, Mueller Hinton Agar, Natrium Broth, Natrium Agar, disc blank, dan kultur bakteri Streptococcus mutans yang diperoleh dari Fakultas Kedokteran Gigi UGM. 3. Prosedur Penelitian a. Persiapan Sampel 1) Produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci ditimbang sebanyak 12,5 mg. 2) Pembuatan konsentrasi 500 ppm dengan cara produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci dilarutkanpada 25 mL DMSO. 3) Konsentrasi 500 ppm produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci diencerkan menjadi konsentrasi 250 ppm, ppm, 50 ppm, 5 ppm, 0,5 ppm. b. Peremajaan Bakteri 1) Pembuatan media agar miring menggunakan media NA (Natrium Agar). 21 2) Penanaman bakteri Streptococcus mutans pada media agar miring. c. Pengukuran Kurva Pertumbuhan Bakteri 1) Pembuatan media agar cair NB (Natrium Broth) 2) Penuangan media agar cair NB (Natrium Broth) pada erlemeyer dengan pembagian larutan blanko, larutan uji 1, larutan uji 2, dan larutan uji 3. 3) Shaker larutan uji 1, larutan uji 2, dan larutan uji 3, dengan kecepatan 120 rpm. 4) Pengukuran kurva pertumbuhan bakteri (Streptococcus mutans) menggunakan alat Spektrometer. 5) Pengukuran kurva pertumbuhan bakteri dilakukan 2x24 jam per 3 jam sekali. d. Uji Antibakteri 1) Pembuatan media padat MHA (Mueller Hinton Agar)untuk dituang dalam petri. 2) Pembuatan media agar cair NB (Natrium Broth) untuk larutan starter bakteri Streptococcus mutans. 3) Perendaman disckblank dalam beberapa konsentrasi produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci. 4) Pembuatan kontrol positif dengan kloramfenicol dan kontrol negatif dengan DMSO tanpa produk nanopartikel. 5) Penanaman bakteri pada media cair NB (Natrium Broth) sebagai starter. 6) Penanaman bakteri Streptococcus mutansdan beberapa konsentrasi produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci serta kontrol positif dan negatif pada petri yang telah terisi media agar padat MHA (Mueller Hinton Agar). 7) Pengukuran zona bening, dilakukan selama 2x24 jam per 6 jam sekali. 22 D. Teknik Analisis Data a. Data Kuantitatif Untuk mengetahui kurva pertumbuhan bakteri Streptococcus mutansmenggunakan spektrometer, dan untuk mengetahui lebar zona bening aktivitas antibakteri produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci. b. Data Kualitatif Untuk mengetahui sifat dari produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci terhadap bakteri Streptococcus mutans. 23 E. Diagram Alir Prosedur Penelitian Dari prosedur penelitian di atas dapat dibuat diagram alir seperti dibawah ini. Isolat bakteri Ditumbuhkan Inkubasi Di NB 25 mL 24 jam Diambil 0,1 mL Diukur OD (OD =1) Pengukuran Kurva Spread plate (3x Ulangan) inkubasi Dosis produk nanopartikel : 1. 0,5 ppm 2. 5 ppm Pengukuran 3. 50 ppm Zona bening 4. 250 ppm 5. 500 ppm 24 Gambar 5. Sketsa petridisck berisi bakteri Streptococcus mutans dan disckblank dengan 3 ulangan. Ketentuan jumlah sampel : 1. Bakteri Streptococcus mutans + kontrol positif kloramfenicol. 2. Bakteri Streptococcus mutans + kontrol negatif DMSO. 3. Bakteri Streptococcus mutans + 3 disckblank berisi nanopartikel alginat 0,5 ppm. 4. Bakteri Streptococcus mutans + 3 disckblank berisi nanopartikel alginat 5 ppm. 5. Bakteri Streptococcus mutans + 3 disckblank berisi nanopartikel alginat 50 ppm. 6. Bakteri Streptococcus mutans + 3 disckblank berisi nanopartikel alginat 250 ppm. 7. Bakteri Streptococcus mutans + 3 disckblank berisi nanopartikel alginat 500 ppm. 25 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antibakteri produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci secara in vitro. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA UNY dan Laboratorium Kimia FMIPA UNY. Tahap-tahap penelitian ini meliputi : A. Nanopartikel Alginat Ekstrak Etanol Temu Kunci Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci (Boesenbergia rotunda) yang telah diteliti sebelumnya oleh Ghabby Maharani Putri (2015) dengan judul “Pembuatan nanopartikel ekstrak herbal temu kunci (Boesenbergia rotunda) dengan alginat”. Dari penelitian tersebut dihasilkan suatu produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci (Boesenbergia rotunda) yang selanjutnya digunakan dalam penelitian ini. B. Uji Aktivitas Antibakteri Uji aktivitas antibakteri produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci dilakukan dengan metode in vitro. Pada uji aktivitas antibakteri ini yang digunakan adalah bakteri Streptococcus mutans, bakteri tersebut merupakan bakteri yang terdapat pada rongga mulut. Langkah langkah yang harus dilakukan adalah sebagai berikut : 26 1. Persiapan Sampel Persiapan sampel yaitu dengan cara melarutkan produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci (Boesenbergia rotunda) dengan pelarut yang sesuai. Pelarut yang biasa digunakan dalam uji antibakteri adalah CMC dan DMSO. CMC(Carboxy Methyl Cellulose)tidak memiliki indeks kristalinitas dan CMC mudah larut dalam air (Irkhas Aliyah, 2014). Sedangkan DMSO (dimethyl sulfoxide) sering digunakan dalam bidang kedokteran karena cepat meresap kedalam epitel ekstrak tanpa merusak sel-sel tersebut (Putri Dayu, 2014). CMC tidak dapat melarutkan sempurna produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci (Boesenbergia rotunda), sedangkan DMSO dapat melarutkan produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci (Boesenbergia rotunda) dengan mudah dan hasilnya larut sempurna. Oleh sebab itu pelarut yang dipilih adalah DMSO (dimethyl sulfoxide). Struktur kimia CMC dan DMSO tampak pada Gambar 6: CMC DMSO Gambar 6. Struktur Kimia CMC dan DMSO Konsentrasi ekstrak yang digunakan pada penelitian ini yaitu 0,5 ppm; 5 ppm; 50 ppm; 250 ppm dan 500 ppm.Pembuatan suspensi dari produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kuncipertama-tama menimbang 12,5 mg nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci (Boesenbergia rotunda)kemudian dilarutkan 27 pada 5 mL DMSO, selanjutnya diencerkan dalam labu takar hingga volume 25mLDMSO untuk konsentrasi 500 ppm dan juga digunakan sebagai larutan induk, kemudian dari larutan induk diencerkan hingga didapat konsentrasi 250 ppm, 50 ppm, 10 ppm, 5 ppm, dan 0,5 ppm.Selain itu menyiapkan kontrol positif dan kontrol negatif, yang digunakan sebagai kontrol positif adalah kloramfenicol karena merupakan salah satu antibiotika yang mempunyai spektrum kerja yang luas. Antibiotika ini dapat menghambat pertumbuhan bakteri gram positif maupun bakteri gram negatif dengan cara menghambat sintesa protein bakteri (Wattimena et al, 1991). Untuk kontrol negatif yang digunakan adalah DMSO tanpa produk nanopartikel alginat ektrak etanol temu kunci. Setelah suspensi nanopartikel, kontrol positif dan negatif dibuat, disckblank direndam dalam produk nanopartikel masing–masing 3 lembar per konsentrasi, sehingga dibutuhkan disckblank sebanyak 21 lembar. Perendaman dilakukan selama 5 menit sebelum melakukan penanaman pada petridisck. Produk nanopartikel alginat yang telah dilarutkan dengan DMSO tampak seperti Gambar 7: Gambar 7. Suspensi nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci 28 2. Peremajaan Bakteri Bakteri indukan Streptococcus mutansyang diperoleh dari Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Gadjah Mada dikembangbiakkan atau diremajakan kembali agar persediaan bakteri tercukupi. Langkah pertama yang dilakukan adalah menyiapkanNA (Natrium Agar) sebagai media tumbuh bakteri. Perhitungan media agar padat NA adalah 28 gr per 1000 mL, sehingga jika membutuhkan media agar NA sebanyak 25 mL, harus menimbang 0,7 gr NA (Natrium Agar),media agar NA dan aquadest dicampur dalam gelas beker, taruh magnetic stirrer didalamnya, dan ditutup menggunakan alumunium foil, lalu dipanaskan dengan hot plate. Setelah mendidih diamkan sejenak, kemudian media NA dituang dalam tabung reaksi, kurang lebih 5mL per tabung reaksi, lalu autoclaf media agar padat NA agar steril dan tidak terkontaminasi. Setelah diautoclafmedia dalam tabung reaksi dimiringkan dan didiamkan hingga padat, media yang telah padat ditaruh dalam lemari pendingin kurang lebih 24 jam. Setelah media agar padat NA siap digunakan langkah selanjutnya adalah menanam bakteri Streptococcus mutans pada LAF (Laminar Air Flow) yang telah disterilkan dengan sinar UV selama 15 menit, penanaman bakteri menggunakan kawatose dengan gerakan spiral pada media agar miring, seperti pada gambar 8: Gambar 8. Bakteri Streptococcus mutans pada media NA 29 3. Pengukuran Kurva Pertumbuhan Bakteri Suatu piaraan mikroorganisme, seperti bakteri yang sudah berumur kemudian diambil sedikit bakteri menggunakan kawat ose untuk ditanam pada medium cair yang cocok. Dalam waktu yang sama bila diambil dan disebarkan pada agar-agar lempengandalam cawan petri, maka jumlah koloni yang tumbuh pada cawan petri dapat dihitung (Schlegel dan Schmidt, 1994).Pengukuran kurva pertumbuhan bakteri Streptococcus mutansdilakukan untukmempelajari dinamika pertumbuhan populasi kultur bakteri, membuat kurva pertumbuhan dari suatu kultur bakteri, dan menentukan waktu generasi kultur bakteri (Wilda Kusnia, 2009). Langkah pertama yang harus dilakukan adalah menyiapkan media agar cair NB (Natrium Broth). Perhitungan media agar cair NB adalah 13 gr per 1000 mL, sehingga jika membutuhkan 400 mL, harus menimbang 5,2 g media cair NB. Media cair NB dan aquadest dicampur dalam erlemeyer yang telah berisi magnetic stirer, dan ditutup dengan alumunium foil. Dipanaskan pada hot plate hingga mendidih. Setelah mendidihmedia cair NB dituang pada erlemeyer untuk larutan blanko 30 mL x 3, starteratauinokulum 20 mL, media uji 1, media uji 2, dan media uji 3 sebanyak 60 mL pada masing-masing larutan uji, kemudian autoclaf larutan tersebut agar steril. Media cair NB didiamkan hingga 24 jam. Setelah media NB siap digunakan, dilakukan penanaman bakteri dalam starter atau inokulum, penanaman dilakukan didalamLAF (Laminar Air Flow) agar proses penanaman steril, lalu dishaker hingga 24 jam. Pengukuran kurva pertumbuhan bakteri dimulai dengan menanam bakteri dari starter/inokulumkedalam media uji 1, 2, dan 3, dengan cara mengambil larutan 30 starter atau inokulumkurang lebih 10% dari volume media cair NB dalam erlemeyer. Sehingga ketiga media uji masing-masing mendapat 6 mL starter bakteri Streptococcus mutans. Pengukuran dilakukan per 3 jam sekali selama 2x24 jam menggunakan spektrometer. Hasil pengukuran kurva pertumbuhan bakteri disajikan pada Tabel 1: Tabel 1. Nilai Optical Density pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. Jam Ke0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 Streptococcus mutans Ulangan 1 2 3 Rata -rata 0,153 0,177 0,201 0,177 0,477 0,451 0,577 0,501 0,751 0,786 0,802 0,779 1,194 1,121 1,105 1,139 1,289 1,229 1,156 1,224 1,312 1,261 1,191 1,254 1,289 1,223 1,131 1,214 1,351 1,285 1,229 1,288 1,332 1,312 1,255 1,295 1,381 1,344 1,321 1,348 1,406 1,352 1,336 1,364 1,431 1,322 1,334 1,362 1,461 1,379 1,367 1,402 1,522 1,413 1,412 1,444 1,422 1,416 1,447 1,428 1,397 1,402 1,424 1,407 1,134 1,187 1,205 1,175 Kurva pertumbuhan menggambarkan fase pertumbuhan dari mikroorganisme. Dengan kurva tersebut dapat diketahui kapan bakteri mulai tumbuh dan aktif berkembang biak. Kurva pertumbuhan diukur berdasarkan kekeruhan menggunakan spektrofotometer, nilai OD (Optical density) terbaca pada panjang 31 gelombang 600 nm. Hasil pengukuran kurva pertumbuhan bakteri juga disajikan pada Gambar 9: 1.6 1.4 Absorbansi 1.2 1 0.8 S. Mutans 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20 30 40 50 Jam ke- Gambar 9. Kurva Pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans Dari hasil kurva yang terlihat kenaikan pertumbuhan bakteri mulai terlihat sejak jam ke-0 hingga jam ke-9, kenaikan tersebut termasuk pesat, pada fase ini dinamakan fase eksponensial atau fase pertumbuhan cepat. Fase ini terjadi setelah bakteri menyesuaikan diri dengan lingkungannya, maka sel jasad renik membelah dengan cepat. Kemudian dari jam ke-9 hingga jam ke-15 mengalami kenaikan pertumbuhan bakteri sedikit demi sedikit, fase ini dinamakan fase pertumbuhan lambat. Lalu pada jam ke-18 mengalami sedikit penurunan. Pada fase ini pertumbuhan jasad renik diperlambat karena beberapa faktor seperti, zat nutrisi dalam medium sudah berkurang, adanya zat-zat hasil metabolisme. Kenaikan kembali hingga jam ke-39 pertumbuhan bakteri mulai meningkat dan mencapai titik puncaknya pada jam tersebut. Fase ini termasuk fase pertumbuhan tetap (statis), karena jumlah sel yang 32 tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati, sel-sel pada fase ini menjadi lebih tahan terhadap keadaan ekstrem seperti panas, dingin, radiasi, dan bahan kimia.Penurunan terjadi pada jam ke-42 menuju jam ke-48, artinya terjadi fase kematian sel pada jam tersebut yang disebabkan nutrien di dalam medium sudah habis, dan energi cadangan didalam sel habis. Jumlah sel yang mati semakin lama akan semakin banyak, dan kecepatan kematian dipengaruhi kondisi nutrien, lingkungan dan jenis jasa renik. 4. Uji Antibakteri Uji antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode kertas cakram dengan tujuan untuk mengetahui besarnya diameter zona hambat pertumbuhan bakteri. Zona hambat adalah zona bening yang terdapat disekitar kertas cakram pada media yang sudah diinokulasi bakteri (Putri Dayu, 2014). Pertama menyiapkan media cair NB (Natrium Broth) sebanyak 10 mL untuk starter/inokulum bakteri Streptococcus mutans dan media padat MHA (Mueller Hinton Agar) sebanyak 100 mL untuk media tanam bakteri pada pengamatan zona bening. Sebelum digunakan media cair NB dan media padat MHA harus distrerilkan terlebih dahulu dengan cara dimasukan dalam autoclaf. Penanaman media cair NB dengan bakteri Steptococcus mutans dilakukan didalam LAF (Laminar Air Flow) agar steril, kemudian dishaker hingga 24 jam. Setelah 24 jam berlalu, starter/inokulum bakteri Streptococcus mutans diukur jumlah OD nya menggunakan spektrometer, jika OD bakteri Streptococcus mutans telah memenuhi angka 1 maka bakteri siap digunakan, namun jika OD bakteri Streptococcus mutans melebihi angka satu maka starter bakteri harus diencerkan terlebih dahulu. 33 Penanaman bakteri Streptococcus mutansdilakukan didalam LAF (Laminar Air Flow) agar steril, peralatan yang digunakan juga harus disterilkan dengan sinar UV didalam LAF (Laminar Air Flow)selama 15 menit. Langkah yang harus dilakukan adalah media agar padat MHA pada petri disck dituangi bakteri Streptococcus mutans sebanyak 100µLmenggunakan tip pipet, kemudian diratakan dengan drigalsky, selanjutnya tempelidisckblank yang telah direndam produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci, 1 petri berisi 3 lembar disckblank dengan konsentrasi yang sama, dimulai dengan konsentrasi 0,5 ppm, 5 ppm, 50 ppm, 250 ppm, dan 500 ppm, kontrol positif (kloramfenicol) dan kontrol negatif (DMSO). Petri yang sudah ditanami bakteri Streptococcus mutans dan disckblank kemudian dililit menggunakan plastik wrap agartetap steril dan tidak menimbulkan bau. Selanjutnya dimasukkan dalam inkubator pada suhu 37ocdengan posisi terbalik dan diukur zona beningnya per 6 jam sekali selama 1x24 jam. Proses penanaman bakteri Streptococcus mutans dan disckblank seperti terlihat pada Gambar 10: Gambar 10. Penanaman bakteri Streptococcus mutans dan discblankpada media MHA (Mueller Hinton Agar) 34 Adanya aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan munculnya zona bening pada media MHA (Mueller Hinton Agar). Diameter zona bening pada ukuran 1020 mm memiliki zona hambat kuat, diameter zona bening pada 5-10 mm memiliki daya hambat sedang, dan diameter zona bening >5 mm memiliki daya hambat lemah (Davis and stout, 1971). Hasil pengukuran zona bening produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci disajikan pada Tabel 2: Tabel 2. Aktivitas antibakteriStreptococcus mutans terhadap nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci. Konsentrasi 0,5 ppm 5 ppm 50 ppm 250 ppm 500 ppm Ulangan 1 2 3 Rata-rata 1 2 3 Rata-rata 1 2 3 Rata-rata 1 2 3 Rata-rata 1 2 3 Rata-rata Lebar zona bening (mm) pada Jam ke6 12 18 24 8,35 8,53 8,83 8,35 7,56 7,73 7,9 7,7 7,72 8 8,03 8,03 7,87 8,08 8,25 8,02 8,86 8,43 8,25 8,19 8,63 8,12 9,13 8,01 9,14 7,61 8,48 8,01 8,87 8,04 8,62 8,07 8,41 8,43 8,44 8,18 8,23 8,13 10,53 5,4 9,14 7,61 10,23 8,5 8,59 8,04 9,73 7,36 9,51 9,26 9,03 8,66 10,39 9,66 9,76 0 11,9 8,83 7,93 0 10,59 9,25 8,90 2,88 10,93 11,2 10,9 11 9,46 8,83 8,53 8,53 11,03 10,8 10,6 10,83 10,47 10,27 10,01 10,12 Menurut Elifah dan Dewi (2010), diameter daya hambat tidak selalu naik sebanding dengan naiknya konsentrasi antibakteri, kemungkinan ini terjadi karena perbedaan kecepatan difusi senyawa antibakteri pada media agar serta jenis dan 35 konsentrasi senyawa antibakteri yang berbeda juga memberikan diameter zona hambat yang berbeda. Hal ini dapat disebabkan oleh banyaknya faktor yang berpengaruh terhadap besar zona hambatan yang dihasilkan pada metode difusi antara lain kecepatan difusi, sifat media agar yang digunakan, jumlah organisme yang diinokulasi, kecepatan tumbuh bakteri, konsentrasi bahan kimia, serta kondisi pada saat inkubasi sehingga diperlukan adanya standarisasi keadaan untuk memperoleh hasil yang dapat dipercaya (Anonim, 2011). Menurut Mickel et al., (2003), faktor lain yang berpengaruh seperti toksisitas bahan uji, interaksi antar komponen medium dan kondisi lingkungan mikro in vitro. Kurva yang menunjukan lebar zona bening dari tiap konsentrasi ditunjukkan pada Gambar 11: Lebar zona bening (mm) pada Jam ke- Nanopartikel 12 10 8 0.5 ppm 6 5 ppm 4 50 ppm 250 ppm 2 500 ppm 0 0 6 12 18 24 waktu (jam) Gambar 11. Kurva perubahan lebar zona bening tiap konsentrasi nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci selama 24 jam Berdasarkan kurva terjadi pelebaran zona bening yang cukup signifikan dimulai dari jam ke-0 hingga jam ke-6 pada semua konsentrasi. Pada konsentrasi 0,5 ppm terjadi pelebaran zona bening dari jam ke-6 hingga jam ke-18, kemudian penurunan terjadi pada jam ke-24. Pada konsentrasi 5 dan 50 ppm, pelebaran zona 36 bening tidak stabil naik atau turun, pada jam ke-12 terjadi penurunan lebar zona bening, kemudian terjadi kenaikan pada jam ke-18, dan penurunan kembali terjadi pada jam ke-24.Pada konsentrasi 250 ppm, terjadi penurunan zona bening mulai dari jam ke-6 hingga jam ke-24. Pada konsentrasi 500 ppm lebar zona bening mulai jam ke-6 hingga jam ke-24 tidak selisih terlalu banyak dan naik turunnya cukup stabil. Berdasarkan tabel dan kurva uji aktivitas antibakteri produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci terhadap bakteri Streptococcus mutans dapat disimpulkan bahwa pada variasi konsentrasi dosis, konsentrasi yang berperan aktif atau yang paling optimal dalam menghambat pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans adalah pada konsentrasi 500 ppm. Data penelitian zona bening uji aktivitas antibakteri produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci (Boesenbergia rotunda) yang telah diperoleh selanjutnya akan diuji statistika menggunakan SPSS versi 16. Uji yang dilakukan meliputi Anova. Uji Anova digunakan untuk mengetahui adanya pengaruh jumlahkonsentrasi, waktu inkubasi, serta interaksi antara konsentrasi dan waktu inkubasi terhadap aktivitas antibakteri. Uji statistika yang diperoleh disajikan pada Tabel3: Tabel 3. Hasil uji Anova terhadap diameter zona bening Streptococcus mutans Sumber Informasi Konsentrasi*1) Waktu*2) Konsentrasi*Waktu*3) *1) Jumlah 41,314 36,603 79,639 uji faktor konsentrasi aktivitas antibakteri Df 4 3 12 terhadap 37 Rata-rata 10,328 12,201 6,637 *2) F 5,282 6,240 3,394 Sig. 0,002 0,001 0,002 uji efek waktu inkubasi terhadap aktivitas antibakteri *3) uji interaksi antara waktu dan konsentrasi 38 Berdasarkan hasil uji Anova terhadap bakteri Streptococcus mutansyang disajikan pada Tabel 3terdapat tiga uji, yaitu uji faktor konsentrasi terhadap aktivitas antibakteri, uji efek waktu inkubasiterhadap aktivitas antibakteri dan uji interaksi antara waktu dankonsentrasi. Nilai signifikansi dari uji interaksi antara waktu inkubasi dan konsentrasi adalah 0,001 (p <0,05), interpretasi nilai p < 0,05 adalah terdapat pengaruh interaksi antara waktu inkubasi dan konsentrasi terhadap aktivitas antibakteri. Nilai signifikansi dari uji konsentrasi terhadap aktivitas antibakteri adalah 0,002 (p < 0,05) interpretasi nilai p < 0,05 adalah terdapat pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas antibakteri. Adapun nilai signifikansi dari uji efek konsentrasi terhadap waktu inkubasi pada aktivitas antibakteri adalah 0,002 (p<0,05) interpretasi nilai p <0,05 adalah terdapat pengaruh konsentrasi terhadap waktu inkubasi pada aktivitas antibakteri.Sehingga ketiga uji, yaitu uji interaksi antara waktu dan konsentrasi, uji efek waktu inkubasi, dan uji faktor konsentrasi terhadap aktivitas antibakteri, mendapatkan hasil yang signifikan pada uji Anova. Sebagai kontrol positif digunakan kloramfenicol karena bersifat bakteriotastik. Mekanisme kerja kloramfenicol sebagai antibakteri yaitu melalui penghambatan terhadap pembentukan ikatan peptida dan biosintesis protein pada siklus pemanjangan rantai asam amino, dengan cara mengikat sub unit 50-S sel mikroba target (Ganiswara, 1995). 39 Kurva hasil pengukuran lebar zona bening kloramfenicol disajikan dalam Gambar 12: Lebar Zona Bening (mm) pada Jam ke- Kloramfenicol 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0,5 ppm 5 ppm 50 ppm 250 ppm 500 ppm 0 6 12 18 24 Waktu (jam) Gambar 12. Kurva perubahan lebar zona bening tiap konsentrasi kloramfenicol (kontrol positif) selama 24 jam Berdasarkan kurva diatas terjadi pelebaran zona bening yang cukup signifikan dimulai dari jam ke-0 hingga jam ke-6 pada semua konsentrasi. Pada konsentrasi 0,5 ppm terjadi penurunan lebar zona bening dari jam ke-6 hingga jam ke-18, kemudian kenaikan kembali terjadi pada jam ke-24. Pada konsentrasi 5 ppm, kenaikan dan penurunan zona bening dari pengukuran ke-6 hingga ke-24 tidak terlampau jauh atau cukup stabil. Pada konsentrasi 50 ppm terjadi penurunan zona bening dari pengukuran jam ke-6 hingga jam ke-24. Pada konsentrasi 250 ppm, lebar zona bening tertinggi pada pengukuran jam ke-6, selanjutnya terjadi penurunan hingga jam ke-18, dan kenaikan kembali terjadi pada jam ke-24. Penurunan sedikit demi sedikit dari jam ke-6 hingga jam ke-18 terjadi pada konsentrasi 500 ppm, kemudian kenaikan kembali terjadi pada jam ke-24. 40 Nilai lebar zona bening kloramfenicol dapat dilihat pada Tabel 4: Tabel 4. Aktivitas antibakteriStreptococcus mutans terhadap kloramfenicol. Konsentrasi 0,5 ppm 5 ppm 50 ppm 250 ppm 500 ppm Ulangan 1 2 3 Rata-rata 1 2 3 Rata-rata 1 2 3 Rata-rata 1 2 3 Rata-rata 1 2 3 Rata-rata Lebar Zona Bening (mm) pada Jam ke6 12 18 24 7,99 7,94 7,08 7,83 8,36 8,00 7,76 8,15 8,26 7,98 7,40 8,56 8,20 7,97 7,41 8,18 8,36 8,20 8,13 8,44 8,26 8,26 7,83 8,13 10,03 9,67 9,23 9,37 8,88 8,71 8,40 8,65 11,80 11,22 9,80 8,40 11,10 11,19 10,23 7,22 11,73 10,72 6,76 6,49 11,54 11,04 8,93 7,37 18,66 12,66 11,16 14,30 15,50 8,54 0 15,28 14,83 10,16 0 11,90 16,33 10,46 3,72 13,83 10,33 10,23 9,36 11,37 10,23 8,82 8,30 9,77 10,00 9,33 9,36 9,69 10,18 9,46 9,01 10,28 Berdasarkan tabel diatas zona hambat yang dihasilkan oleh kloramfenicol sebagai antibiotik tidak beda jauh dibandingkan produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci. Kontrol negatif yang digunakan dalam penelitian ini yaitu campuran aquades dan DMSO, hasil uji antibakteri menunjukkan bahwa tidak terdapat zona hambatan. Berdasarkan kurva dan tabel uji aktivitas antibakteri Streptococcus mutansterhadap produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci terlihat 41 bahwa dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak yang berarti semakin besar kadar bahan aktif yang berfungsi sebagi antibakteri, sehingga kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan Streptococcus mutans juga semakin besar. Menurut Pelczar dan Chan (1998), semakin tinggi konsentrasi antibakteri yang digunakan maka akan semakin cepat bakteri yang terbunuh. Penghambatan pertumbuhanbakteri disebabkan oleh interaksi senyawa aktif melalui pelekat atau difusi zat antimikroba dengan bakteri (Parhusip, 2006). Interaksi tersebut menyebabkan gangguan atau kerusakan metabolisme sel bakteri, menghambat sintesis dinding sel bakteri, mengganggu permeabilitas membran sel bakteri, menghambat sintesis protein sel bakteri dan menghambat bahkan merusaksintesis nukleat sel bakteri (Amir, dkk. 1995). Zona hambat produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci seperti terlihat pada Gambar 13: P3 P1 P2 Gambar 13. Lebar zona bening dengan 3 pengulangan, pada konsentrasi 0,5 ppm Gambar diatas menunjukkan lebar zona bening dengan 3 pengulangan pada konsentrasi 0,5 ppm pada jam ke – 24. Dibandingkan dengan zona hambat kontrol positif kloramfenicol hasilnya tidak terlalu jauh yaitu 0,802 mm untuk produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci dan 0,818 mm untuk 42 kloramfenicol. Menurut Pelczar dan Chan (1998) antimikroba yang baik adalah dalam keadaan konsentrasi rendah sudah mampu menghambat mikroorganisme. Dengan demikian produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci (Boesenbergia rotunda) memiliki potensi untuk menghambat pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. 43 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa : 1. Uji aktivitas antibakteri nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci terhadap bakteri Streptococcus mutans membuktikan bahwa zona bening dari produk nanopartikel dapat menghambat pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans sehingga produk nanopartikel bersifat inhibitor. 2. Berdasarkan hasil pengukuran zona bening bakteri Streptococcus mutans, konsentrasi produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci dalam variasi konsentrasi yang menunjukkan aktivitas terbesar adalah konsentrasi 500 ppm. B. Saran Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, penulis memberikan saran sebagai berikut: 1. Perlu variasi jumlah konsentrasi produk nanopartikel alginat ekstrak etanol temu kunci. 2. Perlu penelitian lebih lanjut menggunakan metode in vivo untuk mengetahui efek langsung pada makhluk hidup seperti mencit. 3. Perlu dilakukan penelitian apakah produk nanopartikel juga berpengaruh pada antibakteri lainnya. 44 4. Perlu perlakuan khusus untuk memasukkan produk nanopartikel kedalam disckblank, agar produk nanopartikel bekerja optimal 5. Perlu dilakukan pengukuran dengan rentan waktu yang lebih sering untuk mengetahui aktivitas bakteri yang optimal. 45 DAFTAR PUSTAKA Ahmad Shobrun Jamil, et al. 2014. Aktivitas Antimikroba Ekstrak Biji Nigella sativa Terhadap Viabilitas BakteriProbiotik Secara In Vitro Dan In Vivo. Fakultas Ilmu Kesehatan : Universitas Muhammadiyah Malang. Aldi, Y., N.C. Sugiarto, S. Andreanus A., dan A.S. Ranti. 1996. Uji efekantihis tonninergik dari tanaman Andrographis paniculataNess. Warta Tanaman Obat Indonesia 3(1): 17-19. Amidi, M., Romeijn, S. G., Borchard, G., Junginger, H. E., Hennink, W. E., & Jiskoot, W. 2006. Preparation and characterization of protein-loaded Ntrimethyl chitosan nanoparticles as nasal delivery system. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 111(1-2), 107–16. Amir, S., A. Setiawati,. A. Muchtar., A. Arif., B. Bahry., D. Tirza., H. R. Dewotodan L. Darmansjah. 1995. Farmakologi dan Terapi. Jakarta: Gaya Baru. Anondini Febrian Ganestia. 2012. Preparasi dan Karakterisasi Mikrosfer Menggunakan Eksipien Komplek Polielektrolit Alginat-Gelatin.FMIPA : Univeritas Indonesia. Belitz, H.D. and Grosch, W. 2004. Food Chemistry. Second Edition. Springer. p. 284–286. Davis W.W. and T.R Stout. 1971. Disc Plate Methode of Microbiological Antibiotic Assay. Microbiol. 22: 659-665. Devi Yusnita. 2014. Minyak Atsiri Rimpang, Batang, dan Daun Temu Hitam (Curcuma aeruginosa Roxb.) Sebagai antibakteri Streptococcus mutans dan Pendegradasi Biofilm pada Gigi. FMIPA : Institut Pertanian Bogor. Dewi, F. K. 2010. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Buah Mengkudu (Morinda citrifolia L.) terhadap Bakteri Pembusuk Daging Segar [Skripsi S1], Jurusan Biologi FMIPA. Universitas Sebelas Maret. Surakarta. Fachrina Rahmawati, Maulita Cut Nurina, dan Sumantri. 2010. Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi Kloroform Ekstrak Etanol Pegagan (Centella asiatica (L) urb) Serta Identifikasi Senyawa Aktifnya. Semarang : Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang. 46 Ganiswarna, V.H.S. 1995. Farmakologi dan Terapi, Edisi ke-4, Jakarta: BagianFarmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Hartono, A. 1999. Terapi nutrisi dan herbal untuk kanker. Intisari 435 (36): 44-5 Heyne, K.1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Vol I. Badan Pengembangan Kehutanan, Departemen Kehutanan, Yayasan Sarana Wanajaya, Jakarta. hlm. 593-594. Hieronymus Budi Santoso . 1998 . Tanaman Obat Keluarga TOGA 1. Yogyakarta : Kanisius Hurkat, P., Jain, A., Jain, A., Shilpi, S., Gulbake, A., & Jain, S. K. (2012). Concanavalin A conjugated biodegradable nanoparticles for oral insulin delivery. Journal of Nanoparticle Research, 14(11), 1219. Irianto, K. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. Jakarta: IramaWidya. Irkhas Aliyah. 2014. Aaktivitas Enzim Selulase Termostabil Dari Isolat Bakteri Termofilik Selulolitik Pasca Erupsi Merapi Pada Variasi Substrat dan Variasi Konssentrasi Substrat. FMIPA : Universitas Negeri Yogyakarta. Kardono L, Artanti N, Dewiyanti I, Basuki T. 2003. Selected Indonesian Medicinal Plants: Monographs and Descriptions. Jakarta: PT Gramedia. Lembi, C., Waaland. 1988. Algae and Human Affairs. New York : Chambridge Univ. Press. Lusiana Juwita. 2015. Formulasi dan Evaluasi secara In Vitro Kompleks Nanopartikel Alginat-Kitosan yang Mengandung Amoksilin dan Bovine Serum Albumin Skripsi. Medan : Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara Medan. Maharum Alfriarti. 2015. Pengaruh Berkumur Larutan Ekstrak Jeruk Nipis 40% Terhadap Pertumbuhan Bakteri Streptococcus mutans PADA SALIVA Anak Yang Mengalami Karies Dini (Early Childhood Caries). Fakultas Kedokteran Gigi : Universitas Hasanuddin. Michalek, S.M., J.R. Mc Ghee. 1982. Dental Microbiology, Fourth Edition. Harper & Raw Publisher. Philadelphia. Mickel, A. K., P. Sharma., S, Chogle. 2003. Effectiveness of StannousFluoride and Calcium Hydroxide against Enterococcusfaecalis. J. Endod 29 (4):259– 60. 47 Muhammad Fiqrie Rahman. 2008. Potensi Antibakteri Daun Pepaya Pada Ikan Gurame yang Diinfeksi Bakteri Aeromonas hydrophila. Bogor : Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Muhammad Fiqrie Rahman. 2008. Potensi Antibakteri Ekstrak Daun Pepaya Pada Ikan Gurami Yang Diinfeksi BakteriAeromonas hydrophila. Fakultas Kedokteran Hewan : Institut Pertanian Bogor. Nester, E. W., C. E. Roberts and B. J. Mc Carthy. 1973. Microbiology Molecules,Microbes, and Man. United State America: Pear sall halt, Rinehart andWinston, Inc. Ni Kadek Ariyanti, Ida Bagus Gede Darmayasa, Sang Ketut Sudirga. 2012. Daya Hambat Ekstrak Kulit Lidah Buaya (Aloe barbader Miller) terhadap Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25963 dan Escherichia coli ATCC 25922. Udayana : Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. Ning Harmanto. 2007. Herbal untuk Keluarga :Jus Herbal Segar dan Menyehatkan. Yogyakarta : Elex Media Komputindo. Nugraheni, W.P. 2001. Kunci Pepet. Sidowayah 34(9): 15-18. Nurina Rahmawati, Edhy Sudjarwo, dan Eko Widodo. 2012 . Uji Aktivitas antibakteri Ekstrak Herbal terhadap Bakteri Escherechia coli. Malang : Fakultas Peternakan Universitas Brawijaya. Pelczar MJ dan Chan ECS. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid 1 dan 2. Penterjemah Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS dan Angka SL. UI Press : Jakarta. Plantus. 2008. Fingerroot (Boesenbergia pandurata Roxb. Schult).Diakses darihttp://anekaplanta.wordpress.com/2008/01/04/temu-kunciboesenbergiapandurata-roxb-schlechter/ pada tanggal 3 Juni 2017. Putri, Dayu Nirwana. 2014. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol Daun Kenikir (Cosmos caudatus Kunth.) terhadap Bakteri Salmonella typhi. Raj Kumar Arya. 2012.Drying Induced Phase Separation. Department of Chemical Engineering : Jaypee University of Engineering and Technology India. Sabir, A. 2005. ”Aktivitas Antibakteri Flavonoid Propolis Trigona sp terhadap bakteri Streptococcus mutans (in vitro)”. Majalah Kedokteran Gigi. 38, (3), 135-141. 48 Sæther, H. V., Holme, H. K., Maurstad, G., Smidsrød, O., & Stokke, B. T. 2008. Polyelectrolyte complex formation using alginate and chitosan. Carbohydrate Polymers, 74, 813–821. Sarmento, B., Ferreira, D., Veiga, F., & Ribeiro, a. 2006. Characterization of insulin-loaded alginate nanoparticles produced by ionotropic pre-gelation through DSC and FTIR studies. Carbohydrate Polymers, 66(1), 1–7. Sarmento, B., Ribeiro, a, Veiga, F., Sampaio, P., Neufeld, R., & Ferreira, D. 2007. Alginate/chitosan nanoparticles are effective for oral insuli delivery. Pharmaceutical research, 24(12), 2198–206. Singh, R., & Lillard, J. W. (2009). Nanoparticle-based targeted drug delivery. Experimental and Molecular Pathology, 86(3), 215–223. Subaryono. 2009. Karakteristik Pembentukan GelAlginat dari Rumput Laut Sargassum sp. dan Turbinaria sp. Tesis. Sekolah Pascasarjana IPB.Bogor p. 65–66. Subur P, et al. 2010. Uji Toksisitas Dan Aktivitas Antibakteri Berbagai Fraksi Ekstrak Daun Tanaman Kamboja (Plumeria acuminate Ait.) FMIPA : Universitas Mulawarman. Sukara, E. 2002. Sumber daya alam hayati dan pencarian bahan baku obat (Bioprospekting). Prosiding Simposium Nasional II Tumbuhan Obat dan Aromatik. Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi LIPI, Bogor. hlm. 31-37. Syahrul. 2005. Penggunaan Fikokoloid Hasil EkstraksiRumput Laut sebagai Substitusi Gelatin pada EsKrim. Tesis. Sekolah Pascasarjana IPB. Bogor 4– 31. Tonessen, H. H. Dan Kaarlsen J. 2002. Alginate in Drug Delivery Systems. New York : Marcel Dekker, Inc. 621-630 Yanti Hamdiyati, et al. 2003. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Patikan Kebo (Euphorbia hirta) Terhadap Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus epidermidis. FMIPA : Universitas Pendidikan Indonesia. Yoyok B. Pramono, et al. 2003. Uji Toksisitas Dan Aktivitas Antibakteri Berbagai Fraksi Ekstrak Daun Tanaman Kamboja (Plumeria acuminate Ait.). FTP : Universitas Gadjah Mada. 49 LAMPIRAN Lampiran 1. Kurva Pertumbuhan Bakteri Streptococcus mutans Nilai OD (Optical Density) S. Mutans Ulangan Jam Ke1 2 3 Rerata 0 0,153 0,177 0,201 0,177 3 0,477 0,45 0,577 0,501 6 0,75 0,786 0,802 0,779 9 1,194 1,12 1,105 1,139 12 1,289 1,229 1,156 1,224 15 1,312 1,261 1,19 1,254 18 1,289 1,223 1,13 1,214 21 1,35 1,285 1,229 1,288 24 1,332 1,3 1,255 1,295 27 1,68 1,587 1,561 1,609 30 1,406 1,352 1,336 1,364 33 1,431 1,322 1,334 1,362 36 1,46 1,379 1,367 1,402 39 1,522 1,4 1,412 1,444 42 1,422 1,416 1,447 1,428 45 1,397 1,402 1,424 1,407 48 1,134 1,187 1,205 1,175 50 Lampiran 2. Diameter zona bening (mm) produk nanopartikel ekstrak temu kunci terhadap bakteri Streptococcus mutans. Ulangan No Konsentrasi U 1 2 1 0,5 ppm 3 1 2 5 ppm 2 Jam D 6 12 18 24 1 8,00 8,00 8,30 7,60 2 9,03 9,50 9,40 9,16 3 8,02 8,10 8,80 8,30 8,35 8,53 8,83 8,35 1 7,30 7,70 7,50 7,50 2 8,00 8,00 8,50 8,20 3 7,40 7,50 7,70 7,40 7,56 7,73 7,90 7,70 1 7,46 7,60 7,30 7,50 2 8,30 8,60 8,80 8,60 3 7,40 7,80 8,00 8,00 7,72 8,00 8,03 8,03 1 9,30 8,30 8,06 8,10 2 8,80 8,60 8,10 8,38 3 8,48 8,40 8,60 8,10 8,86 8,43 8,25 8,19 1 8,50 7,50 9,00 7,60 2 9,00 9,02 9,60 8,30 3 8,40 7,80 8,80 8,14 8,63 8,10 9,13 8,01 R R R R R 51 3 1 2 3 50 ppm 3 1 4 250 ppm 2 1 9,72 6,80 8,00 7,60 2 9,80 8,44 9,30 8,30 3 7,90 7,60 8,14 8,14 9,14 7,61 8,48 8,01 1 8,00 8,30 8,30 7,46 2 9,02 8,60 8,54 8,60 3 8,20 8,40 8,50 8,50 8,40 8,43 8,44 8,18 1 7,90 7,50 10,0 7,40 2 8,40 9,02 11,0 8,80 3 8,40 7,80 10,6 0 8,23 8,10 10,53 5,40 1 9,72 6,80 10,4 8,20 2 9,80 8,44 10,5 9,20 3 7,90 7,60 9,80 8,20 9,14 7,61 10,2 8,53 1 9,50- 9,00 9,20 8,60 2 10,2 9,70 9,00 9,00 3 8,80 9,10 8,90 8,40 9,50 9,26 9,03 8,66 1 10,6 9,80 10,2 0 2 10,1 9,20 10,0 0 3 10,48 10,0 9,10 0 R R R R R 52 R 3 1 2 5 500 ppm 3 10,33 9,67 9,77 0 1 18,02 8,60 7,30 0 2 8,70 9,20 8,50 0 3 9,00 8,70 8,00 0 11,90 8,83 7,93 0 1 11,5 10,6 10,6 10,5 2 11,4 11,8 11,4 11,0 3 9,90 11,3 10,8 11,5 10,9 11,2 10,9 11,0 1 9,40 8,40 8,10 8,00 2 9,00 9,10 9,20 9,20 3 10,0 9,00 8,30 8,40 9,46 8,83 8,53 8,53 1 10,0 10,0 9,70 10,5 2 12,1 11,6 11,2 11,01 3 11,0 10,8 10,9 11,0 11,0 10,8 10,6 10,8 R R R R 53 Lampiran 3. Diameter Zona bening (mm) kloramfenicol terhadap bakteri Streptococcus mutans. No Konsentrasi U Ulangan D 6 8,18 Jam 12 7,76 18 7,66 24 7,20 8,20 8,68 6,60 9,00 7,60 7,40 7,00 7,30 7,99 7,94 7,08 7,83 9,00 7,78 7,60 7,72 8,40 8,52 8,00 8,64 7,70 7,70 7,70 8,10 8,36 8,00 7,76 8,15 8,80 7,70 7,10 8,24 8,00 8,36 7,80 9,16 8,00 7,90 7,30 8,30 8,26 7,98 7,40 8,56 8,30 8,00 8,00 8,10 8,30 8,40 8,40 8,74 8,50 8,20 8,00 8,50 8,36 8,20 8,13 8,44 8,40 8,18 7,50 8,10 8,40 8,62 8,20 8,20 8,00 8,00 7,80 8,10 8,26 8,26 7,83 8,13 1 2 3 1 R 1 2 3 2 R 1 2 3 1 0,5 ppm 3 R 1 2 3 1 R 1 2 3 2 5 ppm 2 R 54 10,3 9,48 9,20 9,00 10,0 9,62 9,30 9,50 9,80 9,92 9,20 9,62 10,0 9,67 9,23 9,37 11,4 11,38 9,40 8,00 12,4 11,28 10,0 8,70 11,6 11,0 10,0 8,50 11,8 11,22 9,80 8,40 11,7 11,0 10,4 7,66 10,8 10,8 10,2 7,00 10,8 11,7 10,1 7,00 11,1 11,1 10,2 7,22 12,7 11,2 7,10 6,20 10,5 10,4 7,00 7,00 12,0 10,5 6,20 6,28 11,7 10,7 6,76 6,49 17,5 13,5 11,0 13,0 22,0 12,3 11,0 10,2 16,5 12,16 11,5 19,7 18,6 12,6 11,1 14,3 16,0 8,44 0 18,6 14,5 9,00 0 13,0 16,0 8,20 0 14,2 1 2 3 3 R 1 2 3 1 R 1 2 3 2 R 1 2 3 3 50 ppm 3 R 1 2 3 1 R 1 2 4 250 ppm 2 3 55 15,5 8,54 #DIV/0! 15,2 16,5 11,0 0 12,0 14,3 9,72 0 12,6 13,7 9,78 0 11,1 14,8 10,1 11,3 10,0 9,30 9,22 9,70 10,9 9,50 15,6 10,0 9,79 9,30 9,30 10,3 10,2 9,36 11,3 10,5 8,10 8,00 10,0 10,0 10,0 9,50 10,20 10,2 8,36 7,40 9,12 10,2 8,82 8,30 9,77 10,3 9,20 9,50 10,1 9,70 9,70 9,40 9,34 10,0 9,10 9,20 9,64 10,0 9,33 9,36 9,69 R 1 2 3 3 #DIV/0! 11,9 R 1 2 3 1 R 1 2 3 2 R 1 2 3 5 500 ppm 3 R 56 Lampiran 4. Uji statistik ANOVA UNIANOVA Diameter BY Konsentrasi Waktu /METHOD=SSTYPE(3) /INTERCEPT=INCLUDE /POSTHOC=Konsentrasi Waktu(DUNCAN) /CRITERIA=ALPHA(0.05) /DESIGN=Konsentrasi Waktu Konsentrasi*Waktu. Univariate Analysis of Variance Notes Output Created 20-Jun-2017 22:50:32 Comments Input Active Dataset DataSet0 Filter <none> Weight <none> Split File <none> N of Rows in Working Data File Missing Value Handling Definition of Missing 60 User-defined missing values are treated as missing. Cases Used Statistics are based on all cases with valid data for all variables in the model. Syntax UNIANOVA Diameter BY Konsentrasi Waktu /METHOD=SSTYPE(3) /INTERCEPT=INCLUDE /POSTHOC=Konsentrasi Waktu(DUNCAN) /CRITERIA=ALPHA(0.05) /DESIGN=Konsentrasi Waktu Konsentrasi*Waktu. Resources Processor Time 00:00:00.140 Elapsed Time 00:00:00.141 [DataSet0] 57 Between-Subjects Factors N Konsentrasi Waktu 0.5 12 5 12 50 12 250 12 500 12 6 15 12 15 18 15 24 15 Konsentrasi Homogeneous Subsets Diameter Duncan Subset Konsentr asi N 1 2 250 12 7.90333 0.5 12 8.06083 5 12 8.40500 50 12 8.43083 500 12 Sig. 1.02125E1 .408 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = 1,955. 58 Uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa konsentrasi 250 ppm, 0,5 ppm, 5 ppm, dan 50 ppm, menghasilkan rata-rata respon yang sama. Sedangkan konsentrasi 500 ppm menghasilkan rata-rata respon yang berbeda dari ke empat konsentrasi lainnya. Keterangan : perlakuan yang terletak dalam satu grub berarti tidak memberikan pengaruh respon yang berbeda. 59 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:Diameter Type III Sum of Source Squares df Mean Square F Sig. Corrected Model 157.555 a 19 8.292 4.241 .000 Intercept 4440.180 1 4440.180 2.271E3 .000 Konsentrasi 41.314 4 10.328 5.282 .002 Waktu 36.603 3 12.201 6.240 .001 Konsentrasi * Waktu 79.639 12 6.637 3.394 .002 Error 78.213 40 1.955 Total 4675.949 60 235.769 59 Corrected Total a. R Squared = ,668 (Adjusted R Squared = ,511) Ada 3 perbedaan mean yang diujikan : 1. Uji interaksi Apakah mean yang ada merupakan pengaruh interaksi antara waktu inkubasi dan konsentrasi terhadap aktivitas antibakteri ? Pengambilan keputusan, antara lain: a. Hipotesis H0 : tidak ada interaksi antara waktu inkubasi dan konsentrasi H1 : ada interaksi antara waktu inkubasi dan konsentrasi b. Pengambilan keputusan Jika probabilitas> 0,05 ; maka H0 diterima Jika probabilitas< 0,05 ; maka H0 ditolak c. Keputusan 60 Terlihat dari F signifikansi adalah sebesar 0,002 yang berarti < 0,05 maka H0 ditolak. Jadi ada pengaruh interaksi antara waktu inkubasi dan perbedaan konsentrasi terhadap aktivitas antibakteri. 2. Uji Efek Faktor Waktu Inkubasi Apakah mean yang ada merupakan pengaruh dari waktu inkubasi terhadap aktivitas antibakteri ? Pengambilan keputusan, antara lain: a. Hipotesis H0 : tidak ada pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas antibakteri H1 : ada pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas antibakteri b. Pengambilan keputusan Jika probabilitas> 0,05 ; maka H0 diterima Jika probabilitas< 0,05 ; maka H0 ditolak c. Keputusan Terlihat dari F signifikansi adalah sebesar 0,001 yang berarti < 0,05, maka H0 ditolak. Jadi ada pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas antibakteri. 3. Uji Efek Faktor Perbedaan Konsentrasi Apakah mean yang ada merupakan pengaruh perbedaan konsentrasi terhadap aktivitas antibakteri ? Pengambilan keputusan, antara lain: a. Hipotesis H0 : tidak ada pengaruh jenis sampel terhadap aktivitas antibakteri H1 : ada pengaruh jenis sampel terhadap aktivitas antibakteri 61 b. Pengambilan keputusan Jika probabilitas> 0,05 ; maka H0 diterima Jika probabilitas< 0,05 ; maka H0 ditolak c. Keputusan Terlihat dari F signifikansi adalah sebesar 0,002 yang berarti < 0,05 maka H0 ditolak. Jadi ada pengaruh perbedaan konsentrasi terhadap aktivitas antibakteri. 62 Lampiran 5. Dokumentasi Penelitian Zona bening pada konsentrasi 0,5 Zona bening pada konsentrasi 5 ppm ppm Zona bening pada konsentrasi 50 Zona bening pada konsentrasi 250 ppm ppm 63 Zona bening pada konsentrasi 500 Nanopartikel alginat ekstrak etanol Temu ppm kunci (Boesenbergia rotunda) Kloramfenicol Kultur bakteri Streptococcus mutans 64 Pengenceran Nanopartikel Disc Blank Autoclaf LAF (Laminar Air Flow) 65 Mueller Hinton Agar Spektrometer Penanaman Bakteri Streptococcus Penempelan disc blank mutans 66
