LAPORAN II

LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA LAPORAN II (ISOLASI DNA GENOM) KHAIRUL ANAM P051090031/BTK BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010 0 ISOLASI DAN IDENTIFIKASI DNA SEL MUKOSA TUJUAN Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui dan memahami prinsip dari sidik jari DNA. TINJAUAN PUSTAKA Sidik jari genetik merupakan salah satu contoh aplikasi untuk mengidentifikasi secara pasti terdakwa kasus kriminal atau uji paternitas. Hanya untuk kembar identik, teknik ini tidak dapat digunakan karena kembar identik memiliki gen yang identik. Dalam suatu kasus kriminal, sidik jari genetik menyediakan bukti tentang identitas tersangka yang diduga sebagai pelaku kejahatan. Informasi yang lebih tepat mengenai fitur orang‐orang tersebut (misalnya warna rambut atau bola mata, karakter, dll) tidak dapat diperoleh menggunakan teknik ini. Sejumlah kecil sampel DNA, misalnya noda darah pada gelas yang pecah, akar rambut atau air ludah dan sel‐sel yang terdapat pada sebatang rokok misalnya, sudah cukup untuk digunakan dalam pemeriksaan sidik jari genetik. Bagaimanakah sebetulnya sidikjari DNA ini dapat digunakan? Setiap manusia memiliki 46 kromosom, 23 dari ayahnya dan 23 dari ibunya. DNA kita yang utuh mengandung kira‐kira 3 milyar pasang basa, tetapi hanya sejumlah kecil yang dimanifestasikan atau sebagai cetak biru tubuh kita. Sisanya sebetulnya disebut sebagai DNA “pengisi” yang belum diketahui fungsinya. Di tempat inilah ada beberapa situs yang memberikan karakteristik bagi masing‐masing invidu karena masing‐masing memiliki panjang yang berbeda‐beda. Apabila kita mencermati situs ini, akan tampak suatu sidik jari genetik yang sangat akurat yang dapat dibuat karena adanya perbedaan‐perbedaan dalam panjang situs‐situs tersebut (Anonim, 2009). Pada praktikum kali ini kita hanya akan melihat satu situs dan panjangnya pada DNA kita. Situs ini disebut lokus D1S80. Lokus D1S80 ini terletak pada kromosom 1 dan terdiri atas urutan‐urutan DNA dengan ulangan (repeat) dan panjang yang sangat bervariasi untuk setiap orang. Contohnya : AGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTC (10x) atau AGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTC (6x) Ulangan yang bervariasi ini menyebabkan perbedaan dalam panjang situs pada masing‐masing orang. Ulangan‐ulangan dalam situs ini disebut lokus mikrosatelit. Urutan DNA disekitar lokus D1S80 ini telah diketahui dan identik pada semua orang, bersifat universal (Sambrook 1989). 1 BAHAN DAN METODE KERJA Bahan Bahan untuk isolasi DNA genom adalah sel mukosa, buffer lisis (SDS 2%, EDTA 10 mM), buffer presipitasi (kalium asetat 8 M), larutan isopropanol dan etanol 70%. Metode Isolasi DNA dari Sel Mukosa Sel mukosa diperoleh dengan cara masing‐masing praktikan diminta untuk berkumur‐kumur agak kuat agar sel mukosa pada langit‐langit mulut sedikit terlepas. Kemudian ambil 1,5 ml air kumur lalu disentrifugasi pada kecepatan 3200 rpm selam 2 menit. Setelah disentrifugasi, buang supernatan lalu ambil 1,5 ml air kumur dan disentrifugasi kembali dan buang supernatant. Pada pelet, ditambahkan 500 ul buffer lisis yang mengandung SDS 2%, EDTA 10 mM, kemudian dilakukan resuspensi. Pada tahap ini, diharapkan membran sel dapat lisis. Setelah diresuspensi, pada larutan ditambahkan 100 ul buffer presipitasi yang mengandung kalium asetat 8 M di dalam es. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit. Larutan supernatant diambil semaksimal mungkin (400 ul) lalu ditambahkan larutan isopropanol 1x (360 ul) lalu diinkubasi di dalam es selama 5‐10 menit. Kemudian larutan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit. Supernatan dibuang lalu pelet dibilas dengan menggunakan etanol 70% sebanyak 500 ul. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang kemudian pelet dikeringkan dengan vakum. Pelet adalah DNA mukosa. PCR D1S80 PCR dilakukan menggunakan primer D1S80 mix spesifik dengan kondisi PCR sebagai berikut, prePCR = 95°C, 5 menit; denaturasi = 95°C, 60 detik annealing = 63°C, 60 detik; extension = 72°C, 60 detik; post PCR = 68°C, 5 menit; penyimpanan = 15°C, 15 menit. Komposisi larutan PCR adalah DNA dalam ddH2O = 5 ul, primer D1S80 2 ul, dNTP mix = 5 ul, buffer taq 50x = 1 ul dan air UV sampai dengan 50 ul. Produk PCR akan diidentifikasi menggunakan elektroforesis dengan gel agarose 2% dan buffer TBE 1x. 2 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Pada foto gel elektroforesis tidak terbentuk pita dari sumur produk PCR seperti yang terlihat pada gambar 1. Gambar 1. Foto gel agarose hasil elektroforesis isolasi DNA Genom sel mukosa Pembahasan Sidik jari dna dimanfaatkan untuk mengidentifikasi personal, kasus paternitas, identifikasi pelaku tindak kejahatan dan pelacakan sumber biologis dengan memanfaatkan material biologis yang tertinggal baik banyak ataupun sedikit. Kelebihan dari sidik jari DNA ini adalah, sensitifitas dan spesifitasnya yang tinggi karena DNA unik dan spesifik, orang yang satu dengan orang yang lain akan berbeda kecuali bila kembar identik. Pilihan sampel yang luas karena sampel bisa diambil dari material biologis apa saja, baik itu sel mukosa, rambut, kulit, darah, air mani, meskipun hanya sedikit. Keuntungan lainnya adalah dapat digandakan melalui proses amplifikasi dengan PCR. Selain itu, material biologis yang cenderung stabil juga merupakan kelebihan tersendiri. 3 Pada praktikum kali ini, dicoba sel mukosa untuk mengidentifikasi personel dari tiap praktikan. Sayangnya dari hasil elektroforesis tidak terbentuk pita dari smur manapun. Hal ini bisa dikarenakan primer yang digunakan kurang baik dan berjumlah sangat sedikit sehingga tidak mampu mengamplifikasi gen target. Gambar 2. (contoh) Foto hasil elektroforesis produk PCR DNA disekitar lokus D1S80 (http://biology.clc.uc.edu/Fankhauser/Labs/Genetics/PCR/PCR_Protocol.htm) Kemungkinan yang dapat terjadi apabila praktikum berjalan dengan baik adalah seperti yang terlihat pada gambar 2. Pada gambar tersebut terlihat perbedaan jarak pita yang terbentuk dari masing‐
masing sampel. Perbedaan ini dapat menjadi ciri dari masing‐masing individu. Semakin banyak pita yang 4 terbentuk memiliki jarak yang sama, maka semakin dekat kekerabatan antara masing‐masing sampel atau begitupun sebaliknya. Sehingga sidik jari DNA selain dapat dimanfaatkan untuk mengidentifikasi individu juga dapat menentukan (perbedaan) spesies, penentuan sex dan pelacakan hubungan genetik. SIMPULAN 1. Pemeriksaan sidik jari DNA memungkinkan kasus inkonklusif jadi konklusif. 2. Pemeriksaan sidik jari DNA memungkinkan dilakukannya pemeriksaan terhadap bahan yang minim dan terdegradasi. 3. Pemeriksaan sidik jari DNA membuat beberapa pemeriksaan yang tidak dapat dilakukan menjadi dapat dilakukan. DAFTAR ACUAN Anonim. 2009. Laboratory Guide: Bridging University To High School: In Real Modern Biology. Department of Biology, University of Kassel Germany. Bogor, 16‐20th November Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory manual (2nd edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press http://biology.clc.uc.edu/Fankhauser/Labs/Genetics/PCR/PCR_Protocol.htm 5