perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id SELEKSI BAKTERI FILOSFER PADI SEBAGAI AGEN BIOKONTROL Xanthomonas oryzae pv. oryzae PENYEBAB PENYAKIT HAWAR DAUN BAKTERI PADA PADI TESIS Disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan mencapai derajat Magister Program Studi Biosain Oleh Rivia Kumala Dewi S901308016 PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA commit to user 2015 i perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id commit to user ii perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id commit to user iii perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id commit to user iv perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id Rivia Kumala Dewi. NIM. S901308016. 2015. Seleksi Bakteri Filosfer Padi Sebagai Agen Biokontrol Xanthomonas oryzae pv. oryzae Penyebab Penyakit Hawar Daun Bakteri Pada Padi. TESIS. Pembimbing I: Prof. Drs. Suranto, M.Sc, Ph.D, Pembimbing II: Dr. Ari Susilowati, M.Si. Program Studi Biosain, Program Pascasarjana, Universitas Sebelas Maret Surakarta. ABSTRAK Hawar daun bakteri (HDB) yang disebabkan oleh bakteri Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) merupakan penyakit yang paling banyak menyerang padi. Biokontrol merupakan salah satu alternatif pengendalian HDB yang ramah lingkungan. Penelitian ini bertujuan untuk menyeleksi bakteri filosfer padi yang bersifat antagonis terhadap Xoo, mendeteksi gen polyketide synthase (PKS) pada DNA genom bakteri antagonis, mengidentifikasi golongan senyawa bioaktif dan menguji aktivitas anti-Xoo ekstrak senyawa bioaktif. Bakteri diisolasi dari daun padi dan diuji kemampuan antagonisnya terhadap Xoo dengan menggunakan uji dual plate, kemudian dilakukan uji hipersensitivitas dan uji patogenisitas. Bakteri antagonis terpilih diidentifikasi berdasarkan karakter morfologi koloni dan sel serta gen penyandi 16S rRNA. Deteksi gen PKS dilakukan dengan menggunakan primer degKS2F.gc dan degKSR5.gc. Ekstraksi senyawa bioaktif dilakukan dengan metode ekstraksi bertingkat menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat, dan metanol. Identifikasi golongan senyawa bioaktif dilakukan dengan menggunakan kromatografi kolom dan spektrofotometer UV-VIS. Uji aktivitas anti-Xoo ekstrak senyawa bioaktif dilakukan dengan menggunakan metode difusi cakram. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa bakteri filosfer padi yang bersifat antagonis terhadap Xoo adalah bakteri Pseudomonadaceae SH2a yang menghasilkan senyawa bioaktif golongan poliketid (pyoluteorin dan 2,4-diacetylphloroglucinol), penazin, pirrolnitrin, peptida, terpenoid, alkaloid, serta lipopeptida; Pantoea sp. MO142; Pantoea sp. MO22g; Erwinia sp. MO34h; Pantoea sp. MO34i; Pantoea sp. MO34j; Pantoea sp. MO43a; serta Pantoea sp. MO63j yang menghasilkan senyawa bioaktif golongan poliketid, peptida, terpenoid, alkaloid, serta lipopeptida. Gen PKS dapat terdeteksi pada DNA genom Pantoea sp. MO22g, Erwinia sp. MO34h, Pantoea sp. MO34i, Pantoea sp. MO34j, serta Pantoea sp. MO43a. Ekstrak senyawa bioaktif bakteri antagonis yang memiliki aktivitas anti-Xoo adalah ekstrak kasar dan fraksi metanol bakteri Pseudomonadaceae SH2a; ekstrak kasar dan fraksi n-heksan Pantoea sp. MO22g, Pantoea sp. MO43a, dan Pantoea sp. MO63j; ekstrak kasar Erwinia sp. MO34h dan Pantoea sp. MO34j; ekstrak kasar, fraksi etil asetat, dan fraksi n-heksan Pantoea sp. MO34i. Kata kunci: filosfer, padi, biokontrol, Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), antagonis, hawar daun bakteri commit to user v perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id Rivia Kumala Dewi. NIM. S901308016. 2015. Selection of Rice Phyllosphere Bacteria As Biocontrol Agents Xanthomonas oryzae pv. oryzae the Causal Bacterial Leaf Blight In Rice. THESIS. Supervisors I: Prof. Drs. Suranto, M.Sc, Ph.D, II: Dr. Ari Susilowati, (M.Sc. Thesis). Bioscience Studies Program, Graduate Program, Sebelas Maret University Surakarta. ABSTRACT Bacterial leaf blight (BLB) was caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is the most commonly attacking rice disease. Therefore we introduced an alternative approach to control the BLB by using biocontrol agents that environment-friendly. The aims of this study were to (i) select rice phyllosphere bacteria antagonistic against Xoo, (ii) detect polyketide synthase (PKS) gene from genomic DNA of antagonist bacteria (iii) identify the groups of bioactive compounds and (iv) test the anti-Xoo activity bioactive compounds extract. Bacteria were isolated from rice leaves and antagonistic ability against Xoo was tested using a dual plate method, and then hypersensitivity and pathogenicity test were conducted respectively. The selected antagonist bacteria were identified based on type of colonies and the morphological character cell, and as well as genes encoding 16S rRNA. Detection of PKS gene was performed using primer degKS2F.gc and degKSR5.gc, while extraction of bioactive compounds was carried out under stratified extraction using n-hexane, ethyl acetate, and methanol solvent respectively. Column chromatography and UV-VIS spectrophotometer were used to identify groups of bioactive compounds. Disc diffusion method was used to look at anti-Xoo activity of bioactive compounds extract. The results showed that rice phyllosphere bacteria antagonistic against Xoo were Pseudomonadaceae SH2a bacterium which produced bioactive compounds polyketide (pyoluteorin and 2,4-diacetylphloroglucinol), phenazine, pyrrolnitrin, peptides, terpenoids, alkaloids, and lipopeptide groups. In addition Pantoea sp. MO142, Pantoea sp. MO22g, Erwinia sp. MO34h, Pantoea sp. MO34i, Pantoea sp. MO34j, Pantoea sp. MO43a, and Pantoea sp. MO63j produced bioactive compounds polyketide, peptides, terpenoids, alkaloids, and lipopeptide groups. Polyketide synthase gene was detected from genomic DNA Pantoea sp. MO22g, Erwinia sp. MO34h, Pantoea sp. MO34i, Pantoea sp. MO34j, and Pantoea sp. MO43a. Bioactive compounds extract from antagonist bacteria that have anti-Xoo activity is crude extracts and methanol fractions Pseudomonadaceae SH2a bacterium; crude extract and n-hexane fractions Pantoea sp. MO22g, Pantoea sp. MO43a, and Pantoea sp. MO63j; crude extract of Erwinia sp. MO34h and Pantoea sp. MO34j; crude extract, ethyl acetate fractions and n-hexane fraction Pantoea sp. MO34i. Keywords: phyllosphere, rice, biocontrol, Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), antagonist, bacterial leaf blight commit to user vi perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id MOTTO ”Sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan. Maka apabila kamu telah selesai (dari suatu urusan), kerjakanlah dengan sungguh-sungguh (urusan) yang lain, dan hanya kepada Tuhan-mulah hendaknya kamu berharap” (QS. Al-Insyiroh: 6-8) ”Barang siapa yang menghendaki kehidupan dunia maka wajib baginya memiliki ilmu, dan barang siapa yang menghendaki kehidupan akhirat, maka wajib baginya memiliki ilmu, dan barang siapa menghendaki keduanya maka wajib baginya memiliki ilmu” (HR. Turmudzi) ”Tidaklah didapatkan ilmu dengan jasad yang santai” (Yahya bin Abi Katsir) “Jika kamu berada di sore hari jangan tunggu pagi hari dan jika kamu berada di pagi hari jangan tunggu sore hari, gunakanlah kesehatanmu untuk (persiapan saat) sakitmu dan kehidupanmu untuk kematianmu “ (HR. Bukhori) Awal dari efisiensi adalah ketertiban commit to user vii perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id HALAMAN PERSEMBAHAN Teriring rasa syukur kepada Allah SWT, karya ini kupersembahkan kepada: Ibunda (almh.) tersayang yang selalu menguatkan dan mencurahkan kasih sayangnya . . . Ayahanda tercinta yang selalu menjaga dan memberikan pandangan lain dalam menyikapi suatu permasalahan . . . Seluruh keluarga besarku yang selalu memberikan semangat dan bantuan . . . Almamaterku . . . commit to user viii perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan Kehadirat Allah Subhanahu Wa Ta`ala atas segala nikmat, hikmah dan petunjuk-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul “Seleksi Bakteri Filosfer Padi Sebagai Agen Biokontrol Xanthomonas oryzae pv. oryzae Penyebab Penyakit Hawar Daun Bakteri Pada Padi”. Tulisan ini menyajikan bahasan tentang bakteri yang bersifat antagonis terhadap Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), identifikasi bakteri antagonis berdasarkan karakter morfologi dan gen penyandi 16S rRNA, deteksi gen polyketide synthase (PKS), senyawa bioaktif yang dihasilkan bakteri antagonis, serta uji aktivitas anti-Xoo ekstrak senyawa bioaktif. Nilai penting dari penelitian ini adalah dengan ditemukannya bakteri yang bersifat antagonis terhadap Xoo maka dapat dikembangkan alternatif pengendalian penyakit hawar daun bakteri pada padi yang ramah lingkungan sehingga penurunan hasil produksi padi dapat diminimalisir tanpa menimbulkan pencemaran lingkungan. Bakteri antagonis ataupun senyawa bioaktif yang dihasilkannya dapat diaplikasikan pada padi yang sehat sebagai langkah pencegahan penyakit atau pada padi yang terserang penyakit sebagai langkah pengobatan. Tulisan ini masih banyak memiliki kekurangan dan jauh dari sempurna. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran yang bersifat membangun sehingga tulisan ini menjadi lebih baik dan bermanfaat bagi yang membutuhkan. Surakarta, Juni 2015 Penulis commit to user ix perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id UCAPAN TERIMA KASIH Alhamdulillah, puji syukur penulis panjatkan Kehadirat Allah Subhanahu Wa Ta`ala yang telah menganugerahkan rahmat dan taufik-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul “Seleksi Bakteri Filosfer Padi Sebagai Agen Biokontrol Xanthomonas oryzae pv. oryzae Penyebab Penyakit Hawar Daun Bakteri Pada Padi”. Penulis juga ingin menyampaikan terima kasih dan penghormatan kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian tesis ini, yaitu: 1. Rektor Universitas Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan izin belajar di Universitas Sebelas Maret. 2. Direktur Program Pascasarjana Universitas Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan izin belajar di program studi Biosain. 3. Ketua Program Studi Biosain yang telah memberikan bimbingan dan dukungan dalam menyelesaikan pembelajaran. 4. Prof. Drs. Suranto, M.Sc, Ph.D selaku dosen pembimbing pertama yang selalu memberikan nasehat, arahan, dan motivasi hingga terselesaikannya penulisan tesis ini. 5. Dr. Ari Susilowati, M.Si selaku dosen pembimbing kedua yang telah banyak membimbing, memotivasi, dan memberikan kepercayaan kepada penulis untuk ikut ambil bagian dalam proyek penelitian ini. 6. Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si selaku dosen pembimbing akademik dan dosen penguji yang telah banyak memberikan bimbingan dan nasehat dalam menyelesaikan pembelajaran. 7. Dr. Artini Pangastuti, M.Si selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan bimbingan dalam penulisan tesis ini. 8. Semua dosen di Program Studi Biosain yang telah memberikan banyak ilmu kepada penulis. 9. Ketua Laboratorium Biologi FMIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan izin kepada penulis untuk melakukan penelitian dalam suasana kondusif. 10. Semua guru penulis mulai dari RA, MI, MTsN dan MAN serta dosen program sarjana atas semua pendidikan dan kasih sayang yang telah diberikan kepada penulis. 11. Ibunda (almh.) tersayang untuk semua bimbingan, kasih sayang, dan semangat yang tiada terukur. 12. Ayahanda tercinta yang selalu menjaga dan memberikan nasehat yang berharga. commit to user x perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id 13. Semua keluarga besar penulis yang selalu memberikan semangat dan bantuan dalam berbagai hal. 14. Sahabat-sahabat Biosain angkatan Agustus 2013: Mbak Yayah, Viktor, Mas Vector, Raqib, Adi, Hailu, serta Danang untuk kebersamaan yang mengesankan dan tak terlupakan. 15. Kakak dan adik kelas di Biosain untuk semangat dan semua bantuannya. 16. Mbak Ifah yang telah banyak membantu dalam hal administrasi dan untuk keramahannya. 17. Semua staf Laboratorium Biologi FMIPA, Laboratorium terpadu FMIPA dan Laboratorium Pusat MIPA untuk semua bantuannya. 18. Semua pihak yang turut membantu dalam penyelesaian tesis ini baik secara langsung maupun tidak langsung yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu. Semoga Allah SWT membalas semua kebaikan yang diberikan kepada penulis dengan balasan yang lebih baik. commit to user xi perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ............................................................................................................ i HALAMAN PENGESAHAN PEMBIMBING .................................................................. ii HALAMAN PENGESAHAN PENGUJI ........................................................................... iii PERNYATAAN KEASLIAN DAN PERSYARATAN PUBLIKASI .............................. iv ABSTRAK .......................................................................................................................... v ABSTRACT ....................................................................................................................... vi MOTTO ............................................................................................................................. vii HALAMAN PERSEMBAHAN ....................................................................................... viii KATA PENGANTAR ........................................................................................................ ix UCAPAN TERIMA KASIH ............................................................................................... x DAFTAR ISI ..................................................................................................................... xii DAFTAR TABEL ............................................................................................................ xiv DAFTAR GAMBAR ......................................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................... xvii DAFTAR SINGKATAN ................................................................................................ xviii BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah ..................................................................................... 1 B. Rumusan Masalah ............................................................................................... 3 C. Tujuan Penelitian ................................................................................................ 4 D. Manfaat Penelitian .............................................................................................. 4 BAB II. LANDASAN TEORI A. Tinjauan Pustaka ................................................................................................. 5 1. Filosfer ........................................................................................................... 5 2. Padi (Oryza sativa L.) ..................................................................................... 7 3. Hawar daun bakteri (bacterial leaf blight)...................................................... 8 4. Xanthomonas oryzae patovar oryzae (Xoo) .................................................. 11 5. Biokontrol ..................................................................................................... 12 6. Mekanisme antagonis .................................................................................... 12 B. Kerangka Berpikir ............................................................................................. 18 commit to user xii perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id BAB III. METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian ........................................................................... 20 B. Alat dan Bahan Penelitian ................................................................................. 20 1. Alat ............................................................................................................... 20 2. Bahan ........................................................................................................... 20 C. Prosedur Penelitian ........................................................................................... 21 1. Peremajaan isolat Xoo .................................................................................. 21 2. Pengambilan sampel daun padi .................................................................... 21 3. Skrining bakteri filosfer padi yang bersifat antagonis terhadap Xoo dengan metode dual plate ......................................................................................... 22 4. Uji hipersensitivitas ...................................................................................... 22 5. Uji patogenisitas ........................................................................................... 22 6. Identifikasi bakteri antagonis ........................................................................ 23 7. Deteksi gen polyketide synthase (PKS) ........................................................ 25 8. Ekstraksi senyawa bioaktif bakteri antagonis ............................................... 26 9. Identifikasi golongan senyawa bioaktif bakteri antagonis ............................ 27 10. Uji aktivitas anti-Xoo ekstrak senyawa bioaktif bakteri antagonis ............. 27 D. Analisis Data ..................................................................................................... 27 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Isolat Bakteri Antagonis Filosfer Padi .............................................................. 28 1. Skrining bakteri filosfer padi yang bersifat antagonis terhadap Xoo ........... 28 2. Identifikasi bakteri antagonis ........................................................................ 31 B. Deteksi Gen Polyketide Synthase (PKS) Bakteri Antagonis............................. 43 1. Amplifikasi domain ketosynthase (KS) gen PKS bakteri antagonis ............ 43 2. Hubungan kekerabatan domain KS............................................................... 47 C. Senyawa Bioaktif Bakteri Antagonis ................................................................ 48 D. Aktivitas Anti-Xoo Ekstrak Senyawa Bioaktif Bakteri Antagonis ................... 52 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan ....................................................................................................... 57 B. Saran .................................................................................................................. 57 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................................ 58 LAMPIRAN ...................................................................................................................... 72 commit to user xiii perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Bakteri filosfer padi yang bersifat antagonis terhadap Xoo................................. 28 Tabel 2. Karakter morfologi bakteri antagonis .................................................................. 32 Tabel 3. Konsentrasi dan kemurnian DNA genom bakteri antagonis ............................... 33 Tabel 4. Analisis kemiripan sekuen parsial gen penyandi 16S rRNA bakteri antagonis menggunakan program BLAST-N ...................................................................... 43 Tabel 5. Analisis kemiripan sekuen parsial gen PKS bakteri antagonis menggunakan program BLAST-N.............................................................................................. 46 Tabel 6. Golongan senyawa bioaktif yang dihasilkan bakteri Pseudomonadaceae SH2a. 48 Tabel 7. Golongan senyawa bioaktif yang dihasilkan bakteri Erwinia dan Pantoea ........ 50 Tabel 8. Aktivitas anti-Xoo ekstrak senyawa bioaktif bakteri antagonis .......................... 54 commit to user xiv perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Gambaran skematis tanaman padi .................................................................. 8 Gambar 2. Scanning electron micrograph (SEM) dari sel-sel Xoo yang berada di dalam pembuluh xilem daun padi ............................................................................. 9 Gambar 3. (a). Daun padi yang terserang HDB dan (b) bacterial ooze ......................... 10 Gambar 4. Morfologi Xoo .............................................................................................. 11 Gambar 5. Diagram kerangka berpikir ........................................................................... 19 Gambar 6. Aktivitas antagonis beberapa bakteri filosfer padi terhadap Xoo ................. 29 Gambar 7. Respon daun tembakau setelah inokulasi beberapa bakteri antagonis pada uji hipersensitivitas ...................................................................................... 29 Gambar 8. Respon daun padi setelah inokulasi beberapa bakteri antagonis pada uji patogenisitas ................................................................................................ 29 Gambar 9. Pewarnaan Gram bakteri antagonis isolat MO142 (a) dan pembentukan benang lendir pada uji KOH bakteri antagonis isolat MO34h (b)............... 32 Gambar 10. Elektroforegram amplikon gen penyandi 16S rRNA dari kedelapan isolat yang diuji ..................................................................................................... 35 Gambar 11. Perbandingan sekuen parsial gen penyandi 16S rRNA Pantoea sp. Ca04 dengan bakteri antagonis isolat MO34j, MO22g, MO34i, serta MO43a... 37 Gambar 12. Perbandingan sekuen parsial gen penyandi 16S rRNA Pantoea sp. A1059 dengan bakteri antagonis isolat MO142 .................................................... 39 Gambar 13. Perbandingan sekuen parsial gen penyandi 16S rRNA Pantoea sp. CT2 dengan bakteri antagonis isolat MO63j ..................................................... 40 Gambar 14. Perbandingan sekuen parsial gen penyandi 16S rRNA Erwinia sp. ICB408 dengan bakteri antagonis isolat MO34h .................................................... 41 Gambar 15. Perbandingan sekuen parsial gen penyandi 16S rRNA Pseudomonas fulva strain 1Y1103 dengan bakteri antagonis isolat SH2a ................................ 42 Gambar 16. Elektroforegram amplikon gen PKS ........................................................... 44 Gambar 17. Perbandingan sekuen gen nonribosomal peptide synthetase-polyketide synthase hybrid (cpbI) Lysobacter lactamgenus dengan sekuen parsial gen PKS bakteri antagonis Pantoea sp. MO22g, Erwinia sp. MO34h, Pantoea sp. MO34i, Pantoea sp. MO34j, Pantoea sp. MO43a ...................... 45 commitserta to user xv perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id Gambar 18. Pohon filogenetik domain KS bakteri antagonis dengan beberapa bakteri lain ................................................................................................................ 47 Gambar 19. Aktivitas anti-Xoo ekstrak kasar (a) dan ekstrak: bakteri Pseudomonadaceae SH2a (b), Pantoea sp. MO63j (c), Pantoea sp. MO34i (d), Pantoea sp. MO22g (e), Pantoea sp. MO43a (f) ............................................................. 53 commit to user xvi perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Halaman Aktivitas antagonis bakteri filosfer padi terhadap Xoo .............................. 72 Lampiran 2. Respon daun tembakau setelah inokulasi bakteri antagonis pada uji hipersensitivitas .......................................................................................... 73 Lampiran 3. Respon daun padi setelah inokulasi bakteri antagonis pada uji patogenisitas .............................................................................................. 74 Lampiran 4. Kemiripan bakteri antagonis dengan data di GenBank berdasarkan gen penyandi 16S rRNA .................................................................................. 75 Lampiran 5. Kemiripan sekuen parsial gen PKS bakteri antagonis dengan data di GenBank ..................................................................................................... 77 Lampiran 6. Penjajaran sekuen parsial gen PKS bakteri antagonis dengan gen nonribosomal peptide synthetase-polyketide synthase hybrid (cpbI) Lysobacter lactamgenus ............................................................................ 80 commit to user xvii perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id DAFTAR SINGKATAN BLAST-N : basic local alignment search tool-nucleotida cfu : colony forming unit DAPG : diacetylphloroglucinol ddH2O : double destilate water DNA : deoxyribonucleic acid g : gram μg : mikrogram ng : nanogram HDB : hawar daun bakteri hsi : hari setelah inokulasi KOH : kalium hidroksida L : liter mL : mililiter μL : mikroliter mm : milimeter MEGA : molecular evolutionary genetics analysis NA : nutrient agar NaCl : natrium chloride NB : nutrient broth NCBI : national center for biotechnology information p.a. : pro analitik pb : pasang basa PCR : polymerase chain reaction PKS : polyketide synthase pmol : pikamolar rRNA : ribosomal ribonucleic acid tRNA : transfer ribonucleic acid UV-VIS : ultra violet-visible XA : Xanthomonas agar Xoo : Xanthomonas oryzae patovar oryzae commit to user xviii