TESIS DETEKSI SIMULTAN CMV DAN ChiVMV PENYEBAB
advertisement
TESIS DETEKSI SIMULTAN CMV DAN ChiVMV PENYEBAB PENYAKIT MOSAIK PADA TANAMAN CABAI RAWIT (CAPSICUM FRUTESCENS L.) DENGAN DUPLEX RT-PCR diawasi dandidukung dengan I GEDE AGUS ADI CHANDRA PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2014 TESIS DETEKSI SIMULTAN CMV DAN ChiVMV PENYEBAB PENYAKIT MOSAIK PADA TANAMAN CABAI RAWIT (CAPSICUM FRUTESCENS L.) DENGAN DUPLEX RT-PCR diawasi dandidukung dengan I GEDE AGUS ADI CHANDRA NIM 1290861010 PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2014 i DETEKSI SIMULTAN CMV DAN ChiVMV PENYEBAB PENYAKIT MOSAIK PADA TANAMAN CABAI RAWIT (CAPSICUM FRUTESCENS L.) DENGAN DUPLEX RT-PCR Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister Pada Program Magister, Program Studi Bioteknologi Pertanian, Program Pascasarjana Universitas Udayana I GEDE AGUS ADI CHANDRA NIM 1290861010 PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2014 ii Lembar Persetujuan TESIS INI TELAH DISETUJUI PADA TANGGAL : 30 Juni 2014 Pembimbing I, Pembimbing II, Dr. Ir. I Dewa Nyoman Nyana, M.Si. NIP. 19540220 198503 1 001 Dr. G.N Alit Susanta Wirya, S.P., M.Agr NIP. 19860115 199403 1 001 Mengetahui Ketua Program Studi Bioteknologi Pertanian Program Pascasarjana Universitas Udayana Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P Prof. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp. S(K) NIP. 19621009 198803 1 002 NIP. 19590215 198510 2 001 iii PENETAPAN PANITIA PENGUJI Tesis ini Telah Diuji Pada Tanggal 30 Juni 2014 Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana, No.1993 /UN14.4/ HK/2014, Tanggal 30 Juni 2014 Ketua : Dr. Ir. I Dewa Nyoman Nyana, M.Si. Anggota : 1. Dr. G.N Alit Susanta Wirya, S.P., M.Agr 2. Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, M.S. 3. Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P. 4. I Putu Sudiarta, S.P., M.Si., Ph.D. iv SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT Saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama : I Gede Agus Adi Chandra NIM : 1290861010 Program Studi : Bioteknologi Pertanian Judul Tesis : Deteksi Simultan CMV dan ChiVMV Penyebab Penyakit Mosaik pada Tanaman Cabai Rawit (Capsicum frutescens L.) dengan Duplex RT-PCR. Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah tesis ini bebas plagiat. Apabila dikemudian hari terbukti plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sangsi sesuai peraturan Mendiknas RI No. 17 Tahun 2010 dan Peraturan Perundang-undangan yang berlaku. Denpasar, 30 Juni 2014 Yang membuat pernyataan (I Gede Agus Adi Chandra) v UCAPAN TERIMA KASIH Pertama-tama perkenankanlah penulis memanjatkan puji syukur ke hadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa, karena hanya atas asung wara nugrahaNya, tesis ini dapat diselesaikan. Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir. I Dewa Nyoman Nyana, M.Si selaku Pembimbing I, pembimbing akademik yang dengan penuh perhatian dan kesabaran telah memberikan bimbingan dan saran kepada penulis; Dr. G.N Alit Susanta Wirya, S.P., M.Agr selaku Pembimbing II yang dengan penuh perhatian dan kesabaran memberikan dorongan, semangat, bimbingan, saran dan pengarahan kepada penulis selama penyusunan tesis ini. Ucapan yang sama juga ditujukan kepada Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, SpPD., KEMD, Ibu Direktur Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp. S(K) dan Ketua Program Studi Bioteknologi Pertanian Program Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program Magister pada Program Pascasarjana Universitas Udayana serta seluruh staf dosen dan staf administrasi yang telah banyak membantu penulis selama menempuh pendidikan. Pada kesempatan ini penulis juga mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, M.S selaku ketua Laboratorium Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian Universitas Udayana atas kesempatan untuk belajar dan kemudahan dalam penggunaan fasilitas Laboratorium Penyakit Tumbuhan vi Fakultas Pertanian Universitas Udayana, selama penulis melakukan penelitian, serta penulis juga mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarmya kepada Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc selaku Dosen Institut Pertanian Bogor atas kerjasama dan kesempatan untuk belajar dan kemudahan dalam penggunaan fasilitas laboratorium di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Institut Pertanian Bogor, selama penulis melakukan penelitian. Ucapan terima kasih penulis sampaikan pula kepada para penguji tesis Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, M.S. Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P. I Putu Sudiarta, S.P., M.Si., Ph.D yang telah dengan sabar memberikan masukan, saran dan koreksi sehingga tesis ini dapat terwujud menjadi lebih baik. Ucapan terima kasih yang tulus penulis sampaikan kepada kedua orang tua tercinta I Nyoman Suastika dan Ni Nyoman Sarini, adikku Ni Made Ayu Serli Mahardika, bersama seluruh keluarga yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu atas dukungan, semangat dan do’a selama penulis menyelesaikan pendidikan terutama penyusunan tesis ini. Akhirnya ucapan terima kasih penulis sampaikan juga kepada Ni Made Fitri Trisna Dewi atas perhatian dan motivasinya, temanteman Agronomi ’08 (NH): Agus Gin, Rian, Dewa, Wira, Bojes, Haris, Benita, Kayan Juna, Baron; teman-teman Biotek ’12: Ocha, Nita, Mika, Dika; temanteman virologi di Fakultas Pertanian Universitas Udayana: Raga, Tude, Gusde, Anom, Veni, Awa, Sukada, serta semua teman-teman yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu atas do’a, kerjasama dan loyalitasnya selama ini. Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa selalu melimpahkan rahmat-Nya kepada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini. vii Semoga tesis ini dapat memberikan sumbangan bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan bermanfaat bagi semua. Denpasar, 30 Juni 2014 Penulis viii ABSTRAK DETEKSI SIMULTAN CMV DAN ChiVMV PENYEBAB PENYAKIT MOSAIK PADA TANAMAN CABAI RAWIT (CAPSICUM FRUTESCENS L.) DENGAN DUPLEX RT-PCR Mendeteksi keberadaan virus penyebab gejala mosaik oleh CMV dan ChiVMV yang menginfeksi tanaman cabai rawit secara bersamaan sulit dilakukan. Perlu dilakukan suatu penelitian yang bertujuan untuk dapat menteteksi keberadaan asosiasi dari kedua virus yang menyebabkan gejala mosaik oleh infeksi single atau double dan mempermudah proses deteksi yang selama ini perlu proses yang panjang dan mahal. Metode yang digunakan adalah metode Duplex RT-PCR dengan harapan dapat mendeteksi dua virus sekaligus yang menyebabkan penyakit mosaik Berdasarkan dari hasil penelitian menunjukkan bahwa metode Duplex RTPCR dapat mendeteksi infeksi ganda dari CMV dan ChiVMV pada tanaman cabai dan merupakan metode yang lebih efektif untuk mendeteksi dua virus sekaligus dalam sekali reaksi PCR. Kata kunci: Cabai rawit, CMV, ChiVMV, Duplex RT-PCR . ix ABSTRACT SIMULTANT DETECTION CMV AND ChiVMV CAUSES MOSAIC DISEASE IN CHILI PEPPER (CAPSICUM FRUTESCENS L.) WITH DUPLEX RT-PCR Detect the presence virus causes mosaic symptoms by CMV and ChiVMV infecting chili pepper plants at the same time was conducted. There needs a study that aims to detect the associations of both viruses causes mosaic symptoms by single or double infection and simplify the detection process which is necessary for a long and expensive process. The used method is a duplex RT-PCR in hopes of simultaneously detecting two viruses causes mosaic disease. Based on the results of the study showed that the duplex RT-PCR method can detect double infection of CMV and ChiVMV on chili plants and this method more effective to detect two viruses simultaneously in a single PCR reaction. Keywords: Chili pepper, CMV, ChiVMV, Duplex RT-PCR x RINGKASAN Kebutuhan cabai meningkat terus-menerus pada setiap tahun sejalan dengan meningkatnya jumlah penduduk dan berkembangnya industri yang membutuhkan bahan baku cabai. Rataan produksi cabai nasional baru mencapai 4,35 ton/ha, sementara potensi produksi cabai dapat mencapai lebih 10 ton/ha (DBPH, 2010). Kendala biologis yang diakibatkan oleh serangan patogen virus pada cabai masih merupakan penyebab utama kegagalan panen, maka usaha untuk mengatasi penyakit cabai akibat virus sangat perlu mendapat perhatian (Suryaningsih et al.,1996). Infeksi CMV sering menimbulkan gejala mosaik yang umumnya muncul pada pucuk tanaman dimana daun muda memperlihatkan perubahan warna belang hijau muda kekuningan diantara warna hijau normal atau hijau tua. Sedangkan tanaman cabai yang terinfeksi ChiVMV pada daunnya akan memperlihatkan gejala belang-belang hijau gelap, bercak-bercak hijau gelap, dan kadang-kadang pola-pola tersebut menyatu ke tulang daun didekatnya, leaf cupping, epinasti dan nekrosis (Ong, 1995; Sulyo et al., 1995). Untuk mendeteksi keberadaan CMV dan ChiVMV penyebab gejala mosik yang menginfeksi tanaman secara bersamaan sangat susah dan belum banyak penelitian yang mengungkap keberadaan asosiasi dari kedua virus ini. Tujuan dari penelitian ini adalah: Untuk dapat mendeteksi infeksi ganda dari CMV dan ChiVMV pada tanaman cabai dengan metode Duplex RT-PCR. Penelitian ini dimulai dengan survei yang dilakukan di kebun petani Desa Kerta, Payangan Gianyar, Bali untuk mengumpulkan sampel tanaman yang bergejala khas infeksi ganda CMV dan ChiVMV. Untuk verifikasi jenis virus maka dilakukan pengambilan sampel daun-daun pucuk dari tanaman-tanaman cabai yang menunjukkan gejala infeksi virus dan untuk dapat mendeteksi infeksi ganda oleh CMV dan ChiVMV yang menginfeksi tanaman cabai, dilakukan deteksi virus dengan metode Duplex RT-PCR, menggunakan primer khusus yang dapat mengamplifikasi virus secara terpisah dengan beberapa tahap yaitu, ekstraksi RNA total. sintesis cDNA. amplifikasi dan elektroforesis. xi DNA dengan PCR Hasil pengamatan di Desa Kerta, Payangan, Gianyar, Bali, tanaman cabai yang terinfeksi ChiVMV pada daun memperlihatkan gejala mosaik dan bentuk daun membulat pada ujungnya serta melengkung ke atas. Gejala yang terinfeksi CMV terlihat belang hijau tua dan hijau muda pada daun-daunnya, gejala ini disertai dengan perubahan bentuk daun (cekung, keriting atau memanjang). Gejala yang diamati dengan adanya infeksi ganda CMV dan ChiVMV. Hasil dari elektroferesis menunjukkan bahwa sampel yang diuji positif ditemukan adanya infeksi ganda ChiVMV dan CMV. Marker DNA (Promega,USA) yang digunakan dalam tahap RT-PCR ini berukuran 100 bp. Hal ini berdasarkan hasil elektroforesis dari hasil RT-PCR yang terlihat pada Gambar 5.2 dimana pita DNA ChiVMV dengan ukuran sekitar 900 bp sesuai dengan primer yang digunakan (Jan et al., 2000), dan CMV juga berhasil diamplifikasi dengan didapat pita DNA berukuran 657 bp sesuai dengan primer yang digunakan. Hasil pengamatan gejala di lapangan menunjukkan bahwa tanaman cabai yang terinfeksi ganda menunjukkan gejala yang lebih parah dibandingkan dengan tanaman cabai yang terinfeksi tunggal. Berdasarkan dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa metode Duplex RT-PCR dapat mendeteksi infeksi ganda dari CMV dan ChiVMV pada tanaman cabai dan merupakan metode yang tepat dan efektif untuk mendeteksi dua virus sekaligus dalam sekali reaksi PCR. Sehingga dapat disarankan dengan metode Duplex RT-PCR dapat diaplikasikan oleh lembaga karantina untuk mendeteksi infeksi dua virus yang menginfeksi tanaman dalam waktu yang cepat, dan mempermudah pengecekan bahan tanaman yang masuk maupun akan dikirim ke luar wilayah. xii DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM ..................................................................................... PERSYARATAN GELAR ......................................................................... LEMBAR PERSETUJUAN ...................................................................... PENETAPAN PANITIA PENGUJI ......................................................... SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT........................................... UCAPAN TERIMA KASIH ...................................................................... ABSTRAK ................................................................................................... ABSTRACT................................................................................................. RINGKASAN .............................................................................................. DAFTAR ISI ............................................................................................... DAFTAR GAMBAR .................................................................................. DAFTAR TABEL ...................................................................................... i ii iii iv v vi ix x xi xiii xv xvi BAB I. PENDAHULUAN .......................................................................... 1 1.1 Latar Belakang ............................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah .......................................................................... 4 1.3 Tujuan Penelitian ........................................................................... 4 1.4 Manfaat Penelitian ......................................................................... 4 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA .............................................................. 5 2.1 Karakteristik Tanaman Cabai Rawit (Capsicum frutescens L.)....... 5 2.2 Penyakit Virus pada Tanaman Cabai............................................... 7 2.3 CMV (Cucumber mosaik virus) ...................................................... 9 2.4 ChiVMV (Chilli Veinal Mottle Virus)............................................. 10 BAB III. KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS PENELITIAN ............................................................................. 14 3.1 Kerangka Berpikir............................................................................ 14 3.2 Konsep Penelitian ............................................................................ 16 3.3 Hipotesis .......................................................................................... 16 BAB IV METODE PENELITIAN ............................................................ 17 4.1 Tempat dan Waktu Penelitian.......................................................... 17 4.2 Bahan dan Alat................................................................................. 17 4.3 Pelaksanaan Penelitian..................................................................... 17 4.3.1 Survei pengambilan sampel di lapangan.......... ...................... 17 4.3.2 Deteksi Duplek CMV dan ChiVMV dengan RT-PCR........... 18 4.3.2.1 Ekstrasi RNA Total.............................................. 18 4.3.2.2 Sintesis cDNA...................................................... 20 4.3.3.3 Amplifikasi DNA dengan PCR............................ 20 4.3.4.4 Elektroforesis ....................................................... 22 xiii BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 23 5.1 Gejala Infeksi Ganda CMV dan ChiVMV pada Tanaman Cabai Rawit ................................................................................................. 23 5.2 Deteksi dengan RT-PCR................................................................... 26 BAB VI SIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 31 6.1 Simpulan........................................................................................... 31 6.1 Saran ................................................................................................. 31 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 32 xiv DAFTAR GAMBAR Halaman 3.1 Kerangka konsep penelitian ................................................................... 16 5.1 Tanaman cabai yang terinfeksi CMV dan ChiVMV ............................. 23 5.2 Hasil elektroforesis sampel tanaman cabai yang terinfeksi ganda CMV dan ChiVMV dengan menggunakan metode RT-PCR dan Duplex RT-PCR..................................................................................... 27 5.3 Gejala tanaman cabai yang terinfeksi virus ........................................... 28 xv DAFTAR TABEL Halaman 2.1 Nama primer yang mengamplifikasi gen coat protein masing-masing virus........................................................................... 21 xvi
