PENGARUH EKSTRAK ETANOL DAUN SIRSAK (Annona muricata
advertisement
PENGARUH EKSTRAK ETANOL DAUN SIRSAK (Annona muricata) TERHADAP EKSPRESI GEN CASPASE 3 PADA KULTUR SEL KANKER SERVIKS UTERI HeLa SKRIPSI Diajukan untuk memenuhi tugas akhir Fakultas Kedokteran Universitas Islam Bandung AGLI ADHITYA ANUGRAH PUTRA 10100108060 FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG 2012 PENGARUH EKSTRAK ETANOL DAUN SIRSAK (Annona muricata) TERHADAP EKSPRESI GEN CASPASE 3 PADA KULTUR SEL KANKER SERVIKS UTERI HeLa SKRIPSI AGLI ADHITYA ANUGRAH PUTRA 10100108060 Dengan ini menyatakan bahwa skripsi yang telah dibuat oleh nama yang disebutkan di atas telah diperiksa dan direvisi, secara lengkap dan memuaskan, sehingga dapat diajukan untuk sidang skripsi Bandung, 5 September 2012 Pembimbing I Prof. Dr. H. Herri. S. Sastramihardja, dr., SpFK(K) NIP : 194404081973031001 Pembimbing II Lelly Yuniarti, S.Si., M.Kes NIK : D.040.380 PENGARUH EKSTRAK ETANOL DAUN SIRSAK (Annona muricata) TERHADAP EKSPRESI GEN CASPASE 3 PADA KULTUR SEL KANKER SERVIKS UTERI HeLa SKRIPSI AGLI ADHITYA ANUGRAH PUTRA 10100108060 Dengan ini menyatakan bahwa skripsi yang telah dibuat oleh nama yang disebutkan di atas telah diperiksa dan direvisi, secara lengkap dan memuaskan, sehingga dapat diajukan untuk sidang skripsi Bandung, 18 September 2012 Pembimbing I Prof. Dr. H. Herri. S. Sastramihardja, dr., SpFK(K) NIP : 194404081973031001 Pembimbing II Lelly Yuniarti, S.Si., M.Kes NIK : D.040.380 Skripsi ini telah dipertahankan oleh penulis di dalam sidang skripsi yang diadakan oleh Fakultas Kedokteran Universitas Islam Bandung pada tanggal 10 September 2012 yang dihadiri oleh : Ketua Sekretaris Penguji I Penguji II Penguji III Pembimbing I Pembimbing II : Santun Bhekti R, dr, M.Kes. : Lelly Yuniarti,S.Si., M.Kes : Santun Bhekti R, dr, M.Kes. : Yani Triyani, dr., SpPK., M.Kes. : Wida Purbaningsih, dr., M.Kes. : Prof. Dr. Herri S Sastramihardja, dr, SpFK(K) : Lelly Yuniarti,S.Si., M.Kes MOTTO Dengan menyebut nama Allah Yang Maha Pengasih, Maha Penyayang ”Sesungguhnya Allah menyukai orang yang berperang dijalan-Nya dalam barisan yang teratur seakan-akan mereka seperti suatu bangunan yang tersusun kokoh” (QS. Ash-Shaff : 4) "Jadilah kamu manusia yang pada kelahiranmu semua orang tertawa bahagia, tetapi hanya kamu sendiri yang menangis; dan pada kematianmu semua orang menangis sedih, tetapi hanya kamu sendiri yang tersenyum " _ Mahatma Gandhi_ Skripsi ini kupersembahkan untuk Bapak dan ibuku tercinta Sebagai wujud bakti, cinta, sayang, dan hormatku Serta semoga semuanya selalu dalam lindungan dan kasih sayang Allah SWT ABSTRAK Kanker serviks uteri adalah kanker ketiga yang paling banyak di diagnosis dan kanker keempat penyebab kematian pada wanita di dunia. Di Indonesia kanker serviks uteri merupakan kanker dengan jumlah kasus terbanyak kedua. Pengembangan anti kanker diarahkan pada gen-gen yang meregulasi apoptosis. Kandungan acetogenin, flavonoid, saponin dan tannin pada daun sirsak dipercaya memiliki efek anti kanker melalui penghambatan gen-gen anti apoptosis, salah satunya adalah caspase 3. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanol daun sirsak terhadap ekspresi gen caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental in vitro terhadap kultur sel kanker serviks uteri HeLa. Sampel dibagi menjadi 4 kelompok, yaitu kelompok 1 adalah kultur sel HeLa yang tidak diberi ekstrak ethanol daun sirsak, kelompok 2,3 dan 4 adalah kultur sel HeLa yang diberi ekstrak ethanol daun sirsak dengan konsentrasi 60μg/mL, 120 μg/mL dan 240 μg/mL. Kepada masing-masing kelompok dilakukan pemeriksaan ekspresi gen caspase 3 dengan RT-PCR. Data dianalisis secara statistik menggunakan metode non parametric Kruskall Wallist Test lalu dilakukan analisis lanjutan dengan menggunakan Uji Spearman Correlation Test. Hasil penelitian memperlihatkan bahwa ekspresi gen caspase 3 kultur sel HeLa pada kelompok yang diberi ekstrak etanol daun sirsak bernilai sama dibandingkan dengan kelompok yang tidak diberi ekstrak etanol daun sirsak. Konsentrasi ekstrak ethanol daun sirsak pada semua perlakuan memiliki rerata 0,04 dan nilai p=1,000 (nilai p>0,05). Hasil uji statistik dengan Uji Korelasi Spearman menunjukkan bahwa tidak terdapat korelasi antara peningkatan konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak dengan peningkatan jumlah ekspresi gen caspase 3 pada kultur sel HeLa secara bermakna dengan nilai p=1,000 (nilai p>0,05). Dengan demikian disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun sirsak tidak dapat meningkatkan ekspresi caspase 3. Selain itu juga tidak terdapat hubungan antara peningkatan konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak dengan peningkatan jumlah ekspresi gen caspase 3 pada kultur sel HeLa. Kata Kunci : Kanker serviks uteri, caspase 3, Daun Sirsak, Acetogenin, Flavonoid, Tannin, Saponin i ABSTRACT Cervical cancer uteri is the third of most diagnosed cancer and the fourth that cause of death in women in the world. In Indonesian, cervical cancer uteri is the cancer with the second highest number of cases. Genes which regulate apoptosis is target in the development of anti-cancer . Acetogenin, flavonoids, saponins and tannins in the leaves of the soursop is believed to have anti-cancer effects through inhibition of anti-apoptotic genes, one of which is caspase 3. This study aimed to determine the effect of ethanol extract of leaves of the soursop to expression of gene caspase 3 in cultured cervical cancer uteri HeLa cells. This research is experimental in vitro cell with cultured cervical cancer uteri HeLa cells. The samples were divided into 4 groups, group 1 was culture HeLa cells that were not given ethanol extract of leaves of the soursop, groups 2,3 and 4 are culture HeLa cells were given ethanol extract of leaves of the soursop with concentration 60μg/mL, 120 mg / mL and 240 mg / mL. Each group examined the expression of gene caspase 3 by RT-PCR. Data were analyzed statistically using the non-parametric Kruskall Wallist Test and further analyzes using Spearman Correlation Test. The results showed that the expression of gene caspase 3 in the HeLa cell culture groups that given the ethanol extract of leaves of the soursop is worth the same as compared with the group who were not given ethanol extract of leaves of the soursop. The concentration of ethanol extract of leaves of the soursop in all treatments had an average value of 0.04 and p = 1.000 (p> 0.05). The results of the statistic test with Spearman correlation test showed that there is no correlation between the increase of concentration ethanol extract of soursop leaves with an increased number expression of gene caspase 3 in HeLa cell cultures significantly, with value of p = 1.000 (p> 0.05). Therefore it can be concluded that the ethanol extract of leaves of the soursop can not increase the expression of caspase 3 in cultured cervical cancer uteri HeLa. In addition, there was no correlation between the increase in the concentration of ethanol extract of soursop leaves with an enhanchment expression of gene caspase 3 in HeLa cell cultures. Keywords: Cervical cancer uteri, caspase 3, Soursop Leaf, acetogenin, flavonoids, tannins, saponins ii KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan ke khadirat Allah Subhaanahu wata’aala, karena berkat rahmat dan karuniaNyalah maka skripsi dengan judul “PENGARUH EKSTRAK ETANOL DAUN SIRSAK (Annona muricata L) TERHADAP EKSPRESI GEN CASPASE 3 PADA KULTUR SEL KANKER SERVIKS UTERI HELA” ini dapat diselesaikan. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan Sarjana pada Program Sarjana Fakultas Kedokteran Universitas Islam Bandung (UNISBA). Dalam menyelesaikan skripsi ini penulis telah mendapat banyak bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada beliau-beliau yang telah menyumbangkan tenaga dan pikirannya dalam tulisan ini. Penulis menghaturkan terima kasih dan penghargaan kepada Prof.Dr.dr.M. Thaufiq Siddiq Boesoirie, M.S.,Sp THT KL (K) selaku rektor Universitas Islam Bandung dan Prof. Dr. Hj. Ieva B. Akbar, dr. AIF selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Islam Bandung yang telah memberikan kesempatan pada penulis untuk mengikuti program Sarjana di Universitas Islam Bandung. Penulis menghaturkan terima kasih dan penghargaan kepada Prof. Dr. Herri S Sastramihardja, dr, SpFK(K) dan Lelly Yuniarti, S.Si., M.Kes selaku pembimbing yang dengan penuh kesabaran dan keikhlasan telah memberikan bimbingan, arahan dan dukungan kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. iii Penulis menghaturkan terima kasih dan penghargaan kepada seluruh dosen dan staf Program Sarjana Fakultas Kedokteran Universitas Islam Bandung, terutama kepada Yuli Susanti, dr yang telah banyak memberi dukungan dan bimbingan kepada penulis selama mengikuti Program Sarjana di Fakultas Kedokteran Universitas Islam Bandung. Penulis menghaturkan terima kasih dan penghargaan kepada Direktorat Jendral Perguruan Tinggi (DIKTI) yang telah memberikan dukungan berupa bantuan dana dan kesempatan dalam mengikuti program Hibah DIKTI sehingga dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulis menghaturkan terima kasih, hormat dan sayang kepada orang tuaku Ibu Leli Rachmawati dan Bapak Slamet Riyadi, serta kakak Gladisya Geminantang Putri dan adikku Renjana Rizkika tercinta yang telah memberikan dukungan moril maupun material, perhatian, pengertian, kasih sayang dan doa restunya selama menyelesaikan Program Sarjana di Fakultas Kedokteran Universitas Islam Bandung. Penulis menghaturkan terima kasih kepada nenek, kakek, paman, tante dan seluruh saudara-saudaraku khususnya, Hazriliyanda dan Hety Misviati, atas dukungannya kepada penulis selama menyelesaikan Program Sarjana di Fakultas Kedokteran Universitas Islam Bandung. Penulis menghaturkan terima kasih kepada seluruh teman-teman angkatan 2008 (ASYIFA) terutama Putri Sukmarani, teman-teman KSR UNISBA dan teman-teman KOSAN (Pras, Egy, Indra, Sapi, Andri, Raka, Alan, Huda, Novan, Ariel, Iman, Mail, Erwan, Aziz, Putra, Kiki, Comby, Refa, dan teman-teman iv semua) yang telah menemani dan memberikan dukungan kepada penulis selama mengikuti Program Sarjana di Fakultas Kedokteran Universitas Islam Bandung. Penulis menghaturkan terima kasih kepada teman-teman satu penelitian, Enggar, Luthfi, dan Nikkita, yang telah menemani, membantu dan memberikan dukungan kepada penulis selama menyelesaikan skripsi ini. Penulis menghaturkan terima kasih kepada staf laboratorium Parasitologi Universitas Gajah Mada, laboratorium Farmasi ITB, Fakultas Biologi UPI, dan Nur Fauziyah, SKM.,MMPH, yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. Penulis menghaturkan terima kasih dan penghargaan kepada seluruh temanteman khususnya, Chandra Hari Wibowo, Hendra, Vissy, Ardiansyah, Rahman, Abbas, yang selama ini membantu dan memberi dukungan dalam menyelesaikan skripsi ini. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangan, oleh karena itu penulis terbuka atas semua saran, kritik dan masukan untuk perbaikan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat menjadi sumbangan ilmiah yang bermanfaat bagi kemajuan ilmu kedokteran dan semua pihak yang memerlukan. Bandung, September 2012 Penulis v DAFTAR ISI Halaman MOTTO..................................................................................................... ABSTRAK ................................................................................................ ABSTRACT .............................................................................................. KATA PENGANTAR .............................................................................. DAFTAR ISI ............................................................................................. DAFTAR TABEL ..................................................................................... DAFTAR GAMBAR ................................................................................ DAFTAR SINGKATAN .......................................................................... DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. i ii iii vi ix x xi xii BAB I PENDAHULUAN 1.1.Latar Belakang Penelitian ................................................... 1.2.Rumusan Masalah............................................................... 1.3.Tujuan Penelitian ................................................................ 1.3.1 Tujuan Umum ............................................................ 1.3.2 Tujuan Khusus ........................................................... 1.4. Manfaat Penelitian ............................................................. 1.4.1 Manfaat Akademik .................................................... 1.4.1 Manfaat Praktis .......................................................... 1 5 5 5 6 6 6 6 BAB II TINJAUAN PUSTAKA DAN KERANGKA PEMIKIRAN 2.1. Tinjauan Pustaka................................................................ 2.1.1 Kanker Serviks Uteri ................................................. 2.1.2 Patogenesis Molekuler Kanker Serviks Uteri ............ 2.1.3 Siklus Sel ................................................................... 2.1.4 Apoptosis ................................................................... 2.1.5 Caspase 3 ................................................................... 2.1.6 Tanaman Sirsak (Annona Muricata L) ...................... 2.1.7 Annonaceous Acetogenins ......................................... 2.1.8 Tanin .......................................................................... 2.1.9 Flavonoid ................................................................... 2.1.10 Saponin .................................................................... 2.1.11 Sel HeLa .................................................................. 2.1.12 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)................................................................. 2.2. Kerangka Pemikiran .......................................................... 2.3. Hipotesis ............................................................................ BAB III SUBJEK/OBJEK/BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1. Subjek/ Objek/ Bahan Penelitian ....................................... 3.1.1 Subjek Penelitian ....................................................... vi 7 7 10 13 18 21 22 24 27 27 28 29 29 30 34 35 35 3.1.2 Bahan Penelitian ........................................................ 3.1.3 Alat Penelitian ........................................................... 3.2. Metode Penelitian .............................................................. 3.2.1 Rancangan Penelitian ................................................ 3.2.2 Definisi Konsep dan Operasional Variabel ............... 3.2.2.1 Definisi Konsep Variabel.................................. 3.2.2.2 Definisi Operasional Variabel .......................... 3.2.3 Jumlah Sampel dan Teknik Pengambilan Sampel ..... 3.2.4 Perlakuan Percobaan.................................................. 3.2.5 Prosedur Penelitian .................................................... 3.2.5.1 Pembuatan Ekstrak Daun Sirsak ....................... 3.2.5.2 Penumbuhan Sel HeLa...................................... 3.2.5.3 Perlakuan Sel HeLa .......................................... 3.2.5.4 Pengukuran Gen Caspase 3 .............................. 3.2.6 Analisis Data.............................................................. 3.2.7 Aspek Etika Penelitian............................................... 3.2.8 Lokasi Penelitian ....................................................... 3.2.9 Waktu Penelitian........................................................ BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Penelitian. .................................................................. 4.1.1 Ekspresi Gen Caspase 3 Kelompok 1 (Kultur Sel HeLa Yang Tidak Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak).. ................................................ 4.1.2 Ekspresi Gen Caspase 3 Kelompok 2 (Kultur Sel HeLa Yang Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dosis ½IC50)....................................... 4.1.3 Ekspresi Gen Caspase 3 Kelompok 3 (Kultur Sel HeLa Yang Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dosis IC50).......................................... 4.1.4 Ekspresi Gen Caspase 3 Kelompok 4 (Kultur Sel HeLa Yang Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dosis 2IC50)....................................... 4.1.5 Distribusi Data. ......................................................... 4.1.6 Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Daun Sirsak Terhadap Ekspresi Caspase 3 Pada Kultur Sel Kanker Serviks Uteri HeLa. ................... 4.1.7 Hubungan Antara Peningkatan Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dengan ` Peningkatan Ekspresi Gen Caspase 3 Pada Kultur Sel Kanker Serviks Uteri HeLa. ................... 4.2 Pembahasan. ....................................................................... 4.2.1 Ekspresi Gen Caspase 3............................................ 4.3 Keterbatasan Penelitian. ..................................................... 4.4 Pengujian Hipotesis. ........................................................... vii 35 36 37 37 37 37 37 38 38 39 39 40 40 41 44 45 45 46 47 48 50 51 52 54 55 56 57 57 59 60 BAB V SIMPULAN DAN SARAN 5.1 Simpulan. ............................................................................ 5.2 Saran.. ................................................................................. DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... LAMPIRAN……… .................................................................................. RIWAYAT HIDUP. .................................................................................. viii 62 62 64 DAFTAR TABEL Tabel 3.1 Jadwal Penelitian ............................................................... Halaman 46 Tabel 4.1 Hasil Kuantifikasi Densitometer Scion Image Pada Gen Caspase 3 Kultur Sel HeLa Yang Tidak Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak............................................................ 49 Hasil Kuantifikasi Densitometer Scion Image Pada Gen Caspase 3 Kultur Sel HeLa Yang Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dosis ½IC50 ................................................ 51 Hasil Kuantifikasi Densitometer Scion Image Pada Gen Caspase 3 Kultur Sel HeLa Yang Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dosis IC50. .................................................... 52 Hasil Kuantifikasi Densitometer Scion Image Pada Gen Caspase 3 Kultur Sel HeLa Yang Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dosis 2IC50. ................................................. 54 Uji Normalitas Ekspresi Gen Caspase 3 Pada Kultur Sel Kanker Serviks Uteri HeLa. .............................................. 54 Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Daun Sirsak Terhadap Ekspresi Caspase 3 Pada Kultur Sel Kanker Serviks Uteri HeLa. ................................................................................. 55 Tabel 4.2 Tabel 4.3 Tabel 4.4 Tabel 4.5 Tabel 4.6 Tabel 4.7 Hubungan Antara Peningkatan Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dengan Peningkatan Ekspresi Caspase 3 Pada Kultur Sel Kanker Serviks Uteri HeLa. ............................ 56 ix DAFTAR GAMBAR Halaman 8 Gambar 2.1 Anatomi Serviks ................................................................ Gambar 2.2 s Gambar 2.3 Patogenesis Molekular Infeksi HPV ................................. 12 Fase-fase Siklus Sel ........................................................... 15 Gambar 2.4 Ikatan Cyclin dengan CDK ................................................ 16 Gambar 2.5 Proses Apoptosis ............................................................... 19 Gambar 2.6 Daun Sirsak ....................................................................... 23 Gambar 2.7 Struktur Annonaceous Acetogenins ................................... 25 Gambar 2.8 Bagan Kerangka Pemikiran ............................................... 33 Gambar 3.1 Bagan Alur Penelitian........................................................ 43 Gambar 4.1 Perlakuan Sel Hela. ........................................................... 47 Gambar 4.2 Hasil Elektroforesis Kelompok 1 ...................................... 49 Gambar 4.3 Hasil Elektroforesis Kelompok 2 ...................................... 50 Gambar 4.4 Hasil Elektroforesis Kelompok 3 ...................................... 52 Gambar 4.5 Hasil Elektroforesis Kelompok 4 ...................................... 53 x DAFTAR SINGKATAN AIF Apaf-1 APC ATP Bad Bax Bcl-2 Bcl-XL Bid CAD CDK CDKI cDNA cGMP CHEK / Chk CIP/KIP CIN DNA DISC DHFR ERK-MAP FADD FASL HPV HDAC` IC50 ICAD IAP INK4/ARF MDR MMPs NADH PARP Rb THF : Apoptotic Inducing Factor : Apoptotic Protease Activating Factor 1 : Anaphase Promoting Complex : Adenosine Triphosphate : Bcl-2 Associated Death Promoter : Bcl-2 Associated X Protein : B Cell Lymphoma 2 : B Cell Lymphoma Extra Large : BH3 Interacting Domain Death Agonist : Caspase Activated DNase : Cyclin Dependent Kinase : Cyclin Dependent Kinase Inhibitor : Complementary DNA : Cyclic Guanosine Monophosphate : Cell Cycle Checkpoint Kinase : CDK Interacting Protein/Kinase Inhibitory Protein : Cervical Intraepithelial Neoplasia : Deoxyribonucleic Acid : Death Inducing Signaling Complex : Dihydrofolate Reductase : Extracellular Signal Regulated Kinases-Microtubule Associated Protein : Fas Associated protein with Death Domain : Fas Ligand : Human Papilloma Virus : Histone Diacetylase : Inhibitory Concentration 50 : Inhibitor Caspase Activated DNase : Inhibitor Apoptosis Protein : Inhibitor of Kinase 4/Alternative Reading Frame : Multi Drug Resistent : Matrix Metalloproteinases : Nicotinamide Adenine Dinucleotide : Poly (ADP-ribose) Polymerase : Retinoblastoma : Tetrahydrofuran xi DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1 Perlakuan Sel 24 Jam ...................................................... 1 Lampiran 2 Elektroforesis .................................................................. 2 Lampiran 3 Hasil Foto Setelah di Invert............................................. 2 Lampiran 4 Hasil Grafik Saat Dilakukan Scion Image. ..................... 3 Lampiran 5 Rekapitulasi Data Hasil Penelitian .................................. 3 Lampiran 6 Hasil Analisis Statistik .................................................... 4 Lampiran 7 Alat-alat Penelitian .......................................................... 6 xii BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Penelitian Kejadian kanker meningkat pada negara berkembang akibat dari gaya hidup yang berhubungan dengan kanker seperti merokok, aktifitas fisik yang kurang, dan pola makan negara-negara barat.1 Kanker adalah penyebab pertama kematian pada negara maju dan penyebab kematian kedua pada negara berkembang.1 Prevalensi kanker di Indonesia pada tahun 2007 sekitar 4,3 per 1000 penduduk dimana provinsi tertinggi adalah Yogyakarta (9,6 per 1000) dan terendah di Maluku (1,5 per 1000).2 Wanita lebih tinggi prevalensinya yaitu 5,7 per 1000 penduduk sedangkan pada laki-laki 2,9 per 1000 penduduk.2 Kanker serviks uteri adalah kanker ketiga yang paling banyak di diagnosis dan kanker keempat penyebab kematian pada wanita di dunia yang berjumlah 9% (529,800) dari total kasus kanker baru dan 8% (275,100) dari total kematian akibat kanker pada wanita tahun 2008.1 Berdasarkan data dari tahun 2004 sampai 2007 kanker serviks uteri di Indonesia merupakan kanker dengan jumlah kasus terbanyak kedua setelah kanker payudara.2 Banyak faktor penyebab terjadinya kanker seviks uteri, baik internal maupun eksternal. Faktor internal terutama keberadaan gen-gen yang berperan pada siklus sel yang telah menjadi pusat pehatian dalam hubungannya terhadap proses terjadinya pertumbuhan tumor.3 Dalam hubungannya dengan petumbuhan tumor, tedapat dua golongan gen, pertama adalah kelompok pemicu terjadinya tumor 1 2 yang lazim disebut tumor onkogen, kedua adalah kelompok penekan terjadinya tumor yaitu tumor suppressor gene dan apoptosis.3 Faktor eksternal penyebab tejadinya kanker serviks uteri ada dua yaitu, yang telah dibuktikan dan yang diperkirakan. Faktor yang telah dibuktikan antara lain, wanita dengan pasangan seksual yang banyak dan wanita yang memulai hubungan seksual pada usia muda, memiliki pasangan seksual yang beresiko, hamil di usia muda dan jumlah kehamilan atau manajemen persalinan yang tidak tepat, infeksi Human Papilloma Virus dan merokok. Faktor yang diperkirakan antara lain, kontrasepsi oral, diet rendah karotenoid dan defisiensi asam folat, etnis dan faktor sosial dan pekerjaan.4 Faktor eksternal utama yang menyebabkan serviks uteri adalah infeksi Human Papilloma Virus (HPV), terutama tipe 16 dan 18. Human Papilloma Virus akan merusak gen-gen yang mengatur siklus sel dan apoptosis salah satunya caspase 3. Human Papilloma Virus tidak hanya menghambat gen yang mengatur siklus sel contohnya p53 namun juga menghambat aktivasi dari gen caspase 3.5 Ekspresi yang rendah dari mRNA caspase 3 dihubungkan dengan prognosis yang buruk. Ekspresi yang tinggi dari gen caspase 3 telah dihubungkan dengan meningkatnya sensitivitas terhadap terapi. Pada penelitian Glioma mengindikasikan bahwa terjadi penurunan secara spontan pertumbuhan sel pada kadar caspase 3 yang tinggi. Oleh karena itu, gen ini merupakan faktor prognosis yang signifikan dalam tumor.6 Dasar terjadinya tumor adalah kehilangan atau tidak responnya suatu sel terhadap pengaturan pertumbuhan sel normal. Kanker sendiri merupakan tumor 3 yang dapat menginvasi dan merusak jaringan sekitar dan juga dapat terjadi metastasis ke jaringan lain. Oleh karena itu pengobatan pada kanker bertujuan untuk menghancurkan pertumbuhan sel yang tidak normal dan menginduksi terjadinya apoptosis atau kematian sel kanker.7 Berdasarkan standar pengobatan saat ini terapi operatif, terapi radiasi dan kemoterapi baik terapi tunggal maupun kombinasi menjadi pilihan terapi untuk kanker serviks uteri. Terapi menggunakan kemoterapi dapat menghambat pertumbuhan dari sel normal, namun terapi ini memiliki beberapa efek samping seperti muntah, penurunan pertumbuhan sel yang lain dan multi drugs resisten (MDR), sehingga obat anti kanker akan dikeluarkan tubuh sebelum memberikan aksinya pada target sel.8 Oleh karena itu telah banyak dikembangkannya terapi kemoterapi dari bahan alam yang efektif dan toksisitasnya rendah sehingga dapat mencegah terjadinya MDR.8 Terapi ini juga sangat berguna bagi masyarakat ekonomi menengah ke bawah, untuk itu masih diperlukan pengembangan agen kemoterapi yang berasal dari bahan alam yang efisien dan terjangkau oleh masyarakat. Indonesia merupakan daerah beriklim tropis sehingga banyak tanaman yang tumbuh di negara ini. Kekayaan alam tumbuhan obat Indonesia terdiri atas 30.000 jenis tumbuhan dari total 40.000 jenis tumbuhan di dunia, dimana 940 jenis diantaranya merupakan tumbuhan berkhasiat obat, diantaranya bahkan dapat mengobati kanker, salah satunya adalah sirsak. Sirsak telah diteliti sejak tahun 1940an, kandungan fitokimia yang telah diteliti dari tanaman ini adalah acetogenins, alkaloid, quinolines, isoquinolines, tanin, methanolic, coumarin, 4 procyanidins, flavonoid, Acetaldehyde, Amyl-caproate.8 Semua bagian dari tanaman sirsak ini dapat digunakan untuk pengobatan. Batang dan daun memiliki zat annonaceous acetogenins yang menunjukan sitotoksik aktif melawan sel kanker .9 Pada batang dan buah sirsak memililiki zat pestisida, namun pada daun tidak ada. Daun sirsak juga sangat mudah untuk didapatkan dan digunakan dibandingkan dengan batang. Annonaceous acetogenins hanya ditemukan pada keluarga annonaceae yang merupakan kelompok besar fitokimia yang secara natural memiliki aktivitas sebagai anti kanker. Annonaceous acetogenins tidak hanya efektif dalam membunuh kanker yang resisten terhadap anti kanker agen tapi juga memiliki afinitas khusus untuk beberapa sel yang resisten.8 Pada penelitian sebelumnya daun annona muricata menghasilkan isolasi annonaceous acetogenins. Annonaceous acetogenins sitotoksik terhadap pancreatic carcinoma cell (PACA-2), Lung Carcinoma cell (A-549), lung, colon, dan pancreatic tumor.8 Pada penelitian sebelumnya, diketahui bahwa terdapat peningkatan caspase 3 pada human hepatoma pada dosis 0,001 sampai 1,0 µM.10 Berdasarkan latar belakang diatas penulis ingin meneliti mengenai mekanisme kematian pada sel kanker serviks uteri yang diberi ekstrak daun sirsak dengan menentukan ekspresi gen caspase 3. Ekstraksi yang akan dilakukan adalah dengan etanol, pemilihan ekstrak etanol dalam penelitian bertujuan bahwa pelarut etanol diharapkan dapat menarik zat-zat berkhasiat yang terdapat dalam simplisia dan lebih efektif. Pada penelitian sebelumnya juga telah diketahui bahwa ekstrak etanol pada daun sirsak dapat melawan berbagai sel kanker.8 Kandungan dalam 5 ekstrak etanol sendiri terdiri dari kandungan bioaktif acetogenin, flavonoid, saponin, dan tanin.11 Acetogenin utama yaitu, asimicin, bullatacin, trilobacin, dan bullatalicin.12 Sel yang dipakai merupakan sel HeLa. Sel HeLa merupakan continuous cell line yang diturunkan dari sel epitel kanker serviks uteri seorang wanita penderita kanker serviks uteri yang bernama Henrietta Lacks. Wanita ini meninggal pada tahun 1951 dan dilakukan biopsi pada jaringan kanker serviks uteri lalu diperbanyak. Sel HeLa tersebut mengandung HPV 18 DNA dan telah di teliti terhadap caspase 3.5,13 1.2. Rumusan Masalah 1. Apakah ekstrak etanol daun sirsak dapat meningkatkan ekspresi gen caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa? 2. Pada konsentrasi berapa ekstrak etanol daun sirsak menyebabkan peningkatan ekspresi gen caspase 3 yang paling maksimal pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa? 3. Apakah terdapat hubungan antara peningkatan konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak dengan peningkatan ekspresi gen caspase 3 ? 1.3. Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan Umum 1. Menilai pengaruh ekstrak etanol daun sirsak pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa dengan menentukan ekspresi gen caspase 3. 6 1.3.2 Tujuan Khusus 1. Menilai apakah pemberian ekstrak etanol daun sirsak dapat meningkatkan ekspresi gen caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa. 2. Menilai konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak yang menyebabkan peningkatan ekspresi gen caspase 3 paling maksimal pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa. 3. Menilai hubungan antara peningkatan konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak dengan peningkatan ekspresi gen caspase 3. 1.4. Manfaat penelitian 1.4.1 Manfaat Akademik 1. Memberikan informasi ilmiah kepada akademisi mengenai pengaruh ekstrak etanol daun sirsak terhadap kultur kanker serviks uteri HeLa melalui mekanisme molekular caspase 3. 2. Memberikan informasi awal sebagai landasan untuk penelitian lebih lanjut. 1.4.2 Manfaat Praktis 1. Memberikan informasi awal kepada masyarakat khususnya ahli kesehatan mengenai pengobatan alternatif kanker serviks uteri yang berasal dari bahan alam. 2. Pengembangan fitofarmaka untuk terapi kanker serviks uteri. BAB II TINJAUAN PUSTAKA, KERANGKA PEMIKIRAN DAN HIPOTESIS 2.1. Tinjauan Pustaka 2.1.1 Kanker Serviks Uteri Kanker merupakan kelompok penyakit yang dikarakteristikkan dengan pertumbuhan yang tidak terkontrol dan abnormal yang menyebar. Jika penyebaran dari kanker tidak terkontrol maka dapat menyebabkan kematian. 14 Di dunia, kanker merupakan pembunuh nomer dua setelah penyakit jantung.14 American Cancer Society menyatakan, kanker adalah sekelompok penyakit yang ditandai oleh pertumbuhan dan perkembangan sel-sel yang tidak terkontrol dan abnormal.15 Kanker dapat dicetuskan oleh faktor eksternal maupun faktor internal yang memicu terjadinya proses karsinogenesis (proses pembentukan kanker). Faktor ekternal dapat juga berupa infeksi, radiasi, zat kimia tertentu dan juga konsumsi tembakau, sedangkan mutasi (baik yang diturunkan maupun akibat metabolisme), hormon dan kondisi sistem imun merupakan faktor internal.16 Kanker serviks uteri merupakan tumor ganas pada bagian bawah dari uterus. Anatomi dari serviks dapat dilihat pada gambar 2.1. Pada serviks terdapat 2 jenis sel yang menutupi, sel squamous (ektoserviks) dan sel kelenjar (endoserviks). Tempat dimana dua sel ini bertemu disebut transformation zone. Sebagian besar dari kanker serviks uteri mulai terjadi pada bagian ini. 15 Kanker serviks uteri kebanyakan mulai pada sel yang melapisi serviks. Sel ini tidak secara tiba-tiba 7 8 berubah menjadi kanker, namun sel serviks yang normal mulanya berkembang secara bertahap. Perkembangan secara bertahap ini disebut pra kanker, istilah untuk pra kanker ini adalah cervical intraepithelial neoplasia (CIN), squamous intraepithelial lesion (SIL) dan dysplasia. Kanker serviks dan pra kanker serviks dibedakan dengan gambaran mikroskopiknya.15 Gambar 2.1. Anatomi Serviks Dikutip dari : Moore et al. clinically oriented anatomy, 5th edition Ada dua tipe utama dari kanker serviks, squamous sel karsinoma dan adenokarsinoma. Sekitar 80%-90% dari kanker serviks merupakan jenis squamous sel karsinoma. Kanker ini berasal dari sel squamous yang menutupi permukaan dari ektoserviks. Squamous sel karsinoma lebih sering mulai dimana ektoserviks bergabung dengan endoserviks.15 9 Kanker serviks uteri adalah kanker ketiga yang paling banyak di diagnosis dan keempat kanker penyebab kematian pada wanita di dunia, berjumlah 9% (529,800) dari total kasus kanker baru dan 8% (275,100) dari total kematian akibat kanker pada wanita tahun 2008.1 Berdasarkan data dari tahun 2004 sampai 2007 kanker serviks uteri merupakan kanker dengan jumlah kasus terbanyak kedua setelah kanker payudara.2 Faktor resiko dari kanker serviks uteri terdiri dari faktor resiko yang telah dibuktikan dan faktor resiko yang diperkirakan. Faktor yang telah dibuktikan antara lain, wanita dengan pasangan seksual yang banyak dan wanita yang memulai hubungan seksual pada usia muda, memiliki pasangan seksual yang beresiko, hamil di usia muda dan jumlah kehamilan atau manajemen persalinan yang tidak tepat, agen infeksius dan merokok. Faktor yang diperkirakan antara lain, kontrasepsi oral, diet rendah karotenoid dan defisiensi asam folat, etnis dan faktor sosial dan pekerjaan.4 Penyebab utama kanker serviks uteri adalah infeksi Human Papilloma Virus (HPV). Terdapat lebih dari 100 jenis HPV yang sudah dapat teridentifikasi. Beberapa tipe HPV virus resiko rendah jarang menimbulkan kanker, sedangkan tipe yang lain bersifat virus resiko tinggi. Baik tipe resiko tinggi maupun tipe resiko rendah dapat menyebabkan pertumbuhan abnormal pada sel tetapi pada umumnya hanya HPV tipe resiko tinggi yang dapat memicu terjadinya kanker. Virus HPV resiko tinggi yang dapat ditularkan melalui hubungan seksual adalah tipe HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, and HPV 45 dan masih terdapat beberapa tipe yang lain.16 Beberapa penelitian mengemukakan bahwa lebih dari 10 90% kanker serviks uteri disebabkan oleh tipe 16 dan 18. Dari kedua tipe ini HPV 16 sendiri menyebabkan lebih dari 50% kanker serviks uteri. Seseorang yang sudah terkena infeksi HPV 16 memiliki kemungkinan terkena kanker serviks uteri sebesar 5%.16 Kanker serviks uteri biasanya tidak menimbulkan gejala, namun ada beberapa diantaranya memiliki gejala. Gejala-gejala yang ditimbulkan antara lain, pendarahan yang tidak normal, berdarah saat hubungan seksual, pendarahan menstruasi yang banyak, keputihan, nyeri pada lumbosakral, edema pada ekstrimitas bawah dan gejala urinary.17 Kanker serviks uteri memiliki beberapa pilihan pengobatan yaitu, operasi, radioterapi, kemoterapi atau metode kombinasi. Pada saat stadium awal dari kanker serviks uteri dilakukan pengobatan operasi, namun pada stadium selanjutnya dilakukan pengobatan radioterapi, kemoterapi atau metode kombinasi. Pada pengobatan kanker memiliki efek samping. 15 Terapi operasi akan menyebabkan wanita kehilangan organ serviks dan kemungkinan untuk reccurence tinggi. Terapi radiasi juga menimbulkan efek samping yang berbahaya karena pada terapi radiasi, sel pada organ normal juga akan terbunuh. Terapi kemoterapi yaitu adriamycin dapat mengakibatkan beberapa efek samping, salah satunya multi drugs resisten (MDR) sehingga obat anti kanker akan dikeluarkan tubuh sebelum memberikan aksinya pada target sel.8 2.1.2 Patogenesis Molekular Kanker Serviks Uteri Hubungan antara infeksi human papiloma virus (HPV) dan kanker serviks uteri telah ditegakkan setelah adanya hubungan antara infeksi HPV dan kanker 11 serviks uteri pada awal 1980an.18 Human Papilloma Virus adalah anggota dari family Papovaviridae dan mengandung untaian ganda DNA virus. Tipe HPV yang paling sering menjadi penyebab kanker serviks adalah HPV 16 dan HPV 18. 19 HPV virus merupakan virus yang tidak berkapsul dengan ukuran relatif kecil (diameter 55nm). Genom dari HPV dapat dibagi menjadi noncoding long control region (LCR), atau upper regulatory region (URR), early region (E), dan late region (L). Early region merupakan downstream dari LCR dan mengandung 6 frame bacaan terbuka, yaitu E1, E2 dan E4-E7,dan berpengaruh dalam replikasi virus dan onkogenesis. E6 dan E7 memiliki efek terhadap perubahan dalam pengaturan siklus sel.18 Protein E7 memiliki peran yang sangat penting dalam transformasi keganasan dari sel epitel serviks. Protein E7 memiliki efek pada protein Retinoblastoma (Rb). Protein E7 berikatan pada Rb dan ikatan ini menggangu komplek antara Rb dan faktor transkripsi selular E2F-1. Hasil dari pembebasan E2F-1 membiarkan transkripsi produk gen yang dibutuhkan sel untuk masuk fase S dari siklus sel, dengan kata lain terjadi peningkatan proliferasi sel terus menerus. Protein E7 dapat juga berhubungan dengan protein selular seperti cyclin E.18 Protein E6 berikatan pada p53 dan terjadi inaktivasi dari gen p53 dengan mendegradasi gen p53, sebagai efeknya akan terjadi gangguan pada fase istirahat G1, apoptosis dan perbaikan DNA. Meskipun protein E7 dapat menghambat kematian pada berbagai tipe sel manusia, namun efisiensinya akan ditingkatkan ketika terdapat ekspresi dari protein E6. Sehingga, protein E6 dipercaya melengkapi peran dari E7 dan mencegah induksi dari apoptosis. Protein E6 juga 12 dipercaya berikatan dan mendegradasi pro-apoptosis BAX dan mengaktifkan antiapoptosis BCL-2 sehingga akan mengganggu proses apoptosis.18 Gambar 2.2. Patogenesis molekular infeksi HPV Dikutip dari : Applied Microbiology 2007 Pada gambar 2.2 dijelaskan tentang mekanisme infeksi HPV. Tidak aktifnya protein p53 dan Rb dapat memberikan peningkatan laju proliferasi dan ketidakstabilan genom. Hal ini menyebabkan akumulasi yang berlebih dari sel host dan kerusakan DNA yang tidak dapat diperbaiki, sehingga terjadi perubahan dari sel normal menjadi sel ganas. Mekanisme tambahan yang menyebabkan terjadinya transformasi yaitu metilasi dari viral dan DNA, aktivasi telomerase, dan faktor hormonal dan immunogenetic.19 Pada penelitian sebelumnya diketahui 13 bahwa HPV tidak hanya menghambat gen p53 namun menghambat aktivasi dari gen caspase 3 dengan mekanisme menginaktivasi caspase inisiasi.5 Mekanisme diatas akan menghambat cascade apoptosis. Protein dari HPV akan memblok aktivasi dari caspase. Penghambatan dari aktivasi caspase akan menghambat aktivasi dari caspase eksekusi yaitu caspase 3, sehingga proses apoptosis akan terhambat.5 2.1.3 Siklus Sel Siklus sel adalah periode pembentukan suatu sel melalui duplikasi kandungan sel dan kandungan genetiknya sampai tercapai pembagian dalam bentuk dua sel yang identik.20 Siklus sel merupakan proses vital dalam kehidupan setiap organisme. Secara normal, siklus sel menghasilkan pembelahan sel. Pembelahan sel terdiri dari 2 proses pertama, yaitu replikasi DNA dan pembelahan kromosom yang telah digandakan ke 2 sel anak. Siklus sel terdiri dari fase presintesis pertumbuhan 1 (G1), fase sintesis DNA (S), fase premitosis pertumbuhan 2 (G2), fase mitosis (M).21 Fase-fase pada siklus sel digambarkan dalam gambar 2.3. Setiap tahap dalam siklus sel dikontrol secara ketat oleh regulator siklus sel, yaitu: a. Cyclin. Jenis cyclin utama dalam siklus sel adalah cyclin D, E, A, dan B. Cyclin diekspresikan secara periodik sehingga konsentrasi cyclin berubahubah pada setiap fase siklus sel. Berbeda dengan cyclin yang lain, cyclin D tidak diekspresikan secara periodik akan tetapi selalu disintesis selama ada stimulasi growth factor. 14 b. Cyclin-dependent kinases (Cdk). Cdk utama dalam siklus sel adalah Cdk 4, 6, 2, dan 1. Cdks merupakan treonin atau serin protein kinase yang harus berikatan dengan cyclin untuk aktivasinya. Konsentrasi Cdks relatif konstan selama siklus sel berlangsung. Cdks dalam keadaan bebas (tak berikatan) adalah inaktif karena diblok oleh ujung C-terminal dari Cyclin– dependent kinase inhibitor (CKI). Cyclin akan menghilangkan pengeblokan tersebut. Ketika diaktifkan, Cdk akan memacu proses downstream dengan cara memfosforilasi protein spesifik. c. Cyclin–dependent kinase inhibitor (CKI), merupakan protein yang dapat menghambat aktivitas Cdk dengan cara mengikat Cdk atau kompleks cyclin-Cdk. Cyclin–dependent kinase inhibitor terdiri dari dua kelompok protein yaitu INK4 (p15, p16, p18, dan p19) dan CIP/KIP (p21, p27, p57). Protein p21 juga menghambat sintesis DNA dengan menonaktifkan proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Ekspresi p21 diregulasi oleh p53 karena p53 merupakan faktor transkripsi untuk ekspresi p21. Siklus sel dimulai dari masuknya sel pada fase G0 (quiescent) ke fase G1 karena adanya stimulus oleh growth factor. Pada awal fase G1, Cdk 4 dan atau 6 diaktifkan oleh cyclin D (cycD). Kompleks Cdk4/6 dengan cycD akan menginisiasi fosforilasi dari keluarga protein retinoblastoma (Rb) selama awal G1. Efek dari fosforilasi ini, fungsi histon deasetilasi (HDAC) yang seharusnya menjaga kekompakan struktur kromatin menjadi terganggu. Akibatnya faktor transkripsi yang semula diikat Rb menjadi lepas dan transkripsi dari E2F responsive genes yang dibutuhkan dalam progresi siklus sel ke fase S menjadi 15 aktif. Gen tersebut antara lain cycE, cycA, Cdc25, DNA polimerase, timidilat kinase, timidilat sintetase, DHFR. Gambar 2.3. Fase-fase siklus sel Dikutip dari : Kumar et al. Basic pathology Pada transisi fase G1 ke fase S, Cdk2 aktif dengan mengikat cycE. Komplek tersebut melanjutkan proses fosforilasi Rb (status hiperfosforilasi) supaya proses transkripsi yang dipacu E2F tetap aktif dan Restriction point (R) yang ada di batas fase G1/S dapat terlampaui, pada saat inilah cycA ditranskripsi. Selama G1/S, kompleks Cdk2-cycE juga memfosforilasi inhibitor p27 sehingga p27 terdegradasi. Ketika siklus sel akan memasuki fase S, cycE akan didegradasi dan Cdk2 yang dibebaskan akan mengikat cycA komplek Cdk2-cycA dibutuhkan sel untuk mereplikasi DNA selama fase S. Komplek Cdk2-cycA akan memfosforilasi protein yang dibutuhkan dalam replikasi DNA supaya aktif, contohnya adalah protein CDC6 (Cell Division Cycle 6). Kompleks tersebut juga menjaga supaya tidak terjadi multiplicity replikasi DNA. Pada akhir fase S, cycA akan melepas Cdk2 dan mengikat Cdk1 (Cdc2) yang meregulasi transisi sel dari S ke G2. Kompleks cycA-Cdk1 akan memfasilitasi kondensasi kromatin yang dibutuhkan 16 untuk penggandaan sel. Pada fase G2, sel juga memiliki kesempatan melakukan mekanisme repair apabila terjadi kesalahan sintesis DNA. Memasuki fase mitosis, cycA akan didegradasi dan terjadi peningkatan ekspresi cycB yang akan mengikat Cdk1. Kompleks Cdk1-cycB secara aktif memacu mitosis. Komplek cycB-Cdk1 berperan penting dalam control rearrangement mikrotubul selama mitosis Cdk1 dapat dinonaktifkan oleh Wee1 dan Myt1 dengan cara Wee1 dan Myt1 akan memfosforilasi Cdk1 pada tirosin-15 dan atau threonin-14. Defosforilasi pada situs tersebut dapat dilakukan oleh Cdc25 sehingga Cdk 1 menjadi aktif kembali dan siklus sel tetap berlangsung. Pada akhir fase mitosis, cycB akan didegradasi oleh anaphase promoting complex (APC) melalui proses proteolitik. APC juga berfungsi untuk memacu kromatid untuk berpisah bergerak ke masing-masing kutub untuk menyelesaikan mitosis (anafase).22 Proses pada siklus sel ini digambarkan pada gambar 2.4. Pada gambar tersebut digambarkan tentang proses berikatannya antara CDK dengan Cyclin. Gambar 2.4. Ikatan cyclin dengan CDK Dikutip dari: Kumar et al. Basic pathology 17 Kerusakan gen-gen dapat terjadi bila kemajuan fase sel menuju ke siklus sel berikutnya terlalu cepat sehingga sel pindah ke keadaan sel berikutnya sebelum fase yang dilalui diselesaikan secara lengkap. 20 Untuk menjamin bahwa DNA berduplikasi dengan akurat dan separasi dari kromosom terjadi dengan benar, maka siklus sel melakukan mekanisme checkpoint. Checkpoint bertugas mendeteksi kerusakan DNA. Apabila terdapat kerusakan DNA, checkpoint akan memacu cell cycle arrest sementara untuk perbaikan DNA atau cell cycle arrest permanen sehingga sel memasuki fase senescent. Bila mekanisme cell cycle arrest tidak cukup menjamin DNA yang rusak diduplikasi, maka sel akan dieliminasi dengan cara apoptosis. Faktor checkpoint pertama pada sel mamalia dikenal dengan restriction point (R) dan muncul menjelang akhir G1. Pada checkpoint ini, DNA sel induk diperiksa apakah terdapat kerusakan atau tidak. Bila terdapat DNA yang rusak, siklus sel dihentikan hingga mekanisme repair DNA rusak telah selesai. Setelah melampaui R, sel menjadi berkomitmen untuk menyelesaikan keseluruhan satu siklus (no return point) dan selanjutnya sel harus mampu melakukan replikasi DNA. Bila tidak melampaui R, sel dapat kembali ke fase G0. Hilangnya kontrol dari R akan menghasilkan survival DNA yang rusak. Checkpoint selanjutnya terdapat pada fase S yang berfungsi mendeteksi kerusakan DNA yang direplikasi. Checkpoint replikasi DNA selesai. Checkpoint pada G2 mencegah inisisasi sebelum replikasi DNA selesai. Checkpoint utama dalam fase S/G2/M adalah Chk1. Ketika terdapat kerusakan DNA, protein kinase ATR akan memfosforilasi Chk1. Kemudian Chk1 memfosforilasi Cdc25C pada serin-216. Fosforilasi tersebut menyebabkan kompleks cycB-Cdk1 yang 18 bertanggung jawab pada progresi fase G2/M tidak aktif. Kompleks cycB-Cdk1 yang bertanggung jawab pada progresi fase G2/M tidak aktif. Selain itu, Chk1 juga memfosforilasi Cdc25A yang bertugas mengaktifkan kompleks cycE-Cdk2 dan cycA-Cdk2 yang berperan pada progresi fase S. Dengan difosforilasinya Cdc25A oleh Chk1, kompleks cyc-Cdk menjadi tidak aktif dan terjadi S arrest. Checkpoint yang terakhir, spindle checkpoint, bertugas untuk menjaga integritas genom menjelang akhir mitosis. Jika terjadi kegagalan pada penempatan pasangan kromosom pada spindle, akan terjadi mitosis arrest. Pada sel kanker, checkpoint tidak berfungsi dengan baik dan siklus sel berlangsung tanpa terkendali.22 2.1.4 Apoptosis Apoptosis merupakan kematian sel yang terprogram pada beberapa proses fisiologi penting yaitu, penghancuran dari sel terprogram selama embryogenesis, berbagai stimulus dari injury yang ringan, delesi dari autoreactive sel T pada thymus, dan involusi fisiologis yang tergantung pada hormon. Apoptosis harus dibedakan dengan nekrosis karena apoptosis merupakan proses bunuh diri untuk menghancurkan sel yang rusak.21 Apoptosis merupakan mekanisme homeostatis sel untuk memelihara populasi sel dalam jaringan tubuh dan dalam mekanisme pertahanan tubuh. Ada 2 jalur apoptosis yaitu jalur ekstrinsik dan jalur intrinsik. Jalur ekstrinsik melibatkan Fas, sedangkan jalur intrinsik melibatkan sitokrom C yang dirilis dari mitokondria. Mitokondria memegang peran kunci dalam proses regulasi kematian sel. Hal ini karena adanya sitokrom C yang berada di space membran mitokondria. Dalam 19 keadaan normal Sitokrom C tidak boleh keluar dari mitokondria. Perannya penting pada fosforilasi oksidatif dari reaksi berantai dalam produksi ATP. Proses apoptosis digambarkan di dalam gambar 2.5 dimana terdapat dua jalur yaitu ekstinsik dan intrinsik. Gambar 2.5. Proses Apoptosis Dikutip dari : kumar et al. Basic pathology Jalur ekstrinsik Jalur ekstrinsik melibatkan Fas Ligan/FASL yang dimiliki oleh sel Tc. Sel Tc ini terkenal untuk recovery, sel Tc akan berkeliling dan bisa mengenali reseptor FAS. Ketika ada target sel yang akan dibunuh (karena rusak), maka sel tadi mengekspresikan reseptor FAS. Hal inilah yang membuat dia bisa dikenali oleh FAS ligan. Ketika mereka saling menempel, terjadi perubahan bentuk pada domain cytosolic (death domain) dari reseptor FAS. Reseptor FAS sendiri adalah protein 20 integral yang memiliki domain ekstraseluler dan domain cytosolic. Perubahan domain dari death domain ini akan dikenali oleh protein adaptor yaitu FADD. Kompleks FADD tersebut dapat mendegradasi procaspase 8 menjadi caspase 8 (aktif). Caspase 8 selanjutnya bisa mendegradasi procaspase 3 menjadi caspase 3 (aktif). Caspase 3 memiliki banyak peran, dia bisa memotong banyak substrat lain.23 Jalur intrinsik Pada mitokondria di membrannya terdapat protein Bcl-2 atau Bcl-XL yang berikatan dengan Bax. Kompleks protein tersebut menjaga sitokrom C supaya tidak keluar dari mitokondria. Jika ada protein Bad datang, maka akan mengganggu kompleks tadi dengan berikatan pada Bcl-2 atau Bcl-XL sehingga Bax terpisah. Bax kemudian berkolaborasi dengan Bax lain membentuk channel formation (suatu kanal). Kanal ini menjadi tempat masuknya ion Ca2+. Ketika ion ini masuk maka keluarlah sitokrom C. Sitokrom C yang berada di sitosol membentuk kompleks dengan Apaf-1, ATP, dan caspase 9 dinamakan Apoptosom (suatu holoenzime, gabungan beberapa protein). Kompleks ini adalah suatu protease yang bertugas memotong atau mendegradasi protein lain. Salah satunya adalah procaspase 3 menjadi caspase 3. Caspase 3 yang jumlahnya berlimpah ini akan memotong sitoskeleton (kerangka sel), PARP, ICAD.23 Apoptosis-inducing factor (AIF) dan CAD endonuklease juga dilepaskan dari intermembran mitokondria, pindah ke nukleus dan mendegradasi kromatin sehingga membentuk DNA ladder. CAD semula terikat ICAD dan kompleks ini 21 tidak aktif. Namun jika kedatangan caspase 3, maka ICAD lepas dan CAD bisa masuk inti dan terjadi proses pemotongan DNA. Sel yang sudah terpotong-potong ini dinamakan apoptotic bodies, yang selanjutnya akan dikenali oleh makrofag untuk di fagositosis.23 2.1.5 Caspase 3 Caspase adalah kelompok dari cysteine-aspartic acid protease. Caspase disintesis sebagai rantai tunggal zymogen tidak aktif dengan N-terminal prodormain ditambah subunit besar dan kecil katalisis. 24 Aktivasi dari zymogen didapatkan lewat pemecahan proteolitik pada tempat yang identik dengan motif caspase yang dikenal. Mekanisme ini memungkinkan caspase dan memproses dirinya sendiri atau caspase zymogen lain.24 Caspase dapat dibagi menjadi kelompok inisiasi dan kelompok eksekusi. Caspase 3 merupakan salah satu contoh dari caspase kelompok eksekusi. Aktivasi caspase 3 merupakan salah satu poin kunci dalam transmisi dari sinyal apoptosis karena aktifitas pemecahan caspase 3 menghasilkan berbagai morfologi dan jenis biokimia dari apoptosis.24 Caspase 3 merupakan bentuk aktif dari procaspase 3 yang diaktifkan oleh caspase 3, caspase 8, caspase 9, caspase 10, CPP32 activating protease, granzyme B. Ketika caspase 3 aktif maka akan menstimulasi pelepasan dari PARP. Pelepasan dari PARP ini akan melakukan degranulasi sel dan akhirnya di kenali oleh makrofag dan di fagositosis.25 Pada penelitian sebelumnya HPV tidak hanya menghambat gen p53 namun menghambat aktivasi dari gen caspase 3.5 Ekspresi mRNA caspase 3 yang rendah 22 dihubungkan dengan prognosis yang buruk. Ekspresi gen caspase 3 yang tinggi dihubungkan dengan meningkatnya sensitivitas terhadap terapi. Pada penelitian Glioma mengindikasikan bahwa terjadi penurunan secara spontan dari pertumbuhan sel pada kadar caspase 3 yang tinggi. Oleh karena itu, gen ini merupakan faktor prognosis yang signifikan dalam tumor.6 2.1.6 Tanaman Sirsak (Annona Muricata L) Sirsak merupakan tanaman dengan tinggi pohon sekitar 5-6 meter. Batang coklat berkayu, bulat, bercabang. Mempunyai daun berbentuk telur atau lanset, ujung runcing, tepi rata, pangkal meruncing, pertulangan menyirip, panjang tangkai 5 mm, hijau kekuningan. Pada gambar 2.6 dapat dilihat bentuk dari daun sirsak. Bunga terletak pada batang atau ranting, daun kelopak kecil, kuning keputih-putihan, benang sari banyak berambut. Buahnya bukanlah buah sejati, yang dinamakan ”buah” sebenarnya adalah kumpulan buah-buah (buah agregat) dengan biji tunggal yang saling berhimpitan dan kehilangan batas antar buah. Daging buah sirsak berwarna putih dan berbiji hitam. Akar pohon sirsak berwarna coklat muda, bulat dengan perakaran tunggang. Di Indonesia, sirsak tumbuh dengan baik pada daerah yang mempuyai ketinggian kurang dari 1000 meter di atas permukaan laut.26 23 Gambar 2.6. Daun Sirsak Dikutip dari : http://daunsirsak.net Kingdom : Plantae Divisi : Magnoliophyta Class : Magnoliopsida Ordo : magnoliales Family : Annonaceae Genus : Annona Spesies : Annona muricata L. Nama daerah : Sirsak, nongko sabrang Biji pada sirsak bersifat racun dan dapat digunakan sebagai insektisida alami, seperti juga biji srikaya. Daun sirsak bermanfaat menghambat sel kanker dengan menginduksi apoptosis, antidiare, analgetik, anti disentri, anti asma, antihelmitic, dilatasi pembuluh darah, menstimulasi pencernaan, mengurangi depresi. Semua bagian sirsak memiliki kegunaan dalam pengobatan. Batang dan daun memiliki zat annonaceous acetogenins yang menunjukan sitotoksik aktif melawan sel kanker.9 Daun sirsak juga sangat mudah untuk didapatkan dan digunakan dibandingkan dengan batang. Selain annonaceous acetogein terdapat kandungan 24 lain pada ekstrak air daun sirsak yang berfungsi dalam menghambat pertumbuhan tumor, yaitu flavonoid, Tanin, dan saponin.11 Sirsak memiliki banyak kandungan fitokimia, yaitu acetogenins, alkaloid, quinolines, isoquinolines, tanin, methanolic, saponin, coumarin, procyanidins, flavonoid, Acetaldehyde, Amyl-caproate, Amyloid, Annonain, Anomuricine, Anomuricinine, Anomurine, Anonol, Atherosperminine, Beta-sitosterol, Campesterol, Cellobiose, Asam sitrat, Citrulline, Coclaurine, Coreximine, Dextrose, Ethanol, Folacin, Fruktosa, Gaba, Galactomannan, Geranyl-caproate Glukosa, HCN, Isocitric-acid, Lignoceric-acid, Malic-acid, Manganese, Mericylalcohol, Metanol, Methyl-hex-2-enoate, Methyl-hexanoate, Muricine, Muricinine, Muricapentocin, Muricoreacin, Myristic acid, Pcoumaric acid, Paraffin, Potassium-chloride, Procyanidin, Reticuline, Scyllitol, Stearic-acid, Stepharine, Stigmasterol, Sukrosa, Xylosylcellulose. Daun sirsak mengandung senyawa acetogenin, minyak esensial, reticuline, loreximine, coclaurine, annomurine, higenamine.8 2.1.7 Annonaceous acetogenins Annonaceous acetogenin hanya ditemukan pada family Annonaceae. Annonaceous acetogenins telah diketahui memiliki khasiat anti tumor, antiparasitic, pesticidal, antiprotozoal, antihelmintic, dan antimicrobial.27 Annonaceous acetogenin merupakan suatu kelompok fitokimia yang mengandung poliketida. Kebanyakan acetogenin adalah derivat rantai panjang asam lemak (C32 atau C34) dan asam carboxylic terminal yang dikombinasi dengan 2 unit propanolol pada posisi C2 untuk membentuk methylsubstituted α,β-unsaturated-γ- 25 lactone.28 Salah satu struktur yang menarik adalah tetrahydrofuran (THF) atau tetrahydropyran (THP). Struktur annonaceous acetogenin digambarkan dalam gambar 2.6. Gambar 2.7. Struktur Annonaceous acetogenin Dikutip dari : American Chemical Society and American Society of Pharmacognosy Annonaceous acetogenin terdiri dari, annocatalin, annohexocin, annomonicin, annomontacin, annomuricatin A & B, annomuricin A thru E, annomutacin, annonacin, (multiple iso, cis, one, etc.), annonacinone, annopentocin A thru C, cis-annonacin, cis-corossolone, cohibin A thru D, corepoxylone, coronin, corossolin, corossolone, donhexocin, epomuricenin A & B, gigantetrocin, gigantetrocin A & B, gigantetrocinone, gigantetronenin, goniothalamicin, isoannonacin, javoricin, montanacin, montecristin, muracin A thru G, muricapentocin, muricatalicin, muricatalin, muri-catenol, muricatetrocin A & B muricatin D, muricatocin A thru C muricin H, muricin I, muricoreacin, murihexocin 3, murihexocin A thru C, murihexol, murisolin, robustocin, rolliniastatin 1 & 2, saba-delin, solamin, uvariamicin I & IV, xylomaticin.29 Efek sitotoksik dan anti kanker dari acetogenins memiliki beberapa mekanisme yaitu, 1). Menghambat oksidase dari NADH di membrane plasma pada sel kanker. Enzim ini hanya di ekspresi pada sel normal yang sehat. Dengan 26 menghambat enzim ini ATP selular akan menurun. 2). Menghambat komplek I (NADH : ubiquimone oxidoreduktase) dalam system transport electron di mitokondria, menghambat fosforilasi oksidasi dan menghasilkan kadar ATP yang rendah, sehingga menghambat pertumbuhan sel kanker. 3). Menghambat sel kanker yang multidrug resistant. Meningkatkan ekspresi dari plasma membrane pump, P-glycoprotein, adalah kontributor terhadap multidrug resistant. Pompa meningkatkan eliminasi dari kandungan anti kanker sebelum kandungan tersebut dapat berefek terhadap sel kanker. Dua tempat ATP berikatan pada intraselular ditemukan pada P-glycoprotein, dan aktivitas pompa membutuhkan ATP. Acetogenin, lewat penurunan ATP, dapat menurunkan aktivitas atau mematikan pompa P-glycoprotein. 4).sel kanker pada fase S dari siklus selnya lebih rentan terhadap acetogenin annonacin. Annonacin mampu mengistirahatkan siklus sel pada fase G1 dan menghambat progresi fase S. sebagai tambahan p53 dan p21 ditingkatkan oleh annonacin.9 Pada studi in vitro telah diketahui bahwa acetogenin yang di isolasi dari daun sirsak berguna melawan berbagai sel, yaitu human hepatoma hep G, prostate adenocarcinoma PC-3, pancreatic carcinoma PACA-2, murine leukemia L1210 dan P388 leukemia, human breast adenocarcinoma MDA-MB231 dan carsinoma MCF-7, human lung carcinoma A-549, dan human colon cancer HT-29. Berdasarkan Nasional Cancer Institute dan atau Nasional Institute of Health (NIH), annonaceous acetogenins dapat secara selektif menghambat pertumbuhan sel kanker dan juga menghambat pertumbuhan sel tumor yang resisten terhadap kemoterapi contohnya adriamycin.8 Pada penelitian sebelumnya, diketahui bahwa 27 terdapat peningkatan caspase 3 pada human hepatoma yang diberi annonaceous acetogenins dengan mekanisme menurunkan kadar intraseluler cGMP yang akan menginduksi apoptosis pada dosis 0,001 sampai 1,0 µM.10 Pada sel kanker bladder T24 annonacin meningkatkan aktivitas caspase 3.30 2.1.8 Tanin Tanin merupakan grup metabolit kedua yang sangat komplek yang larut dalam larutan. Zat ini dapat dibedakan dengan kandungan polyphenolic lain karena tanin dapat mengendapkan protein. Tanin ditemukan pada kayu (80%) dan herbaceous dicotyledenous species (15%). Tannin mungkin memproteksi tanaman dari herbivore dan serangan mikroorganisme patogen dikarenakan memiliki fungsi sebagai antimikroba dan anti jamur. Ikatan kuat antara tanin dengan protein tergantung pada karakteristik dari tannin dan protein. Tanin condensed dan hydrolysable memiliki grup phenolic bebas banyak yang membentuk ikatan hidrogen yang kuat pada banyak tempat dengan protein dan karbohidrat. 31 Hydrolysable tanin memiliki kemampuan dalam menghambat sel tumor yang invasive. Mekanisme penghambatan dari hydrolysable tanin ini dengan menghambat langsung aktivitas MMP-2/-9 atau dengan memblok jalur ERKMAP kinase. Pada penelitian sebelumnya hydrolysable tanin sangat potensial menghambat invasi dari HT1080 sel fibrosarkoma.32 2.1.9 Flavonoid Flavonoid merupakan bagian dari grup besar kandungan polifenol yang sangat banyak pada buah-buahan dan sayuran.33 Pada tanaman, Flavonoid berfungsi 28 melindungi dari radiasi ultraviolet, patogen, dan herbivora. Efek kesehatan dari Flavonoid kebanyakan adalah kontribusi dari antioksidan dan kemampuan chelating. Flavonoid adalah derivat dari benzo-γ-Pyrone yang terdiri dari phenolic dan rantai pyrane.34 Pada penelitian sebelumnya telah terbukti bahwa flavonoid memiliki aktivitas antioksidan yang lebih kuat melawan peroxyl radical dibandingkan dengan vitamin C dan E. Zat Flavonoid dapat menurunkan resiko terjadinya kanker paru. Flavonoid dapat menstimulasi aktivitas enzim sehingga akan menginduksi siklus sel arrest dan apoptosis, mengatur fungsi dari imun tubuh dan menghambat inflamasi, proliferasi dan angiogenesis.34 2.1.10 Saponin Saponin merupakan kelompok dari glycoside yang berasal dari tanaman. Saponin mengandung steroidal atau triterpenoid aglycone yang mana berikatan pada satu atau lebih rantai sakarida. Sakarida yang biasanya berikatan adalah glukosa, galaktosa, asam glukoronik, xylose, atau rhamnose. Saponins merupakan kelompok yang beragam tergantung pada struktur aglycone, rantai samping sakarida, dan komposisi dari rantai sampingnya.35 Saponin memiliki kemampuan sebagai antikanker lewat beberapa mekanisme. Pada penelitian sebelumnya baik in vitro dan in vivo diketahui bahwa saponin memiliki efek sitotoksik melawan pertumbuhan sel tumor. Saponin yang di ekstrak dari agave cantala dan asparagus curillus secara signifikan menghambat pertumbuhan kanker serviks uteri dan p-388 sel leukemia.36 29 2.1.11 Sel HeLa Sel HeLa merupakan salah satu sel kanker turunan dari sel epitel leher rahim (cervix). Sel HeLa adalah sel yang dibiopsi dari salah satu pasien penderita kanker servik uteri yang bernama Henrietta Lacks. Henrietta Lacks meninggal pada tahun 1951 karena adenokarsinoma serviks yang agresif. Biopsi jaringan dilakukan untuk evaluasi diagnosis pada laboratorium John Hopkins. Sel kanker telah tumbuh secara cepat dan menjadi human cell line pertama kali. Sel HeLa diketahui mengandung human papilloma virus (HPV) 18 DNA dan telah diteliti terhadap caspase 3.5,13 Sel HeLa ini digunakan untuk penelitian di seluruh dunia. Sel HeLa dapat tumbuh dengan agresif dalam media kultur. Media yang digunakan adalah media RPMI 1640-serum. Di dalamnya terkandung nutrisi yang cukup untuk pertumbuhan, yaitu asam amino, vitamin, garam-garam anorganik, dan glukosa. Serum yang ditambahkan mengandung hormon-hormon yang mampu memacu pertumbuhan sel. Albumin berfungsi sebagai protein transport, lipid diperlukan untuk pertumbuhan sel, dan mineral berfungsi sebagai kofaktor enzim.13 2.1.12 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Rection (RT-PCR) RT-PCR merupakan metode yang sensitif dan kuat untuk deteksi dan kuantifikasi dari ekspresi mRNA. Faktanya, teknik ini cukup sensitif untuk mampu mengkuantifikasi RNA dari sel tunggal. Terdapat dua langkah dalam RTPCR, yaitu reaksi reverse transcriptase dan amplifikasi PCR. RNA pertama di transkripsikan kembali menjadi komplementari DNA (cDNA) menggunakan sebuah enzim, reverse transcriptase. Hasil cDNA digunakan sebagai template 30 untuk amplifikasi PCR menggunakan spesifik primer. Visualisasi hasil PCR menggunakan elektroforesis dengan medium agarose konsentrasi 0,5% yang telah diberi etidium bromide. Kuantifikasi pita hasil elektroforesis menggunakan piranti lunak scion image.37 2.2. Kerangka Pemikiran Kanker serviks uteri adalah kanker ketiga yang paling banyak di diagnosis dan keempat kanker penyebab kematian pada wanita di dunia, berjumlah 9% (529,800) dari total kasus kanker baru dan 8% (275,100) dari total kematian akibat kanker pada wanita tahun 2008. Berdasarkan data dari tahun 2004 sampai 2007 kanker serviks uteri di Indonesia merupakan kanker terbanyak kedua pada wanita di Indonesia. Banyak faktor penyebab terjadinya kanker seviks uteri, baik internal maupun ekstenal. Faktor internal terutama keberadaan gen-gen yang berperan pada siklus sel telah menjadi pusat perhatian dalam hubungannya dengan proses terjadinya pertumbuhan tumor. Dalam hubungannya dengan petumbuhan tumor, terdapat dua golongan gen. Pertama adalah kelompok pemicu terjadinya tumor yang lazim disebut tumor onkogen, kedua adalah kelompok penekan terjadinya tumor yaitu tumor suppressor gene dan apoptosis. Faktor eksternal utama yang menyebabkan serviks uteri adalah infeksi Human Papilloma Virus, terutama tipe 16 dan 18 yang akan merusak gen-gen yang mengatur siklus sel dan apoptosis salah satunya caspase 3. Pada penelitian sebelumnya HPV tidak hanya menghambat gen p53 namun menghambat aktivasi dari gen caspase 3 dengan menginaktivasi caspase inisisasi. Ekspresi mRNA yang 31 rendah dari caspase 3 dihubungkan dengan prognosis yang buruk. Ekspresi yang tinggi dari gen caspase 3 telah dihubungkan dengan meningkatnya sensitivitas terhadap terapi. Pada penelitian Glioma mengindikasikan bahwa terjadi penurunan secara spontan pertumbuhan sel pada kadar caspase 3 yang tinggi. Oleh karena itu, gen ini merupakan faktor prognosis yang signifikan dalam tumor. Berdasarkan standar pengobatan saat ini terapi operatif, terapi radiasi dan kemoterapi baik terapi tunggal maupun kombinasi menjadi pilihan terapi untuk kanker serviks uteri, namun terapi ini memiliki beberapa efek samping. Terapi operasi akan menyebabkan wanita kehilangan sel serviks normal yang lain dan kemungkinan untuk reccurence tinggi. Terapi radiasi juga menimbulkan efek samping yang berbahaya karena pada terapi radiasi, sel normal juga akan terbunuh. Terapi menggunakan kemoterapi dapat mengakibatkan multi drugs resisten (MDR) sehingga obat anti kanker akan dikeluarkan tubuh sebelum memberikan aksinya pada target sel. Oleh karena itu telah banyak dikembangkannya terapi kemoterapi dari bahan alam yang efektif dan toksisitasnya rendah sehingga dapat mencegah tejadinya MDR. Terapi ini juga sangat berguna bagi masyarakat ekonomi menengah ke bawah, untuk itu masih diperlukan pengembangan agen kemoterapi yang berasal dari bahan alam yang efisien dan terjangkau oleh masyarakat. Tanaman di Indonesia sendiri banyak dipercaya untuk pengobatan, diantaranya bahkan dapat mengobati kanker, salah satunya adalah sirsak. Sirsak telah diteliti sejak tahun 1940an, kandungan fitokimia yang telah diteliti dari tanaman ini adalah acetogenins, alkaloid, quinolines, isoquinolines, tanin, methanolic, 32 ccoumarin, procyanidins, flavonoid. Semua bagian sirsak memiliki kegunaan dalam pengobatan. Batang dan daun memiliki zat annonaceous acetogenins yang menunjukan sitotoksik aktif melawan sel kanker. Daun sirsak lebih mudah untuk didapatkan dan digunakan. Annonaceous acetogenins merupakan kelompok besar fitokimia yang secara natural memiliki aktivitas sebagai anti kanker. Annonaceous acetogenins tidak hanya efektif dalam membunuh kanker yang resisten terhadap anti kanker agen tapi juga memiliki afinitas khusus untuk beberapa sel yang resisten. Pada penelitian sebelumnya daun annona muricata menghasilkan isolasi annopentocin A, B, dan C dan Cis- dan trans- annomuricin-D-ones. Annonaceous acetogenins sitotoksik terhadap pancreatic carcinoma cell (PACA-2), Lung Carcinoma cell (A-549), lung, colon, dan pancreatic tumor. Diketahui juga bahwa terdapat peningkatan apoptosis yang mungkin terdapat peningkatan caspase 3 pada human hepatoma dengan mekanisme menurunkan kadar intraseluler cGMP yang akan menginduksi apoptosis. Pada sel kanker bladder T24 annonacin meningkatkan aktivitas caspase 3. Ekstraksi yang akan dilakukan adalah dengan etanol. Kandungan dalam ekstrak etanol sendiri terdiri dari kandungan bioaktif acetogenin, flavonoid, saponins, dan tannin. Acetogenin utama yaitu, asimicin, bullatacin, trilobacin, dan bullatalicin. Sel HeLa merupakan salah satu sel kanker turunan dari sel epitel leher rahim (cervix) yang positif HPV 18. RT-PCR merupakan metode yang sensitif dan kuat untuk deteksi dan kuantifikasi dari ekspresi mRNA. Visualisasi hasil PCR 33 menggunakan elektroforesis dengan medium agarose yang telah diberi etidium bromide. Kuantifikasi pita hasil elektroforesis menggunakan piranti lunak scion image. Angka kejadian dan kematian kanker serviks uteri meningkat Infeksi HPV 16 dan 18 E6 E7 Inaktivasi gen caspase 3 Gangguan apoptosis Daun Sirsak Mengandung Annonaceous acetogenin, Flavonoid, saponin dan Tanin Annonaceous acetogenin meningkatkan ekspresi gen caspase 3 Ekspresi gen caspase 3 meningkat apoptosis meningkat Gambar 2.8 Bagan Kerangka Pemikiran 34 2.3. Hipotesis Berdasarkan kerangka pemikiran diatas maka dapat disusun hipotesis sebagai berikut : 1. Ekstrak etanol daun sirsak meningkatkan ekspresi gen caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa. 2. Konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak yang dapat meningkatkan ekpresi gen caspase 3 paling maksimal adalah 240 µg/mL. 3. Terdapat hubungan antara peningkatan konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak dengan peningkatan ekspresi gen caspase 3. BAB III SUBJEK/OBJEK/BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1. Subjek/Bahan Penelitian 3.1.1 Subjek Penelitian Subjek pada penelitian ini adalah sel HeLa. Dilakukan sebanyak 12 sampel yang terbagi menjadi 4 perlakuan. Kriteria inklusi : - Kultur sel HeLa yang tidak terkontaminasi - Telah subconfluent Kriteria eksklusi : - Terjadi perubahan morfologi 3.1.2 Bahan Penelitian Bahan penelitian yang digunakan adalah sebagai berikut : 1. Daun sirsak (Annona muricata L.) yang diambil dari perkebunan di Subang, Jawa Barat. Daun yang digunakan adalah daun yang tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda serta diambil dari ranting ke 5-10. 2. Sel HeLa (berasal dari Lab. Parasitologi FK UGM) 3. Medium sel : RPMI-1640 (Gibco), Fetal Bovine Serum/FBS 10% (Gibco), Fungison 0,5% (Gibco), penisilin dan streptomisin 1% (Gibco). 4. Primer Human Caspase 3 a. Sense primer : 5’-CAAACTTTTTCAGAGGGGATCG-3’ 35 36 b. Antisense primer : 5’-GCATACTGTTTCAGCATGGCAC-3’ Kedua primer tersebut mengamflifikasi daerah gen caspase 3 sepanjang 272bp.38 5. Primer beta actin (kontrol positif) a. Sense primer : 5’-GCTGTGCTATCCCTGTA-3’ b. Antisense primer : 5’-GCCTCAGGGCAGCAGCGG-3’ Kedua primer tersebut mengamplifikasi daerah gen beta actin sepanjang 340-bp 6. Kit Isolasi RNA( TriPure Isolation Reagen, Ronche) 7. Kit RT-PCR (Ronche) 8. Bahan pembuatan gel : Buffer TAE, Agarose, Etidium Bromida 9. Larutan buffer 10. Isopropanol 11. Diethylpyrocarbonat (DEPC) 12. RNase – free water of DEPC – treated 0,5% SDS 3.1.3 Alat Penelitian Alat penelitian yang digunakan adalah sebagai berikut: 1. Sentrifus 2. Inkubator CO2 3. Laminar air flow cabinet (Nuaire) 4. Tabung conical steril (Nuclone) 5. Tissue culture flask (Nuclone) 6. Mikroplate 24 sumuran (Nuclone) 37 7. PCR 8. Elektroforesis 9. Scion image 10. Densitometer 3.2. Metode Penelitian 3.2.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni in vitro. Metode uiji yang digunakan adalah pemberian ekstrak etanol daun sirsak terhadap sel HeLa. 3.2.2 Definisi Konsep dan Operasional 3.2.2.1 Definisi Konsep Variabel a. Variabel terikat : - Ekspresi gen mRNA Caspase 3 b. Variabel bebas : - Konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak c. Variabel terkendali : - Sel HeLa - Medium - Konsentrasi sel HeLa - waktu, durasi, CO2, dan Suhu 3.2.2.2 Definisi Operasional Variabel a. Ekspresi gen Caspase 3 diukur kuantifikasinya dengan menggunakan metode densitometer dengan piranti lunak scion image. 38 b. Sel Hela yang digunakan berasal dari laboratorium parasitologi Universitas Gajah Mada yang diambil dari biakan ke-6. Sel HeLa dikatakan subconfluent bila lebih dari 80% tumbuh melekat pada weel microplate. Sel HeLa tidak terkontaminasi apabila pada weel atau microplate hanya tumbuh sel HeLa tanpa adanya bakteri, jamur, ataupun mikroorganisme lain. Morfologi sel hela merupakan fibroblast like cell yang berbentuk polihedral. 3.2.3 Jumlah Sampel dan Teknik Pengambilan Sampel Penentuan jumlah sampel tiap kelompok didasarkan pada formulasi Gomez. Banyaknya perlakuan (T) adalah 4, sehingga jumlah sampel tiap kelompok (r) adalah : T (r-1) ≥ 6 4 (r-1) ≥ 6 4r – 4 ≥ 6 4r r Keterangan : T : Banyaknya Perlakuan r : Jumlah sampel tiap kelompok ≥ 10 ≥ ~3 Jumlah minimal sampel yang akan digunakan untuk penelitian ini adalah 3 buah sampel untuk setiap kelompok perlakuan. 3.2.4 Kelompok Perlakuan Sel dibagi menjadi 4 kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari 4 sampel, yaitu : a. Kelompok I (kontrol negatif) : 1 mL suspense sel HeLa dalam media kultur RPMI-1640. b. Kelompok II : 1 mL suspense sel HeLa + 60µg/mL ekstrak etanol daun sirsak dalam media kultur RPMI-1640. 39 c. Kelompok III : 1 mL suspense sel HeLa + 120µg/mL ekstrak etanol daun sirsak dalam media kultur RPMI-1640. d. Kelompok IV : 1 mL suspense sel HeLa + 240µg/mL ekstrak etanol daun sirsak dalam media kultur RPMI-1640. IC50 ditentukan menggunakan metode MTT dengan IC50= 120µg/mL Selanjutnya mikroplate diinkubasi dalam inkubator 5% CO2 selama 24 jam pada suhu 37oC. 3.2.5 3.2.5.1 Prosedur Penelitian Pembuatan Ekstrak Daun Sirsak Daun sirsak yang digunakan adalah dari daerah perkebunan di Subang, Jawa Barat. Kemudian bahan uji ini diekstrak dengan etanol, pengekstrakan dilakukan di laboratorium Farmakognostik Fakultas Farmasi ITB, Bandung, pembuatan ekstrak dilakukan dengan prosedur sebagai berikut: 1. Sebanyak 10 kg daun sirsak dipotong-potong membentuk simplisia dan dicuci sampai bersih, kemudian dikeringkan. Setelah kering, simplisia ini dihancurkan sehingga menghasilkan 1 kg simplisia kering. 2. Simplisia daun sirsak yang telah menjadi bubuk direbus dengan menambahkan 6 L etanol selama 2 jam disaring dengan ukuran 125 mesh, bagian yang masih kasar diekstrak. 3. Memberikan alas kapas pada maserator. 4. Memasukkan simplisia yang telah dihaluskan ke dalam maserator, lalu tambahkan etanol 95% dan diamkan selama 24 jam. 5. Mengeluarkan larutan dari outlet di bawah maserator. 40 6. Menyaring serbuk yang terbawa dengan menggunakan kertas saring. Larutan ini disebut ekstrak encer. 7. Menambahkan etanol baru ke dalam ampas yang tersisa di dalam maserator. 8. Mengulangi penambahan etanol sampai larutan yang keluar dari outlet maserator tidak berwarna lagi (biasanya 5-6 kali rendaman). 9. Memekatkan ekstrak encer yang telah didapatkan dengan menggunakan alat Rotari Evaporator sampai pekat atau sampai tidak ada lagi pelarut yang menetes di kondensor Rotari Evaporator. 10. Ekstrak ini dinamakan ekstrak pekat. 3.2.5.2 Penumbuhan Sel Hela Media tumbuh yang digunakan adalah RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Instituted), yaitu medium yang digunakan secara luas untuk menumbuhkan sel mamalia, dengan penambahan 10% FBS (Fetal Bovine Serum), Fungison 0,5% dan 1% penisilin-streptomisin. Konsentrasi sel yang digunakan yaitu 1 x 10 3 sel/mL ke dalam 15 sumuran masing-masing dimasukkan 1 mL suspensi sel. 3.2.5.3 Perlakuan Sel HeLa Setelah sel tumbuh subconfluent, maka medium diganti dengan medium yang telah diberi ekstrak etanol daun sirsak sesuai konsentrasi perlakuan. Sel HeLa yang diberi ekstrak etanol daun sirsak diinkubasi pada CO2 5%, suhu 37 °C dalam waktu 24 jam. Setelah 24 jam, sel dapat dipanen dan diteliti. 41 3.2.5.4 Pengukuran Ekspresi Gen Caspase 3 a) Isolasi RNA 1. Media kultur sel diaspirasi. 2. Sentrifuge bahan memakai polypropylene tube memakai Tri pure Isolation Reagent, lalu supernatant dibuang 3. Tambahkan Tri Pure Isolate reagen, sel pellet lalu diinkubasi pada 25oC 4. Lisiskan sel dengan pipeting 5. Pindahkan ke polypropylene tube lalu inkubasi pada 15-25oC , selama 5menit 6. Tambahkan Chloroform 0,15 mL, lalu tutup dan digoyang selama 15 detik 7. Diinkubasi pada 25oC selama 2-15 menit 8. Sentrifuge pada 12.000 g, 15 menit (2-8oC) 9. Pindahkan cairan yang berwarna pucat bagian atas ke polypropylene centrifuge yang baru. 10. Endapkan RNA menambahkan isopropanol 0,5 mL, tutup dan aduk beberapa waktu 11. Inkubasi 5-10 menit pada 15 – 25oC maka RNA akan mengendap 12. Sentrifus 12.000 g, 10 menit 2-8oC 13. Supernatan dibuang, larutkan dalam larutan RNA –water dan simpan di dalam lemari pendingin -8 derajat celsius lakukan RT-PCR 42 b) Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 1. Masukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga yang telah berisi RNA : DEPC treated water 12,5 µL, Primer (oligo(dT)18) 1 µL, Template Total RNA 3 µL. 2. Kemudian masukkan zat-zat dengan urutan : 5x reaction buffer untuk reverse transcriptase Riboblock TM RNAse inhibitor (0,5 µL (20u)) dNTP mix, masing-masing 10mM (2 µL(1mM final concentration)) M-Mulv reverse transcriptase (2 µL (40u)) 3. Kocok dan sentrifugasi 4. Inkubasi 60 menit dengan suhu 37°C c) Elektroforesis Hasil RT-PCR 1. Sebanyak 1 µL hasil utas pertama cDNA ini digunakkan sebagai template dalam reaksi PCR. 2. Pengaturan PCR : satu siklus denaturasi 98°C selama 3 menit, diikuti 60°C selama penambahan 1 U of Taq DNA polymerase (Life Technologies Ltd., Paisley, Scotland) pemanjangan Primer pada 72°C untuk 30 detik; 4 siklus denaturasi pada 94°C selama 30 detik, kemudian ditahan pada 60°C selama 30 detik, pemanjangan primer pada 72°C selama 30 detik; 30 siklus. 3. Hasil PCR diperiksa menggunakan gel agarosa konsentrasi 0,5% yang telah diberi etidium bromide. 43 d) Scion Image 1. Hasil foto elektroforesis di inverted menggunakan perangkat lunak untuk gambar, lalu di masukan kedalam perangkat lunak scion image. 2. Hasil foto tersebut akan menghasilkan sebuah kurva dan akan terdapat hasil angka. 3. Foto-foto tersebut di ulang sebanyak 3x dan di hitung perbedaan dan reratanya. Pembuatan ekstrak etanol daun sirsak Penumbuhan kultur sel, dibagi menjadi 4 kelompok perlakuan Isolasi sel Isolasi RNA RT- PCR Elektroforesis hasil RT-PCR Kuantifikasi dengan Scion Image Gambar 3.1 Bagan Alur Penelitian 44 3.2.6 Analisis Data Data hasil penelitian akan dipresentasikan berupa hasil elektroforesis dari RT-PCR mRNA Caspase 3 dari kelompok kontrol dan kelompok perlakuan daun sirsak. Pengaruh ekstrak etanol daun sirsak terhadap ekspresi Caspase 3 pada kultur sel HeLa masing-masing akan dimasukan ke dalam perangkat lunak SPSS 18 lalu diuji melalui uji normalitas dengan metode Shapiro-Wilk untuk menilai distribusinya. Jika terdistribusi normal, maka akan dilanjutkan dengan Analisis Varians (ANOVA) Satu-Arah, yaitu menguji perbedaan rata-rata antar keempat kelompok perlakuan. Jika hasil uji ANOVA menunjukkan hasil yang signifikan, maka disimpulkan minimal terdapat dua (2) kelompok perlakuan yang memiliki ratarata ekspresi gen Caspase 3 pada kultur sel HeLa. Adapun jika hasil uji ANOVA menunjukkan hasil yang bermakna, maka diuji statistik lanjutan dengan menggunakan Uji Duncan yaitu Posthoc untuk melihat signifikansi antar kelompok. Jika tidak terdistribusi normal, maka akan dilanjutkan dengan uji non- parametrik dengan menggunakan metode Kruskall-Wallis. Adapun jika hasil uji Kruskall-Wallis menunjukkan hasil yang bermakna, maka diuji statistik lanjutan dengan menggunakan Uji Mann-whitney yaitu untuk melihat signifikansi antar kelompok. Sedangkan uji korelasi dilakukan dengan Spearman correlation test dengan melihat korelasi antara dosis dengan ekspresi gen Caspase 3. 45 3.2.7 Aspek Etika Penelitian Kultur sel HeLa merupakan continous cell line yang diturunkan dari sel epitel rahim seorang wanita penderita kanker serviks uteri bernaa Henrietta Lacks yang meninggal akibat kanker pada tahun 1951. Kultur sel ini telah digunakan dalam penelitian diseluruh dunia. Sel HeLa yang digunakan dalam penelitian ini merupakan sel yang disimpan dan dikembangkan di Laboratorium Parasitologi Universitas Gajah Mada. Karena peneliti tidak berhubungan langsung dengan sumber sel HeLa, maka masalah etik dapat diminimalkan. Peneliti mengerjakan penelitian ini dibawah pengawasan dari tim ahli. Penggunaan sel HeLa dalam penelitian ini dilakukan sebaik-baiknya untuk kemajuan ilmu pengetahuan, penelitian dan kepentingan masyarakat dengan mempertimbangkan etika bahan biologi tersimpan. 3.2.8 Lokasi Penelitian Penelitian dilaksanakan di laboratorium Parasitologi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta, laboratorium Biologi Universitas Pendidikan Indonesia (UPI) Bandung, laboratorium Farmakognostik Fakultas Farmasi ITB, Bandung. 46 3.2.9 Waktu Penelitian Penelitian dimulai pada bulan april sampai bulan September yang terdiri dari : Tabel 3.1. Jadwal Penelitian Kegiatan Waktu Pembuatan ekstrak Maret-April Kultur sel Hela April Penentuan MTT April-Mei Perlakuan Juni- Agustus Analisis Statistik Agustus Dan Pembahasan Sidang skripsi September BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Penelitian Pengukuran tebal pita elektroforesa untuk melihat ekspresi gen caspase 3 sel HeLa hasil RT-PCR dilakukan dengan menggunakan sinar UV lalu dikuantifikasi dengan menggunakan densitometer dengan bantuan perangkat lunak Scion image, dengan kontrol positif beta actin sebagai pembanding. Perhitungan dilakukan sebanyak 3 kali lalu di rata-ratakan. Pada penelitian ini sebelumnya dilakukan terlebih dahulu perlakuan sel HeLa yang di inkubasi selama 24 jam. Perbandingan gambaran sel Hela kontrol dan perlakuan terlihat pada gambar 4.1. Kontrol Dosis 120 µg/mL Dosis 60 µg/mL Dosis 240 µg/mL Gambar 4.1 Perlakuan Sel HeLa 47 48 Pada gambar 4.1 terlihat bahwa jumlah sel HeLa pada kontrol sangat banyak, penuh, sel terlihat padat dan menumpuk, bentuk sel seperti sel fibroblast. Pada perlakuan dosis 60 µg/mL ekstrak etanol daun sirsak terlihat jumlah sel sedikit menurun, terlihat beberapa gambaran sel yang bulat dan mengapung yang menunjukan bahwa ada beberapa sel yang mengalami kematian. Sel yang berbentuk fibroblast masih banyak menempel pada microplate. Pada perlakuan 120 µg/mL ekstrak etanol daun sirsak terlihat jumlah sel yang mengalami banyak penurunan, terlihat banyak gambaran sel yang bulat dan mengapung yang menunjukan bahwa banyak sel yang mengalami kematian. Sel yang berbentuk fibroblast tidak banyak yang menempel pada microplate. Pada perlakuan 240 µg/mL ekstrak etanol daun sirsak terlihat jumlah sel yang sudah sangat sedikit sekali, terlihat banyak sekali gambaran sel yang bulat dan mengapung yang menunjukan bahwa banyak sekali sel yang mengalami kematian. Sel yang berbentuk fibroblast tidak banyak yang menempel pada microplate. Hasil ini dapat menunjukan bahwa terdapat penurunan jumlah sel HeLa seiring dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak. 4.1.1 Ekspresi Gen Caspase 3 Kelompok 1 (Kultur Sel HeLa Yang Tidak Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak) Setelah dilakukan isolasi RNA, kemudian dilanjutkan dengan RT-PCR dan elektroforesis. Pada sel HeLa dari ketiga sampel gen caspase 3 tidak terekspresi, seperti yang terdapat pada gambar 4.2. 49 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 300 bp 272 bp 200 bp 340 bp Gambar 4.2 Hasil Elektroforesis Kelompok 1 Keterangan : Jalur 1 : Ladder 100 bp Jalur 2 : Kontrol β-aktin (340 bp) Jalur 3 : Caspase 3 sel HeLa tanpa perlakuan ulangan 1 Jalur 4 : Caspase 3 sel HeLa tanpa perlakuan ulangan 2 Jalur 5 : Caspase 3 sel HeLa tanpa perlakuan ulangan 3 Pada gambar 4.2 terlihat bahwa gen caspase 3 tidak terekspresi pada ketiga sampel kultur sel uteri HeLa yang tidak diberi ekstrak etanol daun sirsak. Pengujian sampel hasil elektroforesis ini dikuantifikasi dengan menggunakan densitometer Scion Image dengan 3 kali pengulangan. Hasil pengulangan tersebut merupakan perbandingan antara band caspase 3 sel HeLa yang tidak diberi ekstrak etanol daun sirsak dan β-aktin sebagai kontrol positif yang kemudian hasil perbandingan tersebut direratakan. Hasil kuantifikasi tersebut dapat dilihat pada tabel 4.1. Tabel 4.1 Hasil Kuantifikasi Densitometer Scion Image pada Gen Caspase 3 Kultur Sel HeLa Yang Tidak Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Jalur 1 3 4 5 Rerata Kelompok 1 Ladder 100 bp sel HeLa tanpa perlakuan ulangan 1 sel HeLa tanpa perlakuan ulangan 2 sel HeLa tanpa perlakuan ulangan 3 sel HeLa tanpa perlakuan Hasil perbandingan 0.04 0.04 0.04 0.04 50 4.1.2 Ekspresi Gen Caspase 3 Kelompok 2 (Kultur Sel Hela Yang Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dosis ½IC50) Setelah dilakukan isolasi RNA, kemudian dilanjutkan dengan RT-PCR dan elektroforesis. Pada sel HeLa dari ketiga sampel gen caspase 3 tidak terekspresi, seperti yang terdapat pada gambar 4.3. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 300 bp 272 bp 200 bp 340 bp Gambar 4.3 Hasil Elektroforesis Kelompok 2 Keterangan : Jalur 1 : Ladder 100 bp Jalur 2 : Kontrol β-aktin (340 bp) Jalur 6 : Caspase 3sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis ½IC50 ulangan 1 Jalur 7 : Caspase 3sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis ½IC50 ulangan 2 Jalur 8 : Caspase 3sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis ½IC50 ulangan 3 Pada gambar 4.3 terlihat bahwa gen caspase 3 tidak terekspresi pada ketiga sampel kultur sel uteri HeLa yang diberi ekstrak etanol daun sirsak dosis ½ IC50. Pengujian sampel hasil elektroforesis ini dikuantifikasi dengan menggunakan densitometer Scion Image dengan 3 kali pengulangan. Hasil pengulangan tersebut merupakan perbandingan antara band caspase 3 sel HeLa yang ekstrak etanol daun sirsak dosis ½IC50 dan β-aktin sebagai kontrol positif yang kemudian hasil 51 perbandingan tersebut direratakan. Hasil kuantifikasi tersebut dapat dilihat pada tabel 4.2. Tabel 4.2 Hasil Kuantifikasi Densitometer Scion Image Pada Gen Caspase 3 Kultur Sel HeLa Yang Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dosis ½IC50 Jalur 1 6 7 8 Rerata Kelompok 2 Rerata hasil perbandingan Ladder 100 bp sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis ½IC50 ulangan 1 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis ½IC50 ulangan 2 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis ½IC50 ulangan 3 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis ½IC50 0.04 0.04 0.04 0.04 4.1.3 Ekspresi Gen Caspase 3 Kelompok 3 (Kultur Sel HeLa Yang Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dosis IC50) Setelah dilakukan isolasi RNA, kemudian dilanjutkan dengan RT-PCR dan elektroforesis. Pada sel HeLa dari ketiga sampel gen caspase 3 terekspresi, seperti yang terdapat pada gambar 4.4. Pada gambar 4.4 terlihat bahwa gen caspase 3 tidak terekspresi pada ketiga sampel kultur sel uteri HeLa yang diberi ekstrak etanol daun sirsak dosis IC50. Pengujian sampel hasil elektroforesis ini dikuantifikasi dengan menggunakan densitometer Scion Image dengan 3 kali pengulangan. Hasil pengulangan tersebut merupakan perbandingan antara band caspase 3 sel HeLa yang ekstrak etanol daun sirsak dosis IC50 dan β-aktin sebagai kontrol positif yang kemudian hasil perbandingan tersebut direratakan. Interprestasi hasil kuantifikasi tersebut dapat dilihat pada tabel 4.3. 52 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 300 bp 272 bp 200 bp 340 bp Gambar 4.4 Hasil Elektroforesis Kelompok 3 Keterangan : Jalur 1 : Ladder 100 bp Jalur 2 : Kontrol β-aktin (340 bp) Jalur 9 : Caspase 3 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis IC50 ulangan 1 Jalur 10 : Caspase 3 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis IC50 ulangan 2 Jalur 11 : Caspase 3 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis IC50 ulangan 3 Tabel 4.3 Hasil Kuantifikasi Densitometer Scion Image Pada Gen Caspase 3 Kultur Sel HeLa Yang Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dosis IC50 Jalur 1 9 10 11 Rerata Kelompok 3 Rerata hasil perbandingan Ladder 100 bp sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis IC50 ulangan 1 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis IC50 ulangan 2 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis IC50 ulangan 3 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis IC50 0.04 0.04 0.04 0.04 4.1.4 Ekspresi Gen Caspase 3 Kelompok 4 (Kultur Sel HeLa Yang Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dosis 2IC50) Setelah dilakukan isolasi RNA, kemudian dilanjutkan dengan RT-PCR dan elektroforesis. Pada sel HeLa dari ketiga sampel gen caspase 3 tidak terekspresi, seperti yang terdapat pada gambar 4.5. 53 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 300 bp 272 bp 200 bp 340 bp Gambar 4.5 Hasil Elektroforesis Kelompok 4 Keterangan : Jalur 1 : Ladder 100 bp Jalur 2 : Kontrol β-aktin (340 bp) Jalur 12 : Caspase 3 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis 2IC50 ulangan 1 Jalur 13 : Caspase 3 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis 2IC50 ulangan 2 Jalur 14 : Caspase 3 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis 2IC50 ulangan 3 Pada gambar 4.5 terlihat bahwa gen caspase 3 tidak terekspresi pada ketiga sampel kultur sel uteri HeLa yang diberi ekstrak etanol daun sirsak dosis 2IC50. Pengujian sampel hasil elektroforesis ini dikuantifikasi dengan menggunakan densitometer Scion Image dengan 3 kali pengulangan. Hasil pengulangan tersebut merupakan perbandingan antara band caspase 3 sel HeLa yang ekstrak etanol daun sirsak dosis 2IC50 dan β-aktin sebagai kontrol positif yang kemudian hasil perbandingan tersebut direratakan. Hasil kuantifikasi tersebut dapat dilihat pada tabel 4.4. 54 Tabel 4.4 Hasil Kuantifikasi Densitometer Scion Image Pada Gen Caspase 3 Kultur Sel HeLa Yang Diberi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dosis 2IC50 Jalur 1 12 13 14 Rerata 4.1.5 Kelompok 4 Rerata hasil perbandingan Ladder 100 bp sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis 2IC50 ulangan 1 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis 2IC50 ulangan 2 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis 2IC50 ulangan 3 sel HeLa + ekstrak etanol daun sirsak dosis 2IC50 0.04 0.04 0.04 0.04 Distribusi Data Sebelum dilakukan analisis statistik, untuk data numerik dilakukan uji normalitas dengan menggunakan Shapiro Wilks Test untuk melihat distribusi data dengan besar sampel ≤50 sampel, hasil uji normalitas dapat dijelaskan pada tabel 4.5 dibawah ini : Tabel 4.5 Uji Normalitas Ekspresi Gen Caspase 3 Pada Kultur Sel Kanker Serviks Uteri HeLa Kultur sel HeLa pada kelompok perlakuan Tidak diberi ekstrak daun sirsak (kontrol) Diberi ekstrak daun sirsak dengan dosis 1/2 IC50 (60) Ekspresi gen Caspase 3 *) Nilai p Distribusi data Tidak Normal Tidak Normal Diberi ekstrak daun sirsak dengan dosis 1 IC50 (120) - Tidak Normal Diberi ekstrak daun sirsak dengan dosis 2 IC50 (240) - Tidak Normal *) Shapiro Wilks Test Uji normalitas dengan Shapiro Wilks Test menunjukkan bahwa sebagian besar variabel ekspresi caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa sama hasilnya sehingga diasumsikan tidak berdistribusi normal sehingga data dianalisis menggunakan uji non-parametrik yaitu Kruskall Wallist Test untuk menguji pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sirsak dapat menurunkan ekspresi 55 caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa, sedangkan untuk melihat perbedaan ekspresi caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa yang bermakna antara 2 kelompok perlakuan di gunakan Mann Whitney test. 4.1.6 Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Daun Sirsak Terhadap Ekspresi Caspase 3 Pada Kultur Sel Kanker Serviks Uteri HeLa Pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sirsak terhadap ekspresi caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa dapat dijelaskan pada tabel 4.6 berikut ini: Tabel 4.6 Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Daun Sirsak Terhadap Ekspresi Caspase 3 Pada Kultur Sel Kanker Serviks Uteri HeLa Ekspresi Caspase Rerata Kultur sel HeLa pada kelompok perlakuan Tidak diberi ekstrak daun sirsak (kontrol) Diberi ekstrak daun sirsak SD Median Minimum Nilai P Maksimum Rentang 1,000 0,04 0,00 0,04 0,04 0,04 0,00 0,04 0,00 0,04 0,04 0,04 0,00 0,04 0,00 0,04 0,04 0,04 0,00 0,04 0,00 0,04 0,04 0,04 0,00 dosis 1/2 IC50 (60) Diberi ekstrak daun sirsak dosis 1/2 IC50 (120) Diberi ekstrak daun sirsak dosis 1/2 IC50 (240) *) Kruskall Wallist test Tabel 4.6 menunjukkan bahwa rerata ekspresi caspase 3 pada Kultur sel HeLa yang diberi ekstrak daun sirsak dosis 1/2 IC50 (60 µg/mL), dosis 1 IC50 (120 µg/mL), dan dosis 2 IC50 (240 µg/mL) adalah 0,040. Berdasarkan data tersebut terlihat bahwa Ekstrak etanol daun sirsak tidak ditemukan ekspresi Caspase 3 56 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa pada dosis 1/2 IC50 (60 µg/mL), dosis 1 IC50 (120 µg/mL), dosis 2 IC50 (240 µg/mL). Berdasarkan Tabel 4.6 terlihat bahwa hasil uji statistik menggunakan Kruskall Wallist test pada derajat kepercayaan 95% menunjukkan bahwa tidak terdapat pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sirsak terhadap ekspresi caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa secara bermakna dengan nilai p=1,000 (nilai p>0,05). 4.1.7 Hubungan Antara Peningkatan Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dengan Peningkatan Ekspresi Gen Caspase 3 Pada Kultur Sel Kanker Serviks Uteri HeLa Hubungan antara peningkatan konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak dengan peningkatan ekspresi caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa dapat dijelaskan pada tabel 4.7. Tabel 4.7 Hubungan Antara Peningkatan Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Sirsak Dengan Peningkatan Ekspresi Caspase 3 Pada Kultur Sel Kanker Serviks Uteri HeLa Hubungan antara peningkatan konsentrasi ekstrak etanol rs 0,00 Nilai p 1,000 daun sirsak dengan peningkatan ekspresi caspase 3 *) Spearman Correlation Test Berdasarkan Tabel 4.7 terlihat bahwa hasil uji statistik menggunakan Spearman Correlation Test pada derajat kepercayaan 95% menunjukkan bahwa tidak terdapat hubungan antara peningkatan konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak dengan ekspresi caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa secara bermakna dengan nilai p=1,000 (nilai p>0,05). 57 4.2. Pembahasan 4.2.1 Ekspresi Gen Caspase 3 Banyak faktor penyebab terjadinya kanker seviks uteri, baik internal maupun ekstenal. Faktor internal terutama keberadaan gen-gen yang berperan pada siklus sel yang telah menjadi pusat pehatian dalam hubungannya terhadap proses terjadinya pertumbuhan tumor. Dalam hubungannya dengan petumbuhan tumor, tedapat dua golongan gen, pertama adalah kelompok pemicu terjadinya tumor yang lazim disebut tumor onkogen, kedua adalah kelompok penekan terjadinya tumor yaitu tumor suppressor gene dan apoptosis. Faktor eksternal utama yang menyebabkan serviks uteri adalah infeksi Human Papilloma Virus (HPV), terutama tipe 16 dan 18. Human Papilloma Virus akan merusak gen-gen yang mengatur siklus sel dan apoptosis salah satunya caspase 3. Human Papilloma Virus tidak hanya menghambat gen yang mengatur siklus sel contohnya p53 namun juga menghambat aktivasi dari gen caspase 3. Pada penelitian ini telah dilakukan pemberian ekstrak etanol daun sirsak untuk melihat pengaruhnya terhadap siklus sel dan pertambahan jumlah sel, parameter yang diukurnya adalah ekspresi gen caspase 3 pada kultur sel HeLa dan sebagai kontrol positifnya adalah housekeeping gene, yaitu gen Beta aktin, gen ini merupakan gen yang selalu ada di dalam sel normal maupun tidak normal. Pada penelitian ini didapatkan hasil bahwa ekstrak etanol daun sirsak tidak dapat meningkatkan ekspresi gen caspase 3. Hal ini dapat dilihat dari hasil uji statistik menggunakan Kruskall Wallist test pada derajat kepercayaan 95% menunjukkan bahwa tidak terdapat pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sirsak 58 terhadap ekspresi caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa secara bermakna dengan nilai p=1,000 (nilai p>0,05). Hasil ini tidak sesuai dengan penelitian sebelumnya. Pada penelitian sebelumnya, diketahui bahwa terdapat peningkatan caspase 3 pada human hepatoma yang diberi annonaceous acetogenins dengan mekanisme menurunkan kadar intraseluler cGMP yang akan menginduksi apoptosis.10 Pada sel kanker bladder T24 annonacin meningkatkan aktivitas caspase 3.30 Hal ini mungkin dikarenakan bahwa pada penelitian ini mengambil daun sirsak secara utuh sehingga kadar acetogenin pada ekstrak ini lebih sedikit dibandingkan dengan isolasi zat acetogenin pada penelitian sebelumnya. Pada gambar 4.1 terlihat bahwa terdapat penurunan kepadatan sel HeLa seiring dengan peningkatan dosis ekstrak etanol daun sirsak, hal ini menunjukan bahwa telah terjadinya kematian sel dan penurunan proliferasi sel pada perlakuan baik 60, 120, dan 240 µg/mL. Kematian sel (Apoptosis) yang terjadi mungkin tidak melalui jalur caspase 3 melainkan melalui jalur caspase 6 atau 7 yang juga merupakan caspase eksekusi.39 Pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Pei-Ming Yang dan kawan-kawan menunjukan bahwa ekspresi gen caspase 7 pada breast cancer MCF-7 cell meningkat dan dapat menginduksi terjadinya apoptosis setelah diberikan flavonoid.40 Pada penelitian tersebut juga dikatakan bahwa pemecahan PARP tidak harus melalui aktivasi dari caspase 3 namun dapat juga lewat caspase 7 dan akan terjadi fragmentasi DNA. Pada penelitian ini juga diuji hubungan antara peningkatan dosis ekstrak etanol daun sirsak dengan peningkatan ekspresi gen caspase 3 pada kultur sel HeLa. 59 Hasil uji statistik menggunakan Spearman Correlation Test pada derajat kepercayaan 95% menunjukkan bahwa tidak terdapat hubungan antara peningkatan konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak dengan ekspresi caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa secara bermakna dengan nilai p=1,000 (nilai p>0,05). Hasil ini tidak sesuai dengan penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa semakin tinggi dosis annonaceous acetogenin maka akan semakin menurunkan kadar intraseluler cGMP yang akan meningkatkan ekspresi caspase 3.10,30 4.3. Keterbatasan Penelitian Penelitian ini tidak lepas dari keterbatasan, baik itu keterbatasan teknik, kemampuan peneliti, dan keterbatasan alat. Diantara keterbatasan tersebut antara lain adalah : 1. Kandungan Zat Aktif Ekstrak Etanol Daun Sirsak Pada penelitian ini peneliti tidak melihat kandungan zat aktif yang ada pada ekstrak etanol daun sirsak. Peneliti hanya menggunakan hasil penelitian sebelumnya. 2. Isolasi RNA Pada penelitian ini peneliti tidak mengukur konsentrasi RNA total karena keterbatasan reagen dan alat. 3. Optimasi suhu RT-PCR Pada penelitian ini tidak dapat mengulang RT-PCR dengan menggunakan suhu optimasi yang berbeda karena keterbatasan waktu, sehingga peneliti hanya 60 menggunakan optimasi suhu RT-PCR untuk gen caspase 3 berdasarkan penelitian sebelumnya. 4. Alat foto khusus elektroforesis Pada penelitian ini tidak dilakukan foto khusus dengan menggunakan alat foto khusus untuk elektroforesis dikarenakan keterbatasan alat, sehingga peneliti hanya mengambil gambar elektroforesis menggunakan kamera digital. 4.4. Pengujian Hipotesis Hipotesis I Hipotesis Penelitian : Ekstrak etanol daun sirsak dapat meningkatkan ekspresi gen caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa. Hasil yang tidak menunjang : Hasil uji statistik menggunakan Kruskall Wallist test pada derajat kepercayaan 95% menunjukkan bahwa tidak terdapat pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sirsak terhadap ekspresi caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa secara bermakna dengan nilai p=1,000 (nilai p>0,05). Kesimpulan : Hipotesis ditolak. Hipotesis 2 Hipotesis Penelitian : Konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak yang dapat meningkatkan ekpresi gen caspase 3 paling maksimal adalah 240 µg/mL. 61 Hasil yang tidak menunjang : Hasil uji statistik menggunakan Kruskall Wallist test pada derajat kepercayaan 95% menunjukkan bahwa tidak terdapat pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sirsak terhadap ekspresi caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa secara bermakna dengan nilai p=1,000 (nilai p>0,05). Kesimpulan : Hipotesis ditolak Hipotesis 3 Hipotesis Penelitian : Semakin tinggi konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak maka ekspresi gen caspase 3 akan semakin meningkat. Hasil yang tidak menunjang : Hasil uji statistik menggunakan Spearman Correlation Test pada derajat kepercayaan 95% menunjukkan bahwa tidak terdapat hubungan antara peningkatan konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak dengan ekspresi caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa secara bermakna dengan nilai p=1,000 (nilai p>0,05). Kesimpulan : Hipotesis ditolak. BAB V SIMPULAN DAN SARAN 5.1. Simpulan Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan untuk menentukan ada tidaknya efek ekstrak etanol daun sirsak terhadap peningkatan ekspresi gen caspase 3, dapat disimpulkan: 1) Pemberian ekstrak etanol daun sirsak tidak dapat meningkatkan ekspresi gen caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa. 2) Tidak terdapat konsentrasi yang dapat meningkatkan ekspresi gen caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa. 3) Tidak terdapat hubungan antara peningkatan konsentrasi ekstrak etanol daun sirsak dengan ekspresi caspase 3 pada kultur sel kanker serviks uteri HeLa. 5.2. Saran 1) Perlu dilakukan penelitian efek ekstrak etanol daun sirsak terhadap kenaikan ekspresi gen caspase 3 dengan variasi masa inkubasi yang lebih beragam. 2) Perlu dilakukan isolasi zat-zat aktif agar dapat mengetahui zat mana yang memiliki efek yang lebih untuk terjadinya apoptosis lewat peningkatan gen caspase 3. 3) Perlu dilakukan penelitian dengan melihat efek ekstrak etanol daun sirsak terhadap ekspresi gen caspase eksekusi lainnya. 62 63 4) Perlu dilakukan penelitian dengan melihat efek ekstrak etanol daun sirsak terhadap ekspresi gen caspase 3 dengan dasar penelitian in vivo. DAFTAR PUSTAKA 1. Jemal A, Bray F, Melissa M, Ferlay J, Ward E, Forman D. Globar Cancer Statistic, Vol 61, maret-april 2011 2. Aditama TY. Program Penyehatan Penyakit dan Penyehatan Lingkungan. DEPKES 2005-2008. Tahun 2008. 3. Prayitno A, Darmawan R, Yuliadi I, Mudigo A. Ekspresi Protein p53, Rb, dan C-myc pada Kanker Serviks Uteri dengan Pengecatan Histokimia. Biodiversitas. Volume 6 nomer 3. Juli 2005 4. Rasjidi I. Epidemiologi Kanker Serviks. Indonesian Journal of Cancer. Vol 3. Juli-September 2009 5. Ocampo EA, Suarez AL P,Hernandez OM, Barron LC, Sastre MAR, Alvarez AC. HPV + Cervical Carcinoma and Cell Lines Display Altered Expression of Caspases.ELSEIVIER. Gynecologic Oncology 108. 2007 6. Kobayashi T, Masumoto J, Tada T, Nomiyama T, Hongo K, Nakayama J. Prognostic Significance of Immunohistochemical Staining of Cleaved Caspase 3, an Activated form of Caspasse 3 in Glioma. American Association for Cancer Research. 2007 7. Kasibhatla S, Tseng B. Why Target Apoptosis in Cancer Treatment. American Association for Cancer Research. 2003 8. Taylor L. Technical Data Report for Graviola Annona Muricata. Herbal secret of the Rainforest. Edisi ke 2. Tahun 2002 9. Raintree Nutrition. Monograph Graviola Annona Muricata. Carson city. 2004 10. Hui FC, Tsai TC, Yun MH, Chih HT, Ming JW, Yang CW. Bullatacin, Apotent Antitumor Annonaceous Acetogenin, Induces Apoptosis through a Reduction of Intracellular cAMP and cGMP Levels in Human Hepatoma 2.2.15 cells. ELSEIVIER. 2003 64 65 11. Alfrits Komansilan, Abdul L. Abadi, Bagyo Yanuwiadi, and David A. Kaligis. Isolation and identification of biolarvicide from soursop (Annona muricata Linn). International Journal of Engineering & Technology IJETIJENS. Vol: 12 No: 03. 2012 12. McLaughlin JL, Benson GB, Fosythe JW. A Novel Mechanism for the Control of Clinical Cancer : Inhibition of the Production of Adenosine Triphosphate (ATP) with a Standardized Extract of Paw-paw (Asimincz triloba, Annonaceae). Cancer Screening and Treatment Center of Nevada. 1996. 13. Lucey BP, Nelson WA. Hutchins GM. Henrietta Lacks, HeLa Cells, and Cell Culture Contamination. Arch Pathol Lab Med. Vol 133. 2009 14. Blecher E, Graves KC, Desantis C, Edward B, Ferlay J, Forman D, et al. Global Cancer Fact and Figures. American Cancer Society. Edisi 2.Atalanta .2008 15. Blecher E, Graves KC, Desantis C, Edward B, Ferlay J, Forman D, et al. Cervical cancer. American Cancer Society . 2012. Diambil dari: www.cancer.gov. 16. Steben M, Franco ED. Human Papillomavirus Infection: Epidemiology and Pathophysiology. Elsevier. Juli 2007 17. Fauci, braunwald, Kasper, Hauser, Longo, Jameson, et all. Harrison’s principles of Internal Medicine. Edisi 17. Hal 557 18. Jo H, Kim JW. Implication of HPV Infection in Uterine Cervical Cancer. Cancer Therapy. Vol 3. 2005 19. Gomez DT, Santos JL. Human Papillomavirus Infection and Cervical Cancer: Pathogenesis and Epidemiology. Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology A. Mendez-Vilas. 2007 20. Shahib MN. Biologi Molekuler Medik I. 1st ed. 2005:420;471. 66 21. Vinay kumar. Abul K ANF. Pathologic Basis of Disease. 7th ed. Philadelphia, Pennsylvania 19106: ELSEVIER; 2005. 22. Sarmoko, Larasati. Regulasi Siklus Sel. Cancer Chemoprevention Research Center. Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. 2009 23. Yau P. Apoptosis. The Science Creative Quarterly. Agustus 2004 24. Meergans T, Hildebrandt AK, Horak D, Haenisch C, Wendel A. The Short Prodomain Influences Caspase 3 Activation in HeLa Cells. Biochem.J. 2000 25. Ting JF, Li HH, Ri SC, Jin L. Caspase Family Proteases and Apoptosis. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2005 26. Meiyanto E. Sirsak (annona muricata L.). Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC). Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. 27. Raintree Tropical Plant Database. Graviola. www.graviola.org. 2005 28. Kojima N, Tanaka T. Medicinal Chemistry of Annonaceous Acetogenins: Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel Analogues. Molecules. 2009. Diambil dari: www.mdpi.com/journal/molecules. 29. Alali FQ, Xiao XL, Mclaughin JL. Annonaceous acetogenins. American Chemical Society and American Society of Pharmacognosy. 1999 30. Shyng SFY, Hsueh LC, Hsiao WC, Yao TY, Ying HK, Kuei HL, et all. Annonacin, a Mono-Tetrahydrofuran Acetogenin, Arrests Cancer Cell at the G1 Phase and Causes Cytotoxxicity in a Bax-and Caspase 3 Related pathway. ELSEVIER. 2003 31. Silanikove N, Perevolotsky A, Provenza FD. Use of tannin-binding chemicals to assay for tannins and their negative postingestive effects in ruminants. Animal Feed Science and Technology. 2001;91:69-81 32. Tanimura S, Kadomoto R, Tanaka T, et al. Suppression of tumor cell invasiveness by hydrolyzable tannins (plant polyphenols) via the inhibition of matrix metalloproteinase-2/-9 activity. Electrophoresis. 2005;330:1306-1313. 67 33. Tang N-ping, Zhou B, Wang B, Yu R-bin, Ma J. Flavonoids Intake and Risk of Lung Cancer : A Meta-analysis. Japanese Journal of Clinical Oncology. 2009;39(6):352-359. 34. Heim KE, Tagliaferro AR, Bobilya DJ. Flavonoid antioxidants : chemistry , metabolism and structure-activity relationships. Biochemistry. 2002;13:572584. 35. Bachran C, Sutherland M, Heisler I, et al. Experimental Biology and Medicine. Experimental Biology and Medicine. 2008. 36. Rao AV, Sung M. Nonisoflavone Soybean Anticarcinogens Saponins as Anticarcinogens1. the journal of nutrition. 1995:717-724 37. Yih HS. A New Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction Method for Accurate Quantification. BMC Biotechnology. 2003 diambil dari: www.biomedcentral.com/1472-6750/3/22. 38. Donoghue S, Baden HS, Lauder I, Sobolewski S, Pringle JH. Immunohistochemical Localization of Caspase-3 Correlates with Clinical Outcome in B-Cell Diffuse Large-Cell Lymphoma Immunohistochemical Localization of Caspase-3 Correlates with Clinical Outcome. American Association for Cancer Research. 1999;59:5386-5391. 39. Boatright MK, Salvesea GS. Mechanism of caspase activation. Current opinion in cell biologi. ELSEVIER. 2003:15: 725-731. 40. Yang PM, Tseng HT, Peng CW, Chen WS, Chiu SJ. Dietary flavonoid fisetin targets caspase-3-deficient human breast cancer MCF-7 cells by induction of caspase-7-associated apoptosis and inhibition of autophagy. International Journal Of Oncology. 2012:40:469-478. LAMPIRAN Lampiran 1 PERLAKUAN SEL 24 JAM KONTROL DOSIS 60 DOSIS 120 DOSIS 240 SEL DI MICROPLATE 68 69 Lampiran 2 ELEKTROFORESIS Lampiran 3 HASIL FOTO SETELAH DI INVERT 70 Lampiran 4 HASIL GRAFIK SAAT DILAKUKAN SCION IMAGE Lampiran 5 REKAPITULASI DATA HASIL PENELITIAN No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Kelompok Kultur sel HeLa yang tidak diberi ekstrak daun sirsak (kontrol) Kultur sel HeLa yang tidak diberi ekstrak daun sirsak (kontrol) Kultur sel HeLa yang tidak diberi ekstrak daun sirsak (kontrol) Kultur sel HeLa yang diberi ekstrak daun sirsak dengan dosis 1/2 IC50 (60) Kultur sel HeLa yang diberi ekstrak daun sirsak dengan dosis 1/2 IC50 (60) Kultur sel HeLa yang diberi ekstrak daun sirsak dengan dosis 1/2 IC50 (60) Kultur sel HeLa yang diberi ekstrak daun sirsak dengan dosis IC50 (120) Kultur sel HeLa yang diberi ekstrak daun sirsak dengan dosis IC50 (120) Kultur sel HeLa yang diberi ekstrak daun sirsak dengan dosis IC50 (120) Kultur sel HeLa yang diberi ekstrak daun sirsak dengan dosis 2 IC50 (240) Kultur sel HeLa yang diberi ekstrak daun sirsak dengan dosis 2 IC50 (240) Kultur sel HeLa yang diberi ekstrak daun sirsak dengan dosis 2 IC50 (240) Dosis Kaspase 0 .0400 0 .0400 0 .0400 60 .0400 60 .0400 60 .0400 120 .0400 120 .0400 120 .0400 240 .0400 240 .0400 240 .0400 71 Lampiran 6 HASIL ANALISIS STATISTIK Uji Normalitas data Warnings Kaspase is constant. It will be included in any boxplots produced but other output will be omitted. Case Processing Summary Cases Valid N Kaspase Missing Percent 12 100.0% N Total Percent 0 N .0% Percent 12 100.0% Descriptivesa a. Kaspase is constant. It has been omitted. Tests of Normalitya . Kaspase is constant. It has been omitted. Non Parametrik Test Descriptive Statistics N Mean Std. Deviation Minimum Maximum Kaspase 12 .0400 .00000 .04 .04 Kelompok 12 2.50 1.168 1 4 Kruskal-Wallis Test 72 Ranks Kelompok Kaspase N Mean Rank Kontrol 3 6.50 Ekstrak sirsak dosis 60 3 6.50 Ekstrak sirsak dosis 120 3 6.50 Ekstrak sirsak dosis 240 3 6.50 Total 12 Test Statisticsa,b Kaspase Chi-Square .000 df 3 Asymp. Sig. 1.000 a. Kruskal Wallis Test b. Grouping Variable: Kelompok Frequencies Kaspase Cumulative Frequency Valid .04 Percent 12 Valid Percent 100.0 Percent 100.0 100.0 Nonparametric Correlations Correlations Dosis Spearman's rho Dosis Correlation Coefficient 1.000 . . . 12 12 Correlation Coefficient . . Sig. (2-tailed) . . 12 12 Sig. (2-tailed) N Kaspase Kaspase N 73 Lampiran 7 Alat-alat Penelitian ALAT EVAPORATOR ALAT PCR ALAT ELEKTROFORESIS WEEL MICROPLATE DAFTAR RIWAYAT HIDUP Curriculum Vitae Data Pribadi / Personal Details Nama / Name : Agli Adhitya Anugrah Putra Alamat / Address : jln srikandi IV no. 54 RT 01/018 Depok II tengah Kode Post / Postal Code : 16411 Nomor Telepon / Phone : 085720863477 Email : [email protected] / [email protected] Jenis Kelamin / Gender : Pria Tanggal Kelahiran / Date of Birth : 26 agustus 1990 Status Marital / Marital Status : Belum menikah Warga Negara / Nationality : Indonesia Agama / Religion : Islam Riwayat Pendidikan Pendidikan Formal : Periode Sekolah / Institusi / Universitas Jurusan Jenjang 2000 - 2001 SD negeri mekarjaya 28 - SD 2003 - 2004 SLTP negeri 4 Depok - SLTP 2006 - 2007 SMU Negeri 2 Depok IPA SMA 2008 - 2012 Univeritas Islam Bandung Fakultas Kedoktera n Sarjana Pendidikan Non Formal : 1. Bahasa Inggris LIA 2. Bahasa Inggris BBC Riwayat Pengalaman Organisasi 1. Tahun Organisasi Posisi : 2002-2003 :DWI SERA BUANA (Pencinta alam) : Anggota 2.Tahun Organisasi Posisi : 2010-2011 : KSR PMI Unit UNISBA : HUMAS 3.Tahun Organisasi Posisi : 2010-2011 : FULDFK : HUMAS 4.Tahun Organisasi Posisi : 2010-2011 : JAMTIBI : Anggota TIMBANGAN ( Tim bendahara dan keuangan) 5.Tahun Organisasi Posisi : 2010-2011 : BEM FK UNISBA : Anggota EKUIN (ekonomi dan investasi) 6.Tahun Organisasi Posisi : 2011-2012 : KSR PMI Unit UNISBA : Komandan
