Aktivitas Enzim Selulase Isolat Asal Indonesia pada

1
PENDAHULUAN
Latar belakang
Enzim merupakan biokatalisator yang
mampu mempercepat reaksi biokimia yang
terjadi di dalam sel maupun di luar sel
(Poedjiadi 1994). Penggunaan enzim dalam
mendegradasi polimer di bidang industri
maupun pertanian telah banyak dilakukan
untuk efisiensi biaya produksi. Salah satu
enzim yang digunakan untuk mendegradasi
polimer karbohidrat adalah enzim selulase.
Enzim selulase sangat diandalkan dalam
degradasi bahan berserat selulosa dan
banyak digunakan pada industri detergent,
makanan ternak, tekstil, dan pabrik kertas
(Kirk 2002).
Sektor pertanian Indonesia yang terus
berkembang membutuhkan solusi dalam
penanganan limbah pertaniannya. Jerami,
tongkol jagung dan kulit pisang merupakan
limbah pertanian yang mengandung serat
terutama selulosa, yang penanganannya
masih dengan cara dibakar. Dengan bantuan
enzim selulase, limbah pertanian tersebut
dapat dimanfaatkan kembali sebagai pakan
ternak ataupun kompos.
Enzim selulase merupakan sistem enzim
yang terdiri atas endo-1,4-β-glukanase,
ekso-1,4-β-glukanase, dan β-D-glukosidase.
Endo-1,4-β-glukanase memotong ikatan
rantai dalam selulosa menghasilkan molekul
selulosa yang lebih pendek, ekso-1,4-βglukanase memotong ujung rantai selulosa
menghasilkan molekul selobiosa, sedangkan
β-D-glukosidase
memotong
molekul
selobiosa menjadi dua molekul glukosa
(Kim 1995). Setiap mikroorganisme
selulolitik memiliki komposisi enzim
selulase yang berbeda-beda, sehingga
penelitian mengenai kemampuan selulolitik
isolat baru perlu dilakukan.
Mikroorganisme
selulolitik
dari
kelompok
bakteri
memiliki
tingkat
pertumbuhan yang cepat sehingga waktu
yang dibutuhkan untuk produksi enzim
menjadi lebih pendek. Selain itu, tingkat
variasi genetik kelompok bakteri sangat
beragam sehingga memungkinkan dilakukan
rekayasa genetika untuk optimasi produksi
maupun aktivitas enzim selulasenya (Alam
et al 2004).
Penelitian ini menggunakan bakteri
selulolitik yang telah berhasil diisolasi
dalam penelitian pendahuluan. Isolat
tersebut mampu mendegradasi selulosa pada
suhu 50 ºC dan dalam media agar-agar CMC
Sigma
(Carboxymethyl
membentuk zona bening.
cellulose)
Tujuan
Tujuan penelitian ini adalah menguji
aktivitas enzim selulase dari empat isolat
bakteri selulolitik yang mampu tumbuh pada
suhu 50 °C dan dua isolat aktinomiset pada
substrat selulosa sintetik seperti CMC,
avicel dan kertas saring serta substrat limbah
pertanian berupa jerami padi, tongkol
jagung, dan kulit pisang.
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium
Mikrobiologi FMIPA IPB dan Laboratorium
Bioteknologi Hewan PPSHB PPM IPB pada
bulan Februari-Oktober 2007.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah bakteri
Gram positif isolat C11-1 berasal dari
pengomposan kulit pisang di Kec. Cikalong
Kulon, isolat C4-4, C5-1, C5-3 yang berasal
dari kompos pisang di Kec. Panyingkiran
dan aktinomiset isolat KBM-2 dan KBM-4
berasal dari tanah sawah di Kab. Kebumen
yang merupakan koleksi Dr. Anja
Meryandini.
Substrat yang digunakan
adalah CMC (Carboxymethyl cellulose) dari
Sigma, CMC Daisel, Avicel, kertas saring
Whatman no.1 berukuran 1 x 6 cm2, kulit
pisang (Kepok mentah), tongkol jagung dan
jerami padi. Pereaksi yang digunakan antara
lain DNS (Asam Dinitrosalisilat), 0.2 M
bufer fosfat pH 7, 0.2 M bufer sitrat pH 5
dan 3.5 dan 0.2 M tris HCl pH 8.
Alat yang digunakan adalah inkubator
bergoyang, vorteks, penangas, pH meter,
sentrifus, pipet mikro, spektrofotometer,
saringan berpori 65 mesh.
Metode Penelitian
Penelitian ini terdiri atas 2 tahap. Tahap
pertama adalah penetapan waktu optimum
aktivitas enzim selulase tiap isolat. Tahap
kedua adalah pengukuran aktivitas enzim
selulase pada berbagai substrat berdasarkan
data pada tahap pertama.
Penetapan Waktu Optimum Produksi
Enzim Selulase
Tahap pertama penelitian ini mengkaji
hubungan kurva pertumbuhan bakteri
2
dengan kurva aktivitas harian enzim
selulasenya.
Pembuatan Kurva Pertumbuhan.
Peremajaan isolat dilakukan pada media
agar miring CMC Sigma 1% (b/v) pada suhu
ruang hingga berumur 24 jam dan disimpan
pada refrigerator pada suhu 4 ºC. Masingmasing sebanyak satu lup isolat berumur 24
jam diinokulasikan ke dalam 100 ml media
cair CMC Sigma 1% (b/v) pada Erlenmeyer
500 ml yang juga mengandung glukosa
0.1% (b/v) dan ekstrak khamir 0.2% (b/v)
(Lampiran 1). Kultur diinkubasi pada
inkubator bergoyang dengan kecepatan 120
rpm pada 29 ºC. Setiap 24 jam densitas
kultur
sel
diukur
menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang
620 nm. Nilai absorbansi tersebut
dikorelasikan dengan kurva standar sel.
Penetapan kurva standar sel dilakukan pada
hari ke-2 atau ke-3 yaitu pada saat sel
mencapai fase eksponensial.
Aktivitas Harian Enzim Selulase.
Sebanyak 1 lup isolat C4-4, C11-1, C5-1,
C5-3 yang berumur 24 jam dan sebanyak 5
potong koloni isolat KBM-2 dan KBM-4
yang berdiameter 1 cm berumur 4 hari
masing-masing diinokulasi ke dalam media
cair CMC Sigma 1% (b/v) pada Erlenmeyer
500 ml. Enzim ektrak kasar didapatkan
dengan mensentrifugasi kultur sel pada 8400
g, suhu 4 °C selama 15 menit. Pengukuran
aktivitas enzim selulase dilakukan dengan
modifikasi metode Miller (1959) dengan
menggunakan enzim ekstrak kasar dan
glukosa sebagai standar pada konsentrasi
0.02 mg/ml – 0.2 mg/ml (Lampiran 2).
Aktivitas enzim selulase diuji terhadap
substrat CMC Sigma 1 % (b/v) yang
dilarutkan dalam bufer fosfat pH 7 pada
suhu 50 ºC selama 60 menit. Oleh karena
proses pengomposan dapat mencapai suhu
50 ºC maka aktivitas enzim selulase bakteri
selulolitik yang digunakan dalam penelitian
ini dilakukan pada suhu 50 ºC. Sampel
merupakan reaksi substrat dan enzim yang
diinkubasi pada suhu 50 ºC kemudian
dicampur dengan DNS, kontrol merupakan
campuran antara substrat dan enzim tanpa
diinkubasi pada suhu 50 ºC yang kemudian
dicampur
DNS,
blanko
merupakan
campuran antara substrat, DNS dan akuades.
Perhitungan aktivitas enzim selulase
dinyatakan dengan nkat/ml, yang diacu
berdasarkan Dybkaer (2001). Satu unit
aktivitas enzim selulase adalah jumlah
enzim yang dibutuhkan untuk melepas 1
µmol gula pereduksi per menit dan satu unit
aktivitas enzim setara dengan 16.67 nkat/ml.
Aktivitas enzim selulase dinyatakan dengan
rumus di bawah ini:
nkat/ml =
(Xs – Xk ) x 1000 x fp
x 16.67
BM glukosa x t
Keterangan :
: Kadar gula sampel (mg/ml)
Xs
: Kadar gula kontrol (mg/ml)
Xk
t
: Waktu inkubasi (menit)
fp
: Faktor pengenceran
Pengukuran aktivitas enzim selulase pada
berbagai substrat
Produksi Enzim Ekstrak Kasar. Isolat
ditumbuhkan terlebih dahulu pada media
cair CMC Sigma 1 % (b/v) di Erlenmeyer
500 ml pada suhu 29 ºC dan digoyang pada
120 rpm selama waktu optimum panennya
berdasarkan data pengamatan pada tahap
pertama. Setelah waktu yang ditetapkan,
kultur sel disentrifugasi pada 8400 g, suhu 4
°C selama 15 menit untuk memisahkan
biomassa. Supernatan merupakan enzim
ekstrak kasar.
Persiapan Substrat. Jerami padi,
tongkol jagung dan kulit pisang dikeringkan
terlebih dahulu pada suhu 70 °C dalam oven
selama 3 hari. Kemudian masing-masing
substrat dihaluskan menggunakan alat
blender dan diayak dengan saringan 65
mesh. Substrat disterilisasi untuk mencegah
kontaminasi.
Uji Aktivitas Enzim pada Berbagai
Substrat. Sebanyak 5 ml substrat CMC
Sigma, CMC Daisel dan avicel ditambahkan
5 ml enzim ekstrak kasar. Untuk substrat
Kertas saring, sebanyak 2.5 potong Kertas
saring 1 x 6 cm2 ditambahkan 2.5 ml bufer
dan 5 ml enzim ekstrak kasar. Sebanyak
0.05 g substrat jerami padi, tongkol jagung
dan kulit pisang ditambahkan 5 ml bufer dan
5 ml enzim ekstrak kasar. Reaksi antara
substrat dan enzim ekstrak kasar dilakukan
di dalam Erlenmeyer 100 ml selama 60
menit pada suhu optimum. Setelah itu reaksi
dihentikan dengan menambahkan 50 μl
NaOH 0.2 M atau dengan menginkubasinya
pada suhu 100 °C. Untuk substrat CMC
Sigma dan Daisel, campuran substrat-enzim
dipindahkan sebanyak 2 ml ke dalam tabung
reaksi kemudian ditambahkan 2 ml DNS dan
segera diinkubasi pada suhu 100 °C.
Sebanyak 1 lembar kertas saring 1 x 6 cm2
dan 3 ml larutannya (enzim ekstrak kasar
3
HASIL PENELITIAN
Hubungan antara kurva pertumbuhan
dan kurva aktivitas harian enzim selulase
Kurva pertumbuhan isolat C4-4, C11-1,
C5-1, C5-3 disajikan bersama dengan kurva
aktivitas harian enzim selulasenya pada
Gambar 1-4.
0.8
7.5
0.6
7.0
0.4
Log sel
Aktivitas selulase
8.0
6.5
0.2
0.0
6.0
0
1
2
3
4
5
6
Waktu (hari)
aktivitas selulase (nkat/ml)
kurva pertumbuhan (log sel)
Gambar 1 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian
enzim selulase isolat C4-4. Aktivitas enzim
selulase diuji terhadap substrat CMC
(Sigma) pada suhu 50 ºC, pH 7 (bufer
fosfat 0.2 M).
7.0
0.8
6.5
0.6
6.0
0.4
Log Sel
Aktivitas selulase
1.0
5.5
0.2
0.0
5.0
0
1
2
3
4
5
6
7
Waktu (hari)
aktivitas selulase (nkat/ml)
kurva pertumbuhan (log sel)
Gambar 2 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian
enzim selulase isolat C11-1. Aktivitas
enzim selulase diuji terhadap substrat
CMC (Sigma) pada suhu 50 ºC, pH 7
(bufer fosfat 0.2 M).
Puncak aktivitas dan waktu optimum
untuk produksi enzim selulase isolat C4-4
adalah hari ke-2 (Gambar 1), dan hari ke-3
untuk isolat C11-1 (Gambar 2).
1.0
7.0
0.8
6.8
0.6
6.6
0.4
6.4
0.2
6.2
0.0
Log sel
Tabel 1 Karakterisasi suhu dan pH optimum
aktivitas selulase pada substrat CMC Sigma
(Sari 2007)
Nama
Suhu
pH optimum
Isolat
optimum
C4-4
70 ºC
5.0 (bufer sitrat)
C5-3
80 ºC
5.0 (bufer sitrat)
C5-1
90 ºC
3.5 (bufer sitrat)
C11-1
70 ºC
8.0 (tris HCl)
KBM-2
50 ºC
7.0 (bufer fosfat)
KBM-4
50 ºC
7.0 (bufer fosfat)
1.0
Aktivitas selulase
dan bufer) dipindahkan ke dalam tabung
reaksi dan ditambahkan 2 ml DNS kemudian
segera diinkubasi pada suhu 100 °C. Setelah
inkubasi campuran substrat avicel, jerami
padi, tongkol jagung dan kulit pisang dengan
enzim selesai segera ditambahkan 50 μl
NaOH 0.2 M. Lalu suspensi tersebut
disentrifus pada kecepatan 2500 rpm selama
25 menit. Sebanyak 2 ml supernatannya
diambil dan ditambahkan 2 ml DNS lalu
diinkubasi pada suhu 100 °C. Seluruh
sampel diukur dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 540 nm. Perlakuan
pada substrat CMC Sigma dan Daisel,
avicel, kertas saring, dan substrat limbah
pertanian berbeda karena tidak semua
substrat tersebut larut dalam bufer.
Konsentrasi substrat tiap Erlenmeyer adalah
1% (b/v) kecuali avicel 2% (b/v). Suhu
inkubasi substrat-enzim serta pH larutan
bufer disesuaikan dengan jenis isolat yang
digunakan. Hal tersebut dapat diketahui dari
penelitian
sebelumnya
yang
telah
mengkarakterisasi suhu dan pH optimum
aktivitas enzim selulase setiap isolat
(Tabel 1). Uji aktivitas enzim selulase pada
berbagai substrat setiap isolat dilakukan
secara duplo dan dua ulangan dengan
menggunakan metode Miller (1959) yang
telah dimodifikasi (Lampiran 3).
6.0
0
1
2 3 4 5
6 7
Waktu (hari)
aktivitas selulase (nkat/ml)
kurva pertumbuhan (log sel)
Gambar 3 Kurva pertumbuhan dan aktivitas harian
enzim selulase isolat C5-1. Aktivitas enzim
selulase diuji terhadap substrat CMC
(Sigma) pada suhu 50 ºC, pH 7 (bufer
fosfat 0.2 M).