AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854

POLIMORFISME GEN MX PADA AYAM LOKAL
DI SULAWESI TENGGARA
Oleh: Muhammad Amrullah Pagala1)
ABSTRACT
The objective this reseacrh was knowed the polymorfism Mx gene of Tolaki Chicken and
Kampung Chicken. As a threatment in this research was carried out experiment by using 12
Tolaki chicken, consist of 6 Tolaki Chicken and 6 Kampung Chicken from Konawe Selatan
Regency. The research was conducted from September to Nopember 2012. The Method of this
research was using DNA Extraction according to Sambrook, et al (1989). The polymorfism test
of Mx Gene was conducted based on PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction- Restriction
Fraghment Long Polymorfism) according to Ko et al (2002); Maeda (2005) and Sulandari et al
(2007). The spesifik primer Mx gene according to Seyama et al (2006) was Foward NE-F2
(5’CCTTCAGCCTGTTTTTCTCCTTTTAGG
AA3’)
and
Reverse
NE-R2/R
(5’CAGAGGAATCTGATTGCTCAGGCGTGTA3). Result showed that all Tolaki Chicken and
village Chicken sample had Mx gene with 299 bp. While the test results show the chicken Mx
gene polymorphism has a degree Tolaki Mx gene polymorphism is very high with the A allele
frequency of (0.83) is higher than Kampung chickens (0,67). Overall a total of 12 samples of
native chickens Southeast diSulawesi have A allele frequency or f (A) is very high with an allele
frequency of 0.75 A and G allele frequency of 0.25.
Keywords : local chicken, polymorfism, Mx gene and PCR-RFLP.
PENDAHULUAN
Ayam lokal di Indonesia memiliki
potensi
yang
sangat
besar
untuk
pengembangan dan peningkatan mutu
genetiknya. Potensi genetik ini tercermin
dari tingginya keragaman sifat-sifat yang
dimiliki, baik sifat-sifat tampilan fisik
maupun produktivitasnya (Mansjoer, 2003).
Tingginya keragaman sifat ayam lokal
merupakan bahan baku genetik yang dapat
dimanfaatkan guna membentuk galur ayam
unggul, melalui seleksi yang ketat dan
terarah terutama terhadap sifat-sifat yang
bernilai ekonomis tinggi seperti produksi
daging dan telur, kemampuan adaptasi serta
daya tahan terhadap penyakit.
Di daerah tropis tingginya prevalensi
penyakit
dan
terbatasnya
upaya
meningkatkan mutu genetik merupakan
faktor utama yang membatasi produktivitas
ayam lokal (Otim, 2005). Beberapa riset
sebelumnya yang melihat hubungan asosiasi
penyakit dan karakterisasi gen pada ayam
lokal telah dilakukan oleh Dalgaard, et al
(2003) dan Maeda (2005). Hasil ini
mempertegas kemampuan ternak dalam
1
merespon serangan penyakit ternyata
dikendalikan oleh sejumlah gen.
Ayam Tolaki merupakan salah satu
dari 31 jenis ayam lokal yang memiliki
karakteristik penampilan yang khas
(Nataamidjaja dan Dwiyanto, 1994). Ayam
Tolaki adalah ayam lokal asli Sulawesi
Tenggara. Sebagaimana yang dinyatakan
Sarwono (2005), bahwa ayam yang
berbadan atletis ini diperkirakan berasal dari
Sulawesi Tenggara. Habitat ayam ini
terdapat di wilayah yang berdekatan dengan
hutan, diduga kuat ayam Tolaki merupakan
hasil perkawinan dari ayam Kampung dan
ayam hutan. Oleh karena itu ayam Tolaki
memiliki sifat-sifat yang mirip dengan ayam
hutan seperti pola warna bulu dan sifat liar
(agresifitasnya) yang mirip dengan ayam
hutan merah (Gallus-gallus), termasuk
beberapa sifat ketahanannya terhadap
beberapa penyakit viral. Hasil penelitian
sebelumnya menunjukkan bahwa aliran gen
Mx pada ayam lokal yang mengendalikan
sifat daya tahan penyakit viral pada ayam
diperoleh dari atau bersumber dari ayam
hutan. Keberadaan gen Mx pada ayam lokal
telah dibuktikan oleh hasil penelitian Pagala
)Staf Pengajar Jurusan
Peternakan Volume
Fakultas Peternakan
Universitas
Oleo,
Kendari
AGRIPLUS,
23 Nomor
: 02 MeiHalu
2013,
ISSN
0854-0128
118
119
dan Aku (2012) yang menemukan adanya
gen Mx pada ayam Tolaki dengan panjang
ukuran pita 299 bp.
Karakterisasi genetik sifat ekonomis
pada ayam lokal melalui analisis DNA
termasuk identifikasi molekuler sifat
ketahanan terhadap penyakit viral masih
sangat sedikit dilakukan. Oleh karena itu
penting melakukan penelitian
analisis
molekuler ayam lokal untuk menghasilkan
karakterisasi genetik sifat ketahanan
penyakit
viral
yang
dimilikinya.
Berdasarkan Pemikiran tersebut, maka telah
dilakukan suatu penelitian molekuler yang
dapat menggambarkan derajat polimorfisme
sifat resistensi penyakit viral pada Ayam
Tolaki.
METODE PENELITIAN
Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan bulan
September sampai Nopember 2012 Lokasi
pengambilan sampel dilaksanakan di
Kabupaten Konawe Selatan Propinsi
Sulawesi Tenggara. Analisis sampel di
Laboratorium Pemuliaan dan Genetika
Molekuler Departemen Ilmu Produksi dan
Teknologi Peternakan Fakultas peternakan
IPB Bogor.
Materi Penelitian
Sampel yang digunakan dalam
penelitian ini adalah ayam Tolaki dan ayam
kampung yang diambil dari beberapa daerah
di Kabupaten Konawe Selatan Sulawesi
Tenggara sebanyak 12 ekor. Selanjutnya
analisis di Laboratorium. Bahan yang
digunakan adalah bahan kimia untuk
pengambilan sampel darah, ekstraksi DNA,
amplifikasi DNA, gel elektroforesis, dan
Silver Staining antara lain : EDTA, Trs,
HCL pekat, potassium asetat, air bebas ion,
NaCl, NaOH, SDA, natrium asetat, asam
asetat, fenol, etanol absolute, kloroform,
isoamil alkohol, dan proteinase K, agarose,
bromfenolblue, etidium Bromida, marker
DNA leader 100 pb, Tris-Borat-EDTA,
Mgcl2, dNTP, Taq polymerase dan random
primer.
Alat yang digunakan mesin PCR,
elektroforesis, autoclave, vacuum tainer,
pipet mikro, pipet tip,disposable glove,
sentrifuse, vortex,gelas piala, magnetic
stirrer, tabung eppendorf, alat thremocycler,
lampu UV, kamera paraloid.
Isolasi DNA Total
Isolasi DNA Total dilakukan
dengan menggunakan metode pemurnian
fenol dan presipitasi dengan etanol menurut
(Sambrook, et al, 1989). Adapun prosedur
pelaksanaannya adalah sebagai berikut :
1. Darah ayam sebanyak 250 µl yang
sebelumnya telah ditambahkan EDTA
10% dipindahkan kedalam tabung
ependorf 1,5 ml.
2. Ditambahkan digestion buffer (SDS 1%
v/v, 10 mM EDTA, pH 8, 20 mM NaCl,
50 mM, Tris HCL pH 9) sebanyak 500
µl dan dikocok.
3. Inkubasi pada suhu 550C selama
semalam atau 16 jam.
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA pada praktikum ini
menggunakan protokol ekstraksi DNA
metode phenol (Sambrook, et al, 1989).
Sebagai berikut :
1. 250 µl sampel darah dalam EtOH
dipindahkan ke tabung 1,5 ml
2. Ditambahkan 1000 µl DW/TE dan lisis
buffer 500 µl dikocok pada votex dan
didiamkan selama 5 menit.
3. Sentrifuge pada kecepatan 8000 rpm
selama 5 menit
4. Supernatannya dibuang dan endapannya
(pelet) disuspensikan dengan larutan 40
L SDS 10% dan 10 L Protk 5 mg/ml,
dan 1 x STE sampai 400 µl.
5. Dikocok pelan dalam inkubator pada
suhu 55°C selama 2 jam.
6. Supernatan sisa diekstraksi dengan
penambahan 1 x volume 400 µl phenol400
µl
(chloroform-Isoamil
alkohol,24:1) dan 40 µl 5M Nacl.
Dikocok pelan pada suhu ruang selama 1
jam.
7. Sentrifuge pada kecepatan 12000 rpm
selama 5 menit. Bagian bening (DNA)
dipindahkan ke tabung 1,5 ml baru.
8. Ditambahkan 800 µl Etanol absolut dan
40 µl 5 M Nacl.
9. Selanjutnya tabung difreezing selama
(lebih dari) 30 menit/over night.
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128
120
10. Larutan kemudian disentrifuse pada
12.000 xg selama 5 menit untuk
mempresipitasi Asam Nukleat.
11. Supernatan dibuang dan pelet dibilas
dengan 800 L Etanol 70% (etanol
kemudian dibuang).
12. Diamkan dalam keadaan terbuka dalam
desikator atau ruang terbuka sampai
alkoholnya hilang.
13. Ditambahkan 100 µl.TE 80% atau
Elution Buffer dan DNA kemudian
disimpan dalam freezer sampai akan
digunakan.
Identifikasi dan Uji Polimorfisme gen Mx
Secara umum metode genotiping
yang akan dilakukan untuk mengidentifikasi
genotip jenis gen adalah PCR-RFLP
(polymerase chain reaction-restriction
fragment length polymorphism). Metode
PCR-RFLP mengikuti metode penggunaan
penanda molekuler gen menurut metode
analisis Gen Mx+ PCR-RFLP oleh Ko et al
(2002); (Maeda, 2005) dan Sulandari et al,
2007).
Primer
spesifik
untuk
mengamplifikasi gen Mx berdasarkan
Seyama et al (2006) adalah primer Foward
M A1 A2 A3 A4 A5 A6
NE-F2
(5’CCTTCAGCCTGTTTTTCTCCTTTTA
GGAA 3’) dan primer Reverse NE-R2/R
(5’CAGAGGAATCTGATTGCTCAGGCG
TGTA 3’). Untuk menentukan genotipe
Mx++, Mx+-, dan Mx—digunakan metode
PCR-RFLP yaitu hasil PCR dari fragmen
gen Mx dipotong oleh enzim retriksi yang
dapat memotong situs 631 yaitu enzim
retriksi Hpy81 (Sironi et al, 2008). Produk
PCR yang sudah dipotong dengan enzim
restriksi kemudian dipisahkan dengan
metode elektroforesis gel poliakrilamida 5%
(PAGE5%) yang kemudian di visualisasikan
dengan metode pewarnaan sensitif perak.
Prosedur
pewarnaan
perak
nitrat
berdasarkan Sulandari dan Zein, (2003).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi PCR pada Ayam Tolaki dan
Ayam Kampung
Hasil ekstraksi DNA ayam Tolaki dan
ayam Kampung yang dilanjutkan dengan
proses perbanyakan (amplifikasi DNA)
dengan PCR (Polymerisasi Chain Reaction)
ditampilkan pada Gambar di bawah ini.
M B1 B2 B3 B4 B5 B6
299 bp
Gambar 1. Hasil Amplifikasi PCR DNA Ayam Tolaki dan Ayam Kampung
Keterangan :
M = Marker 1 kb
A = Sampel Ayam Tolaki
B = Sampel Ayam Kampung
Berdasarkan gambar 1, terlihat bahwa
semua sampel ayam lokal baik sampel ayam
Tolaki maupun ayam Kampung memiliki
atau mengandung gen Mx dengan ukuran
pita DNA sebesar 299 bp. Gen Mx adalah
gen yang bertanggungjawab terhadap
kemampuan ayam dalam mempertahankan
diri (Resisten) terhadap serangan virus flu
burung (avian influenza) dan New castle
Disease (ND) yang disebabkan oleh virus
vesicular stomatitis virus (VSV) (Maeda,
2005). Hasil penelitian serupa sebelumnya
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128
121
juga telah dilakukan oleh Sironi, et al
(2008) yang menemukan adanya gen Mx
pada ayam jenis white leghorn dan New
Hampshire sebesar 300 bp. Keberadaan gen
Mx pada ayam Tolaki dan ayam kampung
semakin menguatkan dugaan awal bahwa
sebagian besar ayam lokal memiliki daya
tahan terhadap serangan penyakit ayam
yang disebabkan oleh virus VSV ini.
M AG AA AG AA AA AA
Polimorfisme Ayam Tolaki dan Ayam
Kampung
Hasil uji polimorfisme ayam Tolaki
dan ayam Kampung dengan teknik PCRRFLP dapat dilihat pada gambar 2 dibawah
ini.
AG AA AA AA AG GG
A (ayam Tolaki)
B (ayam Kampung)
Gambar 2. Polymorfisme Gen Mx pada ayam Tolaki dan ayam kampung
Berdasarkan gambar 2 tersebut
diperoleh informasi bahwa semua sampel
DNA ayam Tolaki dari 2 Kecamatan yang
berbeda
memiliki
keragaman
alel
(polymorfisme) yang cukup tinggi, terdiri
dari alel AA, AG dan GG. Uji deteksi
polymorfisme bertujuan untuk melihat
frekuensi alel dari gen Mx. Gen Mx sendiri
memiliki 3 kategori berbeda yang
digolongkan
kedalam
gen
Mx++(mengandung jenis alel yang resisten
terhadap virus flu burung), gen Mx+(mengandung jenis alel yang bisa resistent
dan rentan terhadap virus flu burung) dan
gen Mx—(mengandung alel yang rentan
terhadap serangan virus flu burung).
Hasil dari visualisasi PCR-RFLP di
atas diperoleh panjang gen Mx sebesar 299
bp. Dimana Genotipe AA digambarkan
dengan pita DNA sepanjang 299 bp (tidak
terpotong oleh enzim Hpy8I). Genotipe AG
digambarkan dengan pita DNA sepanjang
299, 200 dan 99 bp (terpotong sebagian oleh
enzim Hpy8I). Sedangkan Genotipe GG
digambarkan dengan pita DNA sepanjang
200 dan 99 bp (terpotong sempurna oleh
Berdasarkan
deteksi
enzim Hpy8I).
polymorfisme gen Mx menggunakan enzim
retriksi Hpy 81 pada gambar di atas
diperoleh informasi dari 6 sampel ayam
Tolaki, terdapat 4 sampel dengan tipe alel
AA (67% gen Mx++) dan terdapat 2 sampel
dengan tipe alel AG (33% gen Mx+-), tidak
terdapat alel GG (0% gen Mx--). Sementara
pada 6 sampel ayam Kampung terdapat 3
sampel dengan tipe alel AA (50 % gen Mx+), 2 sampel dengan tipe alel AG (33% gen
Mx--) dan terdapat 1 alel GG (17 % gen
Mx++). Hasil ini bermakna bahwa kedua
ayam lokal tersebut memiliki daya tahan
terhadap penyakit viral cukup tinggi,
dimana ayam Tolaki relatif sedikit lebih
tinggi daya tahannya dibandingkan ayam
Kampung. Adapun nilai frekuensi alel gen
Mx ayam Tolaki disajikan pada tabel 3
berikut ini.
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128
122
Tabel 3. Frekuensi Alel Gen Mx Ayam Tolaki
Jumlah Ayam (ekor)
Genotipe
Mx++
Mx+Ayam Tolaki ( 6)
4
2
Ayam Kampung (6)
3
2
Total = 12
7
4
Berdasarkan Tabel 3, diperoleh
informasi sampel ayam Tolaki mempunyai
frekuensi alel A pada gen Mx lebih tinggi
yakni 0,83 dibandingkan frekuensi alel G
yakni hanya 0,17. Sementara pada ayam
Kampung frekuensi alel A pada gen Mx
yakni 0,67 dan frekuensi alel G 0,33. Hasil
ini menunjukkan frekuensi Alel A pada
ayam Tolaki relatif sedikit lebih tinggi
daripada ayam Kampung. Namun secara
keseluruhan dari kedua sampel ayam lokal
tersebut diperoleh frekuensi alel A yang
cukup tinggi yakni 0,75 dan frekuensi alel G
yang rendah yakni 0,25.
Hasil ini sejalan dengan hasil analisis
A/G SNP gen Mx dari populasi ayam lokal
Indonesia yang telah dilakukan oleh
Sulandari, dkk (2007) diperoleh frekuensi
alel A yang resisten terhadap AI berkisar
0,35 – 0,89.
Hal ini menunjukkan
ketahanan ayam lokal Indonesia terhadap
serangan virus AI cukup tinggi. Sartika, dkk
(2011) juga melakukan identifikasi gen
penciri resistensi genetik terhadap flu
burung pada 110 ayam sentul diperoleh
hasil alel gen Mx+ 55% dan alel gen Mx- 45
%. Selanjutnya seleksi terhadap ayam lokal
di Indonesia dari 200 induk ayam dan 40
ayam jantan diperoleh frekuensi alel resisten
Mx++ 65% pada induk dan 60% pada ayam
jantan, sementara frekuensi alel yang rentan
virus Mx- yakni 35% pada induk dan 40%
pada jantan.
Daya tahan terhadap penyakit viral ini
ditemukan pada exon 13 nukleotida nomor
1892, yakni adanya mutasi basa transisi
(single mutation), dimana mutasi pada
pasangan basa GC menjadi AT, sehingga
menyebabkan perubahan asam amino serin
(AGT)
menjadi
asparagin
(AAT).
Terdapatnya asam amino asparagin (A)
pada nukleotida nomor 1892 exon 13
menjadi indikator ayam tersebut tahan
terhadap infeksi virus, yang dikelompokkan
sebagai gen Mx+, dan sebaliknya bila yang
terjadi adalah mutasi basa menjadi asam
Mx-0
1
1
Frekuensi Alel
F(A/ Mx+)
F(G/ Mx-)
0,83
0,17
0,67
0,33
0,75
0,25
amino serin (G), maka ayam rentan terhadap
serangan virus, dikelompokkan sebagai gen
Mx-.(Watanabe 2003; Ko et al., 2004). Gen
Mx ini dapat digunakan sebagai marker
guna mendeteksi daya tahan ayam terhadap
penyakit viral seperti Avian Influenza dan
Newcastle Disease, hal ini dikarenakan gen
Mx merupakan native antiviral yang spesifik
pada ayam, sehingga gen Mx ini dapat
digunakan sebagai penciri dalam seleksi
molekuler (Sartika, 2011).
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat
diambil beberapa kesimpulan sebagai
berikut :
1. Ayam lokal di Sulawesi Tenggara yakni
ayam Tolaki dan ayam Kampung
terbukti memiliki Gen Mx yang
bertanggungjawab terhadap serangan
virus Flu Burung (Avian Influenza)
ataupun serangan virus tetelo (Newcastle
Disease), dengan ukuran sebesar 299 bp.
2. Ayam Tolaki dan ayam Kampung
memiliki gen Mx dengan derajad
polimorfisme yang sangat tinggi yang
terdiri dari alel AA, AG dan GG. Ayam
Tolaki memiliki frekuensi alel A sedikit
lebih tinggi (0,83) dari ayam kampung
(0,67).
3. Secara keseluruhan dari total 12 sampel
ayam lokal diSulawesi Tenggara
memiliki frekuensi alel A atau f(A)
sangat tinggi dengan frekuensi alel A
sebesar 0,75 dan frekuensi alel G sebesar
0,25.
DAFTAR PUSTAKA
Dalgaard TS, Hojsgaard S, Skodt K,
Madsen JHR. 2003. Differences in
chickens MHC class I alpha gene
expression
between
Marek’s
disease-resistant and susceptible
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128
123
MHC haplotypes. Scand.
Immunology.57(2);135-43.
Kerjasama
Dinas
Pertanian
Konawe selatan dan STIPER
Kendari.
J
Ko, J.H., H.K. Jin, A.Asano, A.Takada,
A.Ninomiya,
H.Kida,
H.Hokiyama,
M.Ohara,
M.Tsuzuki,
M.Nishibori,
M.Mizutani and T.Watanabe.
2002. Polymorphisms and the
differential antiviral activity of the
Genome
chciken Mx gene.
Research 12 (4):595-601.
Maeda, 2005. Polymorphism of Mx Gene in
Asian
Indigenous
chicken
population.
Makalah
dipresentasekan pada Seminar
Nasional Tentang Unggas Lokal
III. Universitas Diponegoro.25
Agustus 2005.
Mansjoer SS. 2003. Potensi ayam buras di
Indonesia. Makalah semiloka
pengkajian
pengembangan
produksi bibit ayam Buras dan
Itik, Cisarua Bogor, Tanggal 11 12 Desember 2003.
Nafiu, LD, Aku, AS, Saili, T, Taufik Y dan
Rusdin, M. 2009. Pelestarian dan
Pengembangan Ayamn Tolaki
sebagai Plasma Nutfah Asli
Sulawei
Tenggara.
Laporan
Penelitian. Lembaga Penelitian
Unhalu. Kendari
Nataamidjaja A.G. dan K. Diwyanto, 1994.
Konservasi Ayam Buras Langka.
Proceeding,
Koleksi
dan
Karakterisasi
Plasma
Nutfah
Pertanian, Bogor.
Otim MO. 2005. Newcastle Disease in
village poultry:Molecular and
phylogenetic studies of the virus
and
disease
epidemiology.[disertasi].
Copenhagen (DK) : The Royal
Veterinary
and
Agricultural
University.
Pagala M.A dan Aku, 2012. Optimalisasi
Potensi Genetik Ayam Tolaki
dalam Upaya Pelestarian Plasma
Nutfah Ayam Lokal di Sulawesi
Tenggara.
Laporan Penelitian.
Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis.
1989. Molecular Cloning. A
Laboratory Manual 2nd ed. Cold
Spring Harbor Laboratory Press.
Sartika, T., Sulandari, S.,and, M.S.A Zein.
Selection of Mx gene genotype as
genetic
marker
for
Avian
Influenza resistance in Indonesian
native chicken. BMC Proceedings
2011, 5(Suppl 4):S37.
Sarwono, B. 2005. Ayam Aduan. Penebar
Swadaya. Jakarta. Hal 16-18
Seyama, T., J.H. Ko, M.Ohe, N.Sasaoka, A
Okada,
H.Gomi,
A.Yoneda,
J.Ueda, M.Nishibori, S.Okamoto,
Y.Maeda and T.Watanabe. 2006.
Population Research of genetic
polymorphism at amino acid
position 631 in chciken Mx
protein with differential antiviral
activity. Biochem.Genet. 44:432443.
Sironi,
L.,
Ramelli.P.,
Williams,
JL.,Mariani, P., 2010. PCR-RFLP
Genotyping Protocol for Chicken
Mx Gene G/A Polymorphism
associated with the S631N
Mutation. Genetics and Molecular
Research 9(2):1104-1108.
Sulandari, S.,M.S.A. Zein, D. Astuti And
T.Sartika.
2007.
Unblocking
Indonesian Indigenous Chicken
Genome to explore genetic
resistance to avian influenza virus
infection. Laporan Akhir, Program
Insentif KNRT 2007.
Watanabe, T. 2003. Genomic analysis of
antiviral resistant Mx gene in the
chicken. Lab. Animal Breeding
and Reproduction, Hokkaido
University.
Sapporo, Japan.
International workshop on Animal
Genome Analysis, KKR 2003
Nop 6; Sapporo (JP) : Hotel
Tokyo.
AGRIPLUS, Volume 23 Nomor : 02 Mei 2013, ISSN 0854-0128