Menghitung Mikroba Tidak Langsung

Laporan Praktikum
Mikrobiologi
Nama
NIM
Kelas/kelompok
PJP
Asisten
: Diana Agustini Raharja
: J3L112168
: C P1/1
: M. Arif Mulya, S. Pi.
: 1. Yuriska Sekar Rani
2. Lia Suliani
3. Ramdhani
KUANTITASI MIKROBA: METODE PENGHITUNGAN
TIDAK LANGSUNG
PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA
PROGAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Pendahuluan
Hal mendasar yang juga perlu diperhatikan dalam Mikrobiologi, yaitu
analisis kuantitatif terhadap suatu bahan. Analisis ini sangat penting untuk
mengetahui jumlah mikroorganisme yang ada pada suatu sampel tertentu
mengandung banyak mikroorganisme atau sebaliknya (Ferdiaz 1993).
Pengamatan bakteri dapat dilakukan secara individual maupun secara kelompok
dalam bentuk koloni. Bila bakteri yang ditumbuhkan di dalam medium yang tidak
cair, maka akan terjadi suatu kelompok yang dinamakan koloni. Bentuk koloni
berbeda-beda untuk setiap spesies dan bentuk tersebut merupakan ciri khas bagi
suatu spesies tertentu (Waluyo 2007).
Beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur
jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan. Cara tersebut dibedakan
atas beberapa kelompok yaitu, perhitungan jumlah sel, terdiri dari hitungan
mikroskopik, hitungan cawan, dan MPN (most probable number); perhitungan
massa sel secara langsung, terdiri dari volumetrik, gravimetrik, dan kekeruhan
(turbidimetri); perhitungan massa sel secara tidak langsung, terdiri dari analisis
komponen sel, analisis produk katabolisme, dan analisis konsumsi nutrien
(Ferdiaz 1993). Sedangkan menurut Irianto (2007), ada beberapa cara
penghitungan jumlah mikroba, yaitu cara penghitungan pada lempeng pembiakan,
cara menghitung langsung (metode kaca objek), metode ukur kekeruhan, metode
turbidimetri, nefelometri, serta dengan jumlah perkiraan terdekat (JPT). Cara
penghitungan pada lempeng pembiakan disebut juga metode penghitungan bakteri
hidup atau metode penghitungan koloni. Pada penghitungan koloni, dilakukan
penyimpanan pada suhu yang sesuai. Oleh karena itu, suatu bakteri dapat tumbuh
menjadi satu koloni yang terhitung mewakili jumlah bakteri hidup yang terdapat
dalam tiap volume pengenceran yang digunakan.
Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel mikroba yang
masih hidup pada metode agar, sehingga sel mikroba tersebut akan berkembang
biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa
menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara,
yaitu metode tuang (pour plate) dan metode permukaan atau sebar (surface atau
spread plate) (Fardiaz 1993). Untuk memenuhi persyaratan statistik, cawan yang
dipilih untuk dihitung harus memiliki 30-300 koloni. Oleh karena itu, dilakukan
sederatan pengenceran dan pencawan. Jumlah mikroba dalam sampel ditentukan
dengan mengalikan jumlah koloni dengan faktor pengenceran pada cawan yang
bersangkutan. Satuan yang digunakan untuk menyatakan jumlah koloni bakteri
adalah CFU/mL (CFU = colony forming units) (Waluyo 2008).
Tujuan
Praktikum dilakukan bertujuan mempelajari cara melakukan pengenceran
serial dan menentukan kepadatan sel bakteri dalam suatu sampel dari jumlah
koloni bakteri yang terbentuk dengan metode hitungan cawan baik cawan sebar
maupun cawan tuang.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah mikropipet dengan tipnya, spreader,
inkubator, cawan petri kosong yang steril, pembakar spirtus, dan rak tabung reaksi.
Bahan-bahan yang digunakan adalah suspensi bakteri dalam media Lactose Broth,
media Plate Count Agar dalam cawan petri, tabung-tabung berisi 9 mL larutan
fisiologis (0,85% NaCl), alkohol 70%, dan Erlenmeyer yang berisi media Plate
Count Agar cair bersuhu sekitar 50°C (hangat).
Prosedur Kerja
Suasana steril harus diciptakan dari awal praktikum hingga akhir praktikum.
Oleh karena itu, tangan dan area meja yang digunakan dibasahi dengan alkohol
70%. Selain itu, pengerjaan dilakukan di dekat api untuk mengurangi atau
mencegah bakteri kontaminan menempel pada alat maupun media. Larutan
pengencer dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL suspensi bakteri dalam media
Lactose Broth diambil dengan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung
pertama (10-1) yang berisi larutan fisiologis, kemudian tabung dikocok homogen.
Tabung kedua (10-2) diisi dengan 1 mL larutan pada tabung pertama dan dikocok
homogen. Percobaan diulangi sampai pengenceran 10-7.
Metode hitungan cawan sebar dilakukan dengan cara sebanyak 0,1 mL
larutan fisiologis hasil pengenceran 10-7 diambil dengan mikropipet dan diteteskan
pada cawan petri yang berisi media Plate Count Agar, kemudian disebar atau
diratakan dengan menggunakan spreader sebanyak tiga kali ulangan. Spreader
yang digunakan harus dalam keadaan sudah steril, yaitu dengan cara direndam
dalam alkohol 70% dan dipanaskan dengan api. Begitu juga tip yang digunakan
untuk mikropipet harus dalam keadaan steril. Percobaan diulangi untuk larutan
fisiologis hasil pengenceran 10-6.
Metode hitungan cawan tuang dilakukan dengan cara sebanyak 0,1 mL
larutan fisiologis hasil pengenceran 10-7 diambil dengan mikropipet dan diteteskan
pada cawan petri kosong yang steril. Setelah itu, cawan petri tersebut dituangkan
media Plate Count Agar sebanyak kira-kira 12 mL yang masih dalam keadaan
hangat. Media Plate Count Agar diratakan dengan cara cawan petri diletakkan
pada meja datar dan digerakkan dengan cara membentuk angka delapan. Hal ini
dilakukan agar ketebalan media Plate Count Agar seragam. Percobaan diulangi
untuk larutan fisiologis hasil pengenceran 10-6 dan 10-5. Setelah selesai, semua
cawan petri diberi pelabelan dan diisolasi pada bagian mulut cawan. Kemudian
cawan-cawan petri tersebut dimasukkan ke dalam plastik steril. Plastik dapat
disterilkan dengan cara disemprotkan alkohol 70% bagian dalamnya. Semua
cawan petri diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam.
Data dan Hasil Pengamatan
Berikut ini data dan hasil pengamatan yang dilakukan pada metode hitungan
cawan baik cawan sebar maupun cawan tuang.
Tabel 1 Hasil pengamatan koloni bakteri pada cawan tuang sebar dan cawan tuang
Jumlah koloni
Jumlah bakteri
Jenis cawan
-5
-6
-7
(CFU/mL)
10
10
10
Cawan sebar
11
5
Tidak dapat dihitung
Cawan tuang
TBUD
0
0
Tidak dapat dihitung
Keterangan: TBUD : terlalu banyak untuk dihitung
: tidak dilakukan
Gambar 1 Koloni bakteri pada larutan fisiologis 10-6 (a) dan 10-7 (b) dengan
metode cawan sebar
Gambar 2 Koloni bakteri pada larutan fisiologis 10-5 (a), 10-6 (b), dan 10-7 (c)
dengan metode cawan tuang
Pembahasan
Proses sterilisasi dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri sebuah
pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik. Teknik aseptik
dilakukan dengan cara tangan dan area meja yang digunakan disemprotkan
dengan alkohol 70%. Spreader, cawan petri, dan tip yang digunakan juga harus
steril. Spreader dibuat steril dengan cara direndam dalam alkohol 70% yang
kemudian dipanaskan dalam api ketika hendak digunakan. Cawan petri baik yang
masih kosong maupun yang sudah berisi media Plate Count Agar harus
distrelisasikan terlebih dahulu dalam autoclave. Tip yang digunakan juga harus
steril. Kotak tip baru dibuka ketika tip akan dipasangkan dengan mikropipet dan
segera ditutup agar kontaminan dari udara tidak sempat menempel pada tip. Setiap
pengerjaan dilakukan di dekat api spirtus. Hal tersebut dilakukan untuk
membunuh mikroorganisme yang tidak diinginkan (kontaminan) agar diperoleh
pengukuran yang akurat.
Konsentrasi sel-sel mikroba di dalam spesimen pada umumnya tidak
diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap
sehingga sekurang-kurangnya satu di antara cawan tersebut mengandung koloni
terpisah di atas permukaan ataupun di dalam agar. Pada pengenceran bertingkat
yaitu pada 10-1 sampai 10-7, sebelum dan sesudah dimasukkan suspensi bakteri
pada larutan fisiologis yang berada dalam tabung, mulut tabung dipanaskan
terlebih dahulu. Hal ini juga dilakukan ketika pengenceran bertingkat dengan
tabung lainnya. Sebelum dilakukan pengenceran bertingkat, larutan dikocok
terlebih dahulu sampai homogen agar ketika mikropipet mengambil cairan yang
juga berisi bakteri. Setelah cairan di dalam mikropipet dikeluarkan ke tabung yang
lainnya, dilakukan pembilasan dengan cara mengambil sejumlah cairan yang
berada di tabung dan mengeluarkannya kembali agar bakteri yang menempel pada
tip dapat terbawa oleh cairan. Tip yang digunakan untuk memindahkan cairan
selalu diganti setiap pemindahan cairan agar sterilisasi dapat terjaga.
Pada percobaan larutan yang digunakan untuk pengenceran, yaitu larutan
fisiologis 0,85% yang mengandung 0,85 gram NaCl dalam 100 mL air. Selain
larutan fisiologis, dapat pula menggunakan phospat buffer salin (PBS) dan
akuades steril. Larutan phospat buffer salin ini merupakan larutan yang paling
baik jika digunakan karena selain mengandung ion-ion yang baik untuk bakteri
juga mengandung NaCl seperti larutan fisiologis. Akuades steril merupakan
pilihan terakhir yang dapat digunakan, karena akuades tidak baik untuk bakteri
akibat adanya pengaruh osmotik dalam air akuades. Jika akuades steril ini
digunakan maka pengerjaan pengenceran bertingkat sebaiknya dilakukan cepat
agar tidak memengaruhi pertumbuhan bakteri ketika berada dalam media agar.
Media agar yang digunakan baik pada cawan tuang dan cawan sebar adalah
Plate Count Agar. Plate Count Agar merupakan media bentuk padat yang
komposisinya sintetik dan memiliki fungsi umum. Plate Count Agar sebagai
media mikroorganisme aerob dengan inokulasi di atas permukaannya. Komposisi
yang terkandung dalam Plate Count Agar di antaranya ekstrak ragi 2,5 g/L,
kasein 5,0 g/L, glukosa 1,0 g/L, dan agar 15.0 g/L. Media ini dapat dibuat dengan
cara dicampurkan 23,5 g media Plate Count Agar dalam 1 L air distilasi yang
kemudian dididihkan sampai larut sempurna. Setelah larut sempurna, media Plate
Count Agar disterilkan terlebih dahulu dengan autoclave pada suhu 121°C selama
15 menit.
Pada cawan sebar, media Plate Count Agar sudah berada di cawan yang
telah disterilkan dengan autoclave. Sedangkan pada cawan tuang, media tersebut
berada pada Erlenmeyer dan media masih dalam keadaan hangat. Jika media pada
cawan tuang terlalu panas, maka bakteri yang hidup di suhu ruang yang diteteskan
dapat mati dan apabila sudah dalam keadaan dingin, media Plate Count Agar akan
membeku sehingga sulit untuk dituangkan ke dalam cawan. Oleh karena itu,
media Plate Count Agar yang sudah dingin sebaiknya dipanaskan kembali. Media
Plate Count Agar yang berada dalam Erlenmeyer harus ditutup dengan
menggunakan aluminium foil agar bakteri yang berasal dari udara (kontaminan)
tidak masuk ke dalam media.
Bakteri yang ditanam pada media diambil dengan mikropipet pada larutan
pengenceran terkecil terlebih dahulu, yaitu 10-7, sehingga tip yang telah digunakan
tidak perlu diganti lagi dengan tip baru untuk mengambil bakteri pada larutan
pengenceran yang lebih besar. Jika dilakukan sebaliknya maka jumlah bakteri
pada larutan yang pengencerannya lebih besar akan memengaruhi jumlah bakteri
pada larutan yang pengencerannya lebih kecil. Sebelum dan sesudah bakteri
ditanam pada media, baik cawan sebar maupun cawan tuang dipanaskan pada
bagian mulutnya agar tidak ada kontaminan yang menempel. Pada cawan tuang,
media yang telah dituangkan diletakkan pada meja yang datar dan ketebalan
lapisan diatur rata dengan cara digerakkan dengan gerakan membentuk angka
delapan.
Pada percobaan yang diperoleh, jumlah koloni yang terbentuk pada cawan
sebar baik pada pengenceran 10-7 maupun 10-6 terlalu sedikit untuk dihitung
(TSUD), karena untuk memenuhi peryaratan statistik, cawan yang dipilih untuk
penghitungan koloni adalah yang mengandung antara 30-300 koloni bakteri.
Sedangkan pada cawan tuang pada pengenceran 10-7 dan 10-6 tidak terbentuk
koloni bakteri sama sekali dan pada pengenceran 10-5 koloni bakteri yang
terbentuk menumpuk dan bergelombol sehingga sulit untuk dihitung sebagai suatu
koloni yang dapat pula disebut dengan terlalu banyak untuk dihitung (TBUD).
Tidak terbentuknya koloni atau sedikitnya koloni bakteri yang terbentuk dapat
disebabkan oleh beberapa hal di antaranya cawan yang berisi bakteri tersebut
terlalu dekat dengan api sehingga bakteri tersebut menjadi mati atau hanya sedikit
saja yang hidup. Selain itu dapat pula dikarenakan spreader yang digunakan untuk
meratakan larutan pengencer bakteri masih panas sehingga bakteri tersebut mati
semua atau sebagian. Jumlah koloni yang diperoleh dalam jumlah sedikit dapat
pula dikarenakan pengenceran bertingkat yang dilakukan tidak homogen sehingga
larutan tersebut terlalu encer (jumlah bakteri terlalu sedikit). Jika koloni bakteri
yang diperoleh pada suatu percobaan memiliki warna lebih dari satu, hal ini
menunjukkan bahwa adanya kontaminan yang ikut tumbuh. Jika suatu cawan
membentuk banyak koloni maka perhitungan dapat dipermudah dengan cara
menggunakan kuadran dan pada salah satu kuadran dihitung yang dapat mewakili
kuadran lainnya seperti berikut.
Gambar 3 Pembuatan kuadran untuk mempermudah perhitungan koloni bakteri
Semakin tinggi tingkat pengenceran yang dilakukan maka jumlah koloni
bakteri yang akan terbentuk semakin sedikit. Hal ini dapat dilihat pada
pengenceran 10-5 yang memiliki jumlah koloni yang terlalu banyak pada cawan
tuang dan pada pengenceran 10-7 memiliki jumlah koloni paling sedikit atau bahan
tidak ada sehingga tidak memenuhi persyaratan statistik. Jumlah koloni yang
berkurang seiring dengan peningkatan pengenceran disebabkan karena jumlah
bakteri yang terkandung dalam tiap volume inokulan yang dipindahkan semakin
berkurang akibat pengenceran yang dilakukan.
Jumlah sel bakteri yang terdapat dalam sampel dapat ditentukan dengan
rumus sebagai berikut.
∑sel
= ∑koloni x
x
Satuan untuk ∑sel adalah CFU/mL yang mana CFU merupakan colony forming
units per mL. Semakin besar pengenceran, maka jumlah koloni semakin kecil
sehingga jumlah mikroorganisme dapat dihitung. Fp merupakan faktor
pengenceran sedangkan ∑inokulan merupakan larutan pengencer yang diambil
untuk diinokulasikan. Pada percobaan volume inokulan yang digunakan sebesar
0,1 mL. Jumlah bakteri pada percobaan baik cawan sebar maupun cawan tuang
tidak dapat dihitung, karena tidak memenuhi persyaratan statistik.
Keuntungan menggunakan perhitungan secara tidak langsung ialah metode
tersebut hanya dapat menghitung jumlah mikroorganisme yang hidup atau sel
yang hidup. Tidak seperti perhitungan secara langsung, seluruh mikroorganisme
baik yang mati maupun hidup dihitung seluruhnya ketika tidak menggunakan
suatu zat pewarna untuk dapat membedakannya (Lay 1994). Kelemahan utama
metode hitungan cawan adalah keselektifannya. Kondisi pertumbuhan bakteri,
termasuk komposisi media yang digunakan, waktu inkubasi, suhu, dan pH sangat
menentukan jenis bakteri yang dapat tumbuh dari seluruh populasi yang ada.
Tidak ada satu kondisi yang universal untuk membuat seluruh mikroorganisme
dapat tumbuh dengan baik. Kekurangan tersebut dapat menjadi suatu keunggulan
jika ingin menghitung populasi mikroorganisme spesifik. Sebagai contoh yaitu
mendesain prosedur yang selektif untuk menghitung bakteri koliform atau
kelompok mikroorganisme fisiologis lainnya (Harmita 2006).
Simpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa pada
cawan sebar baik pada pengenceran 10-7 maupun 10-6 jumlah koloni bakteri yang
terbentuk terlalu sedikit untuk dihitung. Pada cawan tuang baik pada pengenceran
10-7 maupun 10-6 tidak terbentuk koloni bakteri sedangkan pada pengenceran 10-5
jumlah koloni yang terbentuk terlalu banyak untuk dihitung. Sehingga kepadatan
sel bakteri dalam sampel tidak dapat ditentukan.
Daftar Pustaka
Fardiaz S. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta: PT. Raja Grafindo
Persada.
Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Hayati. Jakarta: Kedokteran EGC. Ed. ke-3.
Irianto K. 2007. Mikrobiologi. Bandung: Yrama Widya.
Lay B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Raja Grafindo Persada.
Waluyo Lud. 2008. Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi. Malang:
UMM Press.
_________ 2007. Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press.