Analisis Keterlibatan Protein Heterotrimerik G Subunit a terhadap

PENDAHULUAN
Latar belakang.
Protein G merupakan salah satu
komponen yang berperan dalam transduksi
sinyal pada makhluk hidup. GTP-binding
regulatory protein atau protein G termasuk
dalam famili protein pengikat guanosin
trifosfat (GTP). Protein G sendiri terbagi
menjadi 2 jenis yaitu protein heterotrimerik G,
yang terletak di membran plasma, dan protein
G kecil (small G protein ) yang terletak di
sitoplasma. Beragam jenis transduksi sinyal
pada mamalia telah diketahui melibatkan
protein G khususnya protein heterotrimerik G
(Ma 1994).
Protein heterotrimerik G terbagi menjadi
3 subunit, yaitu subunit α, β dan γ. Protein ini
aktif ketika mengikat dan menghidrolisis GTP
yang diikatnya. Saat aktif protein ini akan
meneruskan sinyal yang diterima reseptor
ekstraseluler kepada efektor intraseluler pada
sisi membran sel bagian dalam. Setelah GTP
yang terikat dihidrolisis menjadi GDP, protein
ini kembali ke konformasi semula dan
menjadi tidak aktif (Krauss 2001). Protein
heterotrimerik G, khususnya subunit α, telah
diketahui terlibat dalam transduksi sinyal
cekaman biotik, hormon dan lain sebagainya
(Assman 2002)
Kedelai (Glycine max) merupakan salah
satu produk pertanian dengan tingkat
permintaan yang tinggi di dunia. Kandungan
gizi yang tinggi, karena mengandung
beberapa asam amino esensial, serta beragam
kegunaan lain selain untuk dikonsumsi
mengakibatkan melonjaknya permintaan akan
kedelai. Beragam usaha telah dilakukan untuk
meningkatkan produksi kedelai dunia, mulai
dari cara intensifikasi dengan menggunakan
teknik pertanian yang lebih baik, sampai
dengan ekstensifikasi lahan oleh negaranegara pengeskpor kedelai terbesar dunia
seperti Brazil dan Amerika (USDA 2007).
Produksi kedelai Indonesia belum mampu
memenuhi kebutuhan dalam negeri sehingga
masih perlu mendatangkan dari luar. Produksi
kedelai Indonesia pada tahun 2006 baru
mencapai 783 554 ton per tahun (BPS 2006),
sedangkan kebutuhan dalam negeri mencapai
kurang lebih 2 juta ton, sehingga pada tahun
2006 Indonesia mengimpor kedelai sebesar
kurang lebih 1 370 000 metrik ton (USDA
2007).
Oleh karena itu perlu diupayakan
peningkatan produksi kedelai di Indonesia
untuk menutupi kekurangan tersebut. Hal ini
dapat dilakukan baik melalui intensifikasi
yaitu penggunaan kultivar unggul dan
perbaikan teknik budidaya maupun ekstensifikasi atau perluasan lahan pertanaman.
Di seluruh dunia, tanah dengan pH cukup
rendah banyak dijumpai di daerah tropis.
Kondisi tanah masam ini dijumpai pada
kurang lebih 40% lahan yang dapat ditanami
di seluruh dunia (Gardner 1998). Indonesia
sebagai negara agraris memiliki 18,2 juta
hektar lahan dengan tingkat pH rendah
(Mashuda 2006) yang potensial untuk
dikembangkan sebagai lahan pertanian,
khususnya untuk kedelai.
Tantangan yang menghadang untuk
ekstensifikasi adalah kondisi pH tanah yang
rendah, yang akan meningkatkan kelarutan
ion-ion logam di tanah. Tingginya kandungan
ion-ion logam tertentu dalam tanah dapat
bersifat toksik bagi tanaman. Salah satu ion
tersebut adalah Aluminium (Al) dalam bentuk
ion Al3+. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa pada tanah dengan kondisi
masam, ion Al3+ yang terakumulasi merupakan faktor penyebab utama yang membatasi
tingkat keberhasilan panen (Kochian 1995),
karena ion Al3+ menghambat pertumbuhan
akar, yang akan berakibat terhadap pertumbuhan tanaman (Gardner 1998).
Salah satu solusi terhadap permasalahan
tersebut adalah penggunaan kultivar unggul
yang tahan terhadap Al3+ tinggi. Usaha untuk
menghasilkan kultivar unggul tersebut dapat
dicapai dengan teknik pemuliaan konvensional ataupun melalui perakitan genetik
tanaman. Namun usaha untuk merakit tanaman yang memiliki sifat ketahanan terhadap
Al3+ sebelumnya harus didahului oleh studi
mengenai mekanisme pertahanan serta gengen yang terlibat dalam ketahanan terhadap
Al3+. Oleh karena itu, usaha untuk memahami
mekanisme yang terlibat dalam peristiwa
toksisitas Al pada tanaman, khususnya pada
kedelai merupakan langkah penting.
Cote dan Crain (1993) menunjukkan
adanya penghambatan dari Al3+ terhadap
pemecahan fosfoinositol menjadi IP3,
sehingga mempengaruhi regulasi kanal Ca2+
dan mengakibatkan perubahan kandungan
Ca2+ intraseluler, yang berpengaruh terhadap
fungsi seluler sel tumbuhan. Legendre et al.
(1993) menegaskan bahwa aktivitas protein
heterotrimerik Gα meningkatkan kandungan
IP3 intraseluler, dan mendorong peningkatan
produksi H2O2 pada kultur sel kedelai. Hal ini
menunjukkan bahwa IP3 berperan dalam
regulasi produksi H2O2 (Legendre et al.
1993b), dan secara tidak langsung regulasi
produksi H2O2 dipengaruhi oleh protein
2
heterotrimerik G. Jika transduksi sinyal
cekaman Al3+ pada tumbuhan melibatkan
protein heterotrimerik G, maka produksi H2O2
pada sel tumbuhan dapat dijadikan indikator
untuk melihat keterlibatan protein heterotrimerik G dalam cekaman aluminium.
Tujuan penelitian.
Tujuan penelitian ini adalah untuk
menganalisis keterlibatan protein heterotrimerik G subunit α pada mekanisme toleransi dari kultivar kedelai toleran asam
(Slamet) terhadap cekaman Al3+ melalui
identifikasi produksi H2O2.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan
April 2005 sampai dengan Desember 2006,
bertempat di Laboratorium Biologi Seluler
dan Molekuler Tanaman dan Laboratorium
Biorin (Biotechnology Research IndonesiaThe Netherland), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB,
Jalan Kamper, Kampus IPB Darmaga.
BAHAN DAN METODE
Sterilisasi Eksplan
Biji kedelai Slamet dipilih yang berkulit
mulus dan tidak cacat. Biji dicuci dengan air
dan Tween-80 (0.5%) (v/v) dengan agitasi
kuat, dan dibilas dengan air dua kali. Biji
kemudian disterilisasi dengan alkohol 70%
(v/v) selama 30 detik, setelah itu dibilas
dengan akuades steril. Biji disterilisasi ulang
dengan larutan Natrium Hipoklorit komersial
20% (v/v) (NaClO 5,25%) yang diberi Tween80 (0.5%) (v/v), selama 15 menit dengan
agitasi kuat, dilanjutkan pembilasan dengan
akuades steril sebanyak tiga kali.
Induksi Kalus
Biji yang telah steril ditanam pada botol
kultur berisi larutan mineral MS dan vitamin
B5 (Liu et al. 1997) (Lampiran 1) dengan
tambahan ZPT (Zat Pengatur Tumbuh) 2,4-D
(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) dan Kinetin
(6-Furfurylaminopurin) serta agar 8 g/L. ZPT
diberikan dengan kombinasi sebagai berikut
(Da Silva et al. 2003):
1. Medium MS 0 (Kontrol)
2. Medium MS+ 1 ppm 2,4-D
3. Medium MS+ 1 ppm 2,4-D+ 0.1 ppm
Kinetin
4. Medium MS+ 0.1 ppm Kinetin.
Di dalam tiap botol kultur ditanam 5 biji,
ditumbuhkan pada suhu 24°C dengan
pencahayaan kontinyu dan intensitas cahaya ±
1 000 lux. Eksplan diamati pertumbuhannya
selama 3 minggu hingga terbentuk kalus.
Perlakuan diulang sebanyak sepuluh kali.
Inisiasi dan Pemeliharaan Kultur Suspensi
Sel Kedelai
Kultur berisi kalus dalam media pemeliharaan MS organik minimal dengan 2 g/L
Bacto Tryptone (Becton, Dickinson & Co.)
serta 3 ppm 2,4-D dan 0.1 ppm kinetin (pH
5.8) (Legendre et al. 1992) (Lampiran 1),
kemudian diinkubasi pada inkubator bergoyang resiprokal (bolak-balik) Certomat WR
dengan kecepatan 70 rpm selama 3-4 minggu
secara kontinyu, dalam keadaan gelap. Setelah
3-4 minggu sebanyak 20 sampai 30 mL
suspensi sel dipindahkan ke dalam media cair
baru dengan komposisi yang sama dan
diinkubasi pada inkubator goyangan berputar
Bench Top Shaker 4622 pada kecepatan 70
rpm secara kontinyu dengan intensitas cahaya
15 lux.
Kultur suspensi sel dipelihara selama
penelitian, dengan subkultur ke media dengan
komposisi yang sama setiap 7 hari sekali.
Konsentrasi sel diukur setiap 2 hari sekali
dengan metode PCV (Packed Cell Volume)
yaitu dengan cara sebanyak 10 mL suspensi
sel diendapkan dengan sentrifugasi Jouan
BR4i (Jouan) pada kecepatan 200xg selama 5
menit pada suhu 15 ºC. Persentase PCV
dihitung dengan rumus :
PCV =
mL sel yang terendapkan
× 100%
mL volume total sampel
Kultur suspensi sel yang telah mencapai
konsentrasi sel 10% PCV digunakan untuk
penelitian dengan perlakuan cekaman pH dan
Al3+.
Perlakuan Cekaman Berbagai Nilai pH dan
Al3+
Kultur suspensi sel yang telah mencapai
densitas 10% PCV, sebanyak 10 mL suspensi
dipindahkan ke dalam botol kultur baru.
Kemudian medium diganti dengan medium
baru dengan komposisi yang sama dengan
media pemeliharaan (pH 5.8) sejumlah 10
mL. Kultur suspensi sel kedelai yang berumur
tiga hari setelah pemindahan itu digunakan
untuk percobaan. Kultur sel disaring dengan
Cell Dissociation–Tissue Grinder Kit (SigmaAldrich) berukuran 200 mesh. Sebanyak 0.2 g
sel dipindahkan ke dalam cawan petri
berdiameter 6 cm, diberi 2 mL medium segar