BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Jenis dan

24
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium untuk
membandingkan kemampuan antibakteri ekstrak etanol daun sirih merah (Piper
crocatum)dengan
pelarut
DMSO
dan
aquades
terhadap
Staphylococcus
aureusATCCdengan menggunakan metode dilusi cair yang dilihat berdasarkan
Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM).
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian
Pembuatan ekstrak dilakukan di laboratorium Biologi Farmasi Universitas
Islam Indonesia pada bulan Februari 2016. Sedangkan untuk penelitian dengan
metode dilusi cair dilakukan pada bulan Maret 2016 di laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia.
3.3 Subjek Penelitian
3.3.1 Bakteri
Bakteri
yang
digunakan
untuk
penelitian
adalah
bakteri
standar
Staphylococcus aureusATCC 25923koleksi dari laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia.
3.3.2 Bahan Uji
Bahan uji yang digunakan adalah ekstrak etanol daun sirih merah dengan
pelarut DMSO dan aquades. Pembuatan ekstrak etanol daun sirih merah dilakukan
di Laboratorium Biologi Farmasi Universitas Islam Indonesia. Daun sirih merah
yang digunakan diambil daritanaman sirih merah yang ada di wilayah Sleman,
Yogyakarta dengan usia tanaman minimal berumur 4 bulan dengan umur daun
minimal 1 bulan.
25
3.4 Variabel Penelitian
3.4.1 Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak etanol daun
sirih merah yang diencerkan secara serial dengan pelarut DMSO dan aquades
pada beberapa konsentrasi tertentu.
3.4.2 Variabel Terikat
Variabel terikat pada penelitian ini adalah perkembangbiakan bakteri
Staphylococcus aureus ATCC 25923 yang dilihat dari hasil Kadar Hambat
Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM). Nilai KHM diperoleh
dengan membandingkan kekeruhan pada tabung perlakuan yang disebabkan oleh
perkembangbiakan bakteri dibandingkan dengan tabung kontrol, sedangkan nilai
KBM diperoleh dengan melihat perkembangbiakan bakteri pada media agar darah
pada konsentrasi tertentu.
3.4.3 Variabel Terkendali
Variabel terkendali merupakan variabel yang dapat mempengaruhi penilaian
yang dikendalikan untuk menjaga validitas penelitian. Variabel tersebut antara
lain :
a. Subjek penelitian dijaga dengan menggunakan bakteri uji yang diperoleh
dari biakan murni koleksi laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran
Universitas Islam Indonesia.
b. Bahan uji antibakteri dijaga validitasnya dengan memilih tanaman sirih
merah minimal berumur 4 bulan dengan umur daun minimal 1 bulan.
c. Uji kepekaan dilakukan menurut pedoman kerja laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia.
3.5
Definisi Operasional
a. Ekstrak daun sirih merah adalah ekstrak pekat yang bahannya menggunakan
daun sirih merah sebagai bahan dasar.
b. Aquades adalah pelarutair hasil penyulingan dimana kandungan dalam
aquades murni hanya air (H2O) tanpa ada unsur lain.
26
c. DMSO adalah pelarut polar aprotik yang dapat melarutkan baik senyawa
polar maupun nonpolar dan larut dalam berbagai pelarut organik maupun
air.
d. Staphylococcus aureus ATCC 25923 adalah bakteri Staphylococcus aureus
yang telah distandarisasi dan bukan bakteri yang diambil dari isolat klinik.
e. Kadar Hambat Minimal (KHM) adalah konsentrasi terendah/terkecil dari
antibakteri yang mampu menghambat perkembangbiakan bakteri (dilihat
konsentrasi terkecil yang tetap jernih dibandingkan dengan kontrol).
f. Kadar Bunuh Minimal (KBM) adalah konsentrasi terendah dari antibakteri
yang mampu membunuh bakteri pada media agar darah (konsentrasi
terendah/terkecil yang tidak ada perkembangbiakan bakteri).
3.6
Instrumen Penelitian
3.6.1 Alat
a. Tabung reaksi dan rak
b. Inkubator
c. Ose bulat
d. Lampu spiritus
e. Mikropipet
f. Autoklaf
g. Korek api
h. Blue tip
i. Yellow tip
3.6.2 Bahan
a. Bahan awal yang diproses menjadi ekstrak etanol daun sirih merah
b. Bakteri Staphylococcus aureusATCC 25923
c. DMSO 10%
d. Aquades steril
e. Standard Mc Farland
f. NaCl
g. Penisilin G
h. Media :
27
- BHI ds
- Agar darah
- Mc Conkey
- Agar Sabouraud
3.7
Alur Penelitian
Pengambilan bahan (daun sirih
merah)
Pembuatan ekstrak
Uji sterilisasi ekstrak
Persiapan bakteri
Uji kemampuan antibakteri ekstrak
etanol daun sirih merah dengan
pelarut DMSO dan aquades
Analisis hasil
Gambar 4. Alur Penelitian
3.7.1 Pengambilan Bahan
Daun sirih merah yang digunakan sebagian (2,1 kg) dipesan dari wilayah
Sleman dan sebagian lagi (0,65 kg) diambil dari tanaman sirih merah yang ada di
wilayah Sleman, Yogyakarta. Untuk pengambilandilakukan pada pagi hari, sirih
28
merah yang sudah dipetik langsung diproses untuk dibuat ekstrak. Sirih merah
yang digunakan adalah daun sirih merah yang umurnya cukup tua dengan
tanaman sirih merah minimal berumur 4 bulan dan daun yang berumur minimal 1
bulan, dengan daun yang bersih dan warna mengkilap karena pada saat itu kadar
bahan aktifnya masih tinggi. Cara pemetikan dimulai dari daun tanaman bagian
bawah menuju atas. Setelah dipetik, daun disortir dan direndam dalam air untuk
membersihkan kotoran dan debu yang menempel (Hidayat, 2013).
3.7.2 Pembuatan Ekstrak
a. Pembuatan serbuk simplisia
Daun sirih merah yang sudah dipilih dan dicuci hingga bersih,kemudian
dikeringkan dalam lemari pengering pada suhu 50oC selama 6-8 jam
hingga daun sirih merah menjadi kering. Tujuan pengeringan adalah
untuk mengurangi kadar air yang terdapat dalam daun sirih merah.
Setelah daun menjadi kering kemudian dijadikan serbuk dengan
menggunakan blender. Kemudian serbuk ditimbang sesuai dengan
kebutuhan.
b. Proses ekstraksi
Proses ekstraksi dilakukan dengan proses maserasi yakni dengan cara
serbuk simplisia direndam dengan pelarut etanol 70%. Dimasukkan satu
bagian serbuk kering simplisia ke dalam maserator, kemudian
ditambahkan 10 bagian pelarut (perbandingan 1:10 untuk serbuk
simplisia dan pelarut). Selanjutnya direndam selama 6 jam pertama
sambil sekali-sekali diaduk, kemudian didiamkan selama 18 jam.
c. Separasi dan pemurnian
Setelah serbuk dimaserasi kemudian disaring dengan menggunakan
corong Buchner yang tujuannya untuk memisahkan senyawa yang tidak
dikehendaki
dengan
semaksimal
mungkin
tanpa
mempengaruhi
kandungan senyawa yang dikehendaki, sehingga diperoleh ekstrak yang
lebih murni (pemisahan etanol dengan ampas).
29
d. Pengentalan ekstrak
Fitrat dari proses penyaringan diletakkan pada rotary evaporator selama
5 jam yang bertujuan untuk memisahkan ekstrak dengan pelarut etanol.
Pada proses ini filtrat yang diletakkan pada rotary evaporator akan
menjadi ektrak kental dan siap untuk digunakan (Depkes, 2008).
3.7.3 Uji Sterilisasi Ekstrak
Uji sterilisasi ekstrak bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak steril atau
tidak. Uji ini dilakukan dengan cara mengambil 1 ose ekstrak dan digoreskan pada
media agar darah, Mc Conkey dan Sabouraud. Pada media agar darah dan Mc
Conkey yang telah digoreskan kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24
jam. Sedangkan pada media Sabouraud diinkubasi pada suhu 25-30oC selama 2448 jam. Adanya koloni kuman yang tumbuh pada agar darah, Mc Conkey dan
Sabouraud menunjukkan bahwa ekstrak tidak steril. Jika ekstrak tidak steril maka
ekstrak akan disaring dengan menggunakan penyaring.
3.7.4 Persiapan Bakteri
Bakteri Staphylococcus aureus yang telah disediakan diambil beberapa
koloni kuman kemudian digoreskan pada media agar darah dan diinkubasikan
pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Hasil bakteri yang ditanam pada media agar
darah kemudian diambil dengan menggunakan ose sebanyak 3-4 koloni,
kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 1 ml BHI ds,
diinkubasikan selama 4 jam pada suhu 37oC. Selanjutnya dibuat larutan bakteri
dengan kekeruhan 108 CFU/ml dengan cara memasukkan NaCl ke dalam suspensi
Staphylococcus aureus sampai kekeruhannya sama dengan standar Mc Farland.
Bakteri dengan kekeruhan 108 CFU/ml tersebut kemudian diencerkan 100 kali
dengan cara mengambil 0,1 ml bakteri dengan kekeruhan 108 CFU/ml kemudian
dimasukkan ke dalam BHI ds sebanyak 9,9 ml sehingga diperoleh kekeruhan 106
CFU/ml yang siap digunakan dalam percobaan dilusi.
30
3.7.5 Perbandingan Uji Kemampuan Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Sirih
Merah dengan Pelarut DMSO dan Aquades terhadap Staphylococcus
aureus
Pengujian dengan menggunakan metode dilusi cair dengan menggunakan
ekstrak etanol daun sirih merah dengan pelarut DMSO dan aquades, masingmasing dibuat dengan kadar 100%, kemudian disiapkan 11 tabung steril. Tabung
pertama diisi ekstrak etanol sirih merah dan pelarut DMSO dengan kadar 100%
sebanyak 2 ml, sedangkan tabung ke-2 sampai tabung ke-10 diisi dengan aquades
masing-masing sebanyak 1 ml. Dari tabung pertama diambil 1 ml kemudian
dimasukkan ke dalam tabung ke-2 sehingga konsentrasi tabung ke-2 menjadi
setengah dari tabung pertama. Kemudian, dari tabung ke-2 diambil 1 ml dan
dimasukkan dalam tabung ke-3 dan begitu seterusnya sampai tabung ke-7.
Setelah mencapai tabung ke-7, pada tabung ke-7 diambil 1 ml dan dimasukkan ke
dalam tabung ke-8 sebagai kontrol ektstrak. Konsentrasi ekstrak sirih merah
berturut-turut dari tabung pertama sampai ke-7 adalah 100%; 50%; 25%; 12,5%;
6,25%; 3,13% dan 1,56%. Pada tabung ke-9 telah dimasukkan 1 ml akuades
kemudian ditambahkan dengan 1 ml BHI ds dan digunakan sebagai kontrol
media.
Masing-masing tabung, dari tabung ke-1 sampai ke-7, 10 dan 11 ditambah
suspensi Staphylococcus aureusdalam media BHI ds dengan kepadatan bakteri
106 CFU/ml sebanyak 1 ml, sehingga volume masing-masing menjadi 2 ml.
Dengan demikian konsentrasi akhir bahan uji menjadi setengah dari konsentrasi
awal yakni, 50%; 25%; 12,5%; 6,25%; 3,13%; 1,56% dan 0,78%. Kemudian
tabung-tabung tersebut diinkubasikan dalam suhu 37oC selama 18-24 jam untuk
menilai apakah terdapat perkembangbiakan bakteri yang dilihat dengan adanya
kekeruhan pada media.
Dilakukan hal yang sama dengan membuat campuran ekstrak etanol daun
sirih merah dengan pelarut aquades, dimana dibuat konsentrasi 100%; 50%; 25%;
12,5%; 6,25%; 3,13% dan 1,56% pada tabung ke-1 sampai ke-7. Tabung ke-1
sampai ke-7, tabung 10 dan 11 ditambah suspensi S. aureusdalam media BHI ds
dengan kepadatan bakteri106 CFU/ml sebanyak 1 ml, sehingga masing-masing
31
volume menjadi 2 ml. Sehingga konsentrasi akhir menjadi 50%; 25%; 12,5%;
6,25%;
3,13%;
1,56%
dan
0,78%.
Kemudian
tabung-tabung
tersebut
diinkubasikan dalam suhu 37oC selama 18-24 jam untuk menilai apakah terdapat
perkembangbiakan bakteri yang dilihat dengan adanya kekeruhan pada media.
Pada pengujian untuk pelarut DMSO disertakan 4 macam kontrol, yaitu
kontrol ekstrak pada tabung ke-8 yang berisi 1 ml aquades dan sisa ekstrak dari
tabung ke-7, sebagai kontrol media pada tabung ke-9 yang berisi 1 ml aquades
dan 1 ml BHI ds, kontrol bakteri pada tabung ke-10 yang berisi 1 ml akuades dan
1 ml suspensi bakteri 106 CFU/ml dalam BHI ds. Sedangkan untuk kontrol
antibiotik pada tabung ke-11 yang berisi 1 ml suspensi Staphylococcus aureus
ditambah dengan antibiotik Penisilin G 0,12 µg/ml. Kadar suspensi antibiotik
penisilin G yang mampu menghambat bakteri S.aureusadalah 0,06-0,12 µg/ml.
Pada pelarut aquades juga terdapat 4 macam kontrol yaitu tabung ke-8
sebagai kontrol ekstrak yang berisi 1 ml aquades dan sisa ekstrak dari tabung ke7, kontrol media pada tabung ke-9 yang berisi 1 ml aquades dan 1 ml BHI ds.
Kontrol bakteri pada tabung ke-10 berisi 1 ml aquades dan 1 ml suspensi bakteri
106 CFU/ml dan kontrol antibiotik pada tabung ke-11 yang berisi 1 ml suspensi
Staphylococcus aureusditambah dengan antibiotik Penisilin G 0,12 µg/ml.
Nilai KHM (Kadar Hambat Minimal) ditentukan dengan
mengamati
kejernihan dari tabung ke-1 sampai ke-7 kemudian dibandingkan dengan kontrol.
Untuk menentukan nilai KBM (Kadar Bunuh Minimal), dari tabung ke-1 sampai
ke-11 diambil 1 ose dan digoreskan pada media agar darah kemudian
diinkubasikan selama 18-24 jam pada suhu 37oC dan dilihat pertumbuhan S.
aureus pada media tersebut.
Hasil penelitian dapat dinilai apabila tabung kontrol (tabung ke-8,9 dan 11)
jernih
dan
tidak
terdapat
perkembangbiakan
bakteri,
serta
tidak
ada
perkembangbiakan bakteri pada media agar darah. Pada tabung ke-10
menunjukkan kekeruhan dan terdapat perkembangbiakan bakteri pada media agar
darah.Hasilnya dibandingkan antara pelarut DMSO dan aquades dengan melihat
pada tabung dan media agar darah.
32
3.8
Analisis Data
Pada penelitian eksperimental laboratorium ini data dianalisis dengan
menggunakan metode dektriptif, yaitu melakukan pengamatan dan perbandingan
terhadap kemampuan ekstrak etanol daun sirih merah dengan pelarut DMSO dan
aquades untuk menghambat perkembangbiakan dan pertumbuhan Staphylococcus
aureus yang dinilai dengan melihat Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar
Bunuh Minimal (KBM) yang konsisten.
3.9
Etika Penelitian
Penelitian ini telah mendapatkanethical clearance dari Komisi Etik
Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia. Nomor
ethical
clearance
yang
24/Ka.Kom.Et/70/KE/I/2016.
telah
didapat
pada
penelitian
ini
adalah