Hup_ensis !,in/oensls - Jurnal Kesehatan Badan Penelitian dan

furnal Vektor Penyakit, Vol. VII No.
1, 2013 :'J,6 - 22
Optimasi Teknik Isolasi DI\IA dan RAPD - PCR pada Keong
oncomelania hup ensis lindo ensls sebagai Hospes perantara
.Schistos omiasis di Sulawesi Tengah
(Optimization Techniqwes und Isolation DNA RAPD - PCR Oncomelania
Hup_ensis !,in/oensls Snail As Intermediate Host of Schistosomiasis
in Central Sulawesi)
Gunawan*
Balai Litbang P2B2 Donggala, Badan Litbang Kesehatan, Kementerian Kesehatan, RI
INFO ARTIKEL
Keywords :
Schistosomiasis
DNA,
O.h.lindoinsis,
RAPD-PCR
Kata kunci :
Schistosomiasis,
DNA,
O.h.lindoensis,
RAPD-PCR
ABSTRACT/ABSTRAK
ln Indonesia schistosomiasis is
caused by Schistosoma japonicum with O.h.lindoensis
snails as an intermediate host. For that we need to do research on the level of DNA
polymorphism o.h.lindoensis snails. one method used is the technique of Random
Amplified Polymerasechain Reaction (RAPD-?1R). Thereforeweneeda propermethod of
DNAextraction aswellasin determining the optimumreaction canditionsfor MpD-pcR.
This study aimed to be obtained of o.h.lindoensis DNA from in the highlands of central
sulawesi in Bada, Napu and Lindu and to optimize condition ofpcR-RApD. To be obtained
o.h.lindaensis DNA using with protocols or operating procedures pureLink Genomic DNA
Mini Kits TM. The extraction of DNA yieled good qualitlt of DNA. while amplification of
DNA using PCR-MPD will become efficient and consistent if the amplification reactions
are in ideal condition. In o.h.lindoensis, clear pcR-RApD patterns were obtained using
70ng DNA template, 2 5 pmol primer and the number ofthermal cyclewas 40 x
Di Indonesia schistosomiasis disebabkan oleh cacing Schistosoma japonicum dengan
hospes perantara keong oncomelania hupensis lindoensis, untuk itu perlu dilakukan
penelitian tentang tingkat polimorfisme DNA keong Oncomelania hupensis lindoensis
karena penelitian ini belum pernah dilakukan di Indonesia. salah satu metode yang
digunakan adalah teknik Random Amplified polymerase chain Reaction (MpD-pcRJ-.
oleh karena itu diperlukan metode yang tepat dalam ekstraksi DNA serta dalam
menentukan kondisi optimum reaksi MPD-pCR.
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan DNA o.h lindoensis yang berasal dari
daerah endemis schistosomiasrs di sulawesi rengah (Bada, Napu dan Lindu) serta
menentukan kondisi optimum untuk reaksi RApD-pcR untuk mendapatkan DNA
digunakan metode ekstraksi DNA dari PureLink Genomic DNA Mini Kits IM. Ekstraksi
DNA menghasilkan DNA dengan kualitas baik. sedangkan untuk amplifikasi DNA
menggunakan teknik MPD-PCR diperoleh dengan kondisi komponen reaksi yang
ideal. Pada sampel o.h.lindoensis, pola pita-pita DNA dengan teknik MpD-pcR yang
jelas dapat diperoleh dengan menggunakan 10 ng DNA, 25 pmol MpD primer serta
jumlah siklus termal 40x.
@ 2013 furnal Vektor Penyakit. All rights reseryed
*Alamat Korespondensi : email : [email protected]
16
Optimasi Teknik Isolasi DNA dan RAPD
-
PCR
pada
............
[GunawanJ
PENDAHULUAN
tidak diketahui latar belakang genomnya*.
Schistosomiasls di Indonesia pertama kali
ditemukan oleh Muller dan Tesch pada tahun
untuk menguji tingkat polimorfisme
1935 yang disebabkan oleh cacing
Schistosoma japonicum dengan keong
perantara Oncomelania. Keong pertama kali
ditemukan di daerah persawahan Paku, danau
Lindu pada tahun 1972 oleh Carney dkh. dan
diidentifikasi sebagai A.h.lindoensrs'''. Keong
ini bersifat amfibious, dimana keong tersebut
menyukai tempat yang bece[ lembab dan
beraif,, akan tetapi keong ini akan mati apabila
terendam air'''''.
Dewasa ini perkembangan ilmu
pengetahuan sangat pesat, diantaranya
adalah perkembangan ilmu biologi molekuler.
Polymerase Chain Reaction [PCR), merupakan
Metode RAPD PCR banyak dimanfaatkan
DNA.
Sedangkan penelitian tentang variasi genetik
keong O.h.lindoensls sebagai keong perantara
di Indonesia belum pernah
dilakukan dengan menggunakan metode
RAPD-PCR. Tujuan dari tulisan ini adalah
untuk menentukan optimasi teknik isolasi
schistosomiasis
DNA terlebih dahulu dan untuk mendapatkan
hasil amplifikasi MPD-PCR yang jelas dan
baik.
BAHAN DAN METODE
EkstraksiDNA
Mullis tahun 1985 yang efektif untuk
Sampel O.h.lindoensls dikoleksi dari
Dataran Tinggi Bada, Napu dan Lindu
(Sulawesi TengahJ pada bulan April 2011.
perbanyakan DNA secara in vitroa. Teknik ini
memungkinkan dihasilkannya berjuta-juta
telah terbebas dari serkaria. Sebelum
Beberapa marka molekuleryang berbasis PCR
dilakukan isolasi DNA keong telah dipelihara
dalam skala laboratorium selama 90 hari.
suatu teknik yang dikembangkan oleh Kathy
copy dari suatu fragmen DNA tertentu.
salah satunya adalah Random Amplified
Polymorphic DNA IRAPD) yang dikembangkan
pertama kali oleh Williams et al. [1990) dan
banyak dimanfaatkan untuk menguji tingkat
polimorfisme DNAs.
Teknik RAPD-PCR menggunakan primer
acak atau arbitrary primer yang berantai
pendek dengan oligonukleida yang
panjangnya hanya IA-LZ basa yang digunakan
mengamplifikasi fragmen DNA secara acak
tanpa harus mengetahui terlebih dulu urutan
nukleotida atau DNA target yang spesifik.
Perbedaan urutan DNA di antara individu-
individu pada daerah pengikatan primer
oligonukleotida menyebabkan terjadinya
perbedaan-perbedaan [polimorfisme) pada
pola larik yang dihasilkan dari proses
amplifikasi'. Dasar analisis RAPD adalah
menggunakan mesin PCR yang mampu
mengamplifikasi sekuen DNA secara in vitro.
Penggunaan penanda RAPD relatif sederhana
dan mudah dalam hal preparasi. Teknik RAPD
memberikan hasil yang lebih cepat
dibandingkan dengan teknik molekuler
lainnya. Teknik ini juga mampu menghasilkan
jumlah karakter yang relatif tidak terbatas
sehingga sangat membantu untuk keperluan
analisis keanekaragaman organisme yang
Sampel keongyang dipakai adalah keongyang
Ekstraksi DNA dilakukan dengan
menggunakan prosedur kerja dari PureLink"
Genomic DNA Mini Klfs dari invitrogen yang
dimodifikasiu. Caranya yaitu sampel keong
sebanyak 50-60 mg ditimbang kemudian
dipotong kecil-kecil, kemudian dimasukkan
ke dalam mikrotube 2 ml dan ditambahkan
180 pl PureLink'M Genomic Digestion Buffir
dan 20 pl Proteinase K. Sampel kemudian
diinkubasi selama 1-4 jam pada suhu 55eC.
Apabila sampel belum lisis sempurna maka di
inkubasi semalam pada suhu 55
eC.
Selanjutnya larutan tersebut disentrifuse
dengan kecepatan maksimum selama 3 menit
pada suhu ruangan. Kemudian larutan
ditambah 20 pl Rnase A dan campur dengan
divortex. Ditambahkan 200 pl PurelinkTM
Genomic Lysis/Binding Buffer dan campur
dengan di vortex. Kemudian larutan ditambah
200 pl 96-100 %o ethanol dan campur dengan
divortex.
Untuk mencuci DNA larutan diambil
kembali sebanyak ! 640 pl dan dipindahkan
ke dalam PureLink" Spin Column. Setelah itu
coloumn disentrifuse 10.000 rpm selama 1
menit dan coloumn dibuang kemudian diganti
dengan coloumn yangbaru. Larutan ditambah
500 pl Wash Buffer 1, kemudian disentrifuse
L7
furnal Vektor Penyakit, Vol. VII No. 1, 2013 :16 - 22
lagi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1
menit dan coloumn dibuang kemudian diganti
dengan coloumn yang baru. Larutan ditambah
500 pl Wash Buffer 2, kemudian disentrifuse
lagi dengan kecepatan maksimum selama 3
menit dan coloumn dibuang kemudian diganti
dengan coloumn yang baru, Larutan
ditambahkan 25-200 1tl PureLink" Genomic
Elution- Buffer. Diinkubasi selama 1 menit
dengan suhu ruangan. Setelah itu colournn
disentrifugasi lagi dengan kecepatan
maksimum selama 1 menit. Sampel DNA hasil
isolasi kemudian disimpan pada suhu
4eC
untuk dilakukan penguj ian selanj utnyau.
Penentuan Kuantifikasi DNA
Kuantifikasi DNA dilakukan dengan
menggunakan spektrofotometer. Caranya
yaitu spektrofotometer dihidupkan
dan
sebelum digunakan dilakukan set reference
dengan menggunakan 100 pl HPLC. Untuk set
reference absorbansi, ratio dan konsentrasi
DNA harus bernilai 0,00 jika nilai masingmasing parameter lebih dari 0,00 set
reference diulang sampai sampel HPLC
tersebut bernilai 0,00 [untuk mempermudah
set reference, kuvet terlebih dahulu
dibersihkan). Kemudian sampel DNA
sebanyak 2 pl dan 98 pl HPLC dimasukkan
kedalam kuvet lalu dimasukkan kedalam
primer yang digunakan. Pada penelitian ini
volume standar yang digunakan untuk satu
reaksi adalah 25 ytl. Langkah selanjutnya tB
buah mikrotube yang telah berisi AmpliTaq
TM DNA Polymerase dan stoffel fragmen
disiapkan dan ditandai dengan nama primer
serta tanggal dilakukan PCR. Larutan DNA
sebanyah 4 pl dimasukkan ke dalam setiap
mikrotube tersebut, Urutan sampel yang
dimasukkan pada setiap sumur diatur
berdasarkan urutan sampel. Setelah itu,
microtube divortex agar larutan tercampur
lalu disentrifugasi. Mikrotube siap
dimasukkan kedalam termal cycler'.
Amplifikasi DNA dilakukan dengan
menggunakan GeneAmp PCR system 9600
(Perkin Elmer). Reaksi PCR memerlukan tiga
siklus. Program siklus termal adalah : aktivasi
awal pada 95'C selama 15 menit diikuti
dengan 40 siklus yang terdiri dari 1 menit
pada 94"C, 1 menit pada 36'C dan 2 menit
pada72'C. Selanjutnya diikuti dengan 1 siklus
pemanjangan final pada 72"C selama 10
menit. Pada penelitian ini dilakukan optimasi
untuk mendapatkan pita-pita DNA yang jelas
dengan konsentrasi DNA yang berbeda beda
yaitu 5 ng, 10 ng dan 25 ng. Sedangkan untuk
jumlah siklus termal nya juga dilakukan
dengan modifikasi 3 5 x, 40 x, dan 45 x n.
spektrofotometer. Nilai atau parameter yang
terbaca oleh spektrofotometer adalah
HASIT
konsentrasi DNA, rasio DNA, absorbansi dan
protein. Pembacaan menggunakan panjang
sinar 260 nm7.
Untuk hasil spektrofotometer sampel
keong dari tiga lokasi dapat dilihat dalam
RAPD-PCR
Analisis RAPD-PCR dilakukan dengan
menggunakan produk dari Ready-To-Go RA?D
Analysis Kit GE Healthcare Limited, Amersham
Little Chalfont, Buckinghamshire.
Komponen dari kit ini adalah terdiri dari
Tabel 1.
Konsentrasi DNA keong O.h.lindoensis
ID Absorbansi Rasio Konsentrasi Protein
A.3
A4
A5
Place
Ready-To-Go RAPD Analysis Beads (buffea
dATe dCTE dGTe dTTE BSA, AmpliTaq,, and
Stoffel fragmen), kontrol E. Coli BLZ! [DE3J
DNA" kontrol E. Coli [C1a) DNA dan RApD
Primer Set. Langkah pertama dihitung
kebutuhan bahan kimia reaksi yang
digunakan pada reaksi RAPD PCR. Jumlah
bahan disesuaikan dengan jumlah sampel dan
1B
0,022 1,95L
0,010 4,076
0,016 7,775
30,6
29,3
0,0
0,0
2a,4
0,1
Dari hasil spektrofotometer didapatkan
konsentrasi DNA untuk sampel keong
O,h,lindoensls dari dataran tinggi Napu [ffij
adalah 30,6 ng, dataran tinggi Bada (A4) 29,3
ng dan untuk dataran tinggi Lindu (A5) 28,4
ng.
Primer yang dipakai dalam penelitian ini
adalah primer yang terdapat dalam kit RAPD
(dapat dilihat pada Tabel 2).
Optimasi Teknik Isolasi DNA dan RAPD
Tabel 2. Primer yang digunakan dan
Nama
Primer
Primer 1
RA PD Primer 2
RA PD Primer 3
RA PD Primer 4
RA PD Primer 5
_84 PD Primer 6
Urutan basa [5'-3'l
Is'-d [GGTGCGGGAAI -3',i
[5',-d IGTTTCGCTCC]
[s'-d IGTAGACCCGT]
(5',-d [AAGAGCCCGT]
[s'-d [AACGCGCAAC]
PCR
pada
............
(Gunawan)
Fengaruh perbedaan konsentrasi
urutan basa primer
RA PD
-
-3',J
komponen dan perbedaan siklus termal pada
PCR-RAPD O.h.lindoensfs dan kondisi optimal
untuk protokol PCR-RAPD ditampilkan pada
Gambar 1 sampai Gambar4.
-3',)
-3',)
-3',)
[s'-dlcccGTCAGCAl
3',J
1400
600
500
400
300
200
100
Gambar l-. Pola -pola RAPD PCR menggunakan konsentrasi DNA S ,g DNA,
25 pmol RAPD Primer serta jumiah siklus termal 35 x Primer 7,2, dan 3.
C : Kontrol, M : Market 43 : 0.h.lindoensis dari Dataran Tinggi Napu, 44 :
O.h.lindoensrs dari Dataran Tinggi Bada dan
A5:O.h.lindoensis dari Dataran Tinggi Lindu.
Untuk kebutuhan bahan kimia reaksr yang
digunakan pada reaksi RAPD PCR jumlah
bahan disesuaikan dengan jumlah sampel dan
primeryang digunakan [Tabel 3).
Tabel 3. Komposisi untuk RAPD PCR
No
1,
)
3
Nama Bahan
25 pmol RAPD Primer
5-50 ng DNA
Destilled Water IHrOJ
Total Voh"rme
Pada gambar 1 dapat
dilihat bahwa pola
pola RAPD PCR dengan menggunakan
konsentrasi DNA 5 ng DNA, 25 pmol RAPD
Primer serta jumlah siklus termal 35 x
memberikan gambaran band - band DNAyang
teramplifikasi masih kurang j elas.
1 x Reaksi
5 pl
6,6 pl
1-3,4 ptl
25
prl
79
Jurnal Vektor Penyakit, Vol. VII No. 1, 2013 :75 - 22
1400
600
500.
400
300
200
100
C:
RAPD Primer serta jumlah siklus termal40 x dengan Primer 4, 5, dan 6.
Kontrol, M : Marker; A3:0.h.lindoensls dari Dataran Tinggi Napu, A4: O.h.Iindoensis
dari Dataran Tinggi Bada dan A5: O.h.lindoensis dari Dataran Tinggi Lindu.
Sedangkan pada gambar 2 dapat dilihat 40xmemberikan gambaran band -band DNA
bahwa pola pola RAPD PCR dengan yang teramplifikasi masih kurang jelas dan
menggunakan konsentrasi DNA 5 ng DNA" 25 terlihatbandbandDNAmasihbertumpuk.
pmol RAPD Primer serta jumlah siklus termal
1400
600
500
400
300
200
100
Gambar 3. Pola pola RAPD PCR menggunakan konsentrasi DNA 10 ng DNA, 25 pmol
RAPD Primer serta jumlah siklus termal 35 x Primer \,2, dan 3. c : Kontrol, M : Marker,
A3: O.h.lindoensis dari Dataran Tinggi Napu, A4: O.h.lindoensis dari Dataran Tinggi Bada
dan A5 : O.h.lindoensrs dari Dataran Tinggi Lindu.
20
Optimasi Teknik Isolasi DNA dan RAPD
Pada gambar 3 dapat dilihat bahwa pola
pola RAPD PCR dengan menggunakan
konsentrasi DNA 10 ng DNA, 25 pmol RAPD
Primer serta jumlah siklus termal 35
-
PCR
pada
..,....,....
(GunawanJ
rneml:erikan gambaran band - band DNAyang
teramplifikasi masih kurang jelas dan band band DNA belum optimum teramplifikasi.
x
600
500
400
300
Gambar 4. Pola pola RAPD PCR menggunakan konsentrasi DNA 10 ng DNA, 25 pmol
RAPD Primer serta jumlah siklus termai 40 x Prirner 4, 5 dan 6. C : Kontrol, M : Marker;
A3 : A.h.lindoensis dari Dataran Tinggi Napu, 44 : O.h.lindoensis dari
Dataran Tinggi Bada dan A5 : O.h.lindoensis dari Dataran Tinggi Lindu.
Untuk gambar 4 dapat dilihat bahwa pola
pola RAPD PCR dengan menggunakan
konsentrasi DNA 10 ng DNA, 25 pmol RAPD
Primer serta jumlah siklus termal 40 x
memberikan gambaran band - band DNAyang
teramplifikasi terlihat j elas.
PEMBAHASAN
Dalam penelitian ini sampel keong O. h.
lindoensis yang digunakan berasal dari tiga
daerah endemis schistosomiasls di Sulawesi
Tengah yaitu dari Dataran Tinggi Napu, Bada
dan Lindu [Sulawesi Tengah).
Pada penelitian ini didapatkan pola pitapita hasil RAPD yang sangat dipengaruhi oleh
komponen PCR meliputi konsentrasi DNA
cetakan, primer serta dipengaruhi oleh
jumlah siklus termal. Tingkat sensitifitas hasil
PCR-RAPD bervariasi terhadap perubahan
yang diakibatkan perbedaan konsentrasi tiap
komponen. Untuk isolasi DNA Keong
O.h.lindoensis dilakukan sesuai dengan
protokol atau prosedur kerja PurelinkTM
Genomic DNA Mini Kits. Sampel DNA hasil
isolasi kemudian disimpan pada suhu 4eC
untuk dilakukan pengujian selanjutnya. Pada
penelitian ini konsentrasi DNA yang dipakai
adalah 5 ng dan 10 ng. Pada konsentrasi DNA
rendah [5 ng] terdapat band DNA yang tidak
teramplifikasi, Hal ini kemungkinan
disebabkan kualitas DNA yang kurang baik.
DNA yang pemurniannya tidak sempurna
kemungkinan masih mengandung
poiisakarida, senyawa fenolik atau
kontaminan lainnya. Sedangkan pada
konsentrasi DNA 10 ng terdapat band DNA
yang teramplifikasi dapat terlihat jelas.
Beberapa penelitian lain konsentrasi DNA 10
ng menunjukkan hasil pola-pola DNA yang
dihasilkan relaiif konstan. Contohnya pada
penelitian yang diiakukan oleh Vernon
Jennifer G., dkk [1995) dengan konsentrasi
DNA 10 ng menunjukkan pola pola DNA yang
jelas pada Biamphalaria Glabrata (Pulmonata
: Basommatophora).
Selain konsentrasi DNA, hal lain yang
27
furnal Vektor PenyakiL Vol. VII No. 1, 2013 :1.6 - 22
mempengaruhi produk RAPD adalah siklus
termal yang digunakan pada proses PCR.
|umlah siklus dapat mengubah band DNA
produk RAPD. Pada penelitian ini reaksi PCR
dilakukan tiga siklus. Sedangkan pada
penelitian ini untuk jumlah siklus termal nya
juga dilakukan dengan modifikasi 35 x, 40 x,
dan 45 x. Hal ini dilakukan dengan tujuan
untuk mencari optimasi jumlah siklus termal
yang dapat memberikan gambaran band
produk RAPD PCR dengan jelas. Pada
penelitian ini jumlah siklus termalnya yang
terpilih adalah 40 x hal ini dilakukan karena
tergantung pada primer yang digunakan dan
dipilih sebagai jumlah siklus optimal untuk
meminimalkan amplifikasi produk RAPD yang
tidak spesifik. Dengan menggunakan kondisi
PCR 10 ng DNA,25 pmol prime4 serta jumlah
siklus termal 40 x diperoleh amplifikasi
fragmen DNA yang optimum dan konsisten.
Menurut penelitian yang dilakukan oleh
Osama dan Vernon Jennifer G untuk proses
RAPD PCR jumlah siklus termal yang optimal
adalah 45 x, hal ini dapat diperoleh amplifikasi
DNA yang jelas dan konsisten. Jadi jumlah
siklus termal dalam reaksi RAPD PCR sangat
mempengaruhi hasil produk RAPD PCR.
KESIMPULIIN
kepada Kepala Dinas Kesehatan
Kabupaten Poso dan kepada Kepala Dinas
Kesehatan Kabupaten Sigi serta kepada ibu
Dewi Kartikawati Paramita, S.Si, M.Si, Ph.D
dari Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
atas saran-saran dalam ekstraksi DNA dan
SKM, M.Si,
RAPD-PCR,
DAFTARPUSTAKA
1.
Riset Bidang Entomologi dan Moluska. Badan
Litbang Kesehatan. f akarta
2.
3.
menggunakan konsentrasi DNA 10
4.
Perlu modifikasi jumlah siklus termal
konsentrasi DNA agar gambaran band DNA
terlihatjelas.
UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis berterimakasih kepada Kepala
Balai Litbang PZBZ Donggala Bapak fastal,
22
use by individuals and
Barlet, J, M, S and Stirling D.1993. Methods in
Molecular Biology, vol. 226 | PCR Protocols,
Second Editian. Humana Press Inc., Totowa, Nf.
5.
Campbell, N.A. 1996. Biology, Fourth Edition,
NewYork: Benjamin Cummings, pp 600 - 601
h t t p: / / s c i e n c
northern.ed
u
e
/biology / genbio/images/trema
toda.html [4 November
2
004]
6.
Anonim. 2007. User Manual : PureLink'*
Genomic DNA Mini Kits for Purification Of
7.
Mostafa, O.M.S., and Shadia M. El-
Genomic DNA. Invitrogen, pp 8-9.
Daf
trg,
agar waktu dapat dipersingkat dan
for
communities. World Health Organization.
Geneva, pp33B - 356.
rawy.201.7.
Susp
ectibilty of
Biomphalariaspp. To infection with
Schistosoma mansoni in sympatric qnd
konsentrasi primer 25 pmol dan jumlah siklus
termal 40x. Kondisi ini menghasilkan band
dengan intensitas yang baik serta pola-pola
band RAPD yang konsisten.
SARAN
Sudomo, M.2000.Sclrrstosomiasis control in
Indonesia. Majalah Parasitologi Indonesia
13(1-2):1-10.
)an A. Rozendaal.1997. Vector Cantrol :
Methods
Pada sampel O.h.lindoensis kondisi
optimum untuk RAPD PCR adalah
Sudomo, M. Penyakit Pqrasitik yang Kurang
Diperhatikan. Orasi Pengukuhan Profesor
allopatric combinations with observqtions on
the generic variability between snails. l.
8.
Veterinary Parasitology.l 80. pp 226-231.
Vernon, I G., Jones Catherine S. and Noble R.
Leslie.1995. Random Amplified Polymorphic
DNA (RAPD) Markers Reveal CrossFertilisation In Biomphalaria Glabrata
(Pulmonata: Basommatophora). l. Moll. Stud.
61,pp455-465.