Polimorfisme Genetik Gen Follicle Stimulating Hormone Receptor dan Respon Ovarium Terhadap Stimulasi Follicle Stimalding Hormone Oleh : Dr. Daniel Joko Wahyono, M.Biomed I. Pendahuluan Follicle stimuloting hormone (FS[D merupakan hormon yang sangat penting dalam sistem reproduksi mamalia, pubertas. Di yaitu untuk perkembangan gonad dan pematangan masa samping itu, FSH juga diperlukan untuk menghasilkan gamet selama masa subur (Simoni et a1.,1999). FSH menjalankan fungsinya menstimulasi oogenesis melalui interaksi dengan FSHR pada sel target, yaitu sel-sel granulosa folikel. FSHR merupakan anggota kelompok reseptor G-protein-coupled (Simoni and Nieschlag, 1995; lvlayorga et aL.,2000\. Pada teknologi reproduksi berbantuan seperti intracytoplasmic sperm iniection (ICSD dan in vitrofertilization {Vf) stimulasi ovarium dengan FSH merupakan salah satu prosedur standar yang harus dijalani oleh wanita yang mengikuti program reproduksi berbantuan untuk mendapatkan oosit yang meinadai untuk fertilisasi (Lenton et a1.,2000; Agrawal et a1.,2000; Mayorga et a1.,2000; Subiyanto et aI., 2000). Pengalaman di beberapa klinik yang melakukan reproduksi berbantuan menunjukkan adanya variasi respons wanita usia reprodukstif terhadap FSH eksogen (Mayorga et a1.,2000; Subiyanto el aL.,2000). Saat ini diketatrui ada tiga SNPs pada gen reseptor FSH, yaitu satu pada promoter dan dua lainnya pada ekson 10 yang berada pada domain ekstraselular. Situs polimorfik yang pertama ditemukan pada domain ekstraseluler di posisi aa (kodon) 307, yaitu Alanine (Ala) atau Threonine (Thr). Situs polimorfik yang lain ditemukan pada domain intraseluler kodon 680, yaitu Asparagin (Asn) atau Serine (Ser) (Simoni et ol., 1997). Analisis Single Strand Conforaation Polymorphism (SSCP) dapat digunakan untuk melakukan variasi alel l0 yang berkaitan bio.unsoed.ac.id Thr307-Asn680 dan Ala307-Ser680. Frekuensi dan distribusi dua variasi identifikasi dua polimofisme pada ekson yaitu dengan FSHR, alel selanjutnya di analisis dengan SSCP pada kodon 3A7 dan Restrietion Fragment Length Polymorphrsn (RFLP) pada kodon 680 (Simoni et a1.,1999). 2. Follicle stimulating hormone GSH) FSH adalah salah satu hormon gonadotropin yang dihasilkan oleh hipofisa anterior. Sintesis dan sekresi FSH diatur oleh gonadotropin releasing hormone (GnRH) yang disekresikan oleh neuron khusus di dalam hipotalamus. GnRH menginduksi sekresi gonadotropin dengan cara perlekatan dekapeptida pada reseptor spesifik pada gonadotropin hipofisis, kemudian diikuti dengan respons plasma-membran yang menyebabkan dilepaskannya FSH ke sirkulasi (Yen and Jaffe, 1936). Fungsi utama FSH adalah menstimulasi maturasi testis dan ovarium sertra mengafur gametogenesis dan steroidogenesis dalam gonad. Mekanisme kerja FSH pada sel-sel gonad berupa umpan balik negatif. Pada ovarium, FSH menginduksi perkembangan folikel sampai terbentuk folikel tersier (follicle deGraafl. Folikel tersier kemudian membentuk hormon estrogen yang kemudian menekan hipofisis anterior sehingga sekresi FSH menjadi terhenti. Pada testis, target FSH adalah sel sertoli yang terdapat dalam tubuklus senminiferus dan berperan dalam spermatogenesis (Simoni et al., 1997). FSH disusun oleh dua subunit polipeptida yang terikat satu sama lain dalam il€tan nonkovalen dengan afinitas tinggi. Kedua subunit yang menyusunnya dikenal sebagai subunit a dan p. Subunit o dari hormon FSH mempunyai struktur yang sama dengan hormon glikoprotein lain, yaitu luteinizing hormone (LH), human chorionic gandotrophin (hCG) dan thyroid-stimulating hormone GSFD (Yen and Jaffe, 1986; Loumaye et al., 1998). Sub.unit o mengandung 92 residu asam amino dengan lima ikatan disulfida yang berkontribusi pada pembentukan struktur tersiernya. Sebaliknya" subunit p mempunyai sekuens asam amino yang berbeda-beda dan membawa informasi yang spesifik yang akan dikespresikan bila telah bergabung dengan subunit a. Subunit p mengandung l l asam amino dengan enam ikatan disulfida (Loumaye et adalah 33 kilo Dalton (kDa), l residu al., l99S). Berat molekul FSH berat molekul subunit a adalah 14 kDa. bio.unsoed.ac.id glikosilasi sedangkan mengandung empat asam amino asparagin yang terikat pada situs 2 FSH FSH, dan dari keempat asparagin tersebut dua terletak pada subunit c (Asn 52 dan 78), dan dua lainnya terletak pada subunit p (Asn 7 dan Asn 24). Kehadiran dan komposisi rantai samping karbohidrat dan asam sialat yang berbeda-beda pada FSH menentukan lama aktivitas biologi FSH secara in vivo dan pada akhirnya menentukan kualitas FSH dalam tubuh (Loumaye et a1.,1998; Simoni et a1.,1997). Konsentrasi FSH dalam darah yang tidak mencukupi akibat kurangnya sintesis atau sekresi FSH menyebabkan kasus infertilitas pada pria dan wanita. Pada wanit4 keadaan ini ditandai dengan tidak normal atau tidak terjadinya owlasi, sedangkan pada pria keadaan yang mengakibatkan infertilitas ini disebabkan tidak cukup tersedianya spenna yang bergerak normal. Pemberian preparat FSH, baik tunggal atau dikombinasikan dengan LH, sangat membantu penanganan kasus-kasus infertilitas pada pria dan wanita (Loumaye et al.,1998). Preparat FSH yang pertama kali dijumpai di pasaran dihasilkan dari urin wanita pasca menopause yang dikenal dengan human menopausal gonadotropiz (HMG). HMG adalatr sumber FSH eksogen pertama yang dipakai secara klinis untuk stimulasi ovarium (Simoni et a1.,1997). Tingkat kemanjuran HMG dalam menginduksi ovarium masih rendah dibandingkan dengan preparat FSH eksogen lainnya, misalnya urofollitropin (uFSH) dan highly purified urofollitropin (UFSH-FIP) maupun urofollitropin u dan urofollitropin p (Lenton et aI., 2000). Urofollitropin dan uFSH-HP merupakan preparat FSH yang dihasilkan dari proses pemurnian HMG. uFSH dapat diberikan secara subkutan karena tingkat kemurniannyayang lebih tinggi daripada HMG (Bergh et a1.,1997). Preparat FSH terakhir yang dijumpai di pasaran saat ini dihasilkan dari teknologi DNA rekombinan yag dikenal dengan urofollitropin o dan urofollitropin B (Loumaye et rekombinan ini dihasilkan dengan menyisipkan fragmen DNA subunit al., 1998). Produk a dan F gen FSH manusia ke dalam vektor ekspresi pCLH3AXSV2DHFR (untuk subunit a) dan vektor ekspresi pCLH3AXSV2ODC (untuk subunit B), kemudian ditransfeksi ke sel ovarium hamster (Loumaye et al., 1998). Follitropin o dipasarkan dengan nama Gonal-F dan bio.unsoed.ac.id follitropin p dipasarkan dengan naman Puregon atau Follistatin @aya and Gunby,1999). Kedua produk rekombinan FSH manusia yang dihasilkan ini benar-benar murni dan terbebas dari aktivitas LH dan protein urin lainnya (Lenton et a1.,2000).. 3. Aspek Molekul FSHR dan Gen FSHR FSH bekerja dalam sel melalui reseptor khusus, yaitu FSHR yang terletak secara ekslusif pada gonad. Ekspresis FSHR pada manusia dan beberapa mamalia lainnya yang sudah teridentifikasi hanya terdapat pada testis dan ovarium. Pada testis, ekspresi FSHR secara ekslusif hanya ditemukan pada sel-sel Sertoli, sedangkan pada ovarium FSHR hanya diekspresikan pada sel-sel granulosa (Yen and Jaffe, 1986; Simoni et al., 1997; Heckert and Griswold, l99l). FSHR termasuk ke dalam famili reseptor yang membentuk ikatan dengan GTPbinding protein Qrotein G), kompleks protein transmembran yang dicirikan dengan adanya tujuh heliks hidrofobik yang tersisipkan dalam plasmalemma, domain intraseluler dan ekstraseluler dengan dimensi yang bervariasi sesuai dengan tipe ligandnya (Gudermawr et a1.,1995). Bagran intraseluler dari FSHR membentuk ikatan dengan protein G yang setelah adanya aktivasi reseptor oleh interaksi hormonal dengan domain ekstraseluler menginisiasi rangkaian peristiwa yang terutama menyebabkan efek biologi spesifik dari gonadotropin. Diperkirakan FSHR manusia yang terdiri atas domain ekstraseluler, domain transmembran, dan domain intraseluler disusun oleh 695 asam amino (aa) termasuk 17 aa pertama yang mengkode suatu signal peptida hidrofobik. Domain eksfaseluler reseptor terdiri atas 349 aao domain transmembran terdiri atas264 aa, dan domain intraseluler terdiri atas 82 aa. Homologi di antara spesies mamalia yang berbeda umumnya tinggi dan mencapai 9O %padadomian transmemban (Simoni et al.,1997). Domain ekstraseluler disusun oleh beberapa unit pengulangan yang tidak sempurna yang masing-masingnya terdiri atas 24 residu. Leucine-rich repeot (LRR) ditemukan pada protein yang terlibat dalam adhesi antara sel tertentu dan interaksi protein-protein pada spesies mulai dan yeast sampai manusia (Kobe and Deisenhofer, 1993). Pola LRR sangat 9. Domain - 8 dan kurang bio.unsoed.ac.id conserved pada ekson 2 conserved pada ekson mengandung beberapa residu sistein yang terutama terletak pada ekson eksfiaseluler I dan 10. Delapan residu sistein yang terutama terletak pada ekson conserted yang juga terdapat pada reseptor I dan 10. Delapan residu sistein sangat LH (LI{R) dan reseptor TSH (TSI{R), kemungkinan mempunyai peran penting dalam integritas konformasi domain ekstraseluler dari semua reseptor hormon glikoprotein (Kobe and Deisenhofer, 1993). Hasil perbandingan domain transmembran FSHR, LHR, dan TSHR menunjukkan bahwa domain transmembran pada segmen 2,3, dan 4 sangat homolog, sedangkan pada empat segmen lainnya mempunyai tingkat homologi yang rendah. Residu prolin yang kemungkinan penting untuk ketepatan insersi protein ke dalam membran diketahui homolog untuk segmen ke4, ke-6, dan ke-7 dari semua reseptor hormon glikoprotein (Simoni et a1.,1997). Penelitian menggunakan teknik biologi molekuler pada jaringan ovarium menunjukkan bahwa sel-sel granulosa merupakan satu-satunya sel yang mengekspresikan FSHR (Camp et a1.,1991). Ekspresi reseptor pada organ wanita seperti halnya pada organ pria juga bersifat gonad dan cell-specific.Pada pria" ekspresi FSH semra spesifik terikat pada reseptor yang terletak pada membran sel Sertoli (Kangasniemi et al., 1990). Hasil hibridisasi in situ jugamembukrikan bahwa sel-sel Sertoli merupakan satu-satunya sel yang mengekspresikan FSHRpada testis @oeckers et al.o 1994). Hasil pemetaan kromosom gen FSHR dengan teknik hibridisasi in situflourescent menggunakan pelacak cDNA atau DNA genom dan analisis lingkage menunjukkan bahwa gen FSHR terletak pada kromosom 2p2l pada manusia (Minegishi e/ al.,l99l; Kelton et al.,1992). Gen FSIIR adalah gen salinan tunggal (single copy gene). Hasil analisis restriksi klon genom menunjukkan panjang gen FSHRpada manusia adalah 54 kpb, sedangkan tikus adalah 86 kpb. Gen FSHR terdiri atas dikode oletr ekson I- 9, sedangkan transmembran dan domain 1234 pb (Heckert et l0 ekson dan 9 intron. Domain ekstraseluler FSI{R C domain ekstraseluler, domain intraseluler dikode oleh ekson t0 dengan panjang lebih dari bagian ujung al., 1992; Gromoll et aI., 1996). Gen manusia mengkode 695 asam amino, termasuk signal peptida sebesar 17 asam amino. Ukuran intron sangat bervariasi, intron 7 berukuran 108 pb sedangkan intron I berukuran jauh lebih bear yaitu 15 kpb. bio.unsoed.ac.id Sekuens konsensus splicing pada batas ekson-intron conserved pada semua ekson. Asam amino yang terletak pada hampir setiap penghubung ekson/intron adalah Leusin dan Isoleusin (Simoni et a1.,1997). 4. Polimorlisme Gen FSHR Situs peta gen pada genom manusia dikenal sebagai polimorfik bila ada probabilitas yang logis bahwa genom dari dua individu akan berbeda satu dengan lainny4 dimana sebagian besar variasi tersebut dalam bentuk polimorfisme basa nukleotida tunggal atau single nucleotide polymorphisns (SNPs) @ruce et al., 2002; Botwell and Sambrook, 2003). Alel adalah perubahan sekuens DNA tertentu yang berbeda dengan sekuens wild We-nyapada satu lokus gen dalam suatu kromosom. Apabila alel tersebut ditemukan pada I lebih dari persen kromosom dari suatu populasi disebut sebagai polimorfisme genetik (Nussbaum et al., 2001). Dewasa ini telah diketahui dengan pasti dua situs polimorfisme pada gen struklur FSI{R manusia. Polimorfisme ini diketahui dari hasil skrining gen FSI{R pada pasien disgenesis ovarium, pasien l4tpogonadotropic hypogondism, dan pria infertil. Polimorfisme pertama ditemukan pada domain ekstraseluler pada kodon 307 (posisi sekuens nukleotida 919) yang dapat ditempati oleh Alanin (GCT) atau Treonin (ACT). Polimorfisme kedua terletak pada domain transmembran pada kodon 680 (posisi sekuens nukleotida 2039) yang dapat ditempati oleh Asparagin (AAT) atau Serin (AGT). Pada posisi sekuens nukleotida 919 dan 2039 te4adi perubahan basa nukleotida dari Guanin menjadi Adenin. Kedua situs polimorfik tersebut terletak pada ekson 10 dan membentuk dua variasi alel pada FSH& yaitu Thr307/Asn680 dan Ala307/Ser680 (Simoni et al., 1999). SNPs pada ekson l0 < menghasilkan empat variasi alel yang dislret dan dicirikan dengan kombinasi Thr307/Ser680, Ala307/Ser680, Ala307/Asn680, danThr307/Ser680. Kedua variasi alel yang pertama sangat sering terjadi pada populasi Kaukasi4 masing-masing Thr307/Ser680 dengan frekuensi 60 o/o dan Ala307/Ser680 dengan frekuensi 40 o/o. Variasi alel yang lebih jarang terjadi adalah pada Ala307/Asn680 dan Thr307/Ser680, frekuensinya sangat kecil yaitu < 5 o/o pada bio.unsoed.ac.id populasi Cina. Pada umumnya polimorfisme pada gen FSHR ekson l0 berupa polimorfisme basa nukleotida tunggal atau single nucleotide polymorphisms 6 (SNPs), seperti Thr307Ala" Val34lAla dan Ser680Asn. Ketiga situs polimorfik tersebut merupakan tipe missense yang tidak menuqiukkan perubahan fenotipe atau tidak mempunyai efek fenotipe (Themmen et a1.,2000). Identifikasi kedua polimofisme pada ekson l0 gen FSHR ini dapat dilakukan dengan analisis Polymerase Chain Reaction Single Stranded Conformation Polynorphisms (PCR-SSCP), sedangkan khusus pada kodon 680 dapat juga dilakukan analisis dengan PCR-SSCP dan Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment lcngth Polynrorphisms (PCR-RFLP). Oleh karena pada kodon 680 ekson 10 gen FSI{R mempunyai situs restriksi yang dapat dikenali oleh enzim restriksi Bsr SI, maka posisi ini dapat dianalisis dengan PCR-RFLP (Simoni et a1.,1999). Penelitian Mayorga et al. Q000) menunjukkan bahwa wanita dengan genotip Asn/Asn membutuhkan jumlatr ampul FSH paling sedikit (31,8 + 2,4 ampvl,l ampul = 75 II-D untuk stimulasi ovarium dan wanita dengan genotip Ser/Ser membutuhkan jumlah ampul FSH terbanyak (46,8 + 5,0 ampul). Hal ini menunjukkan suatu hubungan yang jelas pada regulasi feedback FSH yang bergantung pada tipe FSHR (Mayorga et a1.,2000). Residu Asn berkontribusi dalam glikosilasi FSHR dan penting dalam proses pasca- translasi reseptor dan ekspresi pada permukaan sel. Sebaliknya residu Ser berkonfibusi dalam fosforilasi yang berpotensi menyebabkan turnover reseptor (Mayorga et a1.,2000; Davis et a1.,1995). 5. Kesimpulan FSH menjalankan fungsinya menstimulasi oogenesis melalui interaksi dengan FSHR pada sel target, yaitu sel-sel granulosa folikel ovarium dan sel-sel sertoli testis. Variasi uf"t psnn yang menentukan sensitivitas ovarium terhadap stimulasi FSH merupakan wacana baru dalam endokrinologi reproduksi. Daftar Pustaka bio.unsoed.ac.id Agrawal, R., J. Holmes, H.S. Jacobs. 2000. Follicle-stimulating hormone or human menopausal gonadotropin for ovarian stimulation in in vitro fertilization cycles : a meta-analysis. Fertil Steril 73: 33843. Boeckers, T.M., E. Nieschlag M.R. Kreuta M. Bergmann. 1994. Localization of folliclestimulating hormone immunoreactivity and hormone receptor mRNA in testicular tissue of infertile men. Cell Tissue Res 278: 595-600. Botwell, D. and J. Sambrook.2003. DNA Microarrays : A Molecular Cloning Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA : 400. Brucg A., A.Johnson, J. Lewis, M. Rafi K. Roberts, P. Walter. 20fi2. Moleculm Biologt of The Cell.4e ed. Galand Science, New Yorlg USA : 464. Camp, T.A., J.O. Rahal, I(8. Mayo. 1991. Cellular localization and hormonal regulation of folliclestimllating hormone and luteinizing hormone receptor messenger RNAs in the rat ovary. Mol Endocrinol 5: 1405-17. Davis, D., X. Liq D.L. Segaloff. 1995. Identification of the sites of N-linked glycosylation on the follicle-stimulating hormone (FSH) recepor and assessment of their role in fsh receptor function. Mol Endocrinol 9 : 159-170. Day4 S. and J. Gunby. 1999. Recombinant versus urinay follicle-stimulating hormone for ovarian stimulation in assited reproduction. Hwn Reprod 14 :2207-12. Ford K.A. and A.R. I"aBarbera. 1988. Follicle-stimulating hormone (FSIT) unmasks specific high atrnity FSH-binding stes in cell-free membrane preparations of porcine granulosa cells. Endocrinologt 123 : 237 4-8I. Gromoll, J., E. Pekel, E. Nieschlag 1996. The structure and organization of the human folliclestimulating hormone receptor GSIIR) gene. Genomics 35 : 308-11. Gudemrann, T., B. Nuemberg G. Schuktz. 1995. Receptors and G protein as primary components of transmembrane signal hansduction. I.G-protein-coupled receptors:structure and function. J Mol Med73:51-63. Heckkerl L.L. and M.D. Grsiwold. 1991. Expression of follicle-stimulating hormone recepror mRNA in rat testes dan Sertoli cells. Mol Endocrinol s:670-7. Heckert, L.L., I.J. Daley, M.D. Griswold. 1992. Strucuhal organization of the follicle-stimularing hormone receptor gene. Mol Endocrinol 6 : 70-80. Huhaniemf I., V. Eskol4 P. Pakarinen, T. Matikainen, R. Sprengel. lgg2.'themurine lgteinizing hormone and follicle-stimulating hormone receptor gene : transcription initiation sitei putative promoter sequences and promoter activity. Mot Celt Endocriiol 88 : 55-66. Kangasniemi, M., A. Kaip4 J. Toppari, A. Perhentupa,I. Huhtaniemi, M. Parvinen. 1990. Ceflular regulation of follicle-stimulating hormone (FSID binding rat somniferous tubules. J Androl ll :336-43. bio.unsoed.ac.id Keltorq C.A., S.V.Y th*g, N.P. Nugen! RL. Schweickhardt, J.L. Rosenthal, S.C. Chappl.lgg2. The cloning of the human follicle-stimulating hormone receptor and its expression in COS7, CHO and Y- I cells. Mol Cell Endoginol t9 : 14 I -5 I . inhibitor' a protein lgg3. Crystal structure of porcine ribonuclease leucine-rich repeats' Nature 366 : 7 514 and J. Deisenhofer Kobe, --- - -' B. -with . Lenton,E.,A.Solta&J.Hewitt,A-Thomsorr,W.Davies,N.AshraiV.Sharma"L.Jenner,W. assited of ovuiation in women undergoingptnified Ledger, E. McVeigtr- 2000. -Inducion highlv versus FSH (follitropin alpha) reproductive techniques *inu.y fsff :pgg{lanil;man (urofofiitropin HP) ' Hum Reprod 15 : 1021-7' Loumaye,E.,M.Dreano,A.Galazka,C.Howles,L.Ham.A.Eshkol.lgg8.Recombinatfolliclenttt b-iotechnologl product for treatment of stimulating hormone: development "f ittt infertility.-Hum Reprod Update 4 : 862-81 2000' Ovarian H'M' Behre' C' Gassnerr' E' Nieschlag' M' Simoni' the FSH receptor on depends t" rliiirr.lrtimulating rro*ro* irsrD ltlTrylion Mayorga, M.P., J. Gromoll, response g.notyp" I Ai i"a*'nol aid Metab 85 (9) : 3365-3369' Y. Ibuki, M' Igarashi' 1991' Cloning and sequencing Minegishi, T., K. Nakamura" Y. Takakurq ,pNe. Biociem Biopltys Rei commun 175 :1125-30. human FSH of ;;;'p; Willard. 2001. Thompsom&Thompson Nussbaurrr, R.L., R.R. Mclnnes, H.F. wB saunders Co', Philadeplhia' USA : 87' "*"--?tgi. Simoni, M. and E. Nieschlag. 1995. clinical vse- Reprod Med Rev py 4: : Genetics in Medicine. and in therapy : physiological basis' new preparations t63'167 ' The Follicle-stimulating hormon receptor : simoni, M., J. Gromoll, E. Nieschlag. 19 9,7. biochemystry,molecularbiolory,on'''*'"*andpathophysiology.EndocrRevlS:739773. simoni,M.,J.Gromoll,w.H0ppner.lggg.Mutationanalysisofthefollicle-stimulatinghormone characterization of two irir"ttiir-;;, identification and(2):751-755' GSID receptor in normal *o J Ctin Endocrinol and Metab U discrete Subiyanto, FSH;;"tpt* M. Jaffar, I. Yan, Mal.am Klinik PNI isoforms. g{. JAYA : Y*11". I 1' { 1 in vitro' 2000. Stimulasi ovarium program fertilisasi - receptor Mutation of gonadotropin and gonadofropin Themmer\ A.p.N. and I.T. Huhteniemi. 2000. *d;.il;ht;iolory oif pituitary-gonadal tunction' Endocrine : elucidatin!'ihe;tt t"t"t Rev2l (5):551-583' Physiologt' Pathophysiologt Yerf S.S.C. and R.B. Jaffe. 1986. Reprodrctive endocrinolog't' Philadelphia' London' companv' ctinicat *;;;;;;;;r-iJ.oiiJ.. w.B. Saunders bio.unsoed.ac.id and