identifikasi spesies begomovirus penyebab penyakit daun kuning
advertisement
IDENTIFIKASI SPESIES BEGOMOVIRUS PENYEBAB PENYAKIT DAUN KUNING PADA TANAMAN MENTIMUN MELALUI ANALISIS SEKUEN NUKLEOTIDA ENDANG DARSINI DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015 2 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA * Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Identifikasi Spesies Begomovirus Penyebab Penyakit Daun Kuning pada Tanaman Mentimun Melalui Analisis Sekuen Nukleotida” adalah benar karya saya dengan arahan dari pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya pada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Agustus 2015 Endang Darsini NIM A34110061 *Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait. 4 ABSTRAK ENDANG DARSINI. Identifikasi Spesies Begomovirus Penyebab Penyakit Daun Kuning pada Tanaman Mentimun melalui Analisis Sekuen Nukleotida. Dibimbing oleh GEDE SUASTIKA. Penyakit daun mosaik kuning pada mentimun telah diketahui berasosiasi dengan infeksi Tomato leaf curl NewDelhi virus (ToLCNDV) atau Squash leaf curl China virus (SLCCNV). Tahun lalu, penyakit kuning dengan pertulangan daun yang khas tanpa malformasi pada mentimun (Cucumis sativus) di Bali ditemukan diinduksi oleh SLCCNV. Tahun ini, budidaya mentimun di Jawa Barat dipengaruhi oleh kejadian penyakit yang mirip dengan di Bali. Penelitian ini bertujuan untuk menjelaskan bahwa penyakit pada tanaman mentimun yang muncul di Jawa Barat juga disebabkan oleh SLCCNV. Ekstraksi total asam nukleat dari daun mentimun yang dikumpulkan dari tiga desa di Bogor (Cikarawang, Petir, dan Sindangbarang) dibuat secara terpisah menggunakan PCR dan diamplifikasi menggunakan sepasang primer (SPG1: 5'-CCCCKGTGCGWR AATCCAT-3' dan SPG2: 5'ATCCVAAYWTYCAGGGAG CTAA-3') yang dirancang agar sesuai dengan urutan DNA-A dari Begomovirus. PCR dari ketiga sampel berhasil mengamplifikasi fragmen DNA sesuai dengan ukuran yang diharapkan yaitu 912 pb, hal ini menunjukkan Begomovirus berasosiasi dengan penyakit tersebut. Sekuen DNA dari produk PCR menunjukkan lebih dari 95% kesamaan identitas dengan isolat ToLCNDV yang tersedia di GenBank dan satu kelompok dengan mereka dalam analisis filogenetika. Temuan ini mengonfirmasi bahwa SLCCNV (dari Bali) belum menyebar ke Jawa Barat. Kata kunci: Penyakit kuning, Polimerase chain reaction, Tomato leaf curl NewDelhi virus 6 ABSTRACT ENDANG DARSINI. Identification of Begomovirus Species Causing Yellowing Disease on Cucumber Plant by Nucleotide Sequence Analysis. Supervised by GEDE SUASTIKA. Yellow vein mosaic disease on Cucurbitaceae is known to be associated with infection of Tomato leaf curl NewDelhi virus (ToLCNDV) or Squash leaf curl China virus (SLCCNV). Last year, a yellowing disease with typical vein banding without any leaf malformation on cucumber (Cucumis sativus) in Bali was found to be induced by SLCCNV. This year, cucumber cultivation in West Java was affected by severe incidence of a disease resemble with that occurred in Bali. This research aimed to elucidate if the disease on cucumber plants emerged in West Java is also caused by SLCCNV. Total nucleic acid extractions of cucumber leaves collected from three villages in Bogor (Cikarawang, Petir, and Sindangbarang) were made separately and used for PCR amplifications using a pair of primers (SPG1: 5'-CCCCKGTGCGWRAATCCAT-3' and SPG2: 5'ATCCVAAYWTYCAGGGAGCTAA-3') designed to match the sequences of the DNA-A of Begomovirus. PCR from all three samples yielded amplified DNA fragments of the expected sizes of 912 bp, indicated the association of the virus with the disease. The DNA sequence of the PCR products shared more than 95% sequence identity with ToLCNDV isolates available in the GenBank and clustered with them in the phylogenetic analysis. This finding confirmed that SLCCNV was not spread yet (from Bali) to West Java. Keyword: Polimerase chain reaction, Tomato leaf curl NewDelhi virus, yellowing disease 8 IDENTIFIKASI SPESIES BEGOMOVIRUS PENYEBAB PENYAKIT DAUN KUNING PADA TANAMAN MENTIMUN MELALUI ANALISIS SEKUEN NUKLEOTIDA ENDANG DARSINI Skripsi sebagai salah satu syarat untuk melakukan Penelitian Tugas Akhir pada Departemen Proteksi Tanaman DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015 10 12 PRAKATA Puji syukur penulis haturkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan limpahan rahmat, hidayah serta inayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan tugas akhir yang berjudul “Identifikasi Spesies Begomovirus Penyebab Penyakit Daun Kuning pada Tanaman Mentimun Melalui Analisis Sekuen Nukleotida”. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2014 hingga April 2015 di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Institut Pertanian Bogor. Laporan tugas akhir ini sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana di Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Terima kasih yang sebesar-besarnya penulis haturkan kepada kedua orang tua, bapak Darmanto dan ibu Kasminah yang telah memberikan dukungan moral maupun materiil, kasih sayang dan doa restu, serta saudara-saudara yang telah memberikan motivasi kepada penulis. Terima kasih kepada Dr Ir Gede Suastika MSc selaku dosen pembimbing yang dengan sabar memberikan bimbingan, arahan, dan saran serta ilmu yang sangat bermanfaat kepada penulis dari awal penelitian hingga penulis menyelesaikan laporan tugas akhir ini. Terima kasih kepada Dr Ir Pudjianto MSi selaku dosen penguji tamu yang telah memberikan saran dan nasehat kepada penulis. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada seluruh staf dan dosen di Departemen Protaksi Tanaman atas ilmu yang telah di berikan. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Sari Nurulita SP MSi, Ni Nengah Putri Adnyani SP, Bapak Edi Supardi, keluarga besar Laboratorium Virologi Tumbuhan yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu. Tarima kasih juga kepada sahabat-sahabat Proteksi Tanaman angkatan 48 yang telah memberikan bantuan, dukungan, dan kenangan kebersamaan di Departemen Proteksi Tanaman. Semoga kebaikan dan perhatian yang telah diberikan memperoleh balasan yang lebih baik dari Allah SWT. Penulis berharap hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan. Penulis menyadari bahwa terdapat kekurangan pada penulisan. Kritik dan saran yang bersifat membangun sangat diharapkan agar dapat memperbaiki kegiatan penelitian selanjutnya. Bogor, Agustus 2015 Endang Darsini 14 DAFTAR ISI DAFTAR GAMBAR DAFTAR TABEL DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN Latar Belakang Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Metode Penelitian Pengumpulan Sampel Daun Tanaman Mentimun Sakit Deteksi dengan PCR Ekstraksi DNA Amplifikasi DNA dengan PCR Visualisasi Hasil PCR Sekuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika HASIL DAN PEMBAHASAN Survei dan Pengumpulan Tanaman Sakit Indikasi Asosiasi Begomovirus dengan Penyakit Daun Kuning pada Tanaman Mentimun Identifikasi Spesies Begomovirus Penyebab Penyakit Daun Kuning pada Tanaman Mentimun Hubungan Kekerabatan SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN RIWAYAT HIDUP vi vi vi 1 1 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 5 5 6 6 9 10 10 10 11 13 17 16 DAFTAR GAMBAR 1 Gejala tanaman mentimun (Cucumis sativus) yang terinfeksi Begomovirus di (A) Cikarawang, (B) Petir, dan (C) Sindangbarang. 2 Hasil amplifikasi DNA menggunakan sepasang primer spesifik Begomovirus SPG1 dan SPG2. Lajur: (M) marker 1 kb DNA ladder (Thermo Scientific, US), (K-) Kontrol negatif, (K+) Kontrol positif Begomovirus, SLCCNV tanaman mentimun isolat Bali, (A) sampel tanaman mentimun dari Desa Cikarawang, (B) Sindangbarang, dan (C) Petir. 3 Pohon filogenetika isolat-isolat Tomato leaf curl NewDelhi virus (ToLCNDV) berdasarkan sekuen nukleotida menggunakan program CLC sequence viewer versi 7.5 dan dikonstruksikan menggunakan perangkat ClustalX serta MEGA versi 6.60 dengan pendekatan UPGMA. Squash leaf curl China virus (SLCCNV) digunakan sebagai outgroup. 5 6 9 DAFTAR TABEL 1 Komposisi reaktan Polymerase chain reaction (PCR) untuk satu kali reaksi (Thermo Scientific, US). 2 Tingkat homologi runutan nukleotida ToLCNDV isolat Bogor (Desa Cikarawang, Petir, dan Sindangbarang) dengan isolat ToLCNDV dari negara lain yang terdapat pada GenBank. 4 8 DAFTAR LAMPIRAN 1 Hasil penjajaran sekuen nukleotida fragmen DNA isolat ToLCNDV- 14 Indo(Ci) (Bogor: Cikarawang), ToLCNDV-Indo(Pe) (Bogor: Petir), dan ToLCNDV-Indo(SB) (Bogor: Sindangbarang) dengan isolat ToLCNDV lainnya serta sekuen pembanding outgroup isolat SLCCNV-India yang terdapat pada GenBank menggunakan program ClustalW. Tanda *(bintang) menunjukkan basa nukleotida yang identik. 18 1 PENDAHULUAN Latar belakang Mentimun (Cucumis sativus L.) merupakan salah satu jenis sayuran dari kelompok Cucurbitaceae yang telah dikenal di dunia, dan sebagian besar dikonsumsi dalam bentuk segar. Tanaman ini berasal dari Himalaya di Asia Utara dan telah dibudidayakan hingga ke seluruh wilayah tropis maupun subtropis (Rukmana 1994). Tanaman ini dapat tumbuh di dataran rendah hingga dataran tinggi dengan ketinggian maksimum 1 300 m dari permukaan laut (dpl) (Rukmana 2005). Ketinggian optimal untuk pertumbuhan tanaman mentimun adalah 400 m dpl dengan tekstur tanah berkadar liat rendah pH 6-7 (Puslitbanghorti 2009). Sentra produksi mentimun di Indonesia antara lain Sumatera Utara, Sumatera Barat, Bengkulu, Jawa Barat, Jawa Tengah, dan Jawa Timur (Rukmana 1994; BPS 2015). Buah ini 95% kandungannya berupa air, rendah kalori, tinggi vitamin A, B, C, dan D (GIP 2014). Mentimun muda dijadikan sayuran mentah atau bahan makanan yang diawetkan seperti acar. Selain dikonsumsi, buah ini juga dimanfaatkan sebagai bahan kosmetik dan pengobatan tradisional (Rukmana 1994). Produksi mentimun di Indonesia tiga tahun terakhir terus menurun. Produksi mentimun secara berturut-turut tahun 2012, 2013, dan 2014 adalah 511 525 ton, 491 636 ton, dan 471 640 ton (BPS 2015). Penurunan produksi mentimun ini dipengaruhi oleh beberapa faktor pembatas. Faktor-faktor tersebut antara lain lingkungan biotik seperti organisme pengganggu tanaman (OPT) dan lingkungan abiotik (suhu, kelembapan, angin, dll). Salah satu OPT yang dapat menjadi faktor pembatas dalam produksi mentimun adalah virus. Begomovirus merupakan salah satu genus dari famili Geminiviridae yang anggotanya banyak dilaporkan menyerang tanaman Cucurbitaceae. Gejala khas dari infeksi kelompok virus ini yaitu daun-daun mengalami klorosis, sehingga disebut penyakit daun kuning (King et al. 2012). Polston dan Anderson (1997) melaporkan, kerugian ekonomi diakibatkan oleh serangan kelompok virus tersebut dapat mencapai 100%. Beberapa spesies dari kelompok virus tersebut yaitu Watermelon chlorotic stunt virus (WmCSV) (Ali-Shtayeh 2014), Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Idris et al. 2011), Tomato leaf curl NewDelhi virus (ToLCNDV) (Phaneendra et al. 2012), Squash leaf curl China virus (SLCCNV) (Tahir et al. 2010). Infeksi WmCSV menyebabkan lamina sekitar tulang daun menjadi kuning dan tanaman menjadi kerdil (Ali-Shtayeh 2014). TYLCV menyebabkan daun klorosis sehingga tampak kuning dan mengalami malformasi (Idris et al. 2011). ToLCNDV menyebabkan daun klorosis, mengalami penebalan, menggulung ke atas, dan tanaman menjadi kerdil (Phaneendra et al. 2012). Gejala akibat SLCCNV mirip dengan gejala oleh Begomovirus lain yaitu daun menjadi kuning, namun tulang daun tetap berwarna hijau dan ukuran daun tetap normal (Tahir et al. 2010). Survei yang telah dilakukan di Bogor menemukan banyak tanaman mentimun bergejala mirip dengan serangan Begomovirus. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui tanaman mentimun di Bogor terinfeksi Begomovirus atau virus lain. Salah satu cara identifikasi virus dapat dilakukan dengan teknik biologi molekuler yang berdasarkan sekuen nukleotida (Akin 2 2006). Asam nukleat virus dapat berupa DNA atau RNA (Bos 1990). Virus yang memiliki asam nukleat berupa DNA dapat diidentifikasi dengan menggunakan teknik polymerase chain reaction (PCR). PCR merupakan cara cepat untuk mengamplifikasi DNA secara in vitro yang mampu mengamplifikasi segmen DNA menjadi jutaan kali dalam beberapa jam (Handoyo dan Rudiretna 2001). Teknik ini dapat bekerja secara cepat, spesifik, dan sensitif (Narayanasamy 2011). Hasil amplifikasi DNA kemudian disekuen untuk mengetahui runutan basa nukleotida virus tersebut. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi spesies Begomovirus penyebab penyakit daun kuning pada tanaman mentimun di Bogor melalui analisis sekuen nukleotida. Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dalam memberikan informasi penyebab penyakit daun kuning pada tanaman mentimun, sehingga dapat digunakan sebagai dasar pegendalian di lapangan. 3 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Survei dan pengambilan tanaman mentimun yang terinfeksi virus dilakukan di sejumlah pertanaman mentimun pada tiga desa di Bogor, Jawa Barat yaitu Cikarawang, Sindangbarang, dan Petir. Deteksi dan identifikasi virus dilakukan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dari bulan November 2014 sampai April 2015. Metode Penelitian Pengumpulan Sampel Daun Tanaman Mentimun Sakit Sampel diambil dari ketiga lokasi di Bogor yang telah ditentukan. Pengambilan sampel dilakukan dengan metode purposive sampling, yaitu daun pada pertanaman mentimun yang menunjukkan gejala terinfeksi Begomovirus diambil. Selanjutnya sampel daun tersebut disimpan di dalam deep freezer pada suhu -80 oC. Deteksi dengan PCR Ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA dilakukan dengan menggunakan metode CTAB (Doyle dan Doyle 1990). Sebanyak 0.1 g sampel daun tanaman mentimun dilumatkan dalam nitrogen cair dengan pistil dan mortar. Tepung yang diperoleh ditampung dalam tabung eppendorf 1.5 ml dan ditambahkan 500 μl buffer ekstraksi (2 ml EDTA, 5 ml Tris HCl, 12.6 ml NaCl, 20.4 ml dH2O) ditambahkan 5µl β-merkaptoetanol 1% dan diinkubasi dalam water bath suhu 65 oC selama 60 menit. Siapan selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit, kemudian ditambahkan 500 µl C:I (cloroform : isoamil alkohol = 24:1 v/v) dan disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 17 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 ml baru, kemudian ditambahkan sodium asetat 1/10 volume dan isopropanol 2/3 volume supernatan, kemudian diinkubasi pada suhu -20 oC semalam. Setelah ditambahkan 600 μl etanol 80%, siapan disentrifugasi dengan kecepatan 8 000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet (yang merupakan DNA total) dikeringanginkan dan dilarutkan dalam 50 µl Tris-EDTA buffer (TE buffer) sebelum disimpan pada suhu -20 oC. Amplifikasi DNA dengan PCR. DNA total hasil ekstraksi digunakan sebagai template dalam PCR. Komposisi reaktan yang digunakan dalam proses PCR tercantum dalam Tabel 1. Program amplifikasi terdiri dari denaturasi awal pada suhu 94 oC selama 5 menit; 35 siklus dengan tahapan denaturasi pada suhu 94 oC selama 1 menit, annealing (pengintegrasian primer) pada suhu 50 oC selama 1 menit, elongasi (sintesis untai baru DNA) pada suhu 72 oC selama 1 menit; dan dilanjutkan elongasi akhir pada suhu 72 oC selama 10 menit. Hasil PCR disimpan pada suhu -20 oC. 4 Tabel 1 Komposisi reaktan Polymerase reaksi (Thermo Scientific, US). Komponen Dream taq MM ddH2O SPG1 SPG2 DNA Total volume chain reaction (PCR) untuk satu kali Volume (μL) 12.50 9.50 1.00 1.00 1.00 25.00 Visualisasi Hasil PCR Visualisasi DNA hasil PCR dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1%. Gel agarosa dibuat dengan melarutkan 0.3 gram agarosa dalam 30 ml buffer TBE 0.5x (45 mM Tris-borate, 1 mM EDTA) dan dipanaskan di dalam microwave dengan suhu medium selama 2 menit. Setelah gel agarosa terlarut seluruhnya (bening) didiamkan hingga suhunya sekitar 45 oC, kemudian dituang ke dalam cetakan dan ditunggu hingga padat. Gel agarosa kemudian dilepaskan dari cetakan dan dimasukkan ke dalam mesin elektroforesis. Marker DNA 1 kb sebanyak 5 μl dan sampel hasil PCR sebanyak 5 μl dimasukkan ke dalam masingmasing sumuran gel agarosa. Elektroforesis dilakukan selama 50 menit dengan tegangan 50 Volt. Gel agarosa yang telah dielektroforesis kemudian direndam dalam Ethidium bromida untuk pewarnaan selama 10 menit dalam kondisi gelap, selanjutnya direndam dalam air steril selama 10 menit untuk pembilasan. Selanjutnya visualisasi dilakukan di bawah transluminator UV dan didokumentasikan. Sekuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika Hasil PCR sebanyak 50 μl dikirim ke PT Genetika Science Indonesia untuk dilakukan sekuen nukleotida. Hasil sekuen nukleotida diurutkan antara forward dan reverse (contig) menggunakan software CLC sequence viewer versi 7.5. Selanjutnya dianalisis untuk mengetahui homologi atau kesejajaran sekuen nukleotida lain atau nukleotida virus yang sama pada publikasi yang ada di GenBank dengan program BLAST (Basic Local Alighment Tool) (NCBI 2015). Data sekuen nukleotida terpilih selanjutnya dianalisis melalui ClustalW multiple alignment dengan software BioEdit versi 7.1.7.0. Analisis filogenetika dilakukan dengan menggunakan software ClustalX (1.83) dan MEGA versi 6.06 berdasarkan pendekatan Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA). 5 HASIL DAN PEMBAHASAN Survei dan Pengumpulan Tanaman Sakit Pengambilan tanaman sakit dilakukan pada pertanaman mentimun pada tiga lokasi berbeda. Lokasi pertama di Desa Cikarawang, Kecamatan Dramaga berada pada ketinggian 168 m dpl dan luas lahan 500 m2. Lokasi kedua di Desa Sindangbarang, Kecamatan Bogor Barat dengan ketinggian 211 m dpl dan luas lahan 2000 m2. Lokasi ketiga di Desa Petir, Kecamatan Dramaga dengan ketinggian 365 m dpl dan luas lahan 3000 m2. Varietas tanaman mentimun dari ketiga lokasi tersebut adalah varietas hibrida Wulan, dengan umur tanaman yang berbeda. Umur tanaman mentimun secara berurutan pada lokasi pertama, kedua, dan ketiga yaitu 55, 45, dan 48 hari. Menurut Kementan (2007), varietas mentimun hibrida Wulan merupakan varietas unggul yang dapat di panen lebih kurang pada umur 30 hari setelah tanam dan mampu beradaptasi dengan baik di dataran rendah sampai tinggi (20-800 m dpl). Hasil pengamatan tanaman sakit menunjukkan gejala terinfeksi Begomovirus yang mirip dengan serangan spesies SLCCNV di Bali (Adnyani NNP 2015 Maret 3, komunikasi pribadi). Gejala yang ditunjukkan pada pertanaman mentimun di Cikarawang yaitu daun terdapat bercak kuning secara rapat, bagian ujung-ujung daun mengriting, dan tulang daun terlihat lebih hijau (Gambar 1A). Gejala pada pertanaman mentimun di Petir, daun berwarna kuning keseluruhan, tulang daun terlihat lebih hijau, dan daun keriting menggulung ke bawah (Gambar 1B). Gejala pada pertanaman mentimun di Sindangbarang menunjukkan gejala yang sama dengan sampel daun dari Petir, namun daun keriting tidak menggulung melainkan mengalami malformasi (Gambar 1C). Variasi gejala pada suatu tanaman dapat dipengarui oleh infeksi lebih dari satu virus (Polston dan Anderson 1997). A B C Gambar 1 Gejala tanaman mentimun (Cucumis sativus) yang terinfeksi Begomovirus di (A) Cikarawang, (B) Petir, dan (C) Sindangbarang. Salah satu penyebab daun menguning adalah kekurangan klorofil (klorosis). Hal ini dikarenakan adanya kerusakan kloroplas tanaman akibat infeksi virus. 6 Oleh karena itu produksi klorofil dalam tanaman mengalami penurunan (Bos 1990). Menurut Agrios (2005), penyakit klorosis mampu mengganggu metabolisme tanaman terutama pada proses fotosintesis, sehingga dapat menurunkan kualitas maupun kuantitas produksi tanaman. Indikasi Asosiasi Begomovirus dengan Penyakit Daun Kuning pada Tanaman Mentimun Deteksi Begomovirus dilakukan dengan teknik PCR menggunakan sepasang primer universal SPG1 (5’-CCCCKGTGCGWRAATCCAT-3’) dan SPG2 (5’ATCCVAAYWTYCAGGGAGCTAA-3’). Sepasang primer universal Begomovirus terebut mempunyai prediksi produk PCR sekitar 912 pb. Primer tersebut mengamplifikasi basa nukleotida ke-1490 hingga 2391 daerah open reading frame (ORF) AC2 dan ORF AC1 secara konsisten. ORF AC2 mengode transcriptional activator protein (TrAp) dan ORF AC1 mengode replication-associated protein (Rep) (Li et al. 2004). Hasil PCR yang telah dielektroforesis dan divisualisasi, menunjukkan primer tersebut berhasil mengamplifikasi pita DNA virus dari ketiga sampel mentimun sakit dan SLCCNV isolat mentimun dari Bali sebagai kontrol positif sesuai dengan prediksi yaitu sekitar 912 pb (Gambar 2). Hasil ini mengindikasikan bahwa virus yang berasosiasi dengan penyakit daun kuning pada tanaman mentimun di Bogor adalah salah satu spesies dari Begomovirus. 1000 pb ±912 pb 750 pb Gambar 2 Hasil amplifikasi DNA menggunakan sepasang primer spesifik Begomovirus SPG1 dan SPG2. Lajur: (M) marker 1 kb DNA ladder (Thermo Scientific, US), (K-) Kontrol negatif, (K+) Kontrol positif Begomovirus, SLCCNV tanaman mentimun isolat Bali, (A) sampel tanaman mentimun dari Desa Cikarawang, (B) Sindangbarang, dan (C) Petir. Identifikasi Spesies Begomovirus Penyebab Penyakit Daun Kuning pada Tanaman Mentimun Produk PCR dari tiga sampel tanaman mentimun (Gambar 2) berhasil disekuen di PT Genetika Science Indonesia untuk memperoleh identitas spesies virus tersebut. Hasil sekuen nukleatida sampel Cikarawang, Sindangbarang, dan Petir tersebut terdiri atas pita DNA yang secara berurutan berukuran sekitar 999, 7 903, dan 899 pb sesuai dengan estimasi ukuran pita DNA hasil PCR. Data sekuen nukleotida tersebut kemudian dibandingkan dengan sekuen nukleotida virus-virus yang terdaftar di GenBank. Setelah dilakukan sekuen dan BLAST, virus tersebut temasuk spesies ToLCNDV namun bukan SLCCNV. Sebelumnya, Septariani et al. (2014) telah melaporkan keberadaan ToLCNDV menginfeksi tanaman mentimun di Jawa Tengah dan Jawa Barat. SLCCNV dan ToLCNDV merupakan virus yang menyebabkan penyakit daun mosaik kuning. SLCCNV menunjukkan gejala daun yang lebih dominan kuning mosaik dekat pertulangan daun (yellow vein mosaic) (Sohrab et al. 2013). Infeksi ToLCNDV menginduksi gejala daun dominan mosaik kuning dan keriting (Sawangjit 2009). Virus-virus ini mempunyai asam nukleat berupa single stranded (ss)DNA berbentuk melingkar, bipartit atau monopartit. Penularannya dapat dilakukan melalui serangga vector Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Selain ditularkan melalui serangga vektor, virus ini juga dapat ditularkan melalui inokulasi mekanis (King et al. 2012). Penularan secara inokulasi mekanis hanya terjadi pada beberapa inang tertentu, misalnya pada pumpkin (Cucurbita moschata), ridge gourd (Luffa acutangula), dan sponge gourd (Luffa cylindrica) (Sohrab et al. 2013). Hasil analisis menggunakan ClustalW program BioEdit menunjukkan tingkat kesamaan (homologi) sekuen nukleotida yang tinggi antara tiga isolat ToLCNDV Bogor dengan isolat virus sejenis dari negara lain dibandingkan dengan isolat SLCCNV (Lampiran 1). Dilihat dari tingkat homologi isolat ToLCNDV asal Cikarawang, Petir, dan Sindangbarang memiliki tingkat homologi di atas 97%. Ketiga isolat tersebut memilki tingkat homologi tertinggi dengan ToLCNDV isolat Cucumis melo asal Taiwan dengan nomor aksesi GU180095 yaitu berkisar 95.6% hingga 96.2%, diikuti secara berurutan oleh isolat ToLCNDV asal Thailand, Indonesia, India, dan Pakistan (Tabel 2). Menurut King et al. (2012), virus-virus dikelompokkan dalam spesies yang sama apabila menunjukkan kesamaan sekuen nukleotida (tingkat homolgi) di atas 89%. Hal ini menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut termasuk spesies ToLCNDV bukan spesies SLCCNV. Tingkat homologi ToLCNDV asal Cikarawang, Petir, dan Sindangbarang dengan SLCCNV sangat rendah yaitu hanya 42% sampai 42.3% walaupun masih dalam satu genus Begomovirus. Hubungan Kekerabatan Filogenetika menggambarkan klasifikasi taksonomi suatu organisme berdasarkan pada sejarah evolusi. Analisis filogenetika digunakan untuk mengikuti perubahan yang terjadi secara cepat suatu spesies. Pohon filogeni ada bermacam-macam salah satunya UPGMA. Metode UPGMA merupakan metode sederhana untuk mengasumsikan rataan perubahan sepanjang pohon secara konsisten. Metode ini memberikan estimasi yang baik dan tidak terpengaruh ratarata perubahan panjang cabang pohon filogeni (Dharmayanti 2011). a) Tingkat homologi nukleotida dihitung menggunakan program BioEdit versi 7.17.0. Tabel 2 Tingkat homologi runutan nukleotida ToLCNDV isolat Bogor (Desa Cikarawang, Petir, dan Sindangbarang) dengan isolat ToLCNDV dari negara lain yang terdapat pada GenBank Homologi (%)a No Isolat virus No. aksesi Inang Tanaman 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Bogor: Cikarawag (Ci) Cucumis sativus ID (Mentimun) 2 Bogor: Petir (Pe) Cucumis sativus 97.4 ID (Mentimun) 3 Bogor: Sindangbarang (SB) Cucumis sativus 97.2 98.7 ID (Mentimun) 4 ToLCNDV Taiwan GU180095 Cucumis melo 95.6 96.2 96.1 ID (Melon) 5 ToLCNDV Thailand AB368448 Cucumis sativus 95.0 95.4 95.4 96.8 ID (Mentimun) 6 ToLCNDV Indonesia: Jawa JX416185 Capsicum annum 94.5 95.1 95.1 95.0 94.6 ID (Cabai) 7 ToLCNDV Pakistan EF620534 Luffa acutangula 92.5 93.0 93.2 93.7 93.1 92.2 ID (Oyong) 8 ToLCNDV India KC513822 Papaver somniferum 93.1 93.6 93.6 94.4 94.6 92.9 94.4 ID (Bunga Poppy) 9 SLCCNV India FJ859881 Cucurbita moschata 42.3 42.6 42.0 42.1 42.6 41.9 41.5 41.7 ID (Labu Kuning) 8 9 Analisis pohon filogenetika menunjukkan bahwa tiga isolat ToLCNDV asal Indonesia yaitu Bogor (Cikarawang, Petir, dan Sindangbarang) memiliki kekerabatan yang dekat dengan ToLCNDV isolat melon asal Taiwan dan isolat mentimun asal Thailand, keduanya berada dalam satu kelompok yang sama (Gambar 3). Menurut Septariani et al. (2014), ToLCNDV isolat mentimun dari Kampung Jawa, Bogor memiliki kekerabatan dekat dengan ToLCNDV isolat mentimun asal Thailand. Hal ini menunjukkan bahwa perbedaan lokasi dalam suatu daerah yang sama, memberikan keragaman genetik virus. Hasil filogenetika ini mengindikasi bahwa isolat ToLCNDV Cikarawang, Petir, dan Sindangbarang merupakan hasil adaptasi dari negara-negara tersebut yang masuk ke Indonesia melalui bahan tanaman. Virus ini ditularkan oleh kutu kebul (Bemicia tabaci), mempunyai kisaran inang yang luas dari tanaman budidaya dan gulma. Beberapa famili tanaman inang B. tabaci yaitu Araceae, Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Capparidaceae, Convolvulaceae, Solanaceae, Euphorbiaceae, Lamiaceae, Oxalidaceae, Papilionaceae, Rubiaceae, Solanaceae, dan Sterculiaceae (Hendrival et al. 2011). Kisaran inang ToLCNDV meliputi tanaman sayuran dan tanaman hias, sebagian besar dari famili Cucurbitaceae dan Solanaceae (Jyothsna et al. 2013). Data dalam GenBank memperlihatkan bahwa virus ini sudah terdapat di banyak negara seperti Banglades, India, Indonesia, Pakistan, Thailand, Taiwan, dan Vietnam. Salah satu cara yang dapat digunakan untuk mengendalikan virus menurut Sudiono dan Purnomo (2009) yaitu dengan menanam mentimun pada musim penghujan. Curah hujan yang tinggi pada musim penghujan, menyebabkan populasi kutu kebul menurun. Rendahnya populasi kutu kebul dapat menurunkan infeksi virus di lapangan. ToLCNDV-Mentimun-Indonesia(Pe) ToLCNDV-Mentimun-Indonesia(SB) ToLCNDV-Mentimun-Indonesia(Ci) ToLCNDV-Melon-Taiwan ToLCNDV-Mentimun-Thailand ToLCNDV-Cabai-Indonesia ToLCNDV-Oyong-Pakistan ToLCNDV-Bunga Poppy-India stan SLCCNV-Labu Kuning-India Gambar 3 Pohon filogenetika isolat-isolat Tomato leaf curl NewDelhi virus (ToLCNDV) berdasarkan sekuen nukleotida menggunakan program CLC sequence viewer versi 7.5 dan dikonstruksikan menggunakan perangkat ClustalX serta MEGA versi 6.60 dengan pendekatan UPGMA. Squash leaf curl China virus (SLCCNV) digunakan sebagai outgroup. 10 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Berdasarkan analisis sekuen nukleotida dapat simpulan bahwa virus yang berasosiasi dengan penyakit daun kuning pada tanaman mentimun di Bogor adalah ToLCNDV. Berdasarkan analisis filogenetika, isolat ToLCNDV asal Cikarawang, Petir, dan Sindangbarang Bogor memiliki kekerabatan yang dekat dengan ToLCNDV isolat melon asal Taiwan dan isolat mentimun asal Thailand. Saran Perlu dilakukan penelitian lanjutan mengenai kisaran inang ToLCNDV sebagai langkah awal pengendalian. 11 DAFTAR PUSTAKA Agrios GN. 2005. Plant Pathology. 5th. New York (US): Academic Press. Akin HM. 2006. Virologi Tumbuhan. Yogyakarta (ID): Kanisius. Ali-Shtayeh MS, Jamous RM, Mallah OB, Abu-Zeitoun SY. 2014. Molecular characterization of Watermelon chlorotic stunt virus (WmCSV) from Palestine. Viruses. 6:2444-2462. DOI:10.3390/v6062444. Bos L. 1990. Pengantar Virologi Tumbuhan. Triharso, penerjemah. Yogyakarta (ID): Gadjah Mada University Press. Terjemahan dari: Introduction of Plant Virology. [BPS] Badan Pusat Statistik. 2015. Produksi tanaman sayuran di Indonesia tahun 2010-2014 [internet]. Jakarta (ID): Badan Pusat Statistik Republik Indonesia; [diunduh 2014 April 4]. Tersedia pada: http://www.bps.go.id/ site/resultTab. Dharmayanti NLPI. 2011. Filogenetika molekuler: metode taksonomi organisme berdasarkan sejarah evolusi. Wartazoa. 21(1):1-10. Doyle JJ, Doyle JL. 1990. A rapid total DNA preparation procedure for fresh plant tissue. Focus. 12:13-15. [GIP] General Interest Periodicals. 2014. Health benefits of cucumbers. Kashmir Monitor [internet]. [diunduh 2015 April 6]. Tersedia pada: http://eresources.pnri.go.id:2057/docview/1496737212?pqorigsite=summon. Handoyo D, Rudiretna A. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase chain rection (PCR). Unitas. 9(1):17-19. Hendrival, Hidayat P, Nurmansyah A. 2011. Kisaran inang dan dinamika populasi Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) di pertanaman cabai merah. J HPT Tropika. 11(1): 47-56. Idris AM, Shahid MS, Briddon RW, Khan AJ, Zhu JK, Brown JK. 2011. An unusual alphasatellite associated with monopartite begomoviruses attenuates symptoms and reduces betasatellite accumulation. J Virol. 92:706-717. DOI:10.1099/vir.0.025288-0. Jyothsna P, Haq QM, Sing P, Sumiya KV, Praveen S, Rawayt R, Briddon RW, Malati VG. 2013. Infection of Tomato leaf curl NewDelhi virus (ToLCNDV), a bipartite begomovirus with betasatellites, results in enhanced level of helpervirus components and antagonistic interaction between DNA Ban betasatellites. Microbiol Biotechnol. 97(12):71-5457. DOI:10.1007/s00253-012-4685-9. [Kementan] Kementrian Pertanian. 2007. Keputusan Menteri Pertanian No: 22/Kpts/SR.120/1/2007 tentang Pelepasan Mentimun Hibrida Wulan sebagai Varietas Unggul. Jakarta (ID): RI. King AMQ, Adams MJ, Carstens EB, Lefkowitz EJ. 2012. Virus Taxonomy Classification and Nomenclature of Viruses Nineth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Deigo (US): Academic press. Li R, Salih S, Hurtt S. 2004. Detection of Geminiviruses in sweetpotato by polymerase chain reaction. Plant Disease. 88:1347-1351. Narayanasamy P. 2011. Microbial Plant Pathogens-Detection and Disease Diagnosis: Fungal Pathogens. Edisi ke-3. New York (US): Springer. 12 Phaneendra C, Rao KRSS, Jain RK, Mandal. 2012. Tomato leaf curl NewDelhi virus is associated with pumpkin leaf curl: a new disease in Northern India. Indian J Virol. 23(1):42-45. DOI:10.1007/s13337-011-0054-z. Polston JE dan Anderson PK. 1997. The emergence of whitefly-transmitted Geminiviruses in tomato in the Western hemisphere. Plant Desease. 81(12):1358-1369. [Puslitbanghorti] Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Hortikultura. 2009. Budidaya tanman mentimun [Internet]. [diunduh pada 2015 April 23]. Tersedia pada: http://hortikultura.litbang.pertanian.go.id. Rukmana R. 1994. Budidaya Mentimun. Yogyakarta (ID): Kanisius. Rukmana R. 2005. Bertanam Sayuran di Pekarangan. Yogyakarta (ID): Kanisius. Sawangjit S. 2009. The complete nucleotide sequence of Squash leaf curl China virus-[Wax gourd] and its phylogenetic relationship to other Geminiviruses. Science Asia. 35:131-136. DOI:10.2306/scienceasia1513-1874.2009.35. 131. Septariani DN, Hidayat SH, Nurhayati E. 2014. Identifikasi penyebab penyakit daun keriting kuning pada tanaman mentimun. J HPT Tropika. 14(1):80-86. Sohrab SS, Karim S, Varma A, Abuzenadah AM, Chaudhary AG, Damanhouri GA, Mandal B. 2013. Characterization of Tomato leaf curl New Delhi virus infecting cucurbits: Evidence for sap transmission in a host specific manner. African J Biotechnol. 12(32):500-5009. DOI:10.5897/AJB2013.12012. Sudiono, Purnomo 2009. Hubungan antara populasi kutu kebul (Bemicia tabaci Genn) dan penyakit kuning pada cabai di Lampung Barat. J HPT Tropika. 9(2):115-120. Tahir M, Haider MS, Briddon RW. 2010. First report of Squash leaf curl China virus in Pakistan. Plant Disease. 5:21-24. 13 LAMPIRAN 14 Lampiran 1 Hasil penjajaran sekuen nukleotida fragmen DNA isolat ToLCNDVIndo(Ci) (Bogor: Cikarawang), ToLCNDV-Indo(Pe) (Bogor: Petir), dan ToLCNDV-Indo(SB) (Bogor: Sindangbarang) dengan isolat ToLCNDV lainnya serta sekuen pembanding outgroup isolat SLCCNV-India yang terdapat pada GenBank menggunakan program ClustalW. Tanda *(bintang) menunjukan basa nukleotida yang identik. ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV-India SLCCNV-India Clustal Co ....|....| 5 GATCATGGCA GATCATGGCA GATCATGGCA GATCATGGCA GATCATGGCA GATCATGGCA GATCATGGCA GATCATGGCA TATTTCAGTT ** * ....|....| 15 GTTAATTGAT GTTTATTGAT GTTGATTGAT GTTGATTGAT GTTGATTGAT GTTGATTGAT GTTGATCGAT GTTGATCGAT ATCCCGTCCC * ....|....| 25 ATGTAATACG ATGTAATACG ATGTAATATG ATATAATACG ATATAATACG ATGTAATACG ATATAATACG ATGTAATACG TCGTAATGCT **** ....|....| 35 TGC-ACCCAC TGC-ACCCAC TGC-ACCCAC TGC-ACCCAC TGC-ACCCAC TGC-ACCCAC AAC-AACCAC AAC-ACCCAC TCCCACCTGT * * * ....|....| 45 ACTGCAGATC ACTGCAGATC ACTGCAGATC ACTGCAGATC AATGCAGATC ACTGCAGATC ACGGCAGATC ACGGCAGATC GATGCCGATG ** *** ....|....| 55 AACTCGCCTC AACTCGCCTC AACTCGCCTC AACTCGCCTC AACTCGCCTC AACTCGCCTC AACTCGCCTC AACTCGCCTC GACCTGGATC ** * ** ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV-India SLCCNV-India Clustal Co ....|....| 65 --CTGCGAAT --CTGCGAAT --CTGCGAAT --CTGCGAAT --CTGCGAAT --CTGCGAAT --CTGCGAAT --CTGCGAAT AATTGCGGAT **** ** ....|....| 75 GCTCTTCTTC GCTCTTCTTC GCTCTTCTTC GCTCTTCTTC GCTCTTCTTC GCTCTTCTTC GCTCTTCTTC GCTCTTCTTC TCATCTAATC * * ** ....|....| 85 TTCTTCTGTG TTCTTCTGTG TTCTTCTGTG TTCTTCTGTG TTCTTCTGTG TTCTTCTGTG TTCTTCTGTG TTCTTCTGCG CGCTGAGGTT ** * ....|....| 95 G--GAGCGAT G--GAGCGAT G--GAGCGAT G--GAGCGAT G--GAGCGAT G--GAGCGAT G--GAGCGAT G--GAGCGAT TTTATACGGT ** * ....|....| 105 GTTTTCGCGA GTTTTCGCGA GTTTTCGCGA GTTTTCGCGA GTTTTCGCGA GTTTTCGCGA GTTTTCGCGA GTTTTCGCGA CTGCTGGTGA * * * ** ....|....| 115 CAGGAATAGA CCGGAATAGA CCGGAATAGA CCGGAATAGA CCGGAATAGA CAGGAATAGA CCGGAATAGA CCGGAATAGA CTGAACCCAG * * * ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV-India SLCCNV-India Clustal Co ....|....| 125 GTGGTTCTTC GTGGTTCTTC GTGGTTCTTC GTGGTTCTTC GTGGTTCTTC GTGGTTCTTC GTGGTTCTTC GTGGTTCTTC CCCAATTTCC * * * ....|....| 135 GA---GTGTG GA---GTGTG GA---GTGTG GA---GTGTG GA---GTGTG GA---GTGTG GA---GTGTG GA---GTGTG GATCTACTTG ** ** ....|....| 145 ATGAAGACTATGAAGACTATGAAGACTATGAAGACTATGAAGACTATGAAGACTATGAAGACTATGAAGACTCCCACGATTC * ** * ....|....| 155 ------------------------------------------------------------------------GTTCGGACCA ....|....| 165 ---GCAT--T ---GCAT--T ---GCAT--T ---GCAT--T ---GCAT--T ---GCAT--T ---GCAT--T ---GCAT--T ATCGCAAGAT *** * ....|....| 175 CTTGATTGCC CTTGATTGCC CTTGATTGCC TTTCATTGCC CTTGATTGCC CTTGATTGCC CTTGATTGCC CTTGATTGCC GTGGGACGCG * ** ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV-India SLCCNV-India Clustal Co ....|....| 185 CACTGCTTCA CAATGCTTCA CACTGCTTCA CACTGCTTCA CACTGCTTCA CACTGCTTCA CACTGCTTCA CACTGCTTCA TAATGATCTA * ** * * ....|....| 195 GTGCTGAATT GTGCTGCATT GTGCTGCATT GTGCTGCATT GTTCTGCATT GTGCTGAATT GTGCTGCATT GTGCTGCATT GAGCTGTGAC * *** ....|....| 205 TTTT---TCT CTTT---TCC CTTT---TCC TTTT---TCT TTTT---TCT TTTT---TCT TTTT---TCT TTTC---TCT CCATGAGTCT ** ....|....| 215 TCATCCAGAT TCATCCAGAT TCATCCAGAT TCGTCCAGAT TCGTCCAGAT TCATCCAGAT TCGTCCAGAT TCGTCCAGAT TGATCCATCT * **** * ....|....| 225 AT---TCCTT AT---TCCTT AT---TCCTT AG---TCCTT AT---TCCTT AT---TCCTT AT---TCCTT AT---TCCTT ACGAGCCGTC * * * ....|....| 235 ATAGCTGCTA ATAGCTGCTA ATAGCTGCTA ATAACTGCTA ATAGCTGCTA ATAGCTGCTA ATAGCTGCTG ATAGCTGCTG TTGTTTGTGG * ** ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV-India SLCCNV-India Clustal Co ....|....| 245 TTTGGACCTT TTTGGACCTT TTTGGACCTT TTTGGACCTT TTTGGACCTT TTTGGACCTT TTTGGACCTT TTTGGACCTT TTTTGAGCCC *** ** * ....|....| 255 TATTGCAGAG TATTGCACAG TATTGCACAG TATTGCAGAG TATTGCACAG TATTGCACAG TATTGCACAG TATTGCACAG -ACTGACCAG * ** ** ....|....| 265 GAA------GAA------GAA------GAA------GAA------GAA------GAA------GAA------AAATCTATGT ** ....|....| 275 -GATAGTGGG -GATAGTGGG -GATAGTGGG -GATAGTGGG -GATAGTGGG -GATAGTGGG -GATAGTGGG -GATAGTGGG CGTTAACGGT * ** ** ....|....| 285 AATTCCTCCT AATTCCTCCT AATTCCTCCT AATTCCTCCT AATTCCTCCT AATTCCTCCT AATTCCTCCT AATTCCTCCT GAATTCTTTG * * ** ....|....| 295 TTAATCATGA TTAATCATGA TTAATCATGA TTAATCATGA TTAATCATGA TTAATCATGA TTAATCATGA TTAATCATGA CTCTGTATCT * ** 15 Lampiran 1(lanjutan) ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV-India SLCCNV-India Clustal Co ....|....| 305 CTGGCTTTCC CAGGCTTTCC CAGGCTTTCC CAGGCTTTCC CAGGCTTTCC CAGGCTTTCC CTGGCTTTCC CTGGCTTTCC CTA-TTCTTG * * * ....|....| 315 GTACTTGGTG GTACTTGGTG GTACTTGGTG GTACTTCGTG GTACTTCGTG GTACTTCGTG GTATTTTGTG GTACTTCGTG GTGCTCGGAA ** * * ....|....| 325 TTGCTTTGCC TTGCTTTGCC TTGCTTTGCC TTGCTTTGCC TTGCTTTGCC TTGCTTTGCC TTGCTTTGCC TTGCTTTGCC TT-CGACGTC ** * * * ....|....| 335 AGTCACGCTG AGTCACGCTG AGTCACGCTG AGTCACGCTG AGTCACGCTG AGTCACGCTG AGTCACGCTG AGTCACGCTG AGTCGAATGT **** ....|....| 345 GGCCCCCATG GGCCCCCATG GGCCCCCATG GGCCCCCATG GGCCCCCATG GGCCCCCATG GGCCCCCATG GGCCCCCATG TTAGCCGAGG ** * * ....|....| 355 AATTCTTTAA AATTCTTTAA AATTCTTTAA AATTCTTTAA AATTCTTTAA AATTCTTTAA AATTCTTTAA AATTCTTTAA ATAGTTTTAA * ***** ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV-India SLCCNV-India Clustal Co ....|....| 365 AGTGCTTTAG AGTGCTTTAG AGTGCTTTAG AGTGCTTTAG AGTGCTTTAG AGTGCTTTAG AGTGCTTTAG AGTGCTTTAG TTTACCAAGC * * ....|....| 375 ATAGTGCGGA ATAGTGCGGA ATAGTGCGGA ATAGTGCGGA ATAGTGCGGA ATAGTGCGGA ATAGTGGGGA ATAGTGGGGA ATCTTACAGA ** * ** ....|....| 385 --TCGACGTC --TCAACGTC --TCAACGTC --TCAACATC --TCGACGTC --TCAACGTC --TCAACGTC --TCAACGTC AATGAACTCC * ** * ....|....| 395 ATCAATGACG ATCAATGACG ATCAATGACG ATCAATGACG ATCAATTACG ATCAATGACG ATCAATGACG ATCAATGACG ATTTACTACG ** * *** ....|....| 405 TT-GTACCAT TT-GTACCAG TT-GTACCAG TT-GTACCAG TT-GTACCAT TT-GTACCAG TT-GTACCAG TT-GTACCAG TTCGTGTTCT ** ** ....|....| 415 GCATAAT-TG GCATCAT-TG GCATCAT-TG GCATCAT-TG GCATTAT-TG GCATCAT-TG GCATCAT-TG GCATCAT-TG CCACTCTGTA ** * * ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV-India SLCCNV-India Clustal Co ....|....| 425 CTATACACCT CTATACACCT CTATACACCT CTATACACCT CTATACACCT CTATACACCT CTATACACCT CTATACACCT CTCAACTCTC ** ** * ....|....| 435 TCGGG----TTGGG----TTGGG----TTGGG----TTGGG----TTGGG----TTGGG----TTGGG----CAAGGATTTT ** ....|....| 445 ---CTGAGAT ---CTGAGAT ---CTGAGAT ---CTCAGAT ---CTCAGAT ---CTGAGAT ---CTCAGAT ---CTCAGAT TATCCTTAAC * * ....|....| 455 CAAGATGTCC CTAGATGTCC CCAGATGTCC CTAGATGTCC CGAGATGTCC CTAGATGTCC CAAGATGTCC CAAGATGTCC GGAGAAGTAC *** ** * ....|....| 465 AC--ACAAGT AC--ACAAGT AC--ACAAGT AC--ACAAGT AC--ACAAGT AC--ACAAGT AC--ACAAGT AC--ACAAGT GTGGATGAGT * *** ....|....| 475 AATTGTGTGG AATTGTGTGG AATTGTGTGG AATTGTGTCG AATTGTGTGG AATTGTGTGG AATTGTGGGG AATTGTGTGG AGTAGTGCAG * * *** * ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV-India SLCCNV-India Clustal Co ....|....| 485 GCCTAAG--GCCTAAG--GCCTAAG--GCCTAAG--GCCTAAG--TCCTAAG--TCCTAAG--TCCCAAG--ATTACAGTTG ** ....|....| 495 CAACGAGCCC CAACGAGCCC CAACGAGCCC CACCGAGCCC CACCGAGCCC CACCGTGCCC CATCGAGCCC CAACGAGCCC CATTTAATCG ** * ....|....| 505 ACATTGT--ACATTGT--ACATTGT--ACATTGT--ACATTGT--ACATTGT--ACATTGT--ACATTGT--GAATTGTGAA ***** ....|....| 515 -TTTACCCGT -TTTACCCGT -TTTCCCCGT -TTTGCCCGT -TTTGCCTGT -TTTGCCCGT -TTTGCCCGT -TTTGCCCGT TTCTGCTTGT * * * ** ....|....| 525 TCTACTATCC TCTACTATCC TCTACTATCC TCTACTATCC TCTACTATCC TCTACTATCA TCTACTATCC TCTACTATCC TTCG-TGTCC * * ** ....|....| 535 CCCTCTATTA CCCTCTATTA CCCTCTATTA CCCTCTATGA CCCTCAATTA CCCTCTACTA CCCTCTATGA CCCTCAATGA CCCTCTGTCA ***** * ....|....| 545 CTATACT--T CTATGCT--A CTATGCT--T CTATGCT--T CTATGCT--T CTATGCT--T CTATGCT--T CTATGCT--T ATCTCATGTC * * * ....|....| 605 ATCGACGAGT ATCGACGAGT ATCGACGAGT ATCGACGAGT ATCGACGAGT ATCGACGAGT ATCGACGAGT ATGGACAAGT ACTGCGATAT * * * ....|....| 555 ATGGGCCGAA ATGGGCCTAA ATGGGCCTAA ATGGGCCTAA ATGGGCCTAA ATGGGTCTTA ATGGGCCTAA ATGGGCCTAA GTGAATTTCA ** * ....|....| 615 TGCTGAGGAA TGCGGAGGAA TGCGGAGGAA TGCGGAGGAA TCAGGAGGAA TGAGGAGGAA TCTGCCGGAA TCTGGAGGAA TCAAGCAGAA * *** ....|....| 565 AAGGCCGCGC AAGGCCGCGC AAGGCCGCGC AAGGCCGCGC AAGGCCGCGC AAGGCCGCGC AAGGCCGCGC AAGGCCGCGC ATAACCACAT * ** * ....|....| 625 CTCTGTCGAA CTCTGTCGAA CTCTGTCGAA CTCTGTCGAA CTCTGTCGAA CTCTGTCGAA CTCTGTCGAA CTCTGTCGAA CGTGATCAAT * ** * ....|....| 575 AGCGGCACAC AGCGGCACAC AGCGGCACAC AGCGGCACAC AGCGGCACAG AGCGGCACAC AGCGGCACAC AGCGGCACAC ----GCCCA** ** ....|....| 635 GG--ATGAAA GG--ATGAAA GG--ATGAAA GG--ATGAAA GG--ATGAAA GG--ATGAAA GG--ATGAAA GG--AAGAAA TTTCATGCAT * * * ....|....| 585 ACAACATTCG ACAACATTCG ACAACATTCG ACAACATTGG ACAACATTGG AAAACATTCG ACAACATTGG ACAACATTCA ACTGCATTAA * **** ....|....| 645 TGGAATATGG TGGAATATGG TGGAATATGG TTGAAAATGG TTAAAAATGG TTGAAAATGG TAGAAAATGG TTGAAAATGG CTGTTTCTCA * ....|....| 595 ACGACACCCA ACGACACCCA ACGACACCCA ACGACACCCA ACGACACCCA ACGAAACCCA ACGAGACCCA CACTGGCCCA TTGGTACTTG * ....|....| 655 AGACGCATAA AGACGCATAA AGACGCATAA AGACGCATAA AGACGCATAA AGACGCATAA AGAAACATAA AGAAACGTAA ATTGAC-TGA * * * * ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV-India SLCCNV-India Clustal Co ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV-India SLCCNV-India Clustal Co 16 Lampiran 1(lanjutan) ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV-India SLCCNV-India Clustal Co ....|....| 665 ACCTCAGAAG ACCTCAGAAG ACCTCAAAAG ACCTCAGAAG ACCTCAGAAG ACCTGAGAAG ACCTCAGAAC ACCTCAGAAC TCTTCTGTTC * * ....|....| ....|....| ....|....| 675 685 695 GAGGTTGAAA AATGCGATCT AAATTACTAA GAGGTTGAAA AATGCGATCT AAATTACTAA AAGGTTGAAA AATGCGATCT AAATTAGTAA GAGGTTGGAA AATGCGATCT AAATTGCTAA GAGGTTGGAA AATGCGATCT AAATTGCTAA GAGGTTGAAA AATGCGATCT AAATTATTAG GAGGTTGAAA AATGCGATCT AAATTTGTAA GAGGTTGGAA AATGCGATCC AAATTGCTAA GACATTGAAG GGGAACGTCA GAGTGACTTC * *** * ** * * * ....|....| 705 TTAAATTATG TTAAATTATG TTAAATTATG TTAAATTATG TTAAATTATG TTAAATTATG CTAAATTATG TTAAATTATG CGCAGCGTCG * ....|....| 715 AAACTGCAGA AAACTGTAGA AAACTGCAGA AAACTGCAGA AAACTGCAGA AAACTGCAAG AAACTGCAGA AAACTGCAGA TTTGTG-AGA * ** * ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV_India SLCCNV-India Clustal Co ....|....| 725 ACATAGTCTT ACATAATCTT ACATAATCTT ACGTAATCTT ACATAATCTT ACATAATCTT ACGTAATCCT ACATAATCCT GCGTACTCTA * ** ** ....|....| 735 TTGGTGCTAA TTGGTGCTAA TTGGTGCTAA TTGGTGCTAA TTGGAGCTAA TTGGTGCTAA TTGGTGCTAA TTGGGGCTAA CGCGATCCGA * * * ....|....| 745 TTCCTTTATT TTCCTTTATG TTCCTTTATG TTCCTTTATC TTCCTTTAAC TTCCCTTAAA TTCTTTCAAT TTCCTTTAAT TTC-TATGTA *** ....|....| 755 ACTTTCAACG ACTTTCAACG ACTTTCAACG ACTTTCAACG ACTTTCAATG ACTTTCAACG ACTTTCAACG ACTTTCAATG CCCTCCAACA * * *** ....|....| 765 C----ATCTT C----ATCTT C----ATCTT C----ATCTT C----ATCTT C----ATCCT C----ATCCT C----ATCTT CCAAGACCCA * * * ....|....| 775 CTTTATTCCC CTTTATTCCC CTTTATTCCC CTTTATTCCC CTTTATTCCC CTTTATTCCC CTTTATTTCC CTTTATTCCC TGTTATCATT **** ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV_Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV_India SLCCNV-India Clustal Co ....|....| 785 CGTATTAATC CGTGTTAATC CGTGTTAATC CGTATTAATC CGTGTTAATC CGTGTTAATC TGTGTTAATT CGTGTTAATC TCTTACTGAC * ....|....| 795 GCCTTAGCAT GCCTTAGCAT GCCTTAGCAT GCCTTAGCAT GCCTTAGCAT GCCTTAGCAT GCCTGAGCAT GCCTTAGCAT ATTTTGGCA* *** ....|....| 805 ATGCATCGTT ATGCATCGTT ATGCATCGTT ATGCATCGTT ATGCATCGTT ATGCATCGTT ATGCATCGTT ATGCATCGTT GCGCAGCAGA *** * ....|....| 815 TGCCG-TTTG TGCCG-TTTG TGCCG-TTTG GGCCG-TCTG GGCCG-TCTG GGCCG-TCTG TGCCG-TCTG GGCCG-TCTG AATGGCTCCG * * * ....|....| 825 CTGACCG--CTGACCG--CTGACCG--CTGACCA--CTGACCA--CTGACCA--TTGACCT--CTGACCA--CAGGTGAATA * ....|....| 835 --CCACGAGC --CCACGAGC --CCACGAGC --CCACGAGC --CCACGAGC --CCACGAGC --CCACGAGC --CCACGAGC AACTATGAAA * * ** ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV_India SLCCNV-India Clustal Co ....|....| 845 AGATCGTCCA AGATCGTCCA AGATCGTCCA AGATCGTCCA AGATCGTCCA AGATCGTCCA AGATCGTCCA AGATCGTCCA CGGATGTTAA * ** * ....|....| 855 TCGAT--CTG TCGAT--CTG TCGAT--CTG TCGAT--CTG TCAAT--CTG TCGAT--CTG TCGAT--CTG TCGAT--CTG AGAATGTTTG ** ** ....|....| 865 GAAAACACCC GAAAACACCC GAAAACACCC GAAAACACCC GAAAACACCC GAACTGACCC GAAAACACCC GAAAACACCC GAAACGAACA *** * * ....|....| 875 -----CATTC -----CATTC -----CATTC -----CATTC -----CATTC -----CACTC -----CATTC -----CATTC AAGTACAGTT ** * ....|....| 885 TAGAACGTCC TAGAACGTCA TAGAACGTCC TAGAACGTCT TAGAACGTCT TATAACATCT TAGAACGTCT TAGAACGTCT TGAAATGAAA * ** ....|....| 895 CCGTCTTTGT CCGTCTTTGT CCGTCTTTGT CCGTCTTTGT CCGTCTTTGT CCGTCTTTGT CCGTCTTTGT CCGTCTTTGT CACAGGACAA * ToLCNDV-Indo(Ci) ToLCNDV-Indo(Pe) ToLCNDV-Indo(SB) ToLCNDV-Taiwan ToLCNDV-Thailand ToLCNDV-Indo(Java) ToLCNDV-Pakistan ToLCNDV_India SLCCNV-India Clustal Co ....|....| 905 CGATGTATGC CGATGTATGC CGATGTATGC CGATGTATGC CGATGTATGC CGATGTATGC CGATATACTT CGATGTATGC CTGTGTTTCC * * * ....|....| 915 TTTGA-CATC TTTGA-CATC TTTGA-CATC TTTGA-CATC TTTGA-CATC TTTGA-CATC CTTGA-CATC TTTGA-CATC AATGAACATC *** **** ....|....| 925 TGACGCTGAT TGACGCTGAT TGACGCTGAT TGACGCTGAT TGACGCTGAT TGACGCTGAT TGACGCTGAT TGACGCTGAT TAACACTTAT * ** ** ** 17 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Ngawi, pada 17 Mei 1993. Penulis adalah anak pertama dari dua bersaudara dari pasangan Bapak Darmanto dan Ibu Kasminah, dengan adik bernama Dwi Wijayanti. Penulis menempuh pendidikan di TK tunas Melati Pakah pada tahun 1999, SDN Pakah 2 pada Tahun 2005, MTsN Mantingan pada tahun 2008, dan SMAN 1 Gondang pada tahun 2011. Tahun 2011, penulis diterima sebagai mahasiswa program studi Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor melalui jalur SNMPTN Undangan. Penulis juga mengambil mata kuliah minor Kewirausahaan Agribisnis. Selama menjadi mahasiswi, penulis pernah menjadi anggota Gugus Disiplin Asrama (GDA) dan anggota UKM Karateka IPB pada tahun 2011. Tahun 20112014 penulis menjadi anggota kepengurusan Paguyupan Mahasiswa Sragen Bogor (PMSB). Tahun 2012-2014 penulis menjadi penghuni dan aktif dalam kegiatan Asrama Putri Dramaga (APD). Pada tahun 2012 penulis menjadi anggota kepengurusan Himpunan mahasiswa Proteksi Tanaman (Himasita) IPB. Tahun 2013 menjadi anggota Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Pertanian (BEM FAPERTA). Penulis juga mengikuti beberapa kepanitianaan dikegiatan IPB, Fakultas Pertanian, dan Departemen Proteksi Tanaman.
