1 STUDI FILOGENETIK ELANG LAUT PERUT

STUDI FILOGENETIK ELANG LAUT PERUT PUTIH (Haliaeetus leucogaster)
YANG HIDUP DI PULAU JAWA BERDASARKAN GEN Cytochrome-b (Cyt-b)
Riri Wiyanti Retnaningtyas, Nuning Wulandari, Dwi Listyorini
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Malang
Email: [email protected]
ABSTRAK
Elang Laut Perut Putih merupakan satu-satunya anggota genus Haliaeetus yang dapat ditemukan
di Indonesia. Spesies ini hidup di daerah pesisir, hutan pantai dan lepas pantai dan berperan sebagai predator
di ekosistem pesisir. Populasi spesies ini, terutama di pesisir selatan Jawa, semakin menurun akibat
perburuan liar, perdagangan satwa illegal, deforestasi, dan aktivitas manusia lainnya. Jangkauan distribusi
Elang Laut Perut Putih yang sangat luas, dan dengan adanya fragmentasi habitat, memungkinkan terjadinya
perubahan pada keanekaragaman genetik dalam satu spesies. Oleh sebab itu, dalam penelitian ini dilakukan
studi filogenetik terhadap tiga individu Elang Laut Perut Putih yang hidup di Pulau Jawa berdasarkan gen
Cytochrome-b (Cyt-b). Penelitian ini dilakukan dengan cara mengekstraksi DNA total dari darah Elang
Laut Perut Putih menggunakan High Pure PCR Preparation Kit dari Roche dengan protokol yang
dimodifikasi. Amplifikasi gen Cyt-b dengan cara PCR menggunakan sepasang primer hasil desain yaitu
HL Cyt-b F1 5’– TAG GAA TCT GCC TGC TGA CA-3’ dan HL Cyt-b R1 5’–TTA GTG GTT GAG AAG
TTT GT- 3’. Hasil PCR kemudian dielektroforesis dengan mengguanakan gel agarose 0,8%. Hasil analisis
filogenetik berdasarkan gen Cyt-b, dapat disimpulkan bahwa Elang Laut perut putih yang diteliti merupakan
spesies Haliaeetus leucogaster yang berkerabat dekat dan membentuk species complex dengan Haliaeetus
sanfordi.
Kata Kunci: Haliaeetus leucogaster, DNA Barcoding, Cytochrome-b, studi filogenetik
PHYLOGENETIC STUDY OF WHITE-BELLIED SEA EAGLE (Haliaeetus
leucogaster) LIVING IN JAVA BASED ON Cytochrome-b (Cyt-b) GENE
Riri Wiyanti Retnaningtyas, Nuning Wulandari, Dwi Listyorini
Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Negeri Malang
Email: [email protected]
ABSTRACT
The only species of genus Haliaeetus that can be found in Indonesia is White-bellied Sea Eeagle.
As the top order predator in the coastal ecosystem, White-bellied Sea Eagle is sensitive to any threats caused
by human activities. In the southern coast of Java, the population of this species is decreasing due to illegal
huntings, deforestations, illegal wildlife trades. Regarding its vast distribution in all coastal areas of South
East Asia and Australia, the habitat fragmentation caused by deforestation can lead to changes in this
species’ genetic diversity. Thus, in this research, a phylogenetic study based on Cytochrome-b (Cyt-b) gene
was conducted in order to obtain the Cyt-b gene sequence of three individuals of White-bellied Sea Eagle
and to reconstruct a phylogenetic tree that describes their position Haliaeetus genus. This research was
conducted by performing the DNA isolation using High Pure PCR Template Preparation Kit from Roche
with a modified protocol. PCR was perfomed using a pair of designed primers HL Cyt-b F1 5’– TAG GAA
TCT GCC TGC TGA CA-3’ and HL Cyt-b R1 5’–TTA GTG GTT GAG AAG TTT GT- 3’. The PCR
amplicons were then visualized with electrophoresis using 0.8% of agarose gel. The phylogenetic analysis
1
based on Cyt-b gene indicates that White-bellied Sea Eagles in this research belong to the species
Haliaeetus leucogaster and are very closely related to Haliaeetus sanfordi.
Keywords: Haliaeetus leucogaster, DNA Barcoding, Cytochrome-b, phylogenetic study
PENDAHULUAN
Kelompok burung elang laut (genus Haliaeetus) merupakan kelompok
monofiletik burung pemangsa yang tersebar di seluruh belahan dunia. Genus ini
beranggotakan 8 spesies, 4 di antaranya tersebar di belahan bumi utara yaitu Haliaeetus
albicilla, Haliaeetus leucocephlus, Haliaeetus pelagicus, Haliaeetus leucoryphus; 4
spesies sisanya, yaitu Haliaeetus vocifer, Haliaeetus vociferoides, Haliaeetus
leucogaster, dan Haliaeetus sanfordi tersebar di belahan bumi selatan (Wink et al., 1996;
Lerner & Mindell, 2005). Di Asia Selatan dan Australia, terdapat satu spesies Haliaeetus
yang tersebar mulai dari pesisir barat India, China, seluruh wilayah pesisir Asia Tenggara
termasuk seluruh kepuauan Indonesia, Filipina, Papua Nugini, dan Australia yaitu
Haliaeetus leucogaster (Shephard et al., 2005).
Satu-satunya spesies Haliaeetus yang ada di Indonesia adalah Haliaeetus
leucogaster (Elang Laut Perut Putih) (McKinnon et al., 2010). Elang Laut Perut Putih
atau Haliaeetus leucogaster (Gmelin, 1788) merupakan raptor teritorial berukuran besar
yang hidup di daerah pesisir, danau dan sungai perennial (Shephard et al., 2005). Elang
Laut Perut Putih dewasa memiliki panjang tubuh sekitar 70 – 80 cm, bentang sayap
sepanjang 1,8 – 2 meter dan lebar sayap ± 50 cm. Tubuh Elang Laut Perut Putih dewasa
tertutup oleh bulu berwara putih dan abu-abu, iris mata berwarna cokelat gelap dengan
pupil berwarna hitam dan memiliki tonjolan pada bagian atas mata. Kulit bagian tarsus
hingga cakar tertutup oleh sisik berwarna kekuningan (Retnaningtyas et al., 2013).
Perbedaan ciri morfologi antara Elang Laut Perut Putih dengan spesies lain yang
tergolong genus Haliaeetus ditunjukkan oleh Gambar 1.
Gambar 1. Perbedaan ciri morfologi Elang Laut Perut Putih (Haliaeetus lecogaster) (A)
dengan Elang Ekor Putih (Haliaeetus albicilla) (B), Elang Botak (Haliaeetus
leucocephalus) (C) dan Elang Laut Steller (Haliaeetus pelagicus) (D).
Sumber: www.arkive.com
2
Spesies ini memiliki jangkauan distribusi global yang sangat luas, yaitu meliputi
Australia, Bangladesh, Brunei Darussalam, Cambodia; China, Hong Kong, India,
Indonesia, Laos, Malaysia, Myanmar, Papua Nugini, Filipina, Singapura, Sri Lanka,
Thailand, Timor-Leste, dan Vietnam (Shephard et al., 2005) (Gambar 2). Berdasarkan
jangkauan distribusi, maka spesies in dikatakan tidak mendekati ambang batas kategori
Rentan (Vulnerable) (BirdLife International, 2015).
Gambar 2 Peta Distribusi global Elang Laut Perut Putih (Haliaeetus leucogaster).
Sumber: IUCN Red List, 2012.
Habitat Elang Laut Perut Putih adalah hutan pantai dengan daya jelajah
diperkirakan mencapai 13,9 km dan biasanya bersarang di pohon-pohon tinggi seperti
Cemara Laut (Casuarina longistifolia) atau Kepuh (Gunawan, 2007), pada tumpukan
batuan di tepi laut, tebing curam dan pulau-pulau lepas pantai (Shephard, et al., 2005).
Mangsa dari Elang Laut Perut Putih utamanya adalah ikan laut, namun juga dapat
memangsa mamalia kecil dan ikan air tawar (Debus, 2008). Di dalam ekosistem pesisir
di Indonesia, Elang Laut Perut Putih merupakan salah satu pemangsa puncak dan dapat
berperan sebagai indikator kestabilan ekosistem perairan serta untuk mengetahui
seberapa besar pengaruh keberadaan manusia terhadap ekosistem tersebut (Romin &
Muck, 1999). Elang Laut Perut Putih, selain memiliki peran ekologis, juga memiliki peran
dalam kebudayaan seperti yang ada di Sumba Timur, Nusa Tenggara Timur dan Papua
Nugini. Di Sumba timur, Elang Laut Perut Putih dianggap sebagai dewa (Forth, 2000),
sedangkan di beberapa daerah di Australia dan Papua Nugini, burung ini merupakan salah
satu hewan yang dikeramatkan karena dianggap sebagai hewan totemik atau dianggap
sebagai penjelmaan roh nenek moyang (Baldwin, 2010).
Populasi spesies ini, terutama di pesisir selatan Jawa, semakin menurun akibat
perburuan liar, perdagangan satwa illegal, deforestasi, dan aktivitas manusia lainnya yang
menyebabkan burung ini meninggalkan sarang beserta anakan atau telur yang ada di
dalamnya (Debus, 2008; Dennis et al., 2011). Banyak spesies elang termasuk Elang Laut
Perut Putih sangat sensitive terhadap gangguan terutama selama musim kawin. Gangguan
yang ditimbulkan oleh aktivitas manusia dapat menyebabkan pasangan Elang Laut Perut
Putih meninggalkan sarangnya dan menelantarkan telur atau juvenilnya. Hal ini
menyebabkan turunnya produktivitas sehingga berdampak pada penurunan populasi
Elang Laut Perut Putih ( Dennis et al., 2011).
Elang Laut Perut Putih adalah jenis burung pemangsa yang membutuhkan wilayah
teritori yang aman dari kompetisi dengan burung pemangsa dan predator lain, predasi,
maupun gangguan manusia (Gunawan, 2007). Status konservasi Elang Laut Perut Putih
(Haliaeetus leucogaster) ditentukan oleh beberapa parameter, yaitu jangkauan distribusi
3
global, ukuran dan tren populasi (IUCN Red List, 2015). Berdasarkan data IUCN Red
List, spesies ini dikategorikan sebagai least concerned (LC) karena populasi globalnya
belum mendekati batas ambang kategori vulnerable (Rentan), namun tren populasi global
dari Elang Laut Perut Putih cenderung menurun (BirdLife International, 2015). Elang
Laut Perut Putih juga menghadapi ancaman kepunahan seperti halnya spesies lain dalam
famili Accipitridae. Selain itu, jangkauan distribusi Elang Laut Perut Putih yang sangat
luas, dan dengan adanya fragmentasi habitat, memungkinkan terjadinya perubahan pada
keanekaragaman genetik dalam satu spesies (Wiley & Lieberman, 2011). Analisis
filogenetik yang mendalam perlu dilakukan untuk menggambarkan secara rinci mengenai
keanekaragaman genetik spesies ini dan hubungan kekerabatannya dengan spesies
Haliaeetus yang lain sebagai salah satu upaya konservasi yang bertujuan untuk
melestarikan keanekaragaman genetik dari suatu unit taksonomi (Lerner & Mindell,
2005).
Analisis filogenetik dapat dilakukan dengan menggunakan DNA barcoding. DNA
Barcoding adalah teknik identifikasi organisme dengan menggunakan sekuen pendek dari
DNA mitokondria dan dapat digunakan untuk mengidentifikasi organisme hingga tingkat
spesies dengan cepat dan akurat (Hebert & Gregory, 2005). Data sekuen DNA barcode
dapat dijadikan sebagai landasan dalam menyusun pohon filogenetik (Gregory, 2008).
DNA barcode dapat merekonstruksi filogeni dengan cara menyeleksi sekuen gen anggota
taksa, untuk mengidentifikasi hingga tingkat spesies baik pada spesies yang sudah
diidentifikasi maupun spesies yang baru ditemukan. Data sekuen DNA barcode dapat
dijadikan sebagai landasan dalam menyusun pohon filogenetik Dalam kaitannya dengan
genetika populasi, DNA barcode dapat digunakan sebagai langkah awal dalam
menganalisis keanekaragaman genomic dalam satu spesies (Hajibabaei et al., 2007).
Sejauh ini sudah diketahui bahwa Elang Laut Perut Putih membentuk cabang
monofiletik dan berkerabat dekat dengan Elang Laut Steller (Haliaeetus pelagicus)
dengan jarak genetik 0,104 berdasarkan gen Cytochrome-c Oxydase Subunit I (COI)
(Retnaningtyas et al., 2014). Namun demikian, data ini perlu diperkuat dengan parameter
dari gen lain untuk menyusun pohon filogenetik yang lebih komprehensif. Untuk
memastikan bahwa Elang Laut Perut Putih yang hidup di Jawa Timur tergolong dalam
spesies yang sama dengan Elang Laut Perut Putih yang hidup di belahan dunia lain, perlu
dilakukan kajian hubungan kekerabatan berdasarkan gen Cytochrome-b (Cyt-b). Gen
Cytochrome-b (~1,143 bp) merupakan gen penanda yang paling banyak digunakan untuk
mengungkap hubungan kekerabatan di antara taxa yang berkerabat dekat. Untuk burung,
sekuen gen Cytochrome b (Cyt-b) efektif untuk merekonstruksi peristiwa filogenetik yang
terjadi dalam kurun waktu 20 juta tahun terakhir (Wink, 1995), karena sekuen gen Cyt-b
berubah secara lambat selama proses evolusi dan memiliki area dengan variabilitas yang
rendah, sehingga berguna untuk menentukan hubungan filogenetik antarspesies (Esposti
et al., 1993). Gen Cyt-b memiliki area yang bersifat conserved dan area lain yang
menunjukkan adanya variabilitas yang tinggi, dan oleh sebab itu gen ini sangat efektif
untuk menentukan jarak filogenetik antar spesies (Esposti, et al., 1993).
Dari data sekuen gen Cyt-b dapat direkonstruksi pohon filogenetik untuk
menggambarkan hubungan antar organisme dengan nenek moyang terdekatnya (Gregory,
2008). Dengan membandingkan sekuen gen Cyt-b Elang Laut Perut Putih dengan sekuen
gen Cyt-b anggota genus Haliaeetus yang lain dapat diketahui posisi Elang laut Perut
Putih pada pohon filogenetik. Kajian filogenetik menggunakan gen tersebut juga dapat
menambah informasi mengenai hubungan kekerabatan yang lebih mendalam dan evolusi
dari Elang Laut Perut Putih sebagai salah satu upaya konservasi genetik (Lerner &
4
Mindell, 2005; Shephard et al., 2005). Adapun tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mengetahui sekuen gen Cyt-b Elang Laut Perut Putih (Haliaeetus leucogaster) yang
hidup di Jawa Timur dan menyusun topologi pohon filogenetik untuk mengetahui
hubungan kekerabatan Elang Laut Perut Putih (Haliaeetus leucogaster) Jawa Timur
dengan anggota genus Haliaeetus yang lain berdasarkan sekuen gen Cyt-b.
METODE PENELITIAN
Objek penelitian ini adalah 3 individu Elang Laut Perut Putih (Haliaeetus leucogaster)
yang hidup di Pulau Jawa, khususnya di 3 daerah di Jawa Timur, yaitu Tulungagung,
Trenggalek, dan Kediri. Untuk memudahkan penelitian, setiap individu diberi kode
sampel RR01 untuk individu pertama, RR02 untuk individu kedua, dan RR03 untuk
individu ketiga. Sampel darahsebagai material DNA diambil dari vena pectoralis sub
clavia yang terdapat di sayap bagian dalam dengan menggunakan syringe 3 ml. Jumlah
darah yang diambil sebanyak 1 ml dan meneteskan setiap satu tetes darah yang setara
dengan 0,025 gram kedalam microtube yang berisi 1000 μl alkohol absolut. Isolasi DNA
murni dari darah dilakukan dengan menggunakan High Pure PCR Template Preparation
Kit dari Roche dengan protokol yang dimodifikasi (Hermadhiyanti, et al.,2014).
Amplifikasi gen Cyt-b dengan teknik PCR dilakukan dengan primer hasil desain HL Cytb F1 5’– TAG GAA TCT GCC TGC TGA CA-3’ dan HL Cyt-b R1 5’–TTA GTG GTT
GAG AAG TTT GT- 3’. Kondisi PCR yang digunakan dalam penelitian ini adalah initial
denaturaion pada suhu 94°C selama 2,5 menit, kemudian dilanjutkan dengan 32 kali
siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 93°C selama 30 detik, annealing pada suhu
57°C selama 45 detik, dan extension pada suhu 70°C selama 1 menit 30 detik. Selanjutnya
adalah final extension pada suhu 70°C selama 5 menit (Lerner & Mindell, 2005). Hasil
PCR diperiksa melalui elektroforesis dengan gel agarose 0,8% pada voltase 100 volt 200
A selama 78 menit. Sekuensing dilakukan di First Base Laboratories Malaysia. Analisis
filogenetik dilakukan dengan menggunakan software MEGA 6 dengan metode Maximum
Likelihood, Neighbour Joining, Minimum Evolution dan Maximum Parsimony.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA Elang Laut Perut Putih (Haliaeetus leucogaster) kode sampel RR01,
RR02, dan RR03 dilakukan hingga diperoleh konsentrasi DNA yang cukup dan murni
untuk selanjutnya dilanjutkan ke tahap amplifikasi gen dengan teknik Polymerase Chain
Reaction (PCR). Pengukuran konsentrasi DNA yang dilakukan menggunakan NanoDrop
ND-2000 Spectrophotometer menunjukkan konsentrasi DNA yang diperoleh untuk
sampel DNA kode RR01 adalah 252,2 ng/µl; RR02 sebesar 551,3 ng/µl; dan RR03
sebesar 460,6 ng/µl. Ketiga sampel DNA tersebut tidak terkontaminasi RNA maupun
protein. Amplifikasi gen Cyt-b menggunakan primer forward HL Cyt-b F1 5’– TAG GAA
TCT GCC TGC TGA CA-3’ dan primer reverse HL Cyt-b R1 5’–TTA GTG GTT GAG
AAG TTT GT- 3’ menghasilkan fragmen sepanjang ±900 bp. Data hasil sekuensing
berupa chromatogram sekuen forward dan reverse masing-masing sampel dibaca
menggunakan software Finch TV dan kemudian digabungan dengan menggunakan DNA
Baser, menghasilkan sekuen konsensus sekuen forward dan reverse yang diperoleh dari
masing-masing sampel adalah RR01 954 bp, RR02 977 bp dan RR03 948 bp. Masing-
5
masing hasil sekuen konsensus kemudian dicocokkan dengan sekuen gen Cyt-b Elang
Laut Perut Putih Haliaeetus leucogaster AY987321.1 dari GeneBank. Hasil analisis
dengan BLAST menunjukkan bahwa RR01 memiliki kesamaan 99% dengan sekuen query
dengan query coverage sebesar 92%; RR02 memiliki kesamaan 99% dengan query
coverage sebesar 94%; dan RR03 memiliki kesamaan 99% dengan query coverage
sebesar 91%.
Multiple alignment dilakukan menggunakan software ClustalX2 dengan sekuensekuen pembanding dari elang laut yang termasuk genus Haliaeetus, yaitu Haliaeetus
leucocephalus, Haliaeetus leucogaster, Haliaeetus pelagicus, Haliaeetus sanfordi,
Haliaeetus albicilla, Haliaeetus vocifer, Haliaeetus vociferoides, Haliaeetus leucoryphus
dan outgrup Cathartes aura dari familia Cathartidae. Hasil multiple alignment
menunjukkan bahwa sampel RR01, RR02, dan RR03 memiliki domain-domain sama
(conserved) dan domain-domain yang berbeda (variable) dengan spesies lain dalam satu
genus.
Pada penelitian sebelumnya berdasarkan gen COI, Elang Laut Perut Putih yang
diteliti termasuk dalam spesies Haliaeetus leucogaster dan berada pada clade yang
terpisah dari kelompok elang laut dari belahan bumi utara seperti Elang Laut Steller
(Haliaeetus pelagicus), Elang Botak (Haliaeetus leucocephalus) dan Elang Ekor Putih
(Haliaeetus albicilla) (Retnaningtyas, et al., 2015). Hasil yang sama juga ditunjukkan
oleh hasil analisis filogenetik berdasarkan gen Cyt-b.
Hasil rekonstruksi pohon filogenetik menggunakan metode Maximum Likelihood
(ML) menunjukkan bahwa spesies Haliaeetus leucogaster dan Haliaeetus sanfordi
berada pada clade yang sama dengan nilai bootstrap 100. Sampel RR01 membentuk 1
clade dengan RR02 dan Haliaeetus leucogaster Z73468.1 dengan nilai bootstrap 65.
Haliaeetus leucogaster RR03 berada pada clade yang sama dengan Haliaeetus
leucogaster AY987321.1 dengan nilai bootstrap 60. Hal ini menunjukkan bahwa sampel
RR01, RR02 dan RR03 masih tergolong satu spesies dengan Haliaeetus leucogaster
AY987321.1 dan Haliaeetus leucogaster Z73468.1 dari GeneBank (Gambanr 3).
Gambar 3. Hasil rekonstruksi pohon filogenetik menggunakan metode Maximum
likelihood (ML).
6
Selain ML, dilakukan pula rekosntruksi pohon filogenetik menggunakan metode
Neighbour Joining (NJ) dan Minimum Evolution (ME). Pada pohon filogenetik
Neighbour Joining (NJ), spesies Haliaeetus leucogaster dan Haliaeetus sanfordi berada
pada satu clade yang sama dengan nilai bootstrap 100. Haliaeetus leucogaster RR01
membentuk 1 clade dengan Haliaeetus leucogaster RR02 dan Haliaeetus leucogaster
Z73468.1 dengan nilai bootstrap 65. Haliaeetus leucogaster RR03 dan Haliaeetus
leucogaster AY987321. 1 membentuk cabang dengan nilai bootstrap 49. Sampel RR01,
RR02, RR03, H. leucogaster Z73468.1 dan AY987321.1 merupakan bagian dari cabang
cryptic dengan nilai bootsrap 54. Hal ini juga menunjukkan bahwa sampel RR01, RR02
dan RR03 masih tergolong satu spesies dengan Haliaeetus leucogaster AY987321.1 dan
Haliaeetus leucogaster Z73468.1 dari GeneBank (Gambar 4). Hasil rekonstruksi pohon
filogenetik menggunakan metode NJ berbeda dengan hasil rekonstruksi menggunakan
metode ML. Perbedaannya terletak pada niai bootstrap dan jumlah cabang di dalam clade
Haliaeetus leucogaster dan Haliaeetus sanfordi. Pada topologi pohon ML, Haliaeetus
sanfordi tidak membentuk cabang yang lebih kecil, sedangkan pada topologi pohon NJ,
terlihat bahwa Haliaeetus sanfordi membentuk suatu cabang lebih kecil dengan nilai
bootstrap 54. Hal ini disebabkan rekonstruksi menggunakan metode Minimum Evolution
(ME) dan Neighbour Joining (NJ) yang didasarkan pada penghitungan jarak genetik (Nei
& Saitou, 1987; Peer, 2009), sedangkan metode ML didasarkan pada perhitungan
substitusi dan delesi basa nitrogen tiap sekuen DNA yang dianalisis (Felenstein, 1981).
Gambar 4. Hasil rekonstruksi pohon filogenetik menggunakan metode Neighbour Joining.
Rekonstruksi pohon filogenetik menggunakan metode Minimum Evolution (ME)
menghasilkan topologi yang tidak jauh berbeda dengan Neighbour Joining dan Maximum
Likelihood. Pada pohon Mimimum Evolution, sampel RR01, RR02, RR03, Haliaeetus
leucogaster AY987321.1 dan Haliaeetus leucogaster Z73468.1 berada pada clade yang
sama dengan nilai bootstrap 55. Hal ini berarti, sampel RR01, RR02 dan RR03 termasuk
7
spesies yang sama dengan Haliaeetus leucogaster AY987321.1 dan Haliaeetus
leucogaster Z73468.1 (Gambar 5).
Gambar 5. Hasil rekonstruksi pohon filogenetik menggunakan metode Minimum
Evolution (ME).
Analisis filogenetik menggunakan metode ML, NJ, dan ME, menunjukkan bahwa
dalam clade Haliaeetus leucogaster, terdapat cabang-cabang lebih kecil dengan sampel
RR01, RR02 berada pada satu clade dengan Haliaeetus leucogaster Z73468.1 dan sampel
RR03 menempati clade yang sama dengan spesies acuan Haliaeetus leucogaster
AY987321.1 dan Z73468.1 dari GeneBank dengan nilai bootstrap yang berbeda pada
masing-masing pohon. Cabang lebih kecil dalam clade spesies seperti yang terlihat pada
ketiga topologi pohon filogenetik ML, NJ dan ME ini menunjukkan bahwa ketiga
individu Elang Laut Perut Putih yang diteliti masih tergolong satu spesies dengan spesies
acuan dari GeneBank meskipun terdapat variasi dalam sekuen gen Cyt-b-nya. Topologi
pohon filogenetik menggunakan metode ML perlu diperjelas dengan pohon Maximum
Parsimony (MP) untuk memastikan posisi sampel RR01, RR02 dan RR03 dalam
kelompok taksa Haliaeetus leucogaster.
Pada pohon MP terlihat bahwa sampel RR02 secara karakter genetik lebih dekat
kekerabatannya dengan Haliaeetus leucogaster Z73468.1 . Sampel RR01 memisah
membentuk cabang tersendiri dari RR02 dan H. leucogaster Z73468.1 namun masih
tergolong mirip secara karakter genetik dengan kedua sekuen tersebut. Sampel RR03
diketahui memiliki kemiripann terbesar dengan Haliaeetus leucogaster AY987321.1 dan
memisah dari Haliaeetus leucogaster RR01, RR02 dan Z73468.1 karena terdapat
perbedaan karakter genetik pada sekuen DNA-nya. Namun, perbedaan keempat sekuen
DNA tersebut sangat kecil sehingga masih tergolong dalam satu spesies (Gambar 6).
Pohon filogenetik menggunakan metode MP menunjukkan hasil yang berbeda
dibandingkan dengan rekonstruksi pohon ML, NJ dan ME. Hal ini disebabkan Maximum
8
Likelihood dan Maximum Parsimony merupakan metode rekonstruksi pohon filogenetk
yang didasarkan pada karakter genetik sekuen DNA yang meliputi karakter automorfi,
plesiomorfi, dan synapomorfi (Peer, 2009), sedangkan Neighbour Joining dan Minimum
Evolution didasarkan pada jarak genetik (Tamura & Nei, 1987). Ide dasar MP adalah
hasil rekonstruksi filogenetik yang paling mendekati kebenaran adalah yang menjelaskan
data karakter dengan perubahan paling sedikit. Metode Maximum Parsimony digunakan
untuk mendeteksi posisi paling mungkin suatu taksa pada pohon filogenetik (Peer, 2009).
Gambar 6. Hasil rekonstruksi pohon filogenetik genus Haliaeetus menggunakan metode
Maximum Parsimony (MP).
Pernyataan bahwa sampel RR01, RR02 dan RR03 tergolong spesies yang sama
dengan spesies acuan didukung oleh hasil analisis jarak genetik pairwise distance antara
sampel RR01, RR02 dan RR03 dengan species acuan Haliaeetus leucogaster
AY987321.1 dan Z73468.1. Analisis jarak genetik pairwise distance menunjukkan
bahwa RR01 merupakan spesies yang sama dengan RR02 karena jarak genetiknya adalah
0,000. Sampel RR02 berkerabat lebih dekat dengan Haliaeetus leucogaster Z73468.1
dengan jarak genetik 0,001 dibandingkan dengan RR03 yang jarak genetiknya adalah
0,002. Sampel RR03 berkerabat lebih dekat dengan Haliaeetus leucogaster AY987321.1
dengan jarak genetik 0,001 dibandingkan dengan RR01 dan RR02 yang berjarak genetik
0,002 (Gambar 7).
Gambar 7. Analisis jarak genetik pairiwise distance antara sampel RR01, RR02 dan RR03
dengan spesies acuan Haliaeetus leucogaster AY987321.1 dan Haliaeetus
leucogaster Z73468.1 dari GeneBank.
9
Meskipun ketiga sampel memiliki jarak genetik yang bervariasi dengan spesies
acuan, ketiganya masih tergolong satu spesies karena jarak genetiknya kurang dari 0,03.
Hal ini didukung oleh hasil analisis jarak genetik intraspesifik yang menunjukkan bahwa
kelima sekuen gen Cyt-b Haliaeeetus leucogaster termasuk sampel RR01, RR02 dan
RR03 memiliki jarak genetik intraspesifik 0,001 (Gambar 8). Hal ini berarti dalam
kelompok spesies Haliaeetus yang dianalisis terdapat variasi genetik sebesar 0,1% dan
masih tergolong dalam spesies yang sama.
Gambar 8. Analisis jarak genetik intraspesifik dalam satu kelompok spesies Haliaeetus
leucogaster menunjukkan jarak genetik sebesar 0,001.
Hasil rekonstruksi pohon filogenetik menggunakan metode ML, NJ dan ME
memiliki kesamaan lain, yaitu ketiga pohon tersebut menghasilkan topologi yang mirip.
Ketiganya menunjukkan bahwa kelompok Haliaeetus leucogaster dan Haliaeetus
sanfordi berkerabat sangat dekat karena kedua kelompok ini menempati clade yang sama
dan membentuk spescies complex, yaitu suatu kelompok spesies yang berkerabat dekat
yang sangat mirip secara morfologi sehingga sering dianggap sebagai spesies yang sama
(Bickford, et al., 2007), dengan Haliaeetus sanfordi. Jarak genetik interspesifik
menunjukkan bahwa dalam satu genus, spesies Haliaeetus leucogaster berkerabat paling
dekat dengan Haliaeetus sanfordi dengan jarak genetik 0,02. Jarak genetik 0,02
menunjukkan bahwa Haliaeetus leucogaster dan Haliaeetus sanfordi masih tergolong
satu spesies menurut analisis yang dilakukan. Jarak genetik interspesifik terbesar dari
spesies Haliaeetus leucogaster dibandingkan dengan spesies lain dalam satu genus adalah
dengan Haliaeetus albicilla, yaitu 0,101 (Gambar 9).
10
Gambar 9. Analisis jarak genetik interspesifik dalam genus Haliaeetus menunjukkan
bahwa Haliaeetus leucogaster berkerabat paling dekat dengan Haliaeetus
sanfordi dan paling jauh dengan Haliaeetus albicilla.
Berdasarkan rekonstruksi topologi pohon filogenetik menggunakan metode NJ
dan ME, diketahui bahwa terdapat kesamaan pada kedua topologi pohon filogenetik yang
didapatkan yaitu genus Haliaeetus membentuk suatu cabang monofiletik yang memisah
menjadi dua bagian. Kelompok yang pertama terdiri dari spesies Haliaeetus leucogaster
termasuk sampel RR01, RR02 dan RR03, Haliaeetus sanfordi, Haliaeetus vociferoides
dan Haliaeetus vocifer. Kelompok kedua terdiri dari Haliaeetus pelagicus, Haliaeetus
leucoryphus, Haliaeetus albicilla dan Haliaeetus leucocephalus. Kedua kelompok
tersebut terpisah oleh faktor distribusi geografis. Kelompok pertama merupakan
kelompok spesies yang tersebar di belahan bumi selatan yang memiliki iklim tropis
hingga sedang, sedangkan kelompok kedua (H. albicilla, H. leucocephalus, H.
leucoryphus dan H. pelagicus) merupakan kelompok yang tersebar di belahan bumi utara
(Lerner & Mindell, 2005).
Topologi pohon filogenetik NJ dan ME juga menunjukkan bahwa Haliaeetus
leucogaster membentuk species complex dengan Haliaeetus sanfordi. Species complex
merupakan suatu kelompok spesies yang berkerabat dekat yang sangat mirip secara
morfologi sehingga sering dianggap sebagai spesies yang sama (Bickford, et al., 2007),
Hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya cabang-cabang kecil dalam satu clade spesies
yang sama. Fenomena species complex ini didukung oleh data jarak genetik intraspesies
yang menunjukkan bahwa spesies Haliaeetus leucogaster dalam penelitian ini memiliki
variasi genetik sebesar 1%. Perbedaan dalam satu spesies ini disebabkan adanya
perbedaan asal-usul masing-masing sekuen Elang laut perut putih. Luasnya jangkauan
distribusi Elang laut perut putih memungkinkan terjadinya variasi genetik dalam satu
populasi.
Selain itu, diketahui pula bahwa spesies Haliaeetus leucogaster dan Haliaeetus
sanfordi berada pada clade yang sama walaupun Haliaeetus sanfordi menempati suatu
cabang ‘tersembunyi’ atau cryptic dalam clade Haliaeetus leucogaster. Hal ini berarti
kedua spesies tersebut memiliki perbedaan secara genetik yang ditunjukkan oleh
memisahnya kelompok spesies Haliaeetus leucogaster dari kelompok Haliaeetus
sanfordi dengan nilai bootsrap 100 pada topologi pohon MP. Perbedaan interspesifik
yang dimiliki oleh kedua spesies tersebut sangat kecil, yaitu 0,2% yang artinya Haliaeetus
sanfordi secara genetik masih tergolong satu spesies dengan Haliaeetus leucogaster.
Perbedaan 2% diasumsikan dengan divergensi 3-4 juta tahun yang lalu sehingga dapat
diperkirakan Haliaeetus sanfordi memisah dari kelompok spesies Haliaeetus leucogaster
pada kurang lebih 120.000 tahun yang lalu (Wink et al., 1996).
11
Secara morfologi, Haliaeetus leucogaster dan Haliaeetus sanfordi hampir sama,
yang membedakan adalah warna kepala Elang Laut Perut Putih berwarna putih cerah
sedangkan warna putih pada kepala Elang Laut Sanfordi lebih gelap dan warna ekor Elang
Laut perut putih lebih gelap dibandingkan dengan warna ekor Elang Laut Sanfordi (Wink
et al., 1996; Lerner & Mindell, 2005). Kedua spesies ini memiliki perbedaan dalam
perilaku dan daya jelajah walaupun mereka hidup pada jenis ekosistem yang sama
sehingga dikelompokkan sebagai spesies yang berbeda namun berkerabat dekat (Wink et
al., 1996).
KESIMPULAN
Dari penjelasan yang telah disebutkan, dapat disimpulkan bahwa sekuen gen
Cytochrome-b (Cyt-b) Elang Laut Perut Putih (Haliaeetus leucogaster) yang hidup di
Jawa Timur yang didapatkan pada penelitian ini memiliki panjang ± 980 bp dengan
kesamaan dengan sekuen query (Haliaeetus leucogaster AY987321.1) yang ada di
GeneBank sebesar 99% dan berdasarkan gen Cyt-b, Elang Laut Perut Putih sampel RR01,
RR02 dan RR03 dari Jawa Timur adalah spesies Haliaeetus leucogaster berkerabat
sangat dekat dan membentuk species complex dengan Elang Laut Sanfordi (Haliaeetus
sanfordi) berdasarkan data sekuen gen Cyt-b.
DAFTAR RUJUKAN
Baldwin, A. 2010. The White-bellied Sea Eagle in the Jervis Bay region: an exploration
of the cultural, ecological and conservation significance. Tesis. School of Earth
& Environmental Sciences, University of Wollongong.
Bickford, D., D. J. Lohman, N. S. Sodhi, P. K. L. Ng, R. Meier, K. Winker, K. K. Ingram,
& I. Das. 2007. Cryptic Species as A Window on Diversity and Conservation.
Trends in Ecology and Evolution 22 (3) : 148-155.
BirdLife International. 2015. Species factsheet: Haliaeetus leucogaster. The IUCN Red
List of Threatened Species. (Online) http://www.birdlife.org diakses tanggal 17
Maret 2015.
Brazil, M. 2009. Birds of East Asia: eastern China, Taiwan, Korea, Japan, eastern
Russia. Christopher Helm, London.
Debus, S.J.S. 2008. Biology and Diet of the White-bellied Sea-Eagle Haliaeetus
leucogaster Breeding in Northern Inland New South Wales. Australian Field
Ornithology 2008 (25): 165–193.
Dennis, T. E., McIntosh, R. R. & Shaughnessy, P. D. 2011. Effects of human disturbance
on productivity of White-bellied Sea-Eagles (Haliaeetus leucogaster). Emu
(111):179–185
12
Esposti, M. D., De Vries, S., Crimi, M., Ghelli, A., Patarnello, T., Meyer, A. 1993.
Review Mitochondrial cytochrome b: evolution and structure of the protein.
Biochimica et Biophysica Acta, 1143: 243-271
Felsenstein, J. 1981. Evolutionary trees from DNA sequences: A maximum likelihood
approach. J. Mol. Evol., 17:368–376.
Ferguson-Lees, J.; Christie, D. A. 2001. Raptors of the world. Christopher Helm, London.
Forth, G. 2000. Eastern Sumbanese Bird Classification. Journal of Ethnobiology 20 (2):
161-192
Gegory, T. R. 2008. Understanding Evolutionary Trees. Evo Edu Outreach (1): 121–137.
Gunawan & Purwanto, A. A.. 2007. Distribution And Home Range Of White Bellied Sea
Eagle (Haliaeetus leucogaster J.M.Gmelin, 1788) at The National Marine Park
Of Kepulauan Seribu, Jakarta, Indonesia. Prosiding.
Hajibabaei, M., Singer, G. A. C., Hebert, P. D. N. Hickey, D. A. 2007. DNA Barcoding:
How It Complements Taxonomy, Molecular Phylogenetics And Population
Genetics. Trends In Genetics Vol.23 (4) : 167-172.
Hebert, P.D. N. & Gregory, T. R. 2005. The Promise of DNA Barcoding for Taxonomy.
Systematic Biology 54 (5) :852–859
Hermadhiyanti, W. 2014. Studi Filogenetik Elang Jawa (Nisaetus bartelsi) diantara Elang
Genus Nisaetus Berdasarkan Cytochrome-C Oxidase Subunit-1 (COI) DNA
Barcode. Skripsi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Universitas Negeri Malang.
Lerner, H. R.L. & Mindell, D. P. 2005. Phylogeny of eagles, Old World vultures, and
other Accipitridae based on nuclear and mitochondrial DNA. Molecular
Phylogenetics and Evolution 37 : 327–346
Mirabella, M. F. 2011. Pendekatan Pohon dalam Filogenetik. Bandung: Institut
Teknologi Bandung
Nei, M., & N. Saitou. 1987. The Neighbor-joining Method: A New Method for
Reconstructing Phylogenetic Trees. Molecular Biology and Evolution 4(4):406425.
Olsen, P. 2015. Australian Predators of the Sky. Canberra: National Library of Australia
Panday, R., Jha, D.K., Thapa, N., Pokharel, B. R. & Aryal, N. K. 2014. Forensic Wildlife
Parts and their Product Identification and Individualization Using DNA
Barcoding. The Open Forensic Science Journal 7: 6-13
Patwardhan A., Ray S., Roy A. 2014. Molecular Markers in Phylogenetic Studies – A
Review. Journal of Phylogenetics and Evolutionary Biology 2: 131.
doi:10.4172/2329-9002.1000131
13
Retnaningtyas, R.W., Hermadhiyanti, W., Listyorini, D. 2015. Phylogenetic Study of the
White-bellied Sea Eagle (Haliaeetus leucogaster) Based on DNA Barcode
Cytochrome-c Oxydase Subunit I (COI). Proceeding of the 9th Asian Raptor
Research and Conservation Network (ARRCN) Symposium, Thailand.
Retnaningtyas, R. W., W. Hermadhiyanti, D. A. Rahayu, D.Listyorini. 2015. The
Identification of The White-bellied Sea Eagle (Haliaeetus leucogaster) Based on
Morphological Characteristics. KnE Proceeding of International Conference on
Biological Sciences (ICBS) UGM 2013.
Romin, L. A. & Muck, J. A. (1999). Guidelines For Raptor Protection From Human And
Land Use Disturbances. US Fish and Wildlife Service, Salt Lake City, UT.
Saitou, N., & M. Nei. 1986. The Number Of Nucleotides Required To Determine The
Branching Order Of Three Species With Special Reference To The HumanChimpanzee-Gorilla Divergence. J. Molucar Evol. 24: 189-204.
Seibold, I., Helbig, A.J., 1996. Phylogenetic relationships of the sea eagles (genus
Haliaeetus): reconstructions based on morphology, allozymes and mitochondrial
DNA sequences. Journal of Zoological Systematics Evolutionary Research 34:
103–112.
Shephard, Jill M., Catterall, C. P., Hughes, J. M. 2005. Long-Term Variation in The
Distribution of The White-Bellied Sea-Eagle (Haliaeetus leucogaster) Across
Australia. Austral Ecology (30): 131–145
Sorenson, M.D., Ast, J.C., Dimcheff, D.E., Yuri, T., Mindell, D.P., 1999. Primers for a
PCR-based approach to mitochondrial genome sequencing in birds and other
vertebrates. Molecular Phylogenetic and Evolution 12 (2): 105–114.
The IUCN Red List of Threatened Species: Haliaeetus leucogaster. 2012.
http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.20121.RLTS.T22695097A40326383.en.
(Online) Diakses tanggal 23 Januari 2016
Van de Peer, Y., P. Lemey, M. Salemi, & A. M. Vandamme (Eds.). 2009. The
Phylogenetic Handbook: A Practical Approach To Phylogenetic Analysis And
Hypothesis Testing. London: Cambridge University Press.
Wiley, E. O. & Bruce S. Lieberman. 2011. Phylogenetics: Theory and Practice of
Phylogenetic Systematics 2nd Edition. New Jersey: John Wiley and Sons, Inc.
Wink, M. 1995. Phylogeny of Old and New World Vultures (Aves: Accipitridae and
Cathartdae) Inferred from Nucleotide Sequences of Mitochondrial Cytochromeb Gene. Zeitschirft fur Naturforschung 50c : 868-882.
Wink, M., P. Heidrich, & C. Fentzloff. 1996. A mtDNA Phylogeny of Sea Eagles (genus
Haliaeetus) Based on Nucleotide Sequences of Cytochrome-b Gene. Biochemical
Systematics and Ecology 24 (7/8): 783-791.
14
Zein, M. S. A., & Prawiradilaga, D. M. 2013. DNA Barcode Fauna Indonesia. Jakarta:
Kencana Prenadamedia Group.
15