Amplifikasi PCR Kromosom Y Dari Beberapa Suku di Papua

III. Bahan dan Metode
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan selama 3 bulan dari
bulan Mei-Juli 2011 yang dilakukan di LPPT UGM
Yogyakarta.
B. Bahan Penelitian
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah
DNA dari darah manusia yang diperoleh dari tujuh orang
mahasiswa yang telah bersedia di ambil darahnya. Tujuh
orang Mahasiswa ini, asli berasal dari suku mereka
masing-masing,
suku-suku
yang
diambil
merupakan
perwakilan tujuh besar suku-suku yang di ada Papua.
Mereka
yang
bersedia
diambil
darahnya
adalah
mahasiswa yang berasal dari Papua yang sedang kuliah di
Salatiga.
Sampel-sampel DNA ini diberi kode dengan
angka 1-7, yang dapat dilihat pada table 1.
13
Tabel 1. Keterangan sampel dan asal suku
Kode sampel
Keterangan suku
1
Ayamaru (Kabupaten Sorong)
2
Danny (Kabupaten Jaya Wijaya)
3
Yally (Kabupaten Jaya Wijaya)
4
Mapi (Kabupaten Merauke)
5
Paniai (Kabupaten Nabire)
6
Yapen (Kabupaten Yapen/Serui)
7
Biak (Kabupaten Biak)
Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah: larutan
buffer, proteinase K, larutan SDS 10%,
NaCl, ethanol,
TE, dan akuades.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain
PCR dan alat Elektroforesis.
C. Metode
1. Isolasi DNA dari darah
Sebelum melakukan isolasi DNA, terlebih dahulu
diambil sampel DNA yang berasal dari darah.
Diambil darah sebanyak 5 ml yang berasal dari
pembuluh vena dari masing-masing mahasiswa.
Setelah proses pengambilan darah baru dilakukan
metode isolasi DNA dengan cara diambil 1,5 ml
darah ditambahkan EDTA dan 6 ml larutan buffer
EL kemudian dihomogenkan dengan diinkubasi
pada suhu 40°C selama 30 menit. Setelah itu
14
disentrifuge
dengan
kecepatan
3000
rpm,
supernatan dibuang dan pellet ditambahkan dengan
5 ml buffer SE 1x divortex kemudian di sentrifuge
lagi. Pellet yang diperoleh ditambahkan dengan 2 ml
buffer EL 1x, 40 µl proteinase K dan 200 µl SDS
10% dan diinkubasi pada suhu 37⁰C semalam.
Tambahkan 1 ml NaCl 6 mM, kemudian disentrifuge
lagi, supernatan diambil dan dicuci dengan 8 ml
ethanol absolute (96%) dingin, campur perlahanlahan akan terbentuk benang-benang DNA diambil
dan ducuci dengan 2 ml ethanol 70%, kemudian
disentrifuge
lagi
buang
supernatan
dan
pellet
dikeringkan dari sisa alkohol, tambahkan TE 1x dan
disimpan dalam frezzer pada suhu 4°C.
2. Analisis dan Penentuan Kadar Konsentrasi DNA
DNA hasil isolasi, diambil 20 µl dan di spektro.
Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 260 280 nm dengan alat spektrofotometer UV-VIS.
3. Elektroforesis
Untuk melakukan elektroforesis terlebih dahulu
dibuat gel agarose dengan konsentrasi 2%. Pembuatan
gel agarose 2% dilakukan dengan melarutkan 0,5 gr
agarose dalam 25 ml larutan dapar Tris-Boric acid (TBE)
1x lalu dipanaskan sampai homogen (jernih) dan
ditambahkan dengan 2 µl larutan etidium bromide (EB).
15
Larutan gel dituang dalam cetakan dengan sisir
cetakan yang dipasang dengan posisi tegak hingga
melewati sisir. Gel dibiarkan beberapa saat sampai
mengeras. Setelah itu gel direndam dalam larutan
buffer TBE 0,5x. Gel kemudian dielektroforesis dengan
voltase sebesar 100v selama ± 60 menit.
Ambil 5 µl
DNA dari hasil isolasi, tambahkan 2 µl loading buffer,
masukkan
sampel
dielektroforesis
dalam
(running)
slab
pada
gel
tegangan
kemudian
100
volt
selama 1 jam.
4. Identifikasi dengan Reaksi Berantai Polimerase
(PCR)
Untuk identifikasi selanjutnya dilakukan dengan
metode PCR, metode ini dilakukan dua kali dengan
suhu dan link yang berbeda yang berbeda. Sampel 1-3
pada suhu 55°C dengan link 33 dan sampel 4-7 pada
suhu 50°C dengan link 47.
untuk sampel 1-3 pada suhu 55°C, diprogram pada
link 33 yang terdiri dari proses denaturasi pada 95°C
selama 5 menit, kemudian 35 siklus (annealing pada
55°C selama 1 menit, extension pada 72°C selama 1
menit dan denaturasi kembali pada 95°C selama 5
menit) dan 72°C selama 5 menit. Sedangkan untuk
sampel 4-7 pada suhu 50°C diprogram pada link 47
yang terdiri dari proses denaturasi pada suhu 95°C
selama 5 menit, kemudian 35 suklus (annealing pada
16
50°C selama 1 menit, extension pada 72°C selama 1
menit dan denaturasi kembali pada suhu 95°C selama
1 menit) dan 72°C selama 5 menit. Primer yang
digunakan
untuk
PCR
adalah
primer
M9
(5'-
GCAGCATATAAAACTTTCAGG-3') (Kayser et al, 2000).
Campuran
bahan-bahan
yang
digunakan
yaitu
H2O.RNAse (20 µl), primer M9 (2 µl), DNA template
pengenceran 50x (sesuai konsentrasi masing-masing
sampel) sehingga total volume 25 µl. Bahan-bahan
tersebut dicampur dalam tabung PCR 0,2 ml.
Visualisasi
produk
PCR
ini
dilakukan
melalui
elektoforesis dengan cara memasukkan 7,5 µl produk
PCR yang ditambahkan dengan 2 µl loading buffer
(buffer warna) ke dalam sumur gel agarose 2%. Setelah
proses elektroforesis, pita hasil PCR dapat dilihat
dengan alat UV transluminator.
17