BAB III METODOLOGI PENELITIAN Penelitian ini merupakan

BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif dan pengukuran dilakukan
dengan menggunakan alat KCKT. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium
Biofarmasi dan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi USU.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah timbangan, beaker
gelas, neraca analitis (Baecho), pipet tetes, tabung sentrifugasi, rak tabung, gelas
ukur, alat vortex (Health HVM-400), alat sentrifugasi (Health HC 1120T), termos
es, spuit 1 ml, spuit 3 ml, politube, mikropipet, batang pengaduk, vial 2 ml, satu
unit alat KCKT Agilent 1120 Compact LC, kolom ODS C18, wadah solven,
injektor, syringe 50 µl, pompa vakum (Gast DOA-PG04-BN), sonifikator
(Branson 1510), kertas membran filter whatman Cellulose Nitrate 0,45 µm,
penyaring PTFE 0,2 µm. (Gambar alat dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2
halaman 21).
3.2 Bahan
Bahan bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu: metanol p.a. (E.
Merck), NaOH p.a. (E. Merck), plasma darah pasien TB, plasma kontrol (gambar
dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 25), kalium dihidrogen fosfat p.a (E.
Merck), Baku Pirazinamida ARS (ASEAN Reference Substance) (sertifikat
analisis dapat dilihat pada Lampiran 14 halaman 41) , Nikotinamid (Western
Universitas Sumatera Utara
Drugs PVT. LTD.) (sertifikat analisis dapat dilihat pada Lampiran 15 halaman
42), aquabidest (PT. Ikapharmindo Putramas), Heparin sodium inject (PT. B.
Braun Medical Indonesia).
3.3 Pengambilan Sampel
Sampel yang diperiksa dalam penelitian ini adalah plasma darah pasien
penderita Tuberkulosis (TB) yang sedang menjalani perawatan di klinik Dr.
Zainuddin Amir, DSP (Ahli Penyakit Saluran Pernapasan) di Jl. Jemadi, Medan.
Pasien yang diambil darahnya adalah pasien yang telah mengkonsumsi obat TB
kurang dari 2 bulan atau sedang menjalani fase intensif. (Data pasien dapat dilihat
pada Lampiran 13 halaman 40). Waktu pengambilan darah adalah 2 jam setelah
meminum obat.
3.4 Rancangan Penelitian
3.4.1 Penyiapan Bahan
3.4.1.1 Pembuatan Plasma Darah Pasien TB
Darah pasien diambil sebanyak 5 ml, kemudian dimasukkan ke dalam
venoject yang telah terbasahi heparin. Venoject yang berisi darah disentrifugasi
dengan kecepatan 4000 putaran permenit selama 5 menit. Diperoleh dua lapisan
yaitu lapisan atas yang merupakan plasma dan lapisan bawah berupa endapan.
Diambil lapisan atas (plasma).
Universitas Sumatera Utara
3.4.1.2 Pembuatan Plasma Kontrol
Darah diambil dari donatur (dewasa dan sehat) sebanyak 5 ml, kemudian
dimasukkan ke dalam venoject yang telah terbasahi heparin. Venoject yang berisi
darah disentrifugasi dengan kecepatan 4000 putaran permenit selama 5 menit.
Diperoleh dua lapisan yaitu lapisan atas yang merupakan plasma dan lapisan
bawah berupa endapan. Diambil lapisan atas (plasma).
3.4.1.3 Pembuatan Pereaksi
3.4.1.3.1 Aqua Bebas CO2
Dibuat dengan mendidihkan air untuk injeksi segar selama tidak kurang
dari 10 menit sambil mencegah hubungan dengan udara sesempurna mungkin,
didinginkan, dan segera digunakan (Ditjen POM, 1972).
3.4.1.3.2 Natrium Hidroksida (NaOH) 0,2 N
Dilarutkan 8,0 g NaOH dengan air bebas CO2 sampai 1000,0 ml (Ditjen
POM, 1979).
3.4.1.3.3 Kalium Dihidrogen Fosfat 0,2 M
Dilarutkan 27,218 g kalium dihidrogen fosfat dalam air bebas CO2
secukupnya hingga 1000,0 ml (Ditjen POM, 1979).
3.4.1.3.4 Buffer Fosfat pH 7,4
Dibuat dengan mencampur 50,0 ml kalium dihidrogenfosfat 0,2 M dengan
39,1 ml natrium hidroksida 0,2 N, dan diencerkan dengan air bebas
karbondioksida P hingga 200,0 ml (Ditjen POM, 1979).
Universitas Sumatera Utara
3.4.1.4 Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak terdiri dari buffer fosfat pH 7,4 dan metanol dengan
perbandingan
96,6:3,2.
Fase
gerak
dibuat
sebanyak
500
ml
dengan
mencampurkan buffer fosfat pH 7,4 sebanyak 484 ml dan metanol sebanyak 16
ml. Sebelum digunakan fase gerak disaring melalui penyaring membran filter
whatman Cellulose Nitrate 0,45 µm. Kemudian diawaudarakan selama ± 20 menit
menggunakan sonifikator.
3.4.1.5 Pembuatan Larutan Induk Baku
3.4.1.5.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Pirazinamida
Ditimbang seksama sejumlah 10 mg Pirazinamida baku lalu dimasukkan
ke dalam vial yang telah dikalibrasi ad 1 ml, dilarutkan dengan fase gerak (buffer
fosfat pH 7,4:metanol dengan perbandingan 96,8:3,2) sehingga diperoleh
konsentrasi 81,2281 mM (10.000 mcg/ml).
3.4.1.5.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Nikotinamid
3.4.1.5.2.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Pertama
Ditimbang seksama sejumlah 10 mg Nikotinamid lalu dimasukkan ke
dalam labu 10 ml, dilarutkan dengan fase gerak (buffer fosfat pH 7,4:metanol
dengan perbandingan 96,8:3,2) hingga diperoleh larutan dengan konsentrasi
8,1900 mM (1.000 mcg/ml).
3.4.1.5.2.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Kedua
Dipipet larutan induk pertama sebanyak 1,5 ml ke dalam labu 10 ml, diencerkan
dengan fase gerak (buffer fosfat pH 7,4:metanol dengan perbandingan 96,8:3,2)
hingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1,2285 mM (150 mcg/ml).
Universitas Sumatera Utara
3.4.2 Prosedur Analisis
3.4.2.1 Penyiapan Alat KCKT
Alat dihubungkan dengan sumber listrik, kemudian alat dihidupkan
dengan menekan tombol power. Diatur panjang gelombang menjadi 254 nm.
Dipurging untuk menghilangkan gelembung pada selang, kemudian dialirkan fase
gerak hingga laju alir 0,8 ml/menit. Biarkan hingga kondisi alat stabil.
3.4.2.2 Penentuan Garis Alas (Base Line)
Setelah dialirkan fase gerak selama 30 menit, dilihat absorbansi apakah
telah stabil, jika telah stabil absorbansi di nol kan dengan cara click to balance.
3.4.2.3 Penyuntikan Fase Gerak
Untuk mengetahui kebersihan injektor, maka dilakukan penyuntikan fase
gerak dengan cara: tekan single run, tulis nama sampel dan tekan OK. Injektor
diputar ke posisi load dan disuntikkan fase gerak ke dalam injektor dengan
menggunakan penyuntik mikroliter, injektor diputar ke posisi inject. (Hasil
penyuntikan fase gerak dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 26).
3.4.2.4 Penyuntikan Plasma Kontrol
Dipipet 300 µl plasma, dimasukkan ke dalam politube dan ditambahkan
600 µl metanol untuk mengendapkan protein lalu divortex. Disentrifugasi dengan
kecepatan 4000 putaran permenit selama 5 menit. Dipisahkan supernatan dari
endapan dan dikumpulkan. Disaring dengan penyaring PTFE diameter 0,2 µm,
lalu diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan volume penyuntikan 20 µl
Universitas Sumatera Utara
dengan laju aliran (flow rate) 0.8 ml/menit, deteksi pada panjang gelombang 254
nm. Dilihat kromatogram yang terbentuk. (Kromatogram dapat dilihat pada
Lampiran 7 halaman 29).
3.4.2.5 Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif pirazinamida dan nikotinamid dapat dilakukan dengan
membandingkan waktu retensi yang sama dari kromatogram pada penyuntikan
sampel dengan kromatogram pada penyuntikan larutan baku pembanding
pirazinamida dan nikotinamid. (Kromatogram larutan baku pembanding dapat
dilihat pada Lampiran 5 halaman 27 dan Lampiran 6 halaman 28).
3.4.2.6 Analisis Kuantitatif
3.4.2.6.1 Penentuan Linieritas
Pirazinamida
Kurva
Kalibrasi
Baku
Pembanding
Dipipet larutan induk baku Pirazinamida sebanyak 30 µl; 40 µl; 50 µl; 60
µl; 80 µl, masing-masing dimasukkan ke dalam vial yang telah dikalibrasi 1ml,
dicukupkan dengan fase gerak sampai garis tanda sehingga diperoleh konsentrasi
2,4368 mM (300 mcg/ml); 3,2491 mM (400 mcg/ml); 4,0614 mM (500 mcg/ml);
4,8736 mM (600 mcg/ml); 6,4982 mM (800 mcg/ml). Dari masing-masing
konsentrasi dipipet sebanyak 10 µl, dimasukkan ke dalam vial yang telah
dikalibrasi 2 ml, ditambahkan 50 μl larutan nikotinamid konsentrasi 1,2285 mM
(150 mcg/ml) kemudian ditambahkan plasma sampai garis tanda, divortex lalu
didiamkan selama 5 menit. Dipipet 300 µl, dimasukkan ke dalam politube dan
ditambahkan 600 µl metanol untuk mengendapkan protein lalu divortex.
Disentrifugasi dengan kecepatan 4000 putaran per menit selama 5 menit.
Universitas Sumatera Utara
Supernatan yang diperoleh diambil dengan menggunakan spuit kemudian disaring
dengan penyaring PTFE diameter 0,2 µm, lalu diinjeksikan ke dalam sistem
KCKT dengan volume penyuntikan 20 µl dengan laju aliran (flow rate) 0.8
ml/menit, deteksi pada panjang gelombang 254 nm.
Kurva kalibrasi dibuat dengan menggunakan rasio luas puncak antara
bahan obat dengan baku dalam yang terukur oleh detektor versus konsentrasi
bahan obat untuk memperoleh garis regresi linier. (Kromatogram dapat dilihat
pada Lampiran 9 halaman 31 dan data perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 10
halaman 36).
3.4.2.6.2 Pemeriksaan Kadar Pirazinamida Dalam Plasma Darah Pasien TB
Kedalam plasma darah pasien ditambahkan 50 µm nikotinamid 16,3 mM
(2.000 mcg/ml). Didiamkan selama 5 menit. Dipipet 300 µl, dimasukkan ke dalam
politube dan ditambahkan 600 µl metanol untuk mengendapkan protein lalu
divortex. Disentrifugasi dengan kecepatan 4000 putaran per menit selama 5 menit.
Supernatan yang diperoleh diambil dengan menggunakan spuit kemudian disaring
dengan penyaring PTFE diameter 0,2 µm, lalu diinjeksikan ke dalam sistem
KCKT dengan volume penyuntikan 20 µl dengan laju aliran (flow rate) 0.8
ml/menit, deteksi pada panjang gelombang 254 nm. Dilihat kromatogram yang
terbentuk dan waktu retensinya. Dihitung kadar obat dalam plasma dengan
menghitung luas puncaknya. (Kromatogram dapat dilihat pada Lampiran 8
halaman 30 dan data perhitungan kadar dapat dilihat pada Lampiran 11 halaman
38).
Universitas Sumatera Utara
3.4.3 Penentuan Batas Deteksi dan Batas Kuantifikasi
Batas deteksi (Limit of detection/LOD) didefenisikan sebagai konsentrasi
analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi. Batas kuantifikasi
(Limit of quantification/LOQ) didefenisikan sebagai konsentrasi analit terendah
dalam sampel yang masih dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat
diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.
LOD =
3 ,3 x SD
slope
LOQ =
10x SD
slope
Standar deviasi (SD) dapat ditentukan berdasarkan pada standar deviasi blanko,
pada standar deviasi residual dari garis regresi (Rohman, 2007).
Standar deviasi residual (Sy) =
∑ (y − y )
i
n−2
2
(Harmita, 2004).
(Data perhitungan batas deteksi dan batas kuantifikasi dapat dilihat pada
Lampiran 12 halaman 39).
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis Pirazinamida dalam plasma secara Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT) fase balik telah dilakukan oleh Revankar, S.N.,et al.,(1994)
menggunakan fase gerak buffer fosfat pH 7,4 dan metanol (96,8:3,2 v/v) pada
panjang gelombang 268 nm dan baku dalam nikotinamid. Menurut Gandjar dan
Rohman (2007), panjang gelombang yang dipilih biasanya 254 nm karena
kebanyakan senyawa obat menyerap di 254 nm. Menurut Munson (1991),
detektor ini tanggap terhadap banyak obat dan kepekaannya memadai bagi
penetapan sediaan obat dan kebanyakan cairan biologi. Berdasarkan hal tersebut
maka pemeriksaan kadar pirazinamida dalam plasma darah pasien TB dilakukan
secara KCKT dengan menggunakan kolom ODS C18, fase gerak buffer posfat pH
7,4:metanol (96,8:3,2 v/v) dan panjang gelombang 254 nm dengan baku dalam
nikotinamid.
Untuk mengetahui waktu retensi dari pirazinamida dan nikotinamid
terlebih dahulu dilakukan penyuntikan larutan baku. Dari hasil penyuntikan
diperoleh waktu retensi larutan baku pirazinamida yaitu 21,663 menit dan waktu
tambat larutan baku nikotinamid yaitu 25,740 menit. Kedua kromatogram hasil
analisis KCKT ini dapat dilihat pada Gambar 7 dan 8.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 7. Kromatogram hasil penyuntikan Pirazinamida baku
Gambar 8. Kromatogram hasil penyuntikan Nikotinamid baku
Sampel darah diambil dari seorang pasien TB yang sedang menjalani
tahap intensif selama ± 1 bulan. Dosis yang diminum oleh pasien adalah 1200 mg.
Pengambilan darah dilakukan 2 jam setelah pasien mengkonsumsi obat.
Pirazinamida dapat dengan baik diserap dari saluran cerna dan secara luas
didistribusikan pada jaringan tubuh. Waktu paruhnya adalah 8-11 jam (Chambers,
H.F.,2004). Resorpsinya cepat dan hampir sempurna; kadar maksimal dalam
plasma sudah dicapai dalam 1-2 jam (Tjay dan Rahardja, 2002).
Universitas Sumatera Utara
Untuk suatu obat yang diberikan dalam dosis oral berulang waktu yang
diperlukan untuk mencapai keadaan tunak bergantung pada waktu paruh eliminasi
obat. Dari segi klinik, waktu yang diperlukan untuk mencapai 99% dari
konsentrasi tunak dalam plasma adalah 6,6 waktu paruh eliminasi (Shargel, 2005).
Dari hasil penyuntikan sampel diperoleh waktu retensi pirazinamida yaitu
20,660 menit dan nikotinamid yaitu 24,313 menit. Waktu retensi ini berdekatan
dengan waktu retensi pirazinamida baku dan nikotinamid baku. Kromatogram
hasil analisis sampel secara KCKT dapat dilihat pada Gambar 9.
Pirazinamida di dalam tubuh dihidrolisis oleh enzim pirazinamidase yang
berasal dari basil TB menjadi asam pirazinoat yang aktif sebagai tuberkulostatik
(Tjay dan Rahardja, 2002; Istiantoro, 2009). Pada temperatur kamar, pirazinamida
dalam plasma pasien TB berada dalam kondisi stabil. Hal ini dapat dilihat pada
kromatogram sampel tidak ditemukan adanya puncak lain (lihat Gambar 9).
Universitas Sumatera Utara
Gambar 9.
Kromatogram Hasil Penyuntikan Sampel dengan Baku Dalam
Nikotinamid
Penentuan linieritas kurva kalibrasi ditentukan berdasarkan luas puncak
karena puncak yang dihasilkan asimetris. Pengukuran luas puncak biasanya lebih
dipilih pada puncak yang asimetris. Biasanya ketepatan metode menggunakan
nilai luas puncak sedikit dipengaruhi oleh perubahan dalam instrumen dan
parameter kromatografi (Snyder dan Kirkland, 1979). Menurut Kromidas (2005),
hampir semua peraturan menyatakan dengan tegas bahwa perhitungan dapat
dilakukan menggunakan metode luas puncak seperti tinggi puncak.
Kurva kalibrasi pirazinamida baku dibuat dengan konsentrasi 2,4368 mM
(300 mcg/ml); 3,2491 mM (400 mcg/ml); 4,0614 mM (500 mcg/ml); 4,8736 mM
Universitas Sumatera Utara
(600 mcg/ml) dan 6,4982 mM (800 mcg/ml). Dari kurva kalibrasi diperoleh
hubungan yang linier antara luas puncak dan konsentrasi dengan koefisien
korelasi (r)= 0,9725 dan persamaan regresi y = 0,5326x – 1,1920 dengan data
penyuntikan larutan baku pirazinamida. Kurva kalibrasi dapat dilihat pada
Gambar 10.
Rasio luas puncak
pirazinamida/nikotinamid
Kurva Kalibrasi Pirazinamida
Rasio Luas Puncak Pirazinamida/Nikotinamid
vs Konsentrasi
2,4
2,2
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
y = 0,5326x - 1,1920
r= 0,9725
0
2
4
6
8
Konsentrasi (mM )
Gambar 10. Kurva Kalibrasi Pirazinamida Baku Rasio
Pirazinamida/Nikotinamid versus Konsentrasi
Luas
Puncak
Pada penyuntikan kalibrasi diperoleh waktu retensi antara 19,547-19,980 menit.
Kadar sampel dapat dihitung menggunakan persamaan regresi y = 0,5326x
– 1,1920 yaitu dengan mensubsitusikan y dengan harga rasio luas puncak. Hasil
perhitungan diketahui harga x (kadar pirazinamida) adalah 2,4537 mM.
Universitas Sumatera Utara
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Pemeriksaan kadar pirazinamida dalam dalam plasma darah pasien TB
dapat dilakukan dengan cara kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)
menggunakan kolom ODS C18 dengan fase gerak campuran buffer fosfat pH
7,4:metanol (98,9:3,2), dengan laju alir 0,8ml/menit pada panjang gelombang 254
nm dan menggunakan baku dalam nikotinamid. Kadar yang diperoleh adalah
2,4537 mM.
Pirazinamida dalam plasma darah pasien TB berada dalam keadaan stabil
pada temperatur kamar.
5.2 Saran
Disarankan kepada peneliti selanjutnya agar melakukan validasi metode
sehingga diperoleh hasil yang lebih baik.
Universitas Sumatera Utara