AKTIVITAS ANTIOKSIDAN SENYAWA FLAVONOID PADA KULIT

AKTIVITAS ANTIOKSIDAN SENYAWA FLAVONOID PADA KULIT
AKAR TANAMAN ARA
(Ficus racemosa, L)
Irwan Sudarmanto1, Tati Suhartati2
Program Studi Pasca Sarjana Jurusan Kimia, 2Fakultas MIPA, Universitas Lampung
Email: [email protected]
1
Abstract: Flavonoid Antioxidant Activity in Ara’s root skin (Ficus racemosa, L). Identification using
KLT method indicated that fraction of chloroform (FC) consist of 3 flavonoids and fraction of etil asetat
(FE) was 1 flavonoid. Qualitative assay of antioxidant showed that flavonoid which antioxidant activity
was 1 in FC and 1 in FE (from 5 spot that positive of flavonoid). Measurenment of IC50 using DPPH
assay showed that IC50 of FC is 2,67 ppm and IC50 of FE is unidentified. Isolation of FC by colom
chromatography resulted 12 mg of yellow crystall. Elucidation process using UV-VIS and 1H-NMR
indicated that crystall is quercetin with IC50 is 1,66 ppm.
Keywords: Ficus racemosa, Linn; flavonoid; antioxidant
Abstrak: Aktivitas Antioksidan Senyawa Flavonoid pada Kulit Akar Tanaman Ara (Ficus
Racemosa, L). Identifikasi kualitatif mengindikasikan terdapat 3 jenis flavonoid dalam fraksi kloroform
(FC) dan 1 jenis dalam etil asetat (FE). Potensi antioksidan secara kualitatif menunjukkan terdapat 1
bercak positif pada FC dan 5 bercak pada FE dimana bercak positif pada FC adalah senyawa flavonoid
sedangkan dari 5 bercak pada FE yang positif hanya 1 yang merupakan flavonoid. Pengukuran nilai IC 50
kedua fraksi menghasilkan nilai IC50 2,67 ppm untuk FC sedangkan IC50 FE tak bisa diukur. Hasil isolasi
FC menghasilkan 12 mg kristal kuning yang setelah dikarakterisasi menggunakan spektroskopi UV dan
1
H-NMR menunjukkan bahwa senyawa yang berperan sebagai antioksidan tersebut adalah quercetin
dengan IC50 sebesar 1,66 ppm.
Kata kunci: Ficus racemosa, Linn; flavonoid; antioksidan
Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat spesies diseluruh dunia. Di negara-negara Timur
menginaktifkan radikal bebas yang dihasilkan oleh tengah, spesies ficus yang biasa dikonsumsi adalah
berbagai proses normal tubuh, radiasi matahari, asap Ficus carica, Linn
yang terbukti memiliki
rokok, asap kendaraan bermotor dan faktor-faktor kandungan flavonoid tinggi terutama pada bagian
lain (Osawa et al., 1992). Adapun radikal bebas buahnya (Solomon et al., 2006). Sementara itu
adalah suatu bahan kimia baik berupa atom maupun genus ficus yang tumbuh di Indonesia adalah jenis
molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan Ficus racemosa, Linn yang memiliki manfaat untuk
pada lapisan luarnya yang menjadikan spesies ini tujuan medis dan telah digunakan secara empiris
sangat reaktif (Droge, 2002). Karena mempunyai untuk pengobatan berbagai penyakit (Shiksharti et
energi yang sangat tinggi dan kecenderungan untuk al., 2011).
berikatan dengan elektron dari substrat lain, zat ini
Penelitian ini dimaksudkan untuk mengetahui
akan merusak jaringan normal terutama jika apakah kulit akar tanaman Ara (Ficus racemosa, L)
jumlahnya terlalu banyak. Radikal bebas dapat mengandung senyawa-senyawa flavonoid dan
mengganggu produksi DNA, lapisan lipid pada bagaimana potensi senyawa tersebut sebagai
dinding sel, mempengaruhi pembuluh darah, dan antioksidan. Potensi antioksidan dilakukan secara in
produksi prostaglandin (Droge, 2002). Dengan kata vitro menggunakan metode DPPH assay yang cukup
lain radikal bebas sangat membahayakan kesehatan efektif untuk menguji aktivitas antioksidan
manusia dalam jangka pendek maupun jangka senyawa/bahan dari alam.
panjang.
Salah satu metabolit sekunder yang dapat METODELOGI
berfungsi sebagai antioksidan adalah flavonoid.
Flavonoid dapat berlaku sebagai antioksidan karena 1. Alat dan Bahan
sifatnya sebagai akseptor yang baik terhadap radikal
Bahan: Aquades, metanol, kloroform,
bebas (Sathiskumar et al., 2008).
heksana, etil asetat, serbuk Mg, HCl pekat, serbuk
Salah satu tanaman yang menjadi sumber DPPH,
butanol, etanol 70%, silika gel, Na asetat
flavonoid adalah genus ficus yang memiliki 750-800 anhidrat, AlCl3
137
138 Jurnal Kesehatan, Volume VI, Nomor 2, Oktober 2015, hlm 137-141
Alat: Labu ukur, erlenmeyer, pipet, spektro
UV, kolom kromatografi, plat KLT GF254, lampu
UV, seperangkat alat gelas, spektrofotometer
1H
NMR.
2. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Januari- Juli
2015 di Laboratorium Kimia Organik, Jurusan
Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Lampung.
3. Sampel Uji
Tanaman Ara diperoleh dari daerah
Tanggamus yang diambil pada bulan Agustus 2014
berupa akar keras yang terdapat di dalam tanah.
Ambil 5 kg lalu dikeringkan dengan dianginanginkan dan terlindung dari cahaya matahari secara
langsung. Pisahkan kulit dari bagian batang
selanjutnya digiling menjadi serbuk dan diayak
dengan ukuran ayakan 65 mesh.
Cara Penelitian
1. Ekstraksi Bahan
105 g bahan yang telah djadikan serbuk
diayak dengan ukuran 65 mesh direndam dalam
heksana 1000 mL selama 3 hari selanjutnya
direndam dalam 1000 mL etanol 70% selama 4 hari.
Filtrat diuapkan dengan rotary evaporator hingga
didapat 75 g ekstrak pekat yang selanjutnya dipartisi
dengan corong pisah dengan pelarut heksana,
kloroform, etil asetat dan butanol.
Hasil partisi diuji kandungan flavonoidnya
dengan menggunakan reaksi warna dengan cara
mengambil 10 ml fraksi lalu mereaksikannya
dengan serbuk Mg lalu ditambah HCl pekat biarkan
beberapa saat lalu tambahkan amil alkohol. Hasil
positif ditunjukkan oleh terbentuknya warna kuning
hingga
merah kecoklatan menandakan adanya
senyawa flavonoid (Markham, 1998)
2. Uji Kualitatif dan Total Flavonoid
Proses pemisahan fraksi menjadi komponenkomponenya dilakukan untuk mengetahui jumlah
dan jenis flavonoid dalam fraksi yaitu dengan cara
menotolkan fraksi pada plat KLT GF254 lalu dielusi
dengan eluen terpilih hasil optimasi. Selanjutnya
disemprot dengan pereaksi sitroborat yang spesifik
dan selektif untuk senyawa flavonoid. Bercak positif
flavonoid jika terbentuk warna kuning terang yang
berpendar di bawah UV 366 (Markham, 1998).
Untuk mengukur total flavonoid dalam
sampel digunakan prosedur berikut : Sebanyak 5 mg
quercetin ditimbang dan dilarutkan dalam 10
metanol sebagai larutan stok (500 g/mL) lalu
diencerkan sedemikian rupa sehingga diperoleh
konsentrasi larutan quercetin 40-120 g/mL.
Ambil 0,5 mL larutan tersebut tambahkan 1,5
mL metanol; 0,1 mL AlCl3 10 %,; 0,1 mL Na asetat
anhidrat 1M dan 2,8 mL aquades. Inkubasi selama
30 menit ukur absorbansinya pada  415 nm. Setelah
absorbansi diperoleh buat persamaan regresinya
(Chang et al., 2002).
Sampel uji ekstrak kloroform dengan
konsentrasi 1000 g/mL, ekstrak etilasetat 1000
g/mL dilarutkan dalam etanol, tambah 0,1 mL
AlCl3 10 %; 0,1 mL Na asetat anhidrat 1M dan 2,8
mL aquades. Inkubasi selama 30 menit ukur
absorbansinya pada  415 nm. Setelah absorbansi
diperoleh lalu masukkan dalam persamaan regresi
yang dipeoleh diatas. Flavonoid total dinyatakan
sebagai quersetin equivalen per 100 gram bahan (mg
QE/100 g ).
3.
Uji Kualitatif dan Kuantitatif Aktivitas
Antioksidan
Potensi antioksidan diuji dengan menyemprot
bercak pada plat KLT dengan larutan DPPH 0,2%.
Apabila terjadi perubahan warna DPPH dari ungu
menjadi kuning maka senyawa tersebut bersifat
antioksidan (Molyneux, 2004). Diamati bercak mana
saja yang mengalami reaksi dengan DPPH. Hasil uji
harus dikonfirmasi dengan hasil uji kualitatif
senyawa flavonoid karena senyawa yang bersifat
antioksidan tidak terbatas hanya pada senyawa
flavonoid saja.
Uji
kuantitatif
aktivitas
antioksidan
dinyatakan sebagai IC50 yang dilakukan dengan
tahapan berikut: Buat larutan stok DPPH pada
konsentrasi yang memberi serapan pada angka
sekitar 1,0 yaitu pada konsentrasi 50-100 M
(Molyneux, 2004). Lalu buat juga larutan senyawa
uji sehingga diperoleh konsentrasi tertentu lalu
tambahkan DPPH 50 g/mL dengan perbandingan
volume sama (1:1) pada setiap seri konsentrasi dan
diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37oC.
Absorbansi diukur pada 515-517 nm.
Kontrol
positif menggunakan larutan vitamin C dengan
kadar 15, 29, 30 dan 40 ppm dan diperlakukan
seperti pada larutan uji. Nilai absorbansi yang
diperoleh kemudian dikonversi menjadi nilai IC50
dengan cara membuat persamaan garis regresi linear,
y=bx+a dimana y=daya hambat terhadap DPPH dan
x=kadar senyawa uji. Daya hambat dinyatakan
sebagai % daya hambat terhadap DPPH dan dihitung
dengan persamaan berikut:
% daya hambat = 1 – Absorbansi senyawa uji/Absorbansi DPPH
x 100 %
Sudarmanto, Aktivitas Senyawa Flavonoid pada Kulit Akar Tanaman Ara 139
Nilai IC50 merupakan hasil ekstrapolasi dari
persamaan y=bx+a di atas, nilai ini menggambarkan
kadar suatu senyawa yang dapat menonaktifkan
separuh dari kekuatan DPPH.
4. Isolasi
dan Penentuan Struktur Senyawa
Flavonoid
Isolasi dilakukan terhadap fraksi yang
mengandung
flavonoid
sebagai
antioksidan
menggunakan kromatografi kolom. Eluen yang
digunakan sama dengan eluen pada proses KLT.
Pengisian kolom menggunakan silika yang
sebelumnya dibuat bubur dengan cara mencampur
silika sebanyak 15 g dengan 30 ml eluen (1:2).Fraksi
sebelumnya
diimpregnasi
dengan
cara
menambahkan 1,2 g fraksi pekat dengan eluen dan
serbuk silika hingga diperoleh 15 g hasil impregnasi.
Hasil optimasi menunjukkan bahwa untuk sekali
proses kromatografi dengan panjang kolom 30 cm
diperlukan 3 gram bahan hasil impregnasi.
Hasil kromatografi ditampung dalam vial-vial
15 mL dan selalu dikontrol dengan KLT, untuk vial
yang menunjukkan bercak yang sama dapat
digabungkan.
Penentuan struktur senyawa FC1 dilakukan
dengan spektroskopi UV-Vis dan 1HNMR. Hal
tersebut didasarkan pada pendapat Mabry et.al
(1970) yang mengatakan bahwa senyawa flavonoid
dapat diidentifikasi jenis dan strukturnya
menggunakan kedua metode tersebut.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A
B
Gambar 1. Kromatogram yang menunjukkan
bercak positif flavonoid setelah
disemprot
sitroborat dilihat
dibawah UV 366 A). Fraksi etil
asetat B). Fraksi kloroform.
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa pada
fraksi etil asetat terkandung 1 jenis flavonoid
sedangkan pada fraksi kloroform terdapat 3 jenis
senyawa flavonoid.
Hasil penetapan total flavonoid terhadap
kedua fraksi didapat persamaan regresi linear
y=0,0278x+0,003;r2=0,995
diperoleh
jumlah
flavonoid dalam fraksi kloroform adalah 51,33 mg
QE/100 g bahan sedangkan pada fraksi etil asetat
adalah 33,78 mg QE/100 g bahan.
Uji kualitatif aktivitas antioksidan dilakukan
dengan menyemprot plat KLT menggunakan larutan
DPPH 0,2 % yang hasilnya terlihat pada Gambar 2
yang menunjukkan terdapat 5 bercak pada fraksi etil
asetat bersifat sebagai antioksidan dan 1 bercak yang
meredam aktivitas DPPH pada fraksi kloroform.
Setelah dikonfirmasi dengan Gambar 1 ternyata dari
3 senyawa flavonoid dalam fraksi kloroform hanya 1
yang bersifat antioksidan sedangkan satu-satunya
flavonoid dalam fraksi etil asetat bisa bersifat
antioksidan.
HASIL
Dari 4 fraksi yang terbentuk, fraksi yang positif
flavonoid adalah fraksi kloroform (warna kuning)
dan fraksi etil asetat (warna coklat kemerahan).
Selanjutnya uapkan kedua fraksi tersebut dengan
rotary vaccum evaporator hingga diperoleh 1,2 g
fraksi pekat kloroform dan 2,0 g fraksi pekat etil
asetat.
Selanjutnya totolkan fraksi tersebut pada plat
KLT GF254 dengan eluen terpilih yaitu heksana:etil
asetat:metanol (6:3:2) untuk fraksi kloroform dan
heksana:etil asetat:metanol (6:4:4) untuk fraksi etil
asetat. Hasil penyemprotan sitroborat pada KLT
terlihat pada Gambar 1 berikut.
A
B
Gambar 2. Kromatogram yang menunjukkan
senyawa positif antioksidan setelah
disemprot larutan DPPH 0,2% A).
Fraksi etil asetat (dilihat di bawah
UV 254) B). Fraksi kloroform
(dilihat di bawah UV 366).
Hasil uji potensi antioksidan menunjukkan
bahwa IC50 fraksi kloroform adalah 2,67 ppm (Tabel
1) yang berarti memiliki potensi antioksidan tinggi
bahkan dibandingkan dengan IC50 vitamin C. Karena
dalam fraksi kloroform hanya terdapat satu senyawa
yang positif meredam aktivitas DPPH maka
dipastikan bahwa IC50 fraksi kloroform merupakan
140 Jurnal Kesehatan, Volume VI, Nomor 2, Oktober 2015, hlm 137-141
kontribusi tunggal dari senyawa FC1. Absorbansi
larutan DPPH 50 ppm=0,824.
Isolasi dilakukan terhadap fraksi kloroform
yang mengandung flavonoid sebagai antioksidan
menggunakan kromatografi kolom. Eluen yang
digunakan sama dengan eluen pada proses KLT,
yaitu heksana:etil asetat:metanol (6:3:2 ). Pada
penelitian ini diperlukan 80 vial untuk sekali proses.
Dari 5 kali proses elusi diperoleh senyawa FC1 (12
mg), FC2 (15 mg) dan FC3 (20 mg).
Identifikasi terhadap senyawa FC1 hasil isolasi
yang dilakukan dengan spektroskopi UV
menunjukkan peak pada 255 dan 370 nm. Panjang
gelombang ini khas untuk senyawa flavonol. Untuk
pengukuran dengan spektroskopi 1HNMR seperti
terlihat pada Gambar 3 menunjukkan bahwa senya
FC1 memberikan geseran kimia dan pola
splitting berikut:6,3 ppm (singlet, 1); 6,5 ppm
(singlet,1); 7,0 ppm (doublet,1); 7,7 (doublet,1); 7,9
(singlet,1) dan 12 ppm (singlet, 1). Mabry et.al
mengatakan bahwa pola oksigenasi pada cincin A, B
Tabel 1. Hasil pengukuran IC5
Sampel Uji
Konsentra
si
(ppm)
Absorbans
i
Fraksi
kloroform
15
20
30
40
50
10
25
30
40
50
15
25
30
40
50
0,315
0,286
0,210
0,154
0,067
0,084
0,046
0,034
0,032
0,025
0,352
0,268
0,260
0,019
0,013
Fraksi etil
asetat
Vitamin C
%
daya
hamba
t
61
65
74
81
92
89
94
96
97
98
57
67
69
97
99
IC50
2,67
Tak dapat
diukur
11,34
dan C dari senyawa flavonoid dapat dilihat pada
rentang geseran kimia 6-8 dimana pola geseran
seperti diatas identik dengan senyawa quercetin
(Mabry et al., 1970).
Gambar 3. Spektrum 1 H- NMR senyawa FC1 (dalam DMSO)
Hasil uji KLT menggunakan senyawa standar
quercetin seperti pada Gambar 4 memperkuat
dugaan bahwa senyawa hasil isolasi merupakan
suatu flavonol yaitu quercetin.
A
Gambar
Berdasarkan analisis spektroskopi 1H-NMR
da uji KLT di atas, struktur senyawa FC1 adalah
seperti terlihat pada Gambar 5 berikut ini.
B
4. Kromatogram senyawa FC1 (A)
dibandingkan
dengan
standar
quercetin (B) pada plat KLT GF254
dengan eluen metanol (teknis).
quercetin
Gambar 5. Perkiraan struktur senyawa hasil isolasi
3,5,7,3,4 pentahidroksi flavon
Pengukuran nilai IC50 terhadap isolat FC1
dengan cara yang sama dengan prosedur di atas
menghasilkan nilai 1,66 ppm (Tabel 2) yang
Sudarmanto, Aktivitas Senyawa Flavonoid pada Kulit Akar Tanaman Ara 141
menunjukkan bahwa senyawa
potensial sebagai antioksidan.
tersebut
sangat
Tabel 2. Hasil pengukuran absorbansi, % daya
Hambat dan IC50 Senyawa FC1.
Konsentrasi
(ppm)
1
3
5
10
Absorbansi
0,780
0,650
0,512
0,009
% daya
hambat
43
62
70
99
Y = 5,977x + 40,10
r2 = 0,984
IC50 = 1,66 ppm
IC50 (vitamin C )
=
11,34 ppm
IC50 fraksi kloroform
= 2,67 ppm
Menurut Heim et al. (2002), flavonoid akan
memberikan aktivitas antioksidan jika mempunyai
gugus OH pada posisi orto C3 dan C4. Ikatan
rangkap pada C2 dan C3; gugus OH pada C3 dan
gugus keto pada C4. Syarat tersebut terpenuhi oleh
senyawa FC1 yang merupakan suatu quercetin.
SIMPULAN
Senyawa aktif flavonoid dalam fraksi kloroform
kulit akar tanaman Ara (Ficus racemosa, L) yang
berpotensi sebagai antioksidan adalah quercetin
dengan IC50 1,66 ppm.
Ucapan terima kasih
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu
Prof Tati Suhartati atas bimbingannya selama
penelitian berlangsung. Ucapan terima kasih juga
disampaikan untuk Ibu Sofia dan Ibu Asih atas
bantuannya di laboratorium Balai POM.
DAFTAR PUSTAKA
Chang, C.C.,Yang, M.H., Wen and H.M.Chern,
J.C.2002. Estimation of Total Flavonoid
Content in Propolis by Two Complementary
Colorimetric Methods. J Food Drug Anal. 10
(3): 178-182.
Droge W. 2002 Free Radicals in the Physiological
Control of Cell Function. Physiol Rev. 82:4795.
Heim, K.E., Tagliaferro., A.R and Bobilya, D.J.
2002. Flavonoid antioxidant: Chemistry,
Metabolism
and
Structure–Activity
Relationship. J.Nutr Biochem. 10: 572-584.
Markham, K.R.
1998. Cara Mengidentifikasi
Flavonoid. Terjemah Kosasih Padmawinata.
Penerbit ITB. Bandung.
Mabry, T.J., Markham, K.R., and Thomas, M.B.
1970. The Systematic Identification of
Flavonoids. Springer-Verlag. New York Inc. New
York.
Molyneux, P. 2004. The Use of the Stable Free
Radical Diphenyl picrylhidrazyl (DPPH) for
Estimating
Antioxidant
Activity.
Songklanakarin Journal of science and
technology 26 (2): 211-219.
Osawa, T., Katsuzaki., Hagiwara., Shibamoto, T.
1992. A Novel Antioxidant Isolated from
Young Green Barley Leaves. Journal of
Agricultural and Food Chemistry. 40: 11351140.
Solomon, A., Golubowicz, S., Yablowicz, Z,.
Grossman, S., Bergman, M., Gottlieb, H.,
Atlman, A., Kerem, Z. and Flaishman, M.A.
2006.
Antioxydan
Activities
and
Anthocyanin Content of Fresh Fruit Common
of
Fig
(Ficus
carica,
Linn).
J.Agric.Food.Chem. 54: 7717-7723.
Shiksharthi, A.R. and Mittal, S. 2011. Ficus
racemosa,Linn:
Phytochemistry,
Traditional Uses and Pharmacological
Properties: A Review. International
Journal
of
Recent
Advances
in
Pharmaceutical Resarch.