Bioteknologi 5 (2): 56-662, Nopemberr 2008, ISSN: 00216-6887, DOI: 10.13057/biotek/c050203 Keanekarragaman K n Beberap pa Variettas Sansev vieria t trifasciat ta berdassarkan Kaarakter A Anatomi, I Isozim, d Kand dan dungan Saponin S Diversity of D o some Sa ansevieria trifasciataa Cultivars based o Anatom on mical, Isozy ymic and Saponin S Co onstituentss W WHIKA FEB BRI DEWAT TISARI, SUR RANTO♥, PR RABANG SE ETYONO Program Biosain P ns, Program Passcasarjana, Univ versitas Sebelas Maret (UNS) Su urakarta 57126 D Diterima: 9 Ap pril 2008. Disetujui: 7 Juli 20008. A ABSTRACT ♥ Alamat korespondensii: Jl. Ir. Sutaami 36A, Surakartta 57126 Tel. & Faax.: +62-271-6641788. Sansevieria is an ornamenttal plant whicch has variatiion on leaves color and S s shape. The aiim of this re esearch was to t investigatee anatomical structure ( (leaves, stem and root) of five cultivarrs of Sansevieeria trifasciatta namely G Green tiger, Hahnii H medio o picta, Green n arrow, Gold den hahnii, an nd Hahnii c cream, as welll as isozymicc banding patttern and sap ponin constuttuent. The r results indicaated that thosse five cultiv vars have gen netic variation n. Hahnii m medio picta has h unique mo orphological shape than th he others, wh hile Green a arrow has diffferent stalk cells than the others. Thee dendogram resulting f from peroxidase data, S. trifasciata was w clustered in two grou ups where H Hahnii medio o picta has itss own group. The esterase data also sho owing two g groups, wheree Golden hah hnii has its ow wn group. Th he saponin co onstituent w found in was n the all five cultivars, wh hich Golden h hahnii had th he highest c content, i.e. 1.77783 mg/g and d 1.5810 mg/g g respectively for leaves and d roots. K Keywords: Sanseviera trifasciata, anatom my, morpholo ogy, isozyme, saponin. PENDA AHULUAN Sanseevieria meru upakan tanaaman hias yang y mempun nyai keanekaaragaman warna w dan beentuk daun, seerta mudah tumbuh di halaman ru umah tanpa banyak perawatan. p Tanaman ini dibudiay yakan karen na keindahaan bentuk, corak c dan waarna daunny ya. Keanek karagaman antar a individu u serta men ngidentifikasi varietas dan hibrida dapat dipelaajari dengan n isozim (Hu unter, 1981). Issozim atau isoenzim i adaalah enzim yang y terdapatt dalam suatu orrganisme y yang mengkattalis reaksi yang sama, tetapi mem miliki sifat fisiika dan kim mia yang berbeda. Perbedaan antara issozim disebaabkan adany ya lebih dari satu gen dallam suatu organisme yang y mengkode setiap isozim. i Pen ntingnya su uatu organ nisme mempun nyai isozim m berbeda yang maampu ngkatalis reak ksi yang sam ma, adalah peerbedaan men resp pon isozim terhadap faktor ling gkungan. Apa abila faktor liingkungan b berubah, isoz zim yang palin ng aktif dalam lin ngkungan tersebut mela aksanakan fungsinya dan membantu m orga anisme bertaahan hidup (Salisbury dan d Ross, 1992 2). Analisis isozim dapat digunaka an untuk men ngetahui keraagaman geneetik. Pengeta ahuan ini berm manfaat dalaam mengetah hui keaneka aragaman di an ntara kultivaar Sansevieriaa trifasciata. Penelitian P ini bertujuan b unttuk mengetaahui keaneka aragaman lima a varietas S.. trifasciata b berdasarkan struktur anattomi pada akar, a batang dan daun; pola p pita isozim peroksidase dan esteerasi; dan ka andungan sapo onin. Kelimaa varietas S. ttrifasciata yan ng diteliti adallah Green tigeer, Hahnii meedio picta, Greeen arrow, Gold den hahnii, daan Hahnii creaam DEWATISARI dkk. – Keanekaragaman Varietas Sansevieria trifasciata 57 BAHAN DAN METODE Kadar saponin (ppm) = Bahan Bahan material tumbuhan berupa lima kultivar Sansevieria trifasciata yaitu Hahnii cream, Green arrow, Hahnii medio picta, Golden hahnii, dan Green tiger. Bahan lain yang digunakan adalah etanol (70%) dan larutan standar saponin (Merck, Jerman). Kadar saponin sampel X volume pengenceran (ml) Berat sampel (g) Cara kerja Analisis morfologi dan anatomi. Pengamatan morfologi dan anatomi dilaku-kan pada beberapa organ seperti daun, batang semu, dan akar dari kelima varietas S. trifasciata Analisis kadar saponin. Analisis saponin merujuk pada Stahl (1985). Ekstraksi dimulai dengan menimbang 5 g akar S. trifasciata dari masing-masing varietas. Kemudian dicuci, diiris kecil-kecil, dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 45ºC selama 12 jam. Daun kering digerus dengan mortal sampai menjadi serbuk, lalu 0,1 g serbuk yang telah halus diekstraksi dengan 10 ml etanol 70% di atas penangas air dengan suhu 80 ºC selama 15 menit. Kemudian dibuat larutan standar saponin dengan konsentrasi 20, 40, 80, 160, dan 320 ppm dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 365 nm, sehingga diperoleh kurva standar saponin. Selanjutnya ekstrak saponin dari akar dan daun S. trifasciata diuji kadarnya. Analisis pola pita isozim. Proses elektroforesis untuk memunculkan pita-pita isozim peroksidase dan esterase dilakukan dengan merujuk pada Suranto (1999), terdiri dari (i) Ekstraksi Sampel, (ii) Pembuatan media gel, (iii) Proses elektroforesis, (iv) Proses pewarnaan gel, (v) Proses fiksasi gel, dan (vi) Penyimpanan gel Analisis Data Data uji anatomis dilakukan dengan membuat irisan melintang dan membujur dari organ daun, batang, dan akar dari beberapa varietas S. trifasciata kemudian diamati perbedaan susunan jaringan masing-masing varietas di bawah mikroskop. Kadar saponin. Senyawa hasil ekstraksi dihitung kadar saponinnya dengan spektrofotometer UV-vis berdasarkan kurva standard saponin. Kadar yang telah diperoleh kemudian dikonversikan ke dalam bentuk mg/g berat kering daun dengan rumus menurut Ruth dan Blasche (1985): Data pola pita isozim berupa nilai Rf yaitu perbandingan jarak migrasi isozim terhadap jarak migrasi loading dye. Data kuantitatif selanjutnya diubah menjadi data biner. Data kuantitatif dan data biner dianalisis dengan menggunakan hierarchical cluster analysis method average linkage (between group) program SPSS 14 (Santoso, 2004). HASIL DAN PEMBAHASAN Sifat morfologi daun, batang dan akar Varietas yang memiliki helaian daun yang banyak terdapat pada Green tiger dan Golden hahnii. Varietas yang memiliki helaian daun yang paling luas adalah Hahnii medio picta . Helaian daun yang paling panjang dan sempit dimiliki oleh Green arrow. Warna dan corak daunnya serupa dengan Green tiger tetapi helaian daun Green arrow lebih kaku dan tebal. Hahnii cream dan Golden hahnii mempunyai ukuran daun yang serupa. Di lihat dari warna akar, Green tiger, Hahnii medio picta, dan Green arrow berwarna coklat, sedangkan Golden hahnii berwarna oranye dan Hahnii cream berwarna putih kekuningan (Tabel 1). Pada pengamatan anatomi mikroskopis daun, sel-sel pada setiap varietas berbentuk hexagonal. Varietas Green tiger, Green arrow, Golden hahnii, dan Hahnii cream mempunyai bentuk sel yang sama yaitu hexagonal sempit dan memanjang, sedangkan varietas Hahnii medio picta mempunyai sel-sel daun berbentuk hexagonal yang lebih besar dan melebar. Sama halnya pada sifat morfologi, pada mikroskopis daun ini Hahnii medio picta mempunyai karakter sel-sel yang paling berbeda dengan varietas lainnya (Gambar 1). Pada pengamatan anatomi mikroskopis batang yang dipotong secara melintang dan membujur, sel-sel batang pada setiap varietas sama, kecuali sel-sel batang pada varietas Green arrow. Berbeda dengan pengamatan morfologi dan mikroskopis daun sebelumnya. Varietas Green arrow khusus pada batang memiliki perbedaan yang kontras di mana sel-selnya bentuknya memanjang tidak seperti varietasvarietas lainnya yang memiliki sel-sel yang membulat (Gambar 2). Bioteknologi 5 (2): 56-62, Nopember 2008 58 Tabel 1. Karakter morfologi lima varietas Sanseviera trifasciata Sifat Morfologi Green tiger Jumlah daun per 5 – 15 helai tanaman Daging daun Berdaging lunak berair Bangun daun Oval Panjang daun 5 - 10 cm Lebar daun - 9 cm Ujung daun Meruncing Warna daun: Atas hijau tua dengan semburat garisgaris horizontal Hahnii medio picta 3 – 6 helai 3 - 10 helai 5 – 15 helai 2 – 6 helai Berdaging kaku berair Memanjang 15 - 30 cm - 9 cm Meruncing Berdaging kaku berair Lanset 10 –15 cm 2 - 3 cm Meruncing Berdaging lunak berair Oval 5- 10 cm 3 - 6 cm Meruncing Berdaging lunak berair Oval 5- 10 cm 3 - 6 cm Meruncing hijau muda mendekati putih hijau tua dengan semburat garisgaris hijau muda horizontal hijau muda ditengah sedangkan di tepi sekelilingnya berwarna kuning Green arrow Bawah hijau tua dengan semburat garisgaris horizontal hijau muda mendekati putih hijau tua dengan semburat garisgaris hijau muda horizontal Warna akar cokelat cokelat cokelat Daun 1 Golden hahnii hijau muda di tengah sedangkan di tepi sekelilingnya berwarna putih tipis hijau muda hijau muda ditengah ditengah sedangkan di tepi sedangkan sekelilingnya sekelilingnya berwarna kuning berwarna putih tipis oranye putih kekuningan Batang 2 1 Hahnii cream Akar 2 1 2 A B C D E Gambar 1. Penampang melintang dan membujur organ daun lima varietas S.trifasciata dengan Perbesaran 100X. Keterangan: A. Green tiger, B. Hahnii medio picta, C. Green Arrow, D. Golden Hahnii, E. Hahnii cream. 1. Penampang bujur, 2. Penampang lintang DEWATISARI dkk. – Keanekaragaman Varietas Sansevieria trifasciata Gambar 4. Zimogram peroksidase isozim akar dari lima varietas S. trifasciata dengan pewarnaan. Keterangan: A = Green tiger, B = Hahnii medio picta, C = Green arrow, D = Golden hahnii, E = Hahnii cream Gambar 5. Zimogram esterase akar dari lima varietas S. trifasciata dengan pewarnaan. Keterangan: A = Green tiger, B = Hahnii medio picta, C = Green arrow, D = Golden hahnii, E = Hahnii cream. Nomor 1 s.d 13 menunjukkan posisi pita-pita pada tiap varietas tanaman yang diuji Pada pengamatan anatomi mikroskopis akar yang dipotong secara melintang dan membujur, bentuk sel-sel akar pada setiap varietas pada umumnya bentuknya sama. Akan tetapi apabila kita melihat dari penampang membujur varietas Golden Hahnii dan Hahnii cream, keduanya memiliki bentuk sel yang serupa dan berbeda dari varietas-varietas lain, yaitu bentuknya lebih pipih dan memanjang (Gambar 3). Kesamaan kedua varietas ini juga tampak pada sifat morfologi yang memiliki ukuran daun yang sama. Pola Pita Isozim Enzim Peroksidase Berdasarkan jumlah pita yang terekspresi, varietas Green tiger memiliki lima pita, varietas Hahnii medio picta memiliki dua pita, varietas Green arrow memiliki enam pita, varietas Golden hahnii memiliki tiga pita, dan varietas Hahnii cream memiliki empat pita (Gambar 4). Pita yang terbentuk pada gel poliakrilamid untuk enzim peroksidase ini berwarna merah bata. Ketebalan pita pada dasarnya bisa dibedakan menjadi dua, yaitu pita yang tebal dan yang tipis. Pita tipis menunjukkan bahwa kandungan isozim tersebut konsentrasinya sedikit. Perbedaan tebal tipisnya pita disebabkan karena perbedaan jumlah dari molekul-molekul yang termigrasi, pita tebal merupakan fiksasi dari beberapa pita. Pita yang memiliki kekuatan 59 Gambar 6. Dendogram pola pita isozim akar S. trifasciata dengan pewarnaan peroksidase dan esterase. Keterangan: A = Green tiger, B = Hahnii medio picta, C = Green arrow, D = Golden hahnii, E = Hahnii cream ionik lebih besar akan ter-migrasi lebih jauh daripada pita yang berkekuatan ionik kecil (Cahyarini, 2004). Isozim Esterase Hasil analisis elektroforesis organ akar dengan menggunakan gel poliakrilamid pada isozim esterase dapat diketahui pada Gambar 5. Dari zimogram hasil elektroforesis isozim peroksidase organ akar, dapat diketahui bahwa isozim peroksidase menghasilkan 23 pita berdasarkan pergerakan relatif enzim (Rf). Dari data biner tersebut (Gambar 5 ) kemudian dibuat data biner yakni nilai 1 untuk munculnya pita dan nilai nol (0) diberikan untuk ada tidaknya pita. Dengan demikian data dapat dianalisis menggunakan Hierarchical Cluster Analysis metode Average linkage (Between group) program SPSS 14. Dari Gambar 6 dapat diketahui hubungan kekerabatan dari masing-masing individu. Dari dendogram tersebut terdapat dua kelompok di mana varietas Golden hahnii(D) membentuk karakter sendiri dengan varietas Green tiger(A), Hahnii medio picta (B), Green arrow (C), Hahnii cream(E). Pada skala 15 terdapat dua kelompok lagi yaitu varietas Green tiger(A) dan Hahnii medio picta (B), dengan varietas Green arrow (C) dan Hahnii cream(E). Varietas Green tiger (A) dan Hahnii medio picta (B) memiliki hubungan kekerabatan yang paling dekat karena memiliki skala yang lebih rendah dibandingkan hubungan 60 kekerabatan antara varietas Green arrow (C) dan Hahnii cream (E). Berbagai jaringan yang berbeda dapat mengan-dung isozim yang berbeda pula dan semua isozim tersebut mempunyai afinitas terhadap substrat yang berbeda pula. Enzim peroksidase di dalam tubuh tumbuhan S. trifasciata memiliki konsentrasi yang lebih rendah dibandingkan enzim esterase sehingga peroksidase sedikit terekspresikan pada gel. Berdasarkan hasil elektroforesis baik dengan pewarnaan peroksidase maupun esterase, keragaman pola pita isozim lebih cenderung tergolong ke dalam keragaman kuantitatif, yaitu ada atau tidaknya pita pada gel. Sedangkan perbedaan ketebalan pita merupakan sifat kuantitatif. Perbedaan ini disebabkan karena perbedaan jumlah dari molekul-molekul yang termigrasi, pita tebal merupakan fiksasi dari beberapa pita. Molekul yang mempunyai kekuatan ionik besar akan termigrasi lebih jauh daripada yang berkekuatan ionik rendah (Cahyarini, 2004). Dari hasil zimogram dan dendogram di atas dapat menjelaskan bahwa isozim dalam penelitian ini berperan sebagai penanda genetik untuk mempelajari keanekaragaman antar individu serta mengidentifikasi varietas S. trifasciata. Isozim merupakan produk langsung dari gen sehingga dapat digunakan dalam mengidentifikasi varietas dan studi populasi. Jenis dan jumlah enzim pada masing - masing organisme berbeda-beda. Jaringan yang berbeda juga dapat mengandung isozim yang berbeda, dan semua isozim ini mempunyai afinitas yang berbeda-beda terhadap substrat. Goodwin dan Mereer (1983) menjelaskan bahwa fungsi utama isozim adalah sebagai kontrol terhadap aktivitas metabolisme di dalam sel. Frekuensi perbedaan isozim pada organela yang berbeda pada sel tumbuhan. Isozim merupakan salah satu alternatif yang dapat digunakan untuk mengkarakterisasi dan mengklasifikasi koleksi plasma nutfah, karena isozim relatif stabil terhadap lingkungan dan umumnya polimorfik (Aradya et al., 1994). Berdasarkan karakter tersebut maka isozim telah banyak digunakan untuk mengidentifikansi dan mengklasifikasi beberapa spesies tanaman, seperti identifikasi triploid pada jeruk dengan empat sistem enzim (MDH, 6-PGD, SKDH, dan PGI) (King et al., 1996), identifikasi kultivar nenas dengan enzim phosphoglucomutase (PGM) dan peroksidase (PER) (de Wald et al., 1988), studi variasi pola pita protein pada varietas Adenium Bioteknologi 5 (2): 56-62, Nopember 2008 obsesum (kamboja jepang) (Hastuti, 2008), studi pola pita isozim padi (Oryza sativa) varietas Rojolele (Widiyanti, 2007), karekterisasi beberapa varietas mangga (Mangifera indica L.) berdasarkan pola pita protein (Wahyuningsih, 2008) serta karakterisasi, klasifikasi, dan hubungan kekerabatan plasma nutfah nenas di Hawaii (ADH, GPI, PGM, SKDH, TPI, UGPP) (Aradya et al., 1994). Kadar Saponin Daun Metabolit sekunder terakumulasi dalam sel tanaman dalam jumlah yang sedikit. Metabolit sekunder berperan untuk kelangsungan hidup, salah satunya pertahanan diri (Manitto, 1992). Saponin merupakan salah satu metabolit sekunder golongan terpenoid yang disintesis melalui jalur asam mevalonat dari jalur respirasi. Saponin adalah glikosida triterpen dan sterol, merupakan senyawa aktif permukaan dan bersifat seperti sabun serta dapat dideteksi berdasarkan kemampuannya membentuk busa dan menghemolisis sel darah. Pencarian saponin dalam tubuh tumbuhan telah dirangsang oleh kebutuhan akan sumber sapogenin yang mudah diperoleh dan dapat diubah di laboratorium menjadi sterol yang berkhasiat penting, misalnya kortison, estrogen, dan kontraseptif, dan lainlain. Pembentukan busa yang mantap sewaktu mengekstraksi tumbuhan atau waktu memekatkan ekstrak tumbuhan merupakan bukti terpercaya akan adanya saponin (Harbone, 1987). Pada Tabel 1 dan 2 (No 1-5) menunjukkan bahwa kadar saponin daun Golden hahnii lebih tinggi daripada varietas lainnya demikian pula kadar saponin pada akar. Dari hasil yang diperoleh terdapat perbedaan kadar saponin dari organ daun dan akar. Pada Hahnii cream dan Green arrow kadar saponin di akar lebih tinggi dibandingkan dengan kadar yang terdapat di daun, sedangkan pada Hahnii medio picta, Golden hahnii, dan Green tiger kadar saponin daun lebih tinggi dibandingkan di akar. Hal ini disebabkan karena setiap varietas memiliki tingkat biosintesis metabolit sekunder yang dihasilkan berbeda pada masing-masing organnya. Kadar saponin pada organ daun varietas Green arrow tidak jauh berbeda dengan varietas Green tiger, tetapi pada organ akar selisih kadarnya jauh mencapai 0,1293 mg/g. Hahnii cream memiliki kandungan saponin terendah pada organ daun, tetapi pada akar kandungan terendah terdapat pada varietas Green tiger. DEWATISARI dkk. – Keanekaragaman Varietas Sansevieria trifasciata Hahnii medio picta memiliki kandungan saponin organ akar yang hampir sama dengan varietas Hahnii cream yaitu hanya berselisih 0,00376 mg/g. Meskipun terjadi perbedaan kandungan saponin antara daun dan akar tetapi selisih tersebut tidak terlalu jauh. Selisih kadar saponin pada Hahnii cream antara daun dan akarnya adalah 0,4364 mg/g, di mana kadarnya lebih tinggi akar. Pada Green arrow selisih kadar saponin hanya 0,0094 mg/g lebih tinggi akar dari daun. Sedangkan Hahnii medio picta kadar saponin daunnya yang lebih tinggi 0,2901 mg/g dibandingkan akar. Pada Golden hahnii yang memiliki kadar daun 0,1973 mg/g lebih tinggi daripada akar. Demikian pula pada Green tiger kadar daun lebih tinggi 0,2041 mg/g dibandingkan akar. Tabel 1. Hasil ekstrak kadar saponin akar (dalam mg/g) dari lima varietas S. Trifasciata Varietas S. trifasciata Hahnii cream Green arrow Hahnii medio picta Golden hahnii Green tiger Kadar saponin akar 0, 8468 0,9229 0,8092 1,5810 0,7936 Tabel 2. Hasil uji kadar saponin daun S. trifasciata dan berbagai macam tanaman obat. Kadar saponin (mg/g) Hahnii cream 0, 4104 Green arrow 0,9135 Hahnii medio picta 1,0993 Golden hahnii 1,7783 Green tiger 0,9977 Plantago mayor 0,0301 Gynura segetum 0, 8425 Jatropa curcas 1,313 Talinum paniculatum 1,3571 Camellia sinensis 0,0500 Pandanus amaryfolius 0,2200 Nama Tanaman Sumber Hasil penelitian Hasil penelitian Hasil penelitian Hasil penelitian Hasil penelitian Khristyana dkk., 2005 Wibawati, 2006 Sari, 2008 Suskendriyati, 2003 Rao dan Sung, 2008 Susana dkk., 2003 Tanaman lain yang mengandung saponin adalah Plantago mayor L. (daun sendok) dengan kadar saponin optimal adalah 0,03011 mg/g (Khristyana dkk., 2005). Tanaman Gynura segetum yang dikenal sebagai daun dewa memiliki kadar saponin 0,842570 mg/g (Wibawati, 2006). Tanaman Jatropa curcas memiliki kadar saponin optimalnya sebesar 1,313 mg/g (Sari, 2008). 61 Tanaman Talinum paniculatum Gaerth. memiliki kadar saponin sebesar 1,3571 mg/g (Suskendriyati, 2003). Tanaman Panax ginseng memiliki kadar saponin sebesar 0,4040 mg/g (Kim et al., 2005). Tanaman Camellia sinensis (teh) hanya memiliki kadar sebesar 0,0500 mg/l (Rao dan Sung, 2008), daun pandan wangi (Pandanus amaryfolius Roxb) memiliki kandungan saponin sebesar 0,2200 mg/g (Susana, dkk., 2003). Dari ketujuh tanaman obat yang memiliki potensi saponin di atas, kadar Golden Hahnii masih paling tinggi kandungannya yaitu 1,7783 mg/g. Dengan mengetahui bahwa kandungan saponin pada varietas Golden hahnii lebih tinggi daripada tanaman-tanaman obat yang telah diuji kadar saponinnya (Tabel 3), berarti selain berpotensi sebagai tanaman hias dengan keindahan daunnya juga dapat berpotensi sebagai tanaman obat dan dapat diaplikasikan di bidang pertanian serta industri. Hal ini dikarenakan saponin sebagai zat metabolit sekunder banyak digunakan sebagai obat antikarsinogen untuk menghambat pertumbuhan sel tumor dan menurunkan kolesterol darah (Rao dan Sung, 2008). Selain itu saponin banyak digunakan untuk aplikasi di bidang pertanian, industri kosmetik dan shampo, makanan, serta dapat meningkatkan absorbsi zat-zat diuretika (garam-garam) dan merangsang ginjal untuk lebih aktif (Brotosisworo, 1979). Beberapa obat antiinflamator dan antiendemik diketahui mengandung saponin. Beberapa saponin digunakan sebagai antitusif dan ekspektoran pada obat tradisional (Wagle et al., 1999). KESIMPULAN Berdasarkan kandungan saponin daun dan akar, Golden hahnii lebih tinggi daripada varietas lainnya yaitu 1,7783 mg/g dan 1,5810 mg/g, dengan demikian S. trifasciata dapat digolongkan sebagai salah satu tanaman obat yang sangat bermanfaat DAFTAR PUSTAKA Aradya K.M., F. Zee, and R.M. Manshardi. 1994. Isozyme variation in cultivated and wild pinneaple. Euphytica 79: 87-99 Brotosisworo, S. 1979. Obat Hayati Golongan Glikosida. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. De Wald M., G. A. Moore, and W. B. Sherman. 1988. Identification of Pinneaple Cultivar by Isozyme Genotype. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 133 (6): 935 – 938 62 Goodwin T.W. and E.I. Mereer. 1983. Introduction to Plant Biochemistry. London: Second Edition. Pergamon Press. Khristyana, L., Anggarwulan, E., dan Marsusi. 2005. Pertumbuhan Kadar Saponin dan Nitrogen Jaringan Tanaman Daun Sendok (Plantago Mayor L. ) pada Pemberian Asam Giberelat (GA3). Biofarmasi 3(1):11-15 Kim, Jung Hea., Chang, Eun., Jung and Oh, Hoon-Il. 2005. Saponin Production in Submerged Adventitious Root Culture of Panax ginseng as Affected by Culture Conditions and Elicitors. Asia Pasific of Journal Molecular 13 (2): 87-91 Cahyarini, R.D. 2004. Identifikasi Keragaman Genetik Beberapa Varietas Lokal Kedelai di Jawa Berdasarkan Analisis Isozim. [Tesis]. Surakarta: Program Pasca Sarjana Universitas Sebelas Maret. Wahyuningsih, 2008 Susana, dkk., 2003 Sari SR. 2008. Pertumbuhan dan kadar saponin daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) pada pemberian kombinasi IBA (Indole-3-Butyric Acid) dan kinetin. [Skripsi]. Surakarta: FMIPA, Universitas Sebelas Maret King, B. J., L. S. Lee and P. T. Scott. 1996. Identification of Triploid Citrus by Isozyme Analysis. Euphytica 99: 223-231 Manitto, P. 1992. Biosintesis Produk Alami (diterjemahkan oleh Koesoemadiyah). Semarang: IKIP Semarang Press Rao, A. V., Sung, M. K. 2008. Nonisoflavone Soybean Anticarcinogens: Saponins as Anticarcinogens. Journal of Nutrition 27: 717-724 Ruth, H. J. and G, Blaschre. 1985. Analisis Farmasi (diterjemahkan oleh Sarjono Kisman dan Slamet Ibrahim). Yogyakarta: UGM Press. Salisbury, F. B., and C. W. Ross. 1992. Fisiologi Tumbuhan (diterjemahkan oleh Diah R. Lukman dan Sumaryono). Jilid 2. ITB. Bandung. Bioteknologi 5 (2): 56-62, Nopember 2008 Santoso, S. 2004. Pengolahan Data Statistik dengan SPSS 11.5. Jakarta. Stahl, E. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi (diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Sudiro). Bandung: ITB press. Suranto. 1991. Studies of Population Variation in Spesies of Ranunculus. (M. Sc. Thesis). Hobart: Departement of Plant Science- University of Tasmania. Suranto. 2000. Electrophoresis Studies of Ranunculus triplodontus Populations. Biodiversitas. 1 (1): 1 - 7 Suranto. 2002a. Cluster Analysis of Ranunculus Spesies. Biodiversitas 3 (1): 201 – 206. Suranto. 2002b. The Early Aplplication of Electrophoresis of Protein in Higher Plant Taxonomy. Biodiversitas 3 (2): 257262 Suranto. 2007. Prospek Pemanfaatan Sumber-Sumber Bukti Baru dalam Pemecahan Permasalahan Taksonomi Tumbuhan. Surakarta: Program Studi Biosains. Suskendriyati, H. 2003. Pertumbuhan dan Produksi Saponin Kultur Kalus Talinum Paniculatum Gaerth. Dengan Variasi Pemberian Sumber Karbon. Skripsi. UNS. Surakarta Wibawatai, R.H. 2006. pertumbuhan dan Kandungan Saponin daun Gynura segetum (Lour.) Mer. Pada Pemberian Air yang Berbeda [Skripsi]. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret. Surakarta. Wagle, A., Keklar, G. D., and Heble, M. R. 1999. Production of Steroid and Saponin. In K. G. Ramawat and J. M. Merillon (eds.). Biotechnology Secondary Metabolites. Science Publishers Inc. USA. Pp. 219 – 235. Widiyanti. 2007. Studi Variasi Morfologi Biji, Serbuk Sari, dan Pola Pita isozim Padi (oryza sativa) Varietas Rojolele [Thesis]. Program Pascasarjana Universitas Sebelas Maret Surakarta.