Bioesai Anti Tumor/Kanker

2014/11/28
Bioesai Anti
Tumor/Kanker
KIMIA BIOESAI 2014
CANCER
Penyakit degeneratif dengan
pertumbuhan seluler yang tidak
dapat dikontrol/diatur dan
menyebar dalam tubuh
TUMOR
Keadaan pertumbuhan seluler
yang abnormal shg membentuk
kelainan benjolan pada tubuh
Membutuhkan pengobatan jangka Cukup dengan pengangkatan
panjang, spt pembedahan, radiasi, tumor.
kemoterapi
Kondisi yang serious
Biasanya tidak berbahaya.
1
2014/11/28
LYMPHOMA
Kanker yang berawal
dari kelenjar getah
bening
Tipe
Kanker
LEUKEMIA
kelainan yang dimuai
dari sumsum tulang
ADENOMA
Kelainan yang terjadi
dari tiroid, pituitary.
2
2014/11/28
PenyebabTUMOR
Bahan kimia: Benzena
Minum alkohol
Toksin lingkungan (aflatoxins)
Sinar matahari berlebihan
Genetik
Obesitas
Radiasi
Virus
:
3
2014/11/28
Gangguan kontrol pertumbuhan
Kegagalan dalam melakukan bunuh diri sel. Apoptosis atau
bunuh diri sel suatu proses normal untuk menghancurkan
sel tua atau sel rusak.
4
2014/11/28
Keseimbangan
Pada pembentukan kanker kulit, keseimbangan antara
pembelahan sel dan hilangnya sel mengalami perubahan. Sel
Basal membelah lebih cepat dibandingkan kematian sel yang
lepas pada permukaan
Invasi dan metastasis neoplasma
Pertumbuhan sel yang meningkat menghasilkan suatu massa disebut
tumor atau neoplasma. Kalau tiada ada proses bunuh diri maka tumor
terus tumbuh,
Kanker bisa tumbuh ke seluruh tubuh, melalui: invasi dan metastasis.
Invasi dan penetrasi langsung dari migrasi sel kanker ke jaringan sekitar;
melalui pembuluh limfe dan darah, ke jaringan lainnya
5
2014/11/28
Hiperplasia dan Displasia
6
2014/11/28
G2
S PHASE
SPECIFIC
Cytosine
Arbinoside
Hydroxyurea
DNA
S PHASE
SPECIFIC
Synthesis
SELF LIMITING
6-Mercaptpurine
Methotrexate.
M
M
PHASE
PROPHASE
METAPHASE
SPECIFIC
ANAPHASE
vincristine
TELOPHASE
vinblastine
Premitotic
Interval
S
paclitaxel
MITOSIS
PHASE NONSPECIFIC
• Tumor Suppressor
alkylating agents, cis-platinum
Genes -ve (p53)
1
nitrosoureas,
• Growth
Factors dacarbazine
antibiotics+ve R
Oncogenes
G
G0 G
Differentiation
procarbazine
PENTOSTATIN
Purine
synthesis
0
Pyrimidine
synthesis
Inhibits adenosine
Deaminase
PALA
Inhibits Pyrimidine
Biosynthesis
Ribonucleotides
6-MERCAPTOPURINE
HYDROXYUREA
6-THIOGAUNINE
Inhibit Purine ring
biosynthesis
Inhibit Neocleotide
Inhibit
Ribonucleotide
Reductase
Deoxyribonucleotides
interconversions
METHOTREXATE
Inhibit dihydrofolate
reduction, blocks
TMP and Purine
synthesis
5-FLOUROURACIL
Inhibit TMP
Synthesis
DNA
7
2014/11/28
CYTARABINE
FLUDARABINE
2-CHLORODEOXY
BLEOMYCIN
ETOPOSIDE
TENIPOSIDE
DNA
Damage DNA and
Prevent repair
DACTINOMYCINE
DAUNORUBICIN
DOXORUBICIN
MITOXANTRONE
Intercalate with DNA
Inhibit RNA synthesis
ADENOSINE
Inhibit DNA
Synthesis
ALKYLATING AGENTS
MITOMYCETIN
CISPLATIN
PROCARBAZINE
DACARBAZINE
RNA
(Transfer, messenger, ribosomal)
PACLITAXEL
VINCA ALKALOIDS
COLCHICINE
A-ASPARAGINASE
Deaminate
asparagine
Inhibits protein
synthesis
PROTEINS
Enzymes
Form adducts w/ DNA
Microtubules
Inhibit function of
Microtubules
Sel hidup dan sel mati
• Esai penanda DNA
• Esai morfologis
• Esai reproduktif
• Esai Integritas
membran
•Esai Fungsi
8
2014/11/28
Kriteria utama untuk esai viabilitas
Category of
viability assay
Membrane
integrity assay
Functional assay
DNA labeling assay
Assays
Principles
-Exclusion dyes
-Fluorescent dyes
-LDH leakage
-Annexin v assay
The determination of membrane
integrity via dye exclusion from live cells
-MTT, XTT assay
-Crystal violet/ Acid
phosphatase(AP) assay
-Alamar Blue oxidationreduction assay
- Neutral red assay
-[3H]-thymidin/ BrdU
incorporation
Examining metabolic components that
-Fluorescent conjugates
Morphological
mechanism based
assay
-Microscopic observation
-Caspase 3 detection
-PARP cleavage assay
Reproductive assay
-Colony formation assay
are necessary for cell growth
cell selection and viability assay
Determination of morphological change
Determination of growth rate
Esai Integritas Membran
9
2014/11/28
Prinsip
Trypan Blue dye Exclusion Methods
Pewarna Ekslusi
 Memberi gambaran yang membedakan sel hidup dan sel mati
termasuk tidak adanya fungsi transpor zat melalui membran
plasma karena hilangnya intergritas membran.
 Sel harus dihitung dalam rentang waktu 3-5 min karena
berpengaruh pada bertambahnya jumlah warna yang terserap
sejalan dengan waktu.
- Sel hidup (Viable cells) : kecil, bulat dan refraktif
- Sel mati (Non-viable cells) : bengkak, lebih besar dan biru tua
10
2014/11/28
Sel hidup vs sel mati ??
Pewarna Fluorescen
 Ethidium bromide (EtBr) dan propidium iodide (PI)
 PI berikatan denan asam nukleat pada kerusakan
membran : teknik flow cytometric tergantung pada
fluorescence, PI sangat ideal untuk mengevaluasi sifat
permeabilitas dari sel dalam jumlah besar. Hasilnya
memberi akurasi statistik yang baik.
PI impermeable terhadap plasma membran yang utuh
Interkalasi dengan DNA or RNA  merah
11
2014/11/28
 Fluorescein diacetate (FDA) suatu nonpolar ester yang dapat
melalui membran plasma dan di hidrolisasi oleh esterase intraseluler
untuk hasilkan fluorescein bebas, polar fluorescein berada dalam sel
yang masih memiliki membran plasma yang utuh.
Sel hidup (Undamaged cell) : sangat fluorescen
Sel rusak/mati (Damaged cell) : fluorescen lemah
 Hijau kekuningan pada 450-480 nm
Ilustrasi dari prinsip esai sel hidup dengan PI/FDA
Intact cell –
PI and FDA ditambahkan
● FDA (Fluorescein diacetate)
● PI (Propidium iodide)
Membran plasma rusak, fluorescein keluar sel
Fluorescein dlm sel utuh
PI masuk ke dalam sel
12
2014/11/28
Annexin V: Penanda dini suatu Apoptosis
Indikasi apoptosis dengan adanya translokasi membran
fosfolipid fosfatidilserin (PS) dari bagian dalam membran
plasma ke bagian luarnya.
Setelah terpapar dg lingkungan luar, tempat berikatan PS
makin tersedia utk Annexin V, 35-36 kDa, Ca 2+-dependent,
phospholipid binding protein dengan afinitas tinggi terhadapa
PS
Translokasi PS, dilanjutkan dengan proses apoptosis yaitu
hilangnya integritas membran, fragmentasi DNA, dan
kondensasi kromatin.
Annexin V dapat dikonjugasi dengan biotin atau
fluorochrome, cth FITC, PE, APC, Cy5, or Cy5.5. Deteksi dg
flow cytometric
13
2014/11/28
- Translokasi PS terjadi juga pada kematian sel, maka bukan
penanda absolut utk apoptosis.
- Maka ditambahkan dengan pewarna 7-amino-actinomysin (7AAD) atau propidium iodide (PI), yang berikatan dg asam
nukleat, hanya bisa melewati membran plasma saat masih utuh
pada akhir apoptosis maupun nekrosis.
Hasil
/PI+
annexin-/PI-, annexin +/PI-, annexin+/PI+ and annexin –
No Apoptosis = Cell Viability
sel negatif terhadap Annexin V dan pewarna vital tidak mengalami
apoptosis: translokasi PS belum terjadi dan membran masih utuh.
Early Apoptosis
Sel positif Annexin V dan pewarna vital masih negatif, berarti tahap
awal apoptosis dimana translokasi PS telah terjadi, akan tetapi
membran plasma masih utuh.
Late Apoptosis or Cell Death
Sel positif terhadap Annexin V dan pewarna vital, berarti tahap lanjut
apoptosis atau sudah mati, translokasi PS sudah terjadi dan
integritas membran sudah hilang.
14
2014/11/28
Prinsip
Esai LDH
Sel tumor memiliki konsentrasi LDH intraseluler yang tinggi dan membelah
garam tetrazolium bila LDH ada dalam kultur
LDH katalisasi reduksi dari NAD+  NADH dan H+ denga oksidasi laktat menjadi
piruvat. Kedua: diaphorase menggunakan NADH and H+ utk katalisasi reduksi garam
tetrazolium (INT) menjadi formazan (absorbsi 490-520 nm).
15
2014/11/28
Kebocoran LDH
(lactate dehydrogenase)
 Nilai kuantitatifviability
 Aktivitas LDH dapat diukur dg mengukur saat reduksi dari piruvat
dan laktat
 Reduksi diikat pada oksidasi NADH  NAD+,
spectrophotometric pada 340nm
Pyruvate + NADH + H+
LDH
⇌ NAD+ + lactate
Esai Fungsi/Proliferasi Sel
16
2014/11/28
Esai MTT
 Metode ini sensitif, kuantitatif dan uji kolorimetrik
cukup baik, mengevaluasi proliferasi sel, sitotoksisitas,
dan apoptosis.
 Berdasarkan kemampuan enzim dehidrogenase
mitokondria pada sel hidup utk konversi warna kuning
substrat utk mitokhondria dehidrogenasi, yaitu 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide
(MTT) direduksi menjadi produk formazan berwarna biru
gelap yg tidak larut dlm air.
 Jumlah formazan yang dihasilkan sebanding dengan
jumlah sel yang hidup dalam sampel
MTT
Formazan
metabolically active Cell
17
2014/11/28
Uji Kolorimetrik
MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide akan direduksi menjadi produk formazan yang
tidak larut berwarna ungu biru
XTT (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2Htetrazolium-5-carboxanilide) akan direduksi menjadi suatu
derivat formazan yang larut, warna oranye terang.
Keunggulan dg XTT tidak perlu menambahkan zat utk
melarutkan formazan.
MTT dan XTT
Culture cells in a MTP
for a certain period of time (37℃)
MTT assay
XTT assay
Prepare labeling mixture
Add MTT labeling reagent
Add XTT labeling mixture
Incubate cells (0.5-4 h, 37℃)
Insoluble formazan
Soluble formazan
Add solubilizing solution
(Isopropanol) and incubate
Measure absorbance using an ELISA reader
570nm
18
2014/11/28
Example: MTT and XTT
MTT
XTT
Jenny G., Mark H., Anna J., Inger K., Douglas Mc., Roland M., 2002.
Evaluation of redox indicators and the use of digital scanners and spectrophotormeter for
quantification of microbial growth in microplates. J. Micro. Methods. 50:63-73
19