METODE PENELITIAN Desain, Tempat dan Waktu

METODE PENELITIAN
Desain, Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian quasi eksperimental dengan prepost test with control design (Bhisma 2003), karena analisis dilakukan sebelum
dan setelah intervensi. Lokasi penelitian yaitu lingkungan Institut Pertanian
Bogor. Analisis kadar MDA plasma dilakukan di Laboratorium Biokimia
Departemen Gizi Masyarakat Institut Pertanian Bogor (IPB). Penelitian dilakukan
dari bulan Mei hingga September 2011. Penelitian ini telah direview oleh tim
Komisi
Etik
Penelitian
dikeluarkannya
Kedokteran
Ethical
dan
Approval
Kesehatan
atau
Indonesia
ethical
clearance
dengan
No.
KE.01.07/EC/418/2011 yang diterbitkan di Jakarta pada tanggal 5 Juli 2011
(Lampiran 1).
Jumlah dan Cara Pengambilan Sampel
Populasi dalam penelitian ini adalah mahasiswi Alih Jenis Institut
Pertanian Bogor. Teknik pemilihan dan pengambilan sampel dilakukan dengan
metode purposive sampling. Semua sampel, baik perlakuan maupun kontrol
harus memenuhi persyaratan inklusi maupun eksklusi yang ditetapkan.
Syarat inklusi yang harus dipenuhi oleh sampel adalah:
1. Memiliki rentang umur 16-29 tahun.
2. Belum pernah mendapatkan intervensi suplementasi serupa dalam waktu
yang berdekatan, serta
3. Bersedia mengisi informed concent dan berpartisipasi dalam penelitian.
4. IMT tidak lebih dari 25 kg/m2.
Syarat ekslusi yang harus dipenuhi oleh sampel adalah:
1. Hamil atau menyusui.
2. Merokok.
3. Menderita suatu penyakit yang mengharuskannya cek rutin, serta
4. Pindah atau berada di luar lokasi dalam jangka waktu lama, sehingga
tidak dapat mengikuti perlakuan.
Jumlah
sampel
ditetapkan
dengan
(Supranto 2000):
(t-1) (r-1) ≥ 15
23
menggunakan
rumus
berikut
Keterangan:
t = banyaknya kelompok
r = jumlah replikasi per kelompok
Berdasarkan rumus tersebut, dengan jumlah 4 kelompok (t=4), maka
jumlah sampel minimal setiap kelompok (r) yang diperlukan dalam penelitian ini
adalah 6 orang. Dengan demikian jumlah sampel secara keseluruhan adalah 24
orang.
Metode Intervensi
Kelompok perlakuan dibagi menjadi 4, dengan masing-masing kelompok
terdiri dari enam sampel. Kelompok perlakuan tersebut adalah :
1. Kelompok yang diberi vitamin C dosis 500 mg.
2. Kelompok yang diberi vitamin E dengan dosis 200IU (setara 133 mg).
3. Kelompok yang diberi multivitamin-mineral, yaitu vitamin C 500 mg,
vitamin E 30 mg, Seng 15 mg, Tembaga 1,5 mg, serta
4. Kelompok kontrol (tidak mendapatkan suplemen).
Dosis diberikan 8 kali dari AKG, untuk vitamin C kebutuhan wanita
dewasa adalah 60 mg/orang/hari. Untuk perlakuan diberikan 8 kali AKG yaitu 500
mg. Sedangkan untuk vitamin E kebutuhan wanita dewasa adalah 15 mg/orang
/hari, untuk perlakuan diberikan 8 kali AKG yaitu 200 IU, dikonversi dalam mg
yaitu menjadi 133mg. Multivitamin-mineral yang digunakan adalah multivitamin
dengan komposisi tiap kaplet yaitu vitamin B1 15 mg, vitamin B2 15 mg, vitamin
B3 50 mg, vitamin B5 20 mg, vitamin B6 20 mg, vitamin B12 12 mcg, biotin 45 mcg,
asam folat 400 mcg, vitamin C 500 mg, vitamin D 200 IU, vitamin E 30 mg, seng
15 mg, tembaga 1,5 mg dan calcium 100 mg.
Tolerable Upper Intake Levels (ULs) atau angka tertinggi dari nilai zat gizi
yang bila dikonsumsi tiap hati tidak membahayakan kesehatan untuk dewasa ≥
19 tahun menurut food and nutrition Board-institute of Medicine (FNB-IOM)
(2004) adalah 2000 mg/hari (WNPG 2004).
Tolerable Upper Intake Levels (ULs) atau angka tertinggi dari nilai zat gizi
yang bila dikonsumsi tiap hari tidak membahayakan kesehatan untuk dewasa
≥19 tahun menurut food and nutrition Board and Institute of medicine (IOM)
(2000) adalah 1000 mg/hari, yang di dapatkan dari suplemen. Vitamin C, vitamin
E dan multivitamin mineral diberikan secara oral.
Jenis dan Cara Pengambilan Data
Data yang digunakan dalam penelitian ini adalah data primer yang terdiri
dari data karakteristik, data konsumsi dan data kadar MDA plasma.
a.
Data Identitas
Data karekteristik keluarga sampel meliputi pendidikan dan pekerjaan.
Menurut Depkes 2008 klasifikasi tingkat pendidikan menjadi 6 golongan yaitu
tidak pernah sekolah, tidak tamat SD, tamat SMP, tamat SMA dan tamat
perguruan tinggi. Sedangkan pekerjaan diklasifikasikan menjadi swasta, PNS,
wiraswasta, petani dan Ibu Rumah Tangga.
Data karakteristik sampel meliputi nama, umur, departemen dan riwayat
penyakit dilakukan dengan wawancara. Data berat badan, tinggi badan dilakukan
dengan penimbangan dan pengukuran, lalu dihitung Indeks Massa Tubuh (IMT)
didapatkan dari hasil perhitungan:
IMT=
Berat badan (kg)
[tinggi badan (cm)]2
b.
Data Konsumsi
Data konsumsi didapatkan dari food record selama perlakuan (7 hari)
pada sampel dengan menggunakan form food record dengan mencatat jenis
dan jumlah bahan makanan yang dikonsumsi setiap hari selama 24 jam,
sedangkan untuk mengetahui data frekuensi konsumsi makanan sumber
antioksidan selama 1 minggu terakhir sampel digunakan food frequency. Form
food record dan food frequency dapat dilihat pada lampiran 4 dan lampiran 3.
c.
Data Ketaatan Mengonsumsi Suplemen
Sampel harus mengonsumsi suplemen selama satu minggu berturut-
turut. Ketaatan sampel dalam mengonsumsi suplemen diamati dengan mengisi
form kepatuhan.
d.
Data Kadar Malondialdehid (MDA) Plasma
Data pengukuran radikal bebas didapatkan dengan menentukan kadar
lemak peroksida dengan menggunakan metode MDA (Malondialdehid), dilakukan
sebelum dan setelah 7 hari intervensi dengan duplo.
 Prinsip
Penetapan MDA dengan metode uji asam tiobarbiturat (TBA) dapat
diukur secara spektrofotometrik berdasarkan prinsip bahwa asam lemak
tidak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi
peroksida
lipid
yang
kemudian
mengalami
dekomposisi
menjadi
malondialdehid (MDA). MDA bila direaksikan dengan asam tiobarbituburat
(thiobarbiriuric acid, TBA), akan membentuk senyawa berwarna merah muda
yang menyerap cahaya pada panjang gelombang 532 nm. Jumlah MDA
yang terbentuk dapat menggambarkan proses peroksidasi lipid (Soewoto et
al 2001).
 Bahan dan Alat
Bahan yang dibutuhkan untuk analisis:
Bahan analisis adalah
Plasma yang diperoleh dari darah vena yang diambil dari vena
mediana cubiti sebanyak 5 ml dan pemisahan dengan cara pemusingan
menggunakan sentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit.
Reagen yang digunakan adalah
a. Larutan asam trikloroasetat (TCA) 20 % ( 20 gram TCA dilarutkan dalam
100 ml Aquades bebas ion)
b. Larutan asam tiobarbiturat (TBA) 0,67% (0,67 gram TBA dilarutkan
dalam 100 ml Asam asetat)
c. Larutan standar tetraetoksipropan
d. Aquades bebas ion
Alat yang digunakan dalam penelitian:
Alat untuk pengambilan darah adalah
a. Spuit
b. Jarum suntik ukuran G23
c. Kapas
d. Alkohol
e. Tabung EDTA 5 ml
Alat untuk analisis radikal bebas dengan analisis lemak peroksida (MDA)
adalah
a. Tabung reaksi ukuran 5 ml
b. Labu ukur
c. Gelas piala
d. Pipet mikro
e. Sentrifuge
f.
Vorteks
g. Penangas air
h. Spektrofotometer
 Prosedur Pengambilan Darah
Darah diambil dari vena cubiti dengan menggunakan spuit ukuran 5
ml dengan menggunakan jarum G 23. Darah dimasukkan ke dalam tabung
EDTA agar darah tidak membeku dan ditempatkan dalam cool box sebelum
disentrifuge. Darah disentrifugasi pada kecepatan
3000 rpm selama 15
menit. Cairan plasma darah yang telah terpisah dari bagian padat darah
segera dipindahkan ke tabung fial kosong, untuk selanjutnya dianalisis MDA.
 Prosedur Analisis MDA Plasma
Plasma diambil sebanyak 1 ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi
dan ditambahkan 1 ml TCA 20% dingin, kemudian divorteks dan disentifuge
dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatant diambil,
dimasukkan ke dalam tabung reaksi lain yang sudah berisi 2 ml TBA 0,67%,
kemudian dimasukkan ke dalam penangas air dengan suhu 95-1000C
selama 10 menit. Setelah itu tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan
dalam bejana berisi air es. Hasil reaksi diambil sebanyak 1 ml dimasukkan
dalam kuvet dan dibaca serapannya pada pajang gelombang 532 nm
(Marhaen 2004). Prosedur analisis kadar MDA plasma dapat dilihat pada
Gambar 5, untuk alur penelitian dapat dilihat pada Gambar 6.
Prosedur analisis MDA Plasma
1 ml plasma sampel
Tambahkan Larutan TCA 20%, dingin sebanyak 1 ml
Divorteks
Disentrifuge selama 10 menit (3000 rpm)
Mengendap
Ambil supernatan 1 ml
Tambahkan larutan TBA 0,67% sebanyak 2 ml
Divorteks
Masukkan ke penangas mendidih selama ± 15 menit
Dinginkan
Baca serapan pada panjang gelombang 532 nm
Gambar 5 Diagram alir analisis kadar MDA plasma
Merah muda
Alur Penelitian
Populasi
Mahasiswi alih jenis IPB yang masih aktif
Kriteria eksklusi
Kriteria Inklusi
Contoh yang memenuhi kriteria
Penetapan jumlah sampel
berdasrakan rumus (t-1) (r-1) ≥ 15
Total sampel 24 orang
Kelompok
Kontrol
(6 orang)
Tidak diberi
intervensi
suplemen
antioksidan
Kelompok
Intervensi
Vitamin C
(6 orang)
Diberi Vit C
dosis 500 mg
Kelompok
Intervensi
Vitamin E
(6 orang)
Diberi Vit E
dosis 200 Iu
atau setara 133
mg
Analisis MDA plasma sebelum
intervensi
Intervensi selama 7 hari
Analisis MDA plasma setelah
intervensi
Gambar 6 Diagram Alir Penelitian
Kelompok
Intervensi
Multivitaminmineral
(6 orang)
Diberi multivitaminmineral yg mgd :
- vitamin C 500mg
- vitamin E 35 mg,
- Zn 15 mg dan
- Cu 1,5 mg
Pengolahan Data
Data-data yang dikumpulkan selama penelitian ini disajikan dalam bentuk
tabel dan kemudian dianalisis secara deskriptif dan inferensial. Data yang
dianalisis secara deskriptif meliputi data karakteristik sampel, data record
kebiasaan makan, data food frequency dan Indeks Massa Tubuh (IMT).
Konsumsi
Data konsumsi pangan sumber antioksidan dikumpulkan dengan metode
food frequency kemudian diolah untuk mendapatkan data frekuensi konsumsi
pangan berapa kali per minggu. Data konsumsi pangan sehari sampel selama 7
hari didapatkan dengan metode food record. Data konsumsi pagan tersebut
kemudian diolah dan dikonversi menggunakan nutri-survey menjadi data asupan
energi dan zat gizi protein, vitamin A, vitamin C, vitamin E, kalsium, seng dan
tembaga.
Data asupan energi tersebut kemudian dibandingkan dengan AKG untuk
mendapatkan nilai tingkat kecukupan energi dan zat gizi, dengan menggunakan
rumus tingkat kecukupan zat gizi di bawah ini :
TKG = (K/AKGi) x 100%
Keterangan :
TKG
: Tk. kecukupan zat gizi
K
: Konsumsi zat gizi
AKGi : Angka kecukupan zat gizi sampel yang dicari
Menurut Supariasa 2002, Kategori tingkat kecukupan untuk Energi dan
vitamin di bagi menjadi empat kategori yaitu defisit <70%; kurang 70-80%;
sedang 80-99% dan baik ≥ 100%. Menurut Gibson (2005) tingkat kecukupan
vitamin dan mineral dibagi menjadi dua kategori yaitu kurang ≤77% dan cukup
>77%.
Status Gizi
Status gizi sampel dihitung dengan menghitung Indeks massa tubuh
menggunakan indikator berat badan dan tinggi badan. Status gizi sampel
dikategorikan menjadi 3 seperti terlihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Kategori indeks massa tubuh menurut Depkes (1999)
Kategori
Kekurangan BB Tingkat Berat
Kekurangan BB Tingkat Ringan
Normal
Kelebihan BB Tingkat Ringan
Kelebihan BB Tingkat Berat
Kurus
Normal
Gemuk
IMT
< 17,0 kg/m2
17,0-18,5 kg/m2
>18,5-25,0 kg/m2
>25,0-27,0 kg/m2
>27,0 kg/m2
Sumber : Depkes (1994) dalam Supariasa et al (2002)
Penetapan MDA
Data kadar MDA plasma sampel diukur sebelum dan setelah 7 hari
intervensi, kemudian dihitung perubahan kadar MDA plasma yaitu selisih antara
kadar MDA sebelum dan setelah 7 hari intervensi.
Penetapan MDA dengan metode uji asam tiobarbiturat (TBA) diukur
dengan spektrofotometer panjang gelombang 532 nm. Hasilnya dihitung dengan
rumus Kadar MDA, membandingkan absorbansi dengan kurva standar memakai
tetraetoksipropan, menggunakan persamaan Y = aX + b.
Keterangan
:
fp  Faktor Pengenceran
Penetapan Standar MDA
Mengukur MDA sebagai produk peroksidasi lipid, dalam penelitian ini
digunakan tetraetoksipropan (TEP) sebagai prekursor dari MDA, karena MDA
merupakan senyawa yang tidak stabil. TEP dihidrolisis oleh air menjadi MDA dan
alkohol. Prosedur Penetapan standar tersaji lengkap pada Lampiran 6.
Pengenceran larutan tetraetoksipropan (TEP) adalah sebanyak 10000x,
dengan konsentrasi 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, dan 0.5, yang direaksikan dengan TBA,
diperoleh absorbansi secara berurutan 0, 0.198, 0.396, 0.573, 0.770 dan 0.953
nmol/mL (Lampiran 6). Persamaan kurva standar yang didapat yaitu Y=0.001x +
0.006 dengan R2=0,999, di mana y=absorbansi dan x=konsentrasi MDA
(nmol/mL). Kurva standar dapat dilihat pada gambar 7.
A532
Kurva Standar TEP
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
200
400
600
nmol/ml
data asli
Linear (data asli)
Gambar 7 Kurva standar tetraetoksipropan (TEP)
Analisis Data
Data yang telah terkumpul diolah dan dianalisis secara deskriptif dan
inferensial menggunakan Microsoft Excel 2007 dan program SPSS versi 16.0 for
Windows. Untuk menganalisis perbedaan sebelum dan setelah intervensi pada
setiap kelompok perlakuan dilakukan uji T. Sedangkan untuk melihat perbedaan
perubahan kadar MDA plasma (antara setelah dan sebelum intervensi) antar
kelompok perlakuan dilakukan uji beda ANOVA. Jika terdapat indikasi perbedaan
yang signifikan, maka dilanjutkan dengan uji Beda Duncan dan Least Significant
Different (LSD) untuk mengetahui kelompok mana yang sesungguhnya berbeda.