hubungan kuantitatif struktur aktifitas senyawa
advertisement
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR AKTIFITAS SENYAWA NITRASI ETIL P -METOKSISINAMAT TERHADAP AKTIVITAS ANTI TUBERKULOSIS MELALUI PENDEKATAN HANSCH SECARA KOMPUTASI SKRIPSI MAZAYA FADHILA 1111102000079 FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA 2015 UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR AKTIFITAS SENYAWA NITRASI ETIL P -METOKSISINAMAT TERHADAP AKTIVITAS ANTI TUBERKULOSIS MELALUI PENDEKATAN HANSCH SECARA KOMPUTASI SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi MAZAYA FADHILA 1111102000079 FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA 2015 vi iv v ABSTRAK Nama Program Studi Judul : Mazaya Fadhila : Farmasi : Hubungan Kuantitatif Struktur Aktifitas Senyawa Nitrasi Etil P -Metoksisinamat Terhadap Aktivitas Anti Tuberkulosis Melalui Pendekatan Hansch Secara Komputasi. Senyawa etil p -metoksisinamat (EPMS) telah dilaporkan aktif menghambat virulensi Mycobacterium tuberculosis H37Ra, H37Rv, dan isolat klinik pasien resisten MDR (Multidrug Resistant) dengan konsentrasi hambat minimum 242485 μM. Salah satu reseptor yang berperan dalam pengobatan tuberkulosis adalah InhA, suatu enzim yang berperan dalam pembentukan asam lemak Mycobacterium tuberculosis. Dalam penelitian ini, dianalisa hubungan kuantitatif struktur dan aktifitas senyawa turunan asam sinamat dan EPMS terhadap aktifitas anti tuberkulosis menggunakan metode Hansch, selanjutnya penambatan molekul senyawa nitrasi EPMS dengan reseptor inhA menggunakan perangkat lunak Autodock Vina. Visualisasi menggunakan Autodocktools, Pymol, dan LigPlot. Persamaan HKSA Hansch yang diperoleh dari turunan EPMS terhadap aktivitas anti tuberkulosis adalah Log MIC = -0.2909 LogP + 1.6411 LogCPSA - 0.1497 Log sterik - 0.3491. Hasil penambatan molekul terbaik, dengan affinitas -11.2 kcal/mol, adalah 4-nitrophenyl 4-coumarate yang mengikat 6 asam amino yaitu Ser94, Gly96, Thr39, Ile15, Gly14, dan Val65. Hal ini membuktikan bahwa senyawa nitrasi EPMS aktif dan efektif sebagai anti tuberkulosis. Kata kunci : nitrasi EPMS, turunan asam sinamat, inhA, HKSA, penambatan molekul, vi ABSTRACT Name Program Study Title : Mazaya Fadhila : Pharmacy : The Quantitative Structure and Activity Relationship of Etil P -Metoksisinnamic Nitration To Anti Tuberculosis Activity By Hansch Method Computationally Etil p -metoksisinnamic (EPMS) has reported active inhibit Mycobacterium tuberculosis H37Ra, H37Rv, and clinical isolate of MDR (Multidrug Resistant) patient‘s virulence with minimum inhibit concentration 242-485 μM. One of kind receptor that act in tuberculosis is InhA, an enzyme that act in production of Mycobacterium tuberculosis‘s fatty acid. This research analyze the quantitative of structure and activity relationship of cinnamic acid derivates and EPMS to anti tuberculosis activity used Hansch method, and continued by molecular docking EPMS nitration to inhA receptor by AutoDock Vina. Then, visualization by AutoDock Tools, PyMol, and LigPlot. The Hansch QSAR‘s regression collected from EPMS derivates as anti tuberculosis activity is Log MIC = -0.2909 LogP + 1.6411 LogCPSA - 0.1497 Log sterik - 0.3491. The best docking result, with affinity -11.2 kcal/mol, is 4-nitrophenyl 4-coumarate that binded to 6 amino acid, those were Ser94, Gly96, Thr39, Ile15, Gly14, and Val65. This proved that EPMS nitration active and effective as anti tuberculosis. Key Words : EPMS, cinnamic acid derivates , inhA, QSAR, Molecular docking, Autodock Vina vii KATA PENGANTAR بسم هللا الر حمن الر حيم Alhamdulillah segala puji dan syukur penulis sampaikan ke hadirat Allah SWT yang telah memberikan taufik dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini yang berjudul: ―Hubungan Kuantitati Struktur Aktifitas Senyawa Nitrasi Etil P –Metoksisinamat Terhadap Aktivitas Anti Tuberkulosis Melalui Pendekatan Hansch Secara Komputasi‖. Skripsi ini merupakan hasil perjalanan studi selama kuliah di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan konsentrasi Farmasi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta yang disusun untuk memenuhi syarat terakhir perkuliahan dalam rangka memperoleh gelar Sarjana Farmasi. Banyak pihak yang telah membantu dan memberikan dorongan yang sangat besar selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. Penghargaan dan ucapan terimakasih yang tulus dan tak terhingga disampaikan penulis kepada: 1. Bapak Supandi, M.Si, Apt., selaku pembimbing pertama dan Ibu Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt., selaku pembimbing kedua, yang memiliki andil besar dalam proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini, senantiasa meluangkan waktu dan tenaga untuk memberikan arahan dan petunjuk serta dorongan sehingga penelitian dan penyusunan skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. Semoga segala bantuan dan bimbingan bapak mendapat imbalan yang lebih baik di sisi-Nya. 2. Bapak Arief Sumantri SKM, M.Kes., Apt., selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 3. Bapak Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt., selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 4. Ibu Ofa Suzanti Betha M.Si Apt. selaku sekretaris Program Sudi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. viii 5. Ibu Dr. Dra. Delina Hasan M.Kes Apt. selaku pembimbing akademik yang telah banyak memberikan nasihat dan saran. 6. Seluruh staf pengajar Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan khususnya staf pengajar Prodi Farmasi yang telah memberikan ilmu kepada penulis. 7. Bapak Andrianopsyah Mas Jaya Putra, M.Sc., yang telah banyak memberikan masukan dan arahan terkait penelitian yang penulis lakukan. 8. Keluarga tercinta, papa, mama, kakak, kakek, nenek, adik, om dan tante, yang senantiasa menyertai setiap langkah penulis dengan cinta dan kasih, tulus dan ikhlas menyayangi, selalu mendoakan, membantu dan memberikan dorongan spiritual dan material. 9. Sahabatku tersayang, Tari, Dini, Fitri, Firda, Nurul, Deni, yang selalu bersama sama melangkah dan berjuang untuk menjadi pribadi yang sukses dan berhasil. Serta tak bosan dan sabar dalam menghadapi curhatan penulis dalam penyelesaian skripsi ini. 10. Rekan satu tim Docking, Eko, Wahidin, Acad, Haidar, kak Fikri, yang selalu dengan sabar hati membantu penulis dalam mempelajari program-program komputer, berbagi jurnal dan masukan lainnya. 11. Serta rekan rekan seperjuangan Farmasi 2011, khususnya kelas AC tercinta. Terima kasih kepada teman-teman yang selalu bersedia diminta bantuannya dalam penyelesaian skripsi ini dan selama empat tahun berbagi suka dan duka. 12. Setiap orang yang menanyakan, gimana skripsi, kapan wisuda dengan bangga penulis katakan akhirnya telah terselesaikan. Dengan segala kemampuan dan keterbatasan yang ada, penulis menyadari sepenuhnya bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Oleh sebab itu dengan keterbukaan penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun. ix Akhirnya, semoga Allah SWT memberikan taufik dan hidayah-Nya kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan skripsi ini dan semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan di bidang farmasi khususnya dan bidang lain yang ada kaitannya pada umumnya. Jakarta, 26 Mei 2015 Penulis x xi DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ....................................................................................................... ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS ........................................................... iii HALAMAN PERSETUJUAN SKRIPSI ..................................................................... iv HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ........................................................................ v ABSTRAK ...................................................................................................................... vi ABSTRACT ................................................................................................................... vii KATA PENGANTAR .................................................................................................. viii HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH ............................................... xi DAFTAR ISI .................................................................................................................. xii DAFTAR GAMBAR .................................................................................................... xiv DAFTAR TABEL ......................................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................ xvi BAB 1 PENDAHULUAN ............................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang ............................................................................................................ 1 1.2 Rumusan Masalah ....................................................................................................... 3 1.3 Hipotesis...................................................................................................................... 3 1.4 Tujuan Penelitian ........................................................................................................ 3 1.5 Manfaat Penelitian ...................................................................................................... 3 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................................... 4 2.1. Etil-p-Metoksisinamat (EPMS) ................................................................................. 4 2.2. Mycobacterium tuberculosis...................................................................................... 4 2.2.1 Karakteristik Bakteri .................................................................................... 4 2.2.2 Asam Mikolat ............................................................................................... 6 2.2.3 inhA .............................................................................................................. 7 2.3. Tuberkulosis .............................................................................................................. 7 2.3.1 Definisi ......................................................................................................... 7 2.3.2 Patofisiologi ................................................................................................. 7 2.3.3 Gambaran Klinis .......................................................................................... 8 2.4. Isoniazid..................................................................................................................... 8 2.4.1 Efek Antibakteri ........................................................................................... 9 2.4.2 Mekanisme Kerja ......................................................................................... 9 2.4.5 Resistensi .................................................................................................. 10 2.5. Hubungan Kuantitatif Struktur Aktifitas (HKSA)................................................... 10 2.6. Model HKSA Pendekatan Hansch .......................................................................... 11 2.6.1 Parameter Sifat Kimia Fisika dalam HKSA Model Hansch ...................... 11 2.6.2 Analisis Statistik dalam HKSA Model Hansch ......................................... 12 2.7. Penambatan Molekuler ............................................................................................ 12 2.8. Interaksi ikatan ........................................................................................................ 12 2.8.1 Ikatan Ion ................................................................................................... 13 2.8.2 Ikatan Hidrogen .......................................................................................... 13 2.8.3 Interaksi Van Der Waals ............................................................................ 14 2.8.4 Interaksi Dipol-Dipol ................................................................................. 14 2.8.5 Ikatan Kovalen ........................................................................................... 14 xii BAB 3 METODE PENELITIAN ................................................................................. 16 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ................................................................................... 16 3.1.1 Tempat.................................................................................................................... 16 3.1.2 Waktu ..................................................................................................................... 16 3.2 Alat ............................................................................................................................ 16 3.2.1 Perangkat Keras ......................................................................................... 16 3.2.2 Perangkat Lunak......................................................................................... 16 3.3 Bahan ........................................................................................................................ 16 3.3.1 Struktur Nitrasi EPMS ............................................................................... 16 3.3.2 Struktur Tiga Dimensi inhA ....................................................................... 17 3.4 Cara Kerja ................................................................................................................. 17 3.4.1 Hubungan kuantitatif struktur aktifitas model Hansch .............................. 17 3.4.1.1 Pemilihan Deskriptor.............................................................. 17 3.4.1.2 Training Set, Test Set dan Sampel Set.................................... 17 3.4.1.3 Menyingkirkan Outlier ........................................................... 21 3.4.1.4 Menilai Kualitas Persamaan HKSA ....................................... 21 3.4.2 Penambatan Molekul dengan Autodock Vina............................................ 21 3.4.2.1 Penyiapan struktur molekul resptor inhA ............................... 21 3.4.2.2 Optimasi Molekul ................................................................... 21 3.4.2.3 Menentukan Lokasi Penambatan Molekul – Ligan ................ 21 3.4.2.4 Penyiapan Struktur Tiga Dimensi (3D) Ligan ....................... 21 3.4.2.5 Optimasi Ligan ....................................................................... 22 3.4.2.6. Penambatan Molekul ............................................................. 22 3.4.2.7 Visualisasi Hasil Penambatan Molekul .................................. 22 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................................... 23 4.1 Hubungan Kuantitatif Struktur Aktifitas Model Hansch ........................................ 23 4.1.1 Pemilihan Deskriptor ................................................................................ 23 4.1.2 Training Set............................................................................................... 23 4.1.3 Test Set ..................................................................................................... 25 4.1.4 Sample Set ................................................................................................ 26 4.2 Penambatan Molekul dengan Autodock Vina.......................................................... 27 4.2.1 Penyiapan Ligand ..................................................................................... 27 4.2.2 Penyiapan Reseptor................................................................................... 28 4.2.3 Penambatan Molekular ............................................................................. 29 4.2.4 Visualisasi Hasil Penambatan Molekul .................................................... 31 BAB 5 PENUTUP ....................................................................................................................36 5.1 KESIMPULAN ........................................................................................................ 36 5.2 SARAN .................................................................................................................... 36 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................... 37 LAMPIRAN ................................................................................................................... 40 xiii DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Etil p-metoksisinamat................................................................................... 4 Gambar 2. Mycobacterium tuberculosis ........................................................................ 5 Gambar 3. NAD+ ........................................................................................................... 27 Gambar 4. 4-nitrophenyl 4-coumarate-NAD+ .............................................................. 27 Gambar 5. Reseptor 1ZID .............................................................................................. 28 Gambar 6. Perbandingan hasil Visualisasi 4-nitrophenyl 4-coumarate dengan PyMol (kiri) dengan LigPlot (kanan) ...................................................................... 32 xiv DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Senyawa Training Set ...................................................................................... 17 Tabel 2. Senyawa Test Set .............................................................................................. 18 Tabel 3. Senyawa Sample Set ........................................................................................ 19 Tabel 4. Hasil HKSA Training set ................................................................................. 23 Tabel 5. Hasil HKSA Test Set ........................................................................................ 24 Tabel 6. Hasil HKSA Sample Set ................................................................................... 25 Tabel 7. Hasil Penambatan Molekular Sampel Uji ........................................................ 29 Tabel 8. Hasil Visualisasi Senyawa Uji dengan LigPlus ............................................... 30 Tabel 9. Perbandingan Hasil Penambatan Molekular dengan HKSA Sampel .............. 33 xv DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Alur Penelitian ...................................................................................... 38 Lampiran 2. Prosedur Kerja .................................................................................. 39 Lampiran 3. Hasil Penambatan Molekuler Dengan Autodockvina beserta Visualisasi Dengan Pymol (Kiri), dan Ligplot (Kanan) ...................... 59 Lampiran 4. Reseptor inhA yang Diunduh ............................................................... 66 xvi 1 BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Etil p-metoksisinamat (EPMS) adalah salah satu senyawa yang digunakan sebagai dasar senyawa tabir surya yaitu pelindung kulit dari sengatan sinar matahari. Etil p-metoksisinamat termasuk dalam golongan senyawa ester yang mengandung cincin benzena dan gugus metoksi yang bersifat nonpolar dan juga gugus karbonil yang mengikat etil yang bersifat sedikit polar sehingga dalam ekstraksinya dapat menggunakan pelarut-pelarut yang mempunyai variasi kepolaran yaitu etanol, etil asetat, metanol, air, dan heksana (Firdausi, 2009). Etil p-metoksi sinamat telah dilaporkan memiliki aktifitas larvicidal, nematicidal, antifungi, dan antikarsinogenik, serta menghambat aktifitas enzim monoaminoksidase. Senyawa EPMS dilaporkan dapat menghambat virulensi Mycobacterium tuberculosis H37Ra, H37Rv, dan isolat klinik pasien resisten MDR (Multidrug Resistant) dengan konsentrasi hambat minimum 242-485 μM. Sehingga menjadi pedoman dalam merancang senyawa baru dengan senyawa penuntun EPMS sebagai antituberkulosis yang potensial ( Laksamana et al, 2011). Tuberkulosis (TB) adalah penyakit pembunuh kedua setelah HIV/AIDS di dunia. Pada tahun 2013, 9 juta orang terserang TB dan 1.5 jutanya meninggal karena penyakit ini dan sekitar 480.000 orang mengalami multidrug resistant TB (MDR-TB). Di Indonesia, pada tahun 2013, sekitar 325.582 kasus TB baru dan terulang terjadi dengan 1.9% kasus MDR-TB (WHO, 2013). Tuberkulosis adalah penyakit menular langsung yang disebabkan oleh kuman TB (Mycobacterium tuberculosis). Sebagian kuman TB menyerang paru, tetapi dapat juga menyerang organ tubuh lainnya. Genus Mycobacterium merupakan kelompok bakteri Gram positif, berbentuk batang, berukuran lebih kecil dibandingkan bakteri lainnya. Genus ini mempunyai karakteristik unik karena dinding selnya kaya akan lipid, dan lapisan tebal peptidoglikan yang mengandung arabinogalaktan, lipoarabinomanan dan asam mikolat. Asam mikolat tidak biasa dijumpai pada bakteri dan hanya dijumpai pada dinding sel Mycobacterium dan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2 Corynebacterium. Bersifat tahan asam sehingga dikenal juga sebagai Basil Tahan Asam (BTA) (Anonim, 2008; depkes RI, 2007; and Poeloengan et. al, 2007). InhA, adalah enoil reduktase dari Mycobacterium tuberculosis dan bagian dari keluarga rantai pendek dehidrogenase/reduktase (SDR), mengkatalisis reduksi NADH-dependent dari rantai panjang trans-2-enoyl-Asam lemak ACP pada jalur biosintesis asam lemak tipe II dari Mycobacterium tuberculosis. NADH-Dependen enoil-ACP reduktase dikodekan oleh gen Inha Mycobacterium telah divalidasi sebagai target molekul utama dari garis depan isoniazid obat antitubercular (INH). Studi terbaru menunjukkan bahwa InhA juga target untuk baris kedua obat antituberkulosis etionamid (ETA). InhA mengkatalisis pengurangan rantai panjang trans-2-enoil-ACP di tipe II asam lemak jalur biosintesis dari Mycobacterium tuberculosis. Penghambatan InhA mengganggu biosintesis asam mikolat yang konstituen utama dari dinding sel mikobakteri (Kumar, 2011). Hubungan kuantitatif struktur kimia dan aktifitas biologis obat (HKSA) merupakan bagian penting rancangan obat, dalam usaha mendapatkan obat baru dengan aktifikas yang lebih besar, keselektifan yang lebih tinggi, toksisitas atau efek samping sekecil mungkin dan kenyamanan yang lebih besar. Selain itu dengan menggunakan model HKSA, akan lebih banyak menghemat biaya atau lebih ekonomis, karena untuk mendapatkan obat baru dengan aktifitas yang dikehendaki, faktor coba-coba ditekan sekecil mungkin sehingga jalur sintesis menjadi lebih pendek (Siswandono, 2008). Penambatan molekul atau Molecular docking adalah prosedur komputasional yang digunakan untuk memprediksi ikatan nonkovalen makromolekul, lebih sering, sebuah molekul besar (reseptor) dan sebuah molekul kecil (ligan) secara efisien, dimulai dari struktur-struktur yang tidak saling berikatan, struktur yang ditemukan dari simulasi dinamika molekul, homology modeling, dan lain-lain. Tujuan dari molecular docking adalah untuk memprediksi konformasi ikatan dan afinitas pengikatan (Yanuar, 2012). Pada penelitian ini dilakukan analisa hubungan kuantitatif struktur dan aktifitas (HKSA) senyawa nitrasi EPMS degan metode Hansch, yang dilanjutkan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3 dengan penambatan molekul terhadap reseptor inhA menggunakan software AutoDock Vina. 1.2 Rumusan Masalah a. Bagaimana hubungan struktur dan aktifitas biologis senyawa nitrasi EPMS terhadap aktifitas anti tuberkulosis melalui pendekatan Hansch. b. Apakah senyawa nitrasi EPMS aktif menghambat reseptor inhA sebagai anti tuberkulosis dengan metode penambatan molekular. c. Bagaimana interaksi senyawa nitrasi EPMS terhadap reseptor inhA sebagai anti tuberkulosis dengan metode penambatan molekular 1.3 Hipotesis a. Senyawa - senyawa nitrasi EPMS memiliki kemampuan yang berbeda terhadap aktifitas anti tuberkulosis. b. Senyawa - senyawa nitrasi EPMS dapat berinteraksi dengan reseptor inhA pada Mycobacterium tuberculosis sebagai anti tuberkulosis. 1.4 Tujuan Penelitian a. Melakukan analisa hubungan kuantitatif struktur dan aktifitas (HKSA) turunan senyawa EPMS terhadap aktifitas anti tuberkulosis. b. Mengetahui model interaksi senyawa turunan EPMS pada reseptor inhA Mycobacterium tuberculosis. 1.4 Manfaat Penelitian a. Sebagai informasi dalam perancangan obat anti tuberkulosis baru yang lebih potensial dalam menghambat Mycobacterium tuberculosis. b. Sebagai suatu informasi metode analisa HKSA Hansch dalam penelitian kimia komputasi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Etil P-Metoksisinamat (EPMS) Etil p-metoksisinamat (EPMS) adalah salah satu senyawa hasil isolasi rimpang kencur (Kaempferia Galanga L.) yang merupakan bahan dasar senyawa tabir surya yaitu pelindung kulit dari sengatan sinar matahari. EPMS termasuk dalam golongan senyawa ester yang mengandung cincin benzena dan gugus metoksi yang bersifat nonpolar dan juga gugus karbonil yang mengikat etil yang bersifat sedikit polar sehingga dalam ekstraksinya dapat menggunakan pelarutpelarut yang mempunyai variasi kepolaran yaitu etanol, etil asetat, metanol, air, dan heksana (Firdausi, 2009). Gambar 1. etil p-metoksi sinamat (Marvin Sketch) EPMS telah dilaporkan memiliki aktifitas larvicidal, nematicidal, antifungi, dan antikarsinogenik, serta menghambat aktifitas enzim monoaminoksidase. Lakshmanan et al, menyebutkan bahwa EPMS juga dapat menghambat virulensi M. tuberculosis. Sehingga menjadi pedoman untuk merancang senyawa baru dengan senyawa penuntun EPMS sebagai antituberkulosis yang potensial (Lakshmanan et al, 2011). 2.2 Mycobacterium tuberculosis 2.2.1 Karakteristik Bakteri Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang lurus atau sedikit melengkung, tidak berspora, dan tidak berkapsul. Bakteri ini berukuran lebar 0,3 – 0,6 μm dan panjang 1 – 4 μm. Dinding Mycobacterium tuberculosis sangat kompleks, terdiri dari lapisan lemak cukup tinggi (60%). Penyusun utama dinding sel UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 5 Mycobacterium tuberculosis ialah asam mikolat, lilin kompleks, dan trehalosa dimikolat yang disebut cord factor. Bakteri ini dibedakan dari sebagian besar bakteri dan mikobakteri lainnya karena bersifat patogen, dan dapat berkembang biak dalam sel fagosit hewan dan manusia. Pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis relatif lambat dibandingkan Mycobacterium lainnya. Mycobacterium tuberculosis tidak menghasilkan endotoksin maupun eksotoksin. Bagian selubung Mycobacterium tuberculosis mempunyai sifat pertahanan khusus terhadap proses mikobakterisidal sel hospes. Dinding sel yang kaya lipid akan melindungi mikobakteri dari proses fagolisosom, hal ini dapat menerangkan mengapa mikobakteri dapat hidup pada makrofag normal yang tidak teraktivasi (Handayani, 2008). Gambar 2. Mycobacterium tuberculosis Sumber: http://globalbiodefense.com/2014/11/14 Mycobacterium tuberculosis bersifat obligat aerob, sehingga hanya bisa hidup pada keadaan kandungan oksigen tinggi. Dalam es atau keadaan dingin, bakteri ini dapat bertahan selama bertahun-tahun, berada dalam keadaan dormant (tidak aktif). Pertumbuhannya dalam suatu medium pertumbuhan (juga dalam hewan) sangat lambat. Diperlukan waktu paling cepat dua belas jam bagi bakteri ini untuk menggandakan dirinya didalam medium kaya nutrisi. Konsentrasi lemak yang tinggi menyebabkan bakteri ini mempunyai sifat-sifat khusus, yaitu hidrofobik, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 6 tahan asam, impermeabel bila diwarnai, tahan serangan antibodi dan pertumbuhannya lambat (Pfyffer, G.B., 2003). Komponen antigen ditemukan di dinding sel dan sitoplasma, yaitu komponen lipid, polisakarida dan protein. Karakteristik antigen Mycobacterium tuberculosis dapat diidentifikasi dengan menggunakan antibodi monoklonal. Bakteri/basil ini cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada bakteri lainnya karena sifat hidrofobik permukaan selnya. Basil tuberkel resisten terhadap kekeringan dan bertahan hidup dalam waktu yang lama dalam sputum yang kering ( Jawetz et al., 2005 ). 2.2.2 Asam mikolat Asam mikolat merupakan asam lemak berantai panjang yang dihubungkan dengan arabinogalaktan oleh ikatan glikolipid, dan dengan peptidoglikan oleh jembatan fosfodiester. Unsur lain yang terdapat pada dinding sel bakteri adalah polisakarida sepereti arabinogalaktan dan arabinomanan. Struktur dinding sel yang kompleks tersebut menyebabkan bakteri Mycobacterium tuberculosis bersifat tahan asam, yaitu apabila sekali diwarnai akan tetap tahan terhadap upaya penghilangan zat warna tersebut dengan larutan asam – alkohol (Poeloengan et al, 2007). Asam mikolat merupakan konstituen utama dari dinding sel mikobakteri. Biosintesis asam mikolat dicapai melalui sintesis asam lemak Mycobacterium tuberculosis. Tidak seperti bakteri lain, Mycobacterium tuberculosis unik karena memiliki kedua tipe I dan tipe II lemak jalur biosintesis asam. Sisntesis asam lemak tipe I pada Mycobacterium tuberculosis bertanggung jawab untuk generasi asam lemak rantai alkil pendek jenuh, termasuk asam mikolat R-C24. Beberapa produk dari sisntesis asam lemak tipe I, seperti produk asam lemak C16-C26, kemudian dipindahkan ke jalur sisntesis asam lemak tipe II, di mana mereka diperpanjang hingga menjadi C56, membentuk rantai meromikolat yang berfungsi sebagai prekursor untuk asam mikolat akhir (Kumar et al, 2011). 2.2.3 inhA InhA, adalah enoil reduktase dari Mycobacterium tuberculosis dan bagian dari keluarga rantai pendek dehidrogenase / reduktase (SDR), mengkatalisis reduksi NADH-dependent dari rantai panjang Asam lemak trans-2-enoyl ACP pada jalur UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 7 biosintesis asam lemak tipe II dari Mycobacterium tuberculosis. NADHDependen enoil-ACP reduktase dikodekan oleh gen Inha Mycobacterium telah divalidasi sebagai target molekul utama dari garis depan isoniazid obat antituberkular (INH). Studi terbaru menunjukkan bahwa InhA juga target untuk obat antituberkular lini kedua, etionamid (ETA). InhA mengkatalisis reduksi rantai panjang trans-2enoil-ACP di tipe II asam lemak jalur biosintesis dari Mycobacterium tuberculosis. Penghambatan InhA mengganggu biosintesis asam mikolat sehingga mengganggu struktur dinding sel mikobakteri ( Kumar et al, 2011). 2.3 Tuberkulosis 2.3.1 Definisi Tuberculosis adalah penyakit menular langsung yang disebabkan oleh kuman TB (Mycobacterium tuberculosis). Sebagian kuman TB menyerang paru, tetapi dapat juga menyerang organ tubuh lainnya (Depkes RI, 2007). 2.3.2 Patofisiologi Paru merupakan jalan utama masuknya Mycobacterium tuberculosis melalui udara, yaitu dengan inhalasi droplet. Hanya droplet ukuran 1-5 mikron yang dapat melewati sistem mukosiliar saluran nafas, sehingga dapat mencapai dan bersarang di bronkiolus serta alveoli. Tuberkulosis primer terjadi pada individu yang terpapar pertama kali dengan basil tuberkulosis, sedangkan tuberkulosis paru kronik (reaktivasi atau pasca primer), adalah hasil reaktivasi infeksi tuberkulosis pada suatu fokus dorman yang terjadi beberapa tahun lalu. Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap reaktivasi belum dipahami secara keseluruhan (Handayani, S., 2008). Organ tubuh yang paling banyak diserang tuberkulosis adalah paru, beberapa penelitian menunjukkan adanya kenaikan limfosit alveolar, netrofil pada sel bronkoalveolar dan HLA-DR pada pasien tuberkulosis paru. Respon imunologik terhadap infeksi TB berupa imunitas seluler dan hipersensitiviti tipe lambat (delayed-type hypersensitivity). Apabila respons imun lemah atau gagal maka terjadi TB aktif pada individu yang terinfeksi. Imunitas seluler menyebabkan proliferasi limfosit T-cluster of differentition (CD4), dan memproduksi sitokin lokal sebagai respons terhadap antigen yang dikeluarkan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 8 Mycobacterium tuberculosis limfosit T helper 1 (Th1), yang mengaktifkan makrofag sedangkan limfosit T helper 2 (Th2) menambah sistesis antibodi humoral dan kemudian memproduksi sitokin lokal, tumor necrosing factor alfa (TNFa) dan interferon gamma (INFg). Sitokin akan menarik monosit darah ke lesi TB dan mengaktifkannya. Monosit aktif atau makrofag danlimfosit – TCD4 memproduksi enzim lisosim, oksigen radikal, nitrogen intermediate dan interleukin-2 (Ulrichs, at al, 2003). 2.3.3 Gambaran klinis TB paru primer biasanya terjadi pada usia muda. TB tersebut sering asimtomatik tanpa tanda-tanda klinis dan dapat menyebabkan penyakit demam ringan, eritema nodosum (lesi nyeri, garas berindurasi), dan sedikit efusi pleura. Kompresi bronkus oleh limfadenopati dapat menyebabkan mengi dan kadangkadang kolaps lobar diikuti bronkiektasis lanjut. TB pasca primer terjadi berbulan-bulang, dengan malaise, anoreksia, penurunan berat badan, keringat malam, dan batuk produktif. Sulit bernapas, nyeri dada, hemoptysis, dan limfadenopati servikal dapat terjadi. Tanda klinis pneumonia dan efusi pleura dapat terjadi (Ward JPT, 2007). 2.4 Isoniazid Pengobatan terhadap TB dimulai sejak 1940-an dengan streptomisin. Obat anti tuberkulosis pada saat ini digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu lini pertama dan lini kedua. Kelompok lini pertama, yaitu isoniazid, rifampisin, etambutol, streptomisin, dan pirazinamid. Secara umum kelompok lini pertama ini efektifitasnya tinggi, dan toksisitas dapat ditolerir. Kelompok lini kedua, adalah antibiotika golongan fluorokuinolon, sikloserin, etionamid, amikasin, kanamisin, kapreomisin, dan para aminosalisilat (Niemann, S. and Gerdes, S.R., 2003). Isoniazid, diperkenalkan pada tahun 1952, merupakan obat yang paling aktif untuk mengobati tuberkulosis yang disebabkan oleh strain-strain yang rentan. Isoniazid merupakan hidrazida dari asam isonikotinat, yang merupakan suatu molekul kecil, sederhana (MW 137) yang mudah larut dalam air. Secara invitro, isoniazid menghambat sebagian besar basil tuberkel pada konsentrasi 0,2 mp/mL atau kurang dan merupakan bakterisid untuk basil tuberkel UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 9 yang berkembang secara aktif melawan organisme-organisme yang berada ekstrasel maupun intrasel (Katzung, 2004). 2.4.1 Efek Antibakteri Isoniazid secara in vitro bersifat tuberkulostatik dan tuberkulosid dengan KHM (Kadar Hambat Minimun) sekitar 0,025-0,05 mcg/mL. Pembelahan kuman masih berlangsung 2 sampai 3 kali sebelum dihambat sama sekali. Efek bakterisidnya hanya terlihat pada kuman yang sedang tumbuh aktif. Mikroorganisme yang sedang ‖istirahat‖ mulai lagi dengan pembelahan biasa bila kontaknya dengan obat dihentikan. Pada uji hewan, ternyata aktifitas isoniazid lebih kuat dibandingkan streptomisin. Isoniazid dapat menembus sel dengan mudah (Katzung, 2004). 2.4.2 Mekanisme Kerja Dependen-NADH enoil-ACP reduktase dikodekan oleh gen Inha Mycobacterium telah divalidasi sebagai molekul target utama dari obat antituberkulosis lini pertama isoniazid (INH). Studi terbaru menunjukkan bahwa InhA juga target untuk lini kedua obat antituberkulosis etionamid (ETA). InhA mengkatalisis reduksi rantai panjang trans-2-enoil-ACP pada jalur biosintesis asam lemak tipe II dari Mycobacterium tuberculosis. Penghambatan InhA mengganggu biosintesis asam mikolat, yaitu konstituen utama dari dinding sel mikobakteri. Sebagai sebuah prodrug, INH harus diaktifkan oleh mikobakteri katalase-peroksidase KatG terbeih dahulu ke dalam bentuk aktif radikal asil nya. Produk tambahan yang dihasilkan dari ikatan kovalen dari INH aktif dengan InhA kosubstrat NADH, atau produk oksidasi NAD +, berfungsi sebagai InhA inhibitor poten. INH telah banyak diterapkan sebagai agen lini pertama untuk pengobatan tuberkulosis selama 40 tahun terakhir (Kumar, et al, 2011) . 2.4.3 Resistensi Resistensi terhadap isoniazid telah diasosiasikan dengan mutasi yang menghasilkan over-ekspresi dari inhA, yang mengkode suatu pembawa acyl protein reductase dependent-NADH, mutasi atau delesi dari katG, mutasi promotor menghasilkan over-ekspresi dari ahpC, sebuah gen virulence dugaan yang terlibat dalam proteksi sel dari stres oksidatif, dan mutasi kasA. Organisme UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 10 yang secara berlebihan memproduksi inhA menunjukan resistensi tingkat rendah dan resistensi-silang terhadap ethionamide. Mutan-mutan katG menunjukan resistensi tingkat tinggi isoniazid dan tidak menyebabkan resistensi-silang terhadap ethionamide (Katzung, 2004). 2.5 Hubungan Kuantitatif Struktur dan Aktifitas (HKSA) Pendekatan hubungan struktur dan aktifitas biologis mulai berkembang dengan pesat setelah tahun 1960-an, dengan dipelopori oleh Corwin Hansch dan kawan-kawan, yang menghubungkan struktur kimia dan aktifitas biologis obat melalui sifat-sifat kimia fisika umum seperti kelarutan dalam lemak, derajat ionisasi, atau ukuran molekul. Setelah itu, hubungan kuantitatif antara aktifitas biologis dan parameter yang menggambarkan perubahan sifat kimia fisika, yaitu parameter hidrofobik, elektronik dan sterik, pada suatu seri molekul, mulai dikembangkan secara lebih intensif. Hubungan atau korelasi yang baik digunakan untuk menunjang model interaksi obat-reseptor dan meramalkan jalur sintesis obat yang lebih menguntungkan (Siswandono, 2008). Hubungan kuantitatif struktur kimia dan aktifitas biologis obat (HKSA) merupakan bagian penting rancangan obat, dalam usaha mendapatkan obat baru dengan aktifikas yang lebih besar, keselektifan yang lebih tinggi, toksisitas atau efek samping sekecil mungkin dan kenyamanan yang lebih besar. Selain itu dengan menggunakan model HKSA, akan lebih banyak menghemat biaya atau lebih ekonomis, karena untuk mendapatkan obat baru dengan aktifitas yang dikehendaki, factor coba-coba ditekan sekecil mungkin sehingga jalur sintesis menjadi lebih pendek (Siswandono, 2008). 2.6 Model Pendekatan HKSA Hansch Hansch (1963), mengemukakan suatu konsep bahwa hubungan struktur kimia dengan aktifitas biologis (log 1/C )suatu turunan senyawa dapat dinyatakan secara kuantitatif melalui parameter-parameter sifat fisika kimia dari subsituen yaitu parameter hidrofobik (π), elektronik (σ), dan sterik (Es) yang terdapat pada molekul, yang dapat dinyatakan secara matematis sebagai persamaan berikut: Log A = aΣπ + bΣ σ + cΣ Es + d UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 11 Model pendekatan ini disebut juga model energi bebas linier (linier free energy relationship = LFER) atau pendekatan ekstratermodinamik. (Siswandono, 2008) 2.6.1 Parameter Sifat Kimia Fisika dalam HKSA Model Hansch Parameter sifat kimia fisika yang sering digunakan dalam HKSA model Hansch adalah parameter hidrofobik, elektronik dan sterik. Pada proses distribusi atau pengangkutan obat, penembusan membran biologis sangat dipengaruhi oleh kelarutan obat dalam lemak/air, suasana pH dan derajat ionisasi (pKa) sehingga dalam hubungan kuantitatif struktur dan aktifitas, parameter kimia fisika yang sering dilibatkan adalah parameter hidrofobik dan elektronik. Pada proses distribusi obat pengaruh sifat hidrofobik pada umumnya lebih besar dibanding sifat elektronik. a. Parameter hidofobik Parameter hidrofobik (lipofilik) yang sering digunakan dalam HKSA antara lain adalah logaritma koefisien partisi (log P), tetapan π Hansch, tetapan fragmentasi f Rekker-Manhold dan tetapan kromatogram Rm. b. Parameter elektronik Ada tiga jenis sifat elektronik yang digunakan dalam HKSA model Hansch, yaitu: pengaruh berbagai substituen terhadap reaktifitas bagian molekul yang tidak mengalami perubahan, sifat elektronik yang berkaitan dengan tetapan ionisasi (pKa) dan berhubungan dengan bentuk terionkan dan tak terionkan dari suatu senyawa pada pH tertentu, dan sifat oksidasi-reduksi atau reaktifitas senyawa. c. Parameter sterik Tetapan sterik substituent dapat diukur berdasarkan sifat meruah gugus-gugus dan efek gugus pada ontak obat dengan sisi reseptor yang berdekatan (Siswandono, 2008). 2.6.2 Analisis Statistik dalam HKSA Model Hansch Perhitungan statistik yang sering digunakan dalam hubungan struktur dan aktifitas melalui parameter-parameter kimia fisika adalah analisis regresi linier dan non linier. Untuk mengetahui hubungan kuantitatif antara struktur kimia dan aktifitas biologi melalui parameter kimia fisika, dapat dilakukan perhitungan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 12 statistic dengan bantuan computer, menggunakan program MICROSAT, ABSTAT, QSAR, STATGRAPHIC, STATISTIKA, SIGMASTAT, SPSS atau program statistic yang lain (Siswandono, 2008). 2.7 Penambatan Molekul Molecular docking atau penambatan molekul adalah prosedur komputasional yang digunakan untuk memprediksi ikatan nonkovalen makromolekul, lebih sering, sebuah molekul besar (reseptor) dan sebuah molekul kecil (ligan) secara efisien, dimulai dari struktur-struktur yang tidak saling berikatan, struktur yang ditemukandari simulasi dinamika molekul, homology modeling, dan lain-lain. Tujuan dari molecular docking adalah untuk memprediksi konformasi ikatan dan afinitas pengikatan (Yanuar, 2012). Pediksi pengikatan molekul kecil pada protein penting karena data tersebut digunakna untuk screening database virtual molekul mirip obat untuk menentukan senyawa penuntun untuk pengembangan obat selanjutnya. Docking dapat juga digunakan untuk mencoba memprediksi konformasi ikatan dari pengikat yang diketahui, ketika percobaan seluruh struktur tidak tersedia (Yanuar, 2012). 2.8 Interaksi Ikatan Pada umunya, ikatan obat-reseptor bersifat reversibel sehingga obat segera meninggalkan reseptor bila kadar obat dalam cairan luar sel menurun. Untuk ini ikatan yang terlibat pada interaksi obat reseptor harus relative lemah, tetapi masih cukup kuat untuk berkopetensi dengan lain-lain ikatan dengan tempat kehilangan (site of loss) (Siswandono, 2008). Pada interaksi obat dengan reseptor, senyawa dapat menggabungkan beberapa ikatan yang lemah, seperti ikatan hidrogen, ion, dipol-dipol, transfer muatan, hidrofob, dan ikatan van der Waal‘s, sehingga secara total menghasilkan ikatan yang cukup kuat dan stabil. Untuk suatu tujuan tertentu, missal diinginkan efek berlangsung lama dan ireversibel, seperti pada obat antibakteri dan antikanker, diperlukan ikatan yang lebih kuat yaitu ikatan kovalen (Siswandono, 2008). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 13 2.8.1 Ikatan Ion Ikatan ion adalah ikatan yang dihasilkan oleh daya tarik menarik elektrostatik antara ion=ion yang muatannya berlawanan. Kekuatan tarik menarik akan semakin berkuran bila jarak antara ion-ion bermuatan semakin jauh dan pengurangan tersebut berbanding terbalik dengan jaraknya (Siswandono, 2008). Makromolekul dalam sistem biologis yang berfungsi sebagai komponen reseptor mengandung gugus protein dan asam nukleat yang bervariasi, mempunyai gugus kation dan anion potensial tetapi hanya beberapa saja yang dapat terionisasi pada pH fisiologis. Gugus kation protein berupa gugus amino yang terdapat pada asam-asam amino, seperti lisin, glutamin dan asparagine. Gugus anion protein berupa gugus karboksilat, misal pada asam aspartate dan asam glutamate, gugus sulfhidril, missal pada sistein dan metionin dan gugus fosforil, missal pada asam nukleat (Siswandono, 2008). 2.8.2 Ikatan Hidrogen Ikatan hidrogen adalah sutau ikatan antara atom H yang mempunyai muatan positif parsial dengan atom lain yang bersifat elektronegatifan dan mempunyai sepasang elektron bebas dengan oktet lengkap, seperti O, N, dan F. Atom yang bermuatan positif parsial dapat berinteraksi dengan atom negatif parsial dari molekul atau atom lain yang berbeda ikatan kovalennya dalam satu molekul. Ikatan hidrogen pada umumnya terjadi pada senyawa yang mempunyai gugusgugus seperti OH…O, NH…O, NH…N, NH…F, dan OH…F (Siswandono, 2008). Ikatan hidrogen ada dua, yaitu ikatan hidrogen intramolekul, ikatan hidrogen yang terjadi dalam satu molekul, dan ikatan hidrogen intermolekul, ikatan hidrogen yang terjadi antara molekul-molekul. Kekuatan hidrogen intermolekul lebih lama dibanding ikatan hidrogen intramolekul. Ikatan hydrogen dapat mempengaruhi sifat-sifat kimia fisika senyawa, seperti titik didih, titik lebur, kelarutan dalam air, kemampuan pembentukan kelat, dan keasaman. Perubahan sifat-sifat tersebut dapat berpengaruh terhadap aktifitas biologis senyawa (Siswandono, 2008). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 14 2.8.3 Interaksi Van Der Waal‘s Ikatan van der Waal‘s merupakan kekuatan tarik-menarik antar molekul atau atom yang tidak bermuatan, dan letaknya berdekatan atau jaraknya ±4-6 A. Ikatan ini terjadi karena sifat kepolarisasian molekul atau atom. Meskipun secara individu lemah tetapi hasil penjumlahan ikatan van der Waal‘s merupakan faktor pengikat yang cukup bermakna, terutama untuk senyawa-senyawa yang mempunyai berat molekul tinggi. Ikatan van der Waal‘s terlibat pada interaksi cincin benzen dengan daerah bidang datar reseptor dan pada interaksi rantai hidrokarbon dengan makromolekul protein atau reseptor (Siswandono, 2008). 2.8.4 Interaksi Dipol-Dipol Adanya perbedaan keelektronegatifan atom C dengan atom yang lain, seperti O dan N, akan membentuk distribusi elektron tidak simetrik atau dipol, yang mampu membentuk ikatan dengan ion atau dipol lain, baik yang mempunyai daerah kerapatan elektron tinggi maupun yang rendah. Gugus-gugus yang mempunyai fungsi dipolar antara lain adalah gugus karbonil, ester, amida, eter, dan nitril. Gugus-gugus tersebut sering didapatkan pada senyawa berstruktur spesifik (Siswandono, 2008). 2.8.5 Ikatan Kovalen Ikatan kovaeln terbentuk bila ada dua atom saling menggunakan sepasang elektron secara bersama-sama. Ikatan kovalen merupakan ikatan kimia yang paling kuat dengan rata-rata kekuatan 100 kkal/mol. Dengan kekuatan ikatan yang tinggi ini, pada suhu normal ikatan bersifat ireversibel dan hanya pecah bila adapengaruh katalisator enzim tertentu. Interaksi obat-reseptor melalui ikatan kovalen menghasilkan kompleks yang cukup stabil, dan sifat ini dapat digunakan untuk tujuan pengobaan tertentu (Siswandono, 2008). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 15 BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1. Tempat Penelitian dilaksanakan bertempat di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK) Universita Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Serpong. 3.1.2. Waktu Penelitian dilaksanakan selama program komputasi dijalankan pada bulan Febuari dan Maret 2015. 3.2. Alat 3.2.1. Perangkat keras Notebook Compac (Serial CNF02588L3) dengan spesifikasi Intel® Core ™ i5 CPU M 450 @ 2.40GHz 2.40GHz, RAM (Random Access Memory) 2.00 gigabyte, dan jenis system 32-bit Operating System, x64-based processor, Notebook terhubung dengan AC/DC adapter dan terkoneksi internet. 3.2.2. Perangkat lunak Sistem operasi menggunakan Windows 8 Pro, Autodock Tools, Python 2.5.2 dan MGLTools 1.5.6 (Scripps Research Institute), Discovery Studio 3.5 Visualizer (Accelrys Enterprise Platform), Open Babel 2.3.2, Autodock Vina, Pymol (De Lano Scitientific (http://www.chemaxon.com), LLC), LigPlot, CDK Marvin Sketch Descriptor 5.5.1.0 Calculator (http://rguha.net/code/java/cdkdesc.html), Microsoft Exel, Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb). 3.3. Bahan 3.3.1. Struktur Nitrasi EPMS Ligan yang digunakan adalah ligan dari nitrasi etil p-metoksisinamat (EPMS) yang telah beikatan dengan NAD+, dan kontrol positif isoniazid dibuat dengan Marvin Sketch 5.5.1.0 dengan format.sdf. Senyawa nitrasi EPMS yang digunakan ada 6, yaitu 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde, 3-nitrocinnamic acid, 4- UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 16 nitrocinnamic acid, 4-nitrophenyl 4-coumarate, (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐N,N‐ dioxoprop‐2‐enamide, dan (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐ 2‐enamide, yang dibuat dengan MarvinSketch. 3.3.2. Struktur Tiga Dimensi (3D) inhA Makromolekul protein yang dipilih adalah inhA. Struktur tiga dimensi inhA diunduh dari Bank Data Protein melalui situs http://www.rcsb.org/pdb dan diunggah dengan format text (gz) atau .pdb. Protein dengan identitas 1ZID yang berasal dari organisme Mycobacterium tuberculosis. 3.4. Cara kerja 3.4.1. Hubungan kuantitatif struktur aktifitas model Hansch Hubungan kuantitatif struktur dan aktifitas diperoleh dengan menggunakan program CDK Descriptor. Data senyawa disimpan dalam bentuk Microsoft Exel. Browse input file dengan nama senyawa yang akan diuji dengan format .mol . Pada kolom output tentukan nama dan lokasi file hasil. 3.4.1.1. Pemilihan Deskriptor Descriptor yang dipakai ada tiga jenis, yaitu LogP dan Harary Index, dari program Marvin Sketch, serta Charged Partial Surface Areas (CPSA) dari program CDK Deskriptor. Dengan menggunakan Marvin sketch, senyawa yang diuji diubah dalam bentuk aromatis dan dibersihkan secara 3 dimensi, lalu pilih calculating → partition → LogP untuk memperoleh nilai logP. Selanjutnya, untuk nilai sterik pilih calculating → geometrical → Topology Analysis → Harary Index → ok. Untuk memperoleh nilai elektronik, menggunakan program CDK Deskriptor, pada folder electroni → Charged Partial Surface Areas. Kemudian semua data yang diperoleh disatukan dalam Microsoft exel sesuai kelompok masing-masing set. 3.4.1.2. Senyawa Training Set, Test Set dan Sample Set Dari 10 senyawa turunan sinamat dan EPMS yang diperoleh dari referensi, 5 senyawa untuk training set, dan 5 senyawa lainnya untuk test set. (Guzman, 2014). Sedangkan untuk sample set, digunakan 6 senyawa nitrasi EPMS yang akan diuji aktifitasnya, sekaligus dijadikan sebagai ligan penambatan. Dua UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 17 senyawa terakhir dari sample set adalah senyawa yang dirancang sendiri dan diberi nama secara IUPAC, dan sisanya diambil dari refensi yang sama dengan training set dan test set. Senyawa yang diambil dari referensi ini adalah senyawa yang telah disintesis dan telah diujikan kepada Mycobacterium tuberculosis secara in vivo dan menghasilkan nilai MIC (Minimum Inhibit Concentration) Data digunakan untuk memperoleh regresi HKSA. Tabel 1. Senyawa Training Set No Nama Senyawa 1 Ehretiolide 2 4-O-prenylcoumaric acid MIC Struktur (uM) 41 86.1 3 3-coumaric acid 366 4 4-coumaric acid 244 5 EPMS 242 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 18 Tabel 2. Senyawa Tes Set No Nama Senyawa MIC (uM) 1 4-O-geranylcoumaric acid 66.8 2 3-O-prenylcoumaric acid 172 3 3,4-methylenedioxycinnamic acid 312 4 4-coumaric acid 244 5 Trans-cinnamic acid 270 Struktur UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 19 Tabel 3. Senyawa Sample Set No Nama Senyawa 1 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde 2 3-nitrocinnamic acid 3 4-nitrocinnamic acid 4 4-nitrophenyl 4-coumarate 5 (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐N,N‐ dioxoprop‐2‐enamide 6 (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐ dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐ enamide Struktur 3.4.1.3. Menyingkirkan Outlier Pada training set, jika terdapat suatu data yang jauh menyimpang dibandingkan data-data lainnya, maka data ini dapat dihilangkan atau diabaikan dari hasil untuk menghasilkan nilai regresi yang baik. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 20 3.4.1.4. Menilai Kualitas Persamaan HKSA Dari masing-masing hasil training set, test set, dan sample set, analisa hasil regresi dan penyimpangan data dari nilai r2, rata-rata data SD (Root mean square deviation), dan RMSD (Root mean square deviation). 3.4.2. Penambatan Molekul dengan Autodock Vina 3.4.2.1. Penyiapan struktur molekul resptor inhA Pengunduhan makromolekul inhA dari Bank Data Protein melalui situs http://www.rcsb.org/pdb/. Identitas molekul yaitu 1ZID. Data makromolekul diunduh dalam format text (gz). 3.4.2.2. Optimasi Makromolekul Makromolekul protein yang telah diunggah, dipisahkan dari ligan dan molekul air. Pemisahan menggunakan Discovery Studio 3.5 Setelah dipisahankan, kemudian simpan dalam format .pdb. Lalu dilakukan ditambahkan hydrogen menggunakan Autodock Tool (edit → Hydrogens → add) dan disimpan dalam format .pdb 3.4.2.3. Menentukan Lokasi Penambatan Molekul – Ligan Penentuan lokasi penambatan molekul dilakukan berdasarkan jurnal referensi dengan menggunakan Autodock Tools. Pengaturan dilakukan dengan grid box (grid → grid box) yang meliputi ukuran (size x, y, z), kordinat (center x, y, z) dan, besarnya ukuran (amstrong) dan disimpan (file → close saving current). 3.4.2.4. Penyiapan Struktur Tiga Dimensi (3D) Ligan Ligan yang digunakan adalah isoniazid diunggah melalui PubChem (http://PubChem.ncbi.blm.nih.gov) sebagai pembanding dan senyawa nitrasi EPMS yang dibuat dengan menggunakan Marvin Sketch yang disimpan dengan format .pdb. 3.4.2.5. Optimasi Ligan Struktur ligan yang telah dibuat, kemudian dioptimasi dengan menggunakan Autodock Tools. Kemudian, ligan yang telah dibuat (ligand → input → open), disimpan dalam bentuk .pdbqt (ligand → output → save as pdbqt →save). Ligan dan Protein yang telah tersimpan dalam format .pdbqt dikopi atau dipindah kedalam folder Vina. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 21 3.4.2.6. Penambatan Molekul Penambatan molekul diilakukan dengan AutoDock Vina. Kedalam folder vina disediakan file-file reserptor, ligan, vina, conf.txt, vina_split. reseptor, ligan, conf.txt, vina, vina_license, dan vina split. Pada file conf.txt, diisi gridbox sesuai pengaturan dengan size 70x70x70, dan autocenter. Penambatan dimulai dengan membuka program Command Prompt, dan ditulis perintah sebagai berikut: Vina --config conf.txt --log log.txt 3.4.2.7. Visualisasi Hasil Penambatan Molekul Hasil kalkulasi penambatan dilihat pada output dalam format out.pdbqt atau bentuk notepad. Hasil penambatan diperoleh dengan memilih ligan yang memiliki energi ikatan yang paling rendah, nilai ikatan dapat dilihat pada file ‗log.txt‘. Posisi ligan-ligan pada makromolekul divisualisasikan dengan perangkat lunak PyMol untuk melihat kecocokan bentuk dan volume antara ligan dan situs tambatanya. Makromolekul dan output dalam bentuk .pdbqt dibuka dengan menggunakan Wordpad. Kopi isi dalam output.pdbqt dan tambahkan kedalam makromolekul dan simpan dalam format .pdb. Visualisi interaksi makromolekul dan ligan dengan menggunakan Ligplot untuk melihat kekuatan interaksi dan ikatan pada asam amino dalam bentuk dua dimensi dan masukan file .pdb (output makromolekul dan ligan). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 22 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hubungan Kuantitatif Struktur Aktifitas Model Hansch Merumuskan hubungan kuantitatif sementara antara struktur – aktifitas biologis dari senyawa yang jumlahnya terbatas dengan menggunakan statistik analisa regresi. 4.1.1 Pemilihan Deskriptor. Parameter sifat kimia fisika yang sering digunakan dalam HKSA model Hansch adalah parameter hidrofobik, elektronik dan sterik. (Siswandono, 2008). Pada penelitian ini dipilih satu deskriptor yang menggambarkan masingmasing parameter model HKSA Hansch. Pada penelitian ini, dipilih koefisien partisi (log P) untuk parameter hidrofobik (lipofilik), CPSA (Charged Partial Surface Areas) untuk parameter elektronik, dan Harary Index untuk parameter sterik. Program komputer yang digunakan untuk memperoleh nilai HKSA ini adalah CDK Descriptor, yang digunakan untuk mencari nilai CPSA, dan Marvinskecth , digunakan untuk mencari nilai LogP dan Harary Index. Untuk memperoleh nilai elektronik, menggunakan program CDK Descriptor, pada folder electronic → Charged Partial Surface Areas → Go. Dengan menggunakan Marvin sketch, senyawa yang diuji diiubah dalam bentuk aromatis dan dibersihkan secara 3 dimensi, lalu pilih calculating → partition → LogP untuk memperoleh nilai logP. Selanjutnya, untuk nilai sterik pilih calculating → geometrical → Topology Analysis → Harary Index → ok. Untuk setiap nilai deskriptor yang diperoleh, masing-masing dikelompokkan pada senyawanya membentuk kelompok training set, test set, dan sample set. 4.1.2 Training Set Training set menggunakan 5 senyawa turunan asam sinamat yang telah diketahui aktifitas anti tuberkulosisnya terhadap bakteri spesies Mycobacterium tuberculosis UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 23 H37Rv. Pemilihan data training set maupun test set didasarkan pada kemiripan struktur senyawa dari data yang tersedia. Training set ini digunakan untuk memperoleh persamaan HKSA model Hansch. Tabel 4. Hasil HKSA Training set. N Nama Senyawa o MIC Log (uM) MIC LogP Log Log CPSA Sterik Log MIC Uji MIC Uji (uM) 1 4-O-geranylcoumaric acid 66.8 1.824 5.3 2.431 1.821 1.826 66.989 2 3-O-prenylcoumaric acid 172 2.235 3.4 2.329 1.674 2.233 171.230 4 4-coumaric acid 244 2.387 1.67 2.095 1.459 2.386 243.311 5 Trans-cinnamic acid 270 2.431 1.94 2.166 1.399 2.432 270.733 312 2.494 1.63 2.166 1.580 2.495 313.130 3 3,4-methylenedioxycinnamic acid Persamaan Hansch yang diperoleh: Log MIC = a logP + b LogCPSA + c LogSterik + d Log MIC = -0.2909LogP+1.6411LogCPSA-0.1497Log sterik0.3491 R2=0.999964 Dari persaman yang diperoleh diatas, deskriptor (variabel) dari parameter fisika kimia Log CPSA (elektronik), Log P (koefisien partisi), dan Log Sterik (sterik) berpengaruh terhadap aktifitas anti tuberculosis secara linier. Persamaan diatas, digunakan untuk mecari nilai MIC uji, dengan memasukkan nilai LogP, LogCPSA, dan Log Sterik. Hasil nilai MIC uji atau prediksi yang diperoleh masing-masing senyawa sudah mendekati nilai MIC sebenarnya (in vitro). Nilai R2=0.999964 menunjukan nilai hubungan linearitas antara parameter sifat fisika kimia struktur senyawa tehadap aktifitas anti tuberkulosis. Nilai r2 harus ≤1, dan nilai r2 dapat diterima dengan nilai diatas 0,8 (80%), jadi nilai r2 yang diperoleh dari persamaan diatas dapat diterima (Rivai, 2014). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 24 4.1.3 Test Set Test set juga menggunakan 5 senyawa turunan asam sinamat yang telah diketahui aktifitas anti tuberkulosisnya terhadap bakteri spesies Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Test set bertujuan untuk menilai dan memvalidasi persamaan HKSA model Hansch yang dihasilkan dari training set yang dilihat dari nilai RMSD (Root Mean Square Deviation). Menggunakan persamaan yang diperoleh dari training set, didapatkan nilai MIC uji test set dengan memasukkan nilai LogP, Log CPSa, dan Log Sterik masing-masing senyawa test set. Kemudian dihitung perbedaaan MIC uji dengan MIC in vitro dengsn nilai Standar Deviation (SD) dan Root Mean Square Deviation (RMSD). Tabel 5. Hasil HKSA Test Set. N o Nama Senyawa MIC Log (uM) MIC Log Log Log MIC Uji LogP CPSA Sterik MIC Uji (uM) SD SD^2 1 Ehretiolide 41 1.612 8.73 2.659 2.363 1.122 13.244 -0.490 0.240 2 4-O-prenylcoumaric acid 86.1 1.935 3.4 2.351 1.669 2.270 186.591 0.335 0.112 3 3-coumaric acid 366 2.563 1.67 2.095 1.461 2.385 243.134 -0.177 0.031 4 4-coumaric acid 244 2.387 1.67 2.095 1.459 2.386 243.311 -0.001 1.51 5 EPMS 242 2.383 2.41 2.413 1.595 2.670 468.755 0.287 0.082 Total SD^2 0.467 RMSD (%) Nilai RMSD yang diperoleh dari nilai Log MIC in vitro dan Log MIC uji: SD = Log MIC uji – Log MIC in vitro RMSD diperoleh dengan Microsoft Exel dengan formula (=SQRT(∑SD2)) Hasil RMSD yand diperoleh dari test set adalah 0.683% dimana masih dalam rentang nilai yang dapat diterima yaitu lebih kecil atau sama dengan 2%. Hal ini membuktikan bahwa nilai RMSD masih dapat diterima dan persamaan linear yang diperoleh dinyatakan akurat. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 0.683 25 4.1.4 Sample Set Senyawa uji dibuat dengan menggunakan program Marvin sketch. Sample set adalah senyawa nitrasi EPMS yang sudah ada disintesis tetapi belum ada data pengujian terhadap Mycobacterium tuberculosis, sehingga menjadi dasar untuk mengetahui aktivitasnya terhadap bakteri tersebut. Senyawa uji yang digunakan yaitu, 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde, 3-nitrocinnamic acid, 4-nitrophenyl 4coumarate, 4-nitrocinnamic acid, (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐ enamide, (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide. Nilai MIC prediksi senyawa uji (sampel) diperoleh dengan memasukkan nilai Alog P, Log CPSA, dan Log Sterik sampel set ke dalam persamaan HKSA yang diperoleh sebelumnya. Dari persamaan, diperolehlah nilai MIC uji atau prediksi sampel. Tabel 6. Hasil HKSA Sample Set. 1 4-nitrophenyl 4-coumarate 3.41 2.304 1.821 Log MIC Uji 2.167 2 3-nitrocinnamic acid 1.9 2.018 1.564 2.176 150.111 1.59 2.048 1.839 2.274 188.181 No Nama Senyawa ALogP Log Log CPSA Sterik MIC Uji (uM) 147.035 (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐ 3 dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐ enamide 4 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde 2.48 2.184 1.573 2.278 189.929 5 4-nitrocinnamic acid 1.9 2.158 1.560 2.406 255.09 1.66 2.235 1.601 2.596 394.664 6 (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐N,N‐ dioxoprop‐2‐enamide Dari data diatas, nilai MIC uji prediksi terhadap Mycobacterium tuberculosis berturut-turut dari yang paling kecil adalah 4-nitrophenyl 4-coumarate (147.035 uM), 3-nitrocinnamic acid (150.111 uM), (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl)‐ N,N‐dioxoprop‐2‐enamide (188.181 uM), 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde (189.929 uM), 4-nitrocinnamic acid (255.09 uM), (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐ N,N‐dioxoprop‐2‐enamide (394.664 uM). Hal ini menunjukan bahwa dari sampel UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 26 yang diuji, senyawa yang memiliki MIC terendah adalah 4-nitrophenyl 4coumarate dengan MIC=147.035 uM dan diprediksi sebagai senyawa yang paling tinggi aktifitasnya sebagai anti tuberkulosis. Dibandingkan dengan senyawa lead compound EPMS dengan aktifitas 242 uM dan asam sinamat 270 uM, terdapat 4 dari 6 senyawa uji memiliki prediksi aktifitas anti tuberkulosis yang lebih baik (MIC lebih rendah), yaitu 2-nitro-4methylcinnamaldehyde (189.929 uM), 3-nitrocinnamic acid (150.111 uM), 4nitrophenyl 4-coumarate (147.035uM), dan (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐ dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide (188.181uM). Dibandingkan dengan senyawa 3-coumaric acid (243.13 uM), senyawa 3nitrocinnamic acid (150.11 uM) memiliki nilai MIC uji prediksi yang lebih rendah, sehingga menunjukan bahwa perubahan gugus hidroksi (OH) pada rantai samping senyawa asam kumarat menjadi nitro (NO2), pada posisi yang sama yaitu meta, meningkatkan aktifitas anti tuberkulosis senyawa turunan asam sinamat. Berdasarkan struktur molekul, senyawa 3-nitrocinnamic acid (150.111 uM) dan 4-nitrocinnamic acid (255.09 uM) hanya terdapat perbedaan letak gugus nitro (NO2) pada cincin aromatis, namun 3-nitrocinnamic acid memiliki MIC uji lebih rendah dan affinitas yang lebih rendah juga, sehingga dianggap memiliki aktifitas antituberkulosis yang lebih baik dibanding 4-nitrocinnamic acid. 4.2 Penambatan Molekul dengan Autodock Vina 4.2.1 Penyiapan Ligand Ligand yang digunakan adalah senyawa uji yang telah berikatan dengan NAD+, karena mengikuti mekanisme kerja Isoniazid yang berikatan dengan NAD+ membentuk INADH sebelum berikatan pada reseptor inhA dan menimbulkan aktifitas. (Stigliani et al, 2008). Sedangkan kontrol positif Isoniazid diambil dari situs PubChem. Selanjutnya, senyawa-senyawa uji tersebut diubah menjadi bentuk aromatis dan dibersihkan secara 3 dimensi. Optimasi ligand dilakukan dengan AutoDockTools dengan cara mengatur torsi, dan mengubah formatnya menjadi .pdbqt. Berikut adalah contoh gambar struktur sampel yang telah beikatan: UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 27 Gambar 3. NAD+ (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) Gambar 4. 4-nitrophenyl 4-coumarate-NAD+ (Marvin Sketch) 4.2.2 Penyiapan Reseptor Reseptor yang digunakan adalah inhA (PDB:1ZID) yang diunggah dari situs Protein Data Bank http://www.rcsb.org/pdb. Reseptor dioptimasi dengan program Discovery studio menghilangkan ligand-ligand yang masih ada berikatan pada reseptor, Scripts – Selections – Select Ligand – delete. Selanjutnya menghilangkan molekul air agar tidak mengganggu penambatan dan agar pada saat penambatan, dan hanya ligang uji lah yang akan menambat, Scripts – Selection – Select Water Molekules – delete. Selanjutnya penambahan molekul hidrogen dengan AutoDock Tools , Edit – Hidrogen – Add, dan disimpan dalam format .pdbqt. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 28 Gambar 5. Reseptor 1ZID (http://www.rcsb.org/pdb) 4.2.3 Penambatan Molekular Molecular docking atau penambatan molekul adalah prosedur komputasional yang digunakan untuk memprediksi ikatan nonkovalen makromolekul, lebih sering, sebuah molekul besar (reseptor) dan sebuah molekul kecil (ligan) secara efisien, dimulai dari struktur-struktur yang tidak saling berikatan, struktur yang ditemukandari simulasi dinamika molekul, homology modeling, dan lain-lain. Tujuan dari molecular docking adalah untuk memprediksi konformasi ikatan dan afinitas pengikatan. (Arry yanuar, 2012) Sebelum memulai penambatan, pada folder vina harus sudah ada file-file reseptor (1ZID.pdbqt), ligan (2-nitro-4-methylcinnamaldehyde.pdbqt), conf.txt, vina, vina_license, dan vina split. Pada file conf.txt, diisi gridbox sesuai pengaturan dengan size 70x70x70, dan autocenter. Penambatan dimulai dengan membuka program Command Prompt, dan ditulis perintah sebagai berikut. Vina –config conf.txt –log log.txt Setelah proses penambatan selesai maka akan muncul file baru yang berisi nilai hasil penambatan molekul setiap sampel uji, lalu dari 9 nilai yang muncul dari masing-masing sampel, diambil nilai pertama yang dianggap paling baik. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 29 Tabel 7. Hasil Penambatan Molekular Sampel Uji. No Nama Sampel Affinitas (kcal/mol) 4 4-nitrophenyl 4-coumarate -11.2 1 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde -10.9 2 3-nitrocinnamic acid -10.5 5 (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide -10.2 6 (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐ -9.6 2‐enamide 3 4-nitrocinnamic acid -9.2 7 Isoniazid (INH) -10.5 Hasil penambatan molekuler adalah afinitas ikatan antara ligan dengan reseptor yang dinyatakan dengan energi bebas Gibb. Nilai affinitas yang muncul adalah nilai entalpi energi Gibb, dimana nilai (-) < 0 menunjukan reaksi eksotermik yang melepaskan panas. (Bresnick, 2004). Dari hasil penambatan molekul, senyawa yang memiliki affinitas energi yang paling rendah adalah 4-nitrophenyl 4-coumarate dengan -11.2 kcal/mol, diikuti oleh 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde -10.9 kcal/mol, 3-nitrocinnamic acid -10.5 kcal/mol, (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide -10.2 kcal/mol, (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐2‐enamide -9.6 kcal/mol, dan 4-nitrocinnamic acid -9.2 kcal/mol. Sedangkan kontrol positif INH memiliki affinitas energy -10.5 kcal/mol. Nilai affinitas energi yang rendah menunjukan ikatan yang stabil, sehingga, semakin rendah nilai affinitas, maka semakin stabil dan lebih tidak reaktif (energi yang dimaksud adalah energi bebas dari Gibb, G. (Bresnick,2004) Dari data diatas, maka ligan (senyawa uji) yang memiliki nilai affinitas yang paling rendah dan ikatan yang paling stabil dengan reseptornya adalah 4nitrophenyl 4-coumarate. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 30 4.2.4 Visualisasi Hasil Penambatan Molekul Visualisasi docking dilakukan dengan menggunaka program PyMol dan LigPlot. PyMol bertujuan untuk melihat posisi ligand di dalam situs tambatnya pada reseptor secara tiga dimensi, sedangkan LigPlus bertujuan untuk memperoleh ikatan ligand dengan asam amino – asam amino yang terdapat pada reseptor serta jarak masing-masing ikatan tersebut. Tabel 8. Hasil Visualisasi Senyawa Uji dengan LigPlus. No Nama Senyawa Nama Asam Amio Jarak (Å) 1 4-nitrophenyl 4-coumarate Ser94 2.94 Gly96 2.81 Thr39 3.08 Ile15 2.67 Gly14 2.87 Val65 2.94 2-nitro-4- Lys165 2.84 methylcinnamaldehyde Thr196 3.12 Ala22 2.94 Met147 3.29 Val65 2.99 Asp64 3.34 Gly14 3.04 Thr196 2.79 Leu63 3.15 Gly14 2.96 Ser94 2.72 Thr196 3.17 Gly96 2.88 2 3 4 3-nitrocinnamic acid Isoniazid (INH) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 31 (Sambungan) 5 (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐N,N‐ Met147 3.08 Lys165 3.02 Gly96 2.96 Thr196 2.98 Lys118 3.05 (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐ Arg153 2.95 dinitrophenyl)‐N,N‐dioxoprop‐ Asp150 2.50 2‐enamide Gln267 2.97 Ile21 3.01 Thr196 2.97 Asp148 3.04 Gln100 3.24 Met98 2.79 Gly96 2.83 dioxoprop‐2‐enamide 6 7 4-nitrocinnamic acid Dari hasil visualisali dengan Ligplot dapat ditarik kesimpulan bahwa, perubahan molekul senyawa yang berikatan dengan NAD+ menimbulkan perubahan konformasi ligand (ikatan molekul dengan NAD+) dalam situs tambat reseptor, sehingga mengakibatkan perbedaan jenis dan jumlah ikatan yang terbentuk dengan residu asam amino reseptor. Dari data diatas, terlihat bahwa semua sampel uji memiliki interaksi dengan reseptor yang terlihat dari sam amino yang terikat. Sampel uji mengikat 3 – 6 asam amino reseptor secara bervariasi, sedangkan kontrol positif INH berikatan dengan 5 asam amino. Semakin banyak ikatan ligand dengan asam amino reseptor, serta semakin dekat jarak antara ikatan tersebut, maka ikatan yang dihasilkan akan semakin kuat. Senyawa uji yang memiliki afinitas terbaik (-11.2 kcal/mol), 4-nitrophenyl 4coumarate mengikat 6 asam amino, dan 3 diantaranya adalah asam amino yang sama diikat oleh kontrol positif INH yaitu Ser94, Gly96, dan Gly14. Senyawa uji dengan affinitas ke-2, 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde (-10.9 kcal/mol) mengikat 1 asam amino yang sama dengan INH yaitu Thr196 dengan jarak ikatan yang UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 32 lebih dekat. Sedangkan senyawa uji dengan affinitas yang sama dengan kontrol positif INH (-10,5kcal/mol), 3-nitrocinnamic acid mengikat 2 asam amino yang sama dengan INH yaitu Gly14, dan Thr196. Tamires C. at all (2014), menyebutkan dalam penelitiannya bahwa gugus ribose pada adenine dan pyrophosphate pada isoniazid+NADH (INADH) berpengaruh secara kuat terhadap interaksi INADH dengan inhA. Ia juga menyebutkan bahwa, ikatan hidrogen memiliki peran penting dalam perhitungan nilai energi ikatan residu terhadap INADH, serta interaksi hidrofobik secara signifikan berkontribusi pada beberapa residu asam amino yang penting, diantaranya adalah Val65, Ile16, dan Met147. Keterangan: Hijau : C Merah : O Biru :N Putih : H Jingga : P Gambar 6. Perbandingan hasil Visualisasi 4-nitrophenyl 4-coumarate dengan PyMol (kiri) dengan LigPlot (kanan). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 33 Tabel 9. Perbandingan Hasil Penambatan Molekular dengan HKSA Sampel. No Nama Sampel Penambatan Molekul HKSA Affinitas (kcal/mol) MIC Uji 1 4-nitrophenyl 4-coumarate -11.2 147.035 2 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde -10.9 189.929 3 3-nitrocinnamic acid -10.5 150.111 4 (2E)‐3‐(4‐methoxyphenyl)‐N,N‐ -10.2 394.664 -9.6 188.181 -9.2 255.09 dioxoprop‐2‐enamide (2E)‐3‐(4‐methoxy‐3,5‐ 5 dinitrophenyl)‐n,n‐dioxoprop‐2‐ enamide 6 4-nitrocinnamic acid Dari perbandingan diatas, diketahui bahwa senyawa 4-nitrophenyl 4-coumarate memiliki nilai MIC terendah sekaligus didukung dengan hasil docking energi affinitas ikatan terkecil, sehingga dapat disimpulkan bahwa 4-nitrophenyl 4-coumarate merupakan senyawa paling berpotensi terhadap aktifitas anti tuberkulosis secara teoritis. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 34 BAB 5 PENUTUP 5.1. Kesimpulan a. Dalam analisa hubungan kuantitatif struktur dan aktifitas (HKSA), parameter yang memperngaruhi sifat fisika kimia terhadap aktifitas adalah LogP (koefisien partisi), Log CPSA (elektronik), dan Log sterik (sterik). Persamaan HKSA Hansch yang diperoleh dari turunan EPMS terhadap aktifitas anti tuberkulosis adalah Log MIC = -0.2909LogP+1.6411LogCPSA-0.1497Log sterik-0.3491. b. Senyawa uji yang memiliki afinitas terbaik, dengan affinitas -11.2 kcal/mol, adalah 4-nitrophenyl 4-coumarate yang mengikat 6 asam amino yaitu Ser94, Gly96, Thr39, Ile15, Gly14, dan Val65 5.2. Saran a. Untuk melihat persamaan HKSA yang lebih baik dapat menggunakan training set, dan test set dengan jumlah yang lebih banyak. Dengan memvariasikan jenis sampel set terhadap turunan EPMS dapat diketahui sifat gugus yang paling baik terhadap aktifitas anti tuberkulosis. b. Dibutuhkan studi lebih lanjut menggunakan molecular dynamic dan uji in vitro untuk melihat efektifitas senyawa nitrasi EPMS sebagai anti tuberkulosis. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 35 DAFTAR PUSTAKA Anonim .2008 . Tuberkulosis, Kedaruratan Global. dalam www.lungsusa.org. Bresnick, Stephen. 2004. Intisari Kimia Organik. Jakarta: Penerbit Hiprokrates. Depertemen Kesehatan Republik Indonesia. 2007. Penanggulangan nasional Tuberkulosis. Jakarta. Depertemen Kesehatan RI. Firdausi, Nur Indah. (2009). Isolasi Senyawa Etil Para Metoksi Sinamat (Epms) dari Rimpang Kencur Sebagai Bahan Tabir Surya Pada Industri Kosmetik, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Jurusan Kimia Universitas Negeri Malang. Malang. Guzman , J. D. 2014. Review : Natural Cinnamic Acids, Synthetic Derivatives and Hybrids with Antimicrobial Activity. Molecules 2014, 19, 19292-19349; doi:10.3390/molecules191219292 Handayani, S. 2008 . Respon Imunitas Seluler pada Infeksi Tuberkulosis Paru. Cermin Dunia Kedokteran dalam www._kalbe_com . http://www.fao.org/docrep/004/y2775e/y2775e0e.htm. Annex 4 - Amino acids, one and three letter codes. Diakses pada 04.05.2015. http://globalbiodefense.com/2014/11/14/bmc-awarded-21m-investigatetuberculosis-biomarkers/, diakses pada tanggal 21.1.2015, 09:11. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/3767, diakses pada tanggal 14.4.2015. Jawetz, Melnick, Adelberg. 2005. Mikrobiologi Kedokteran, Salemba Medika Jakarta. Katzung, B.G. 2007. Basic & Clinical Pharmacology, Tenth Edition. United States : Lange Medical Publications. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 36 Kumar, U.C, Mahmood, S. 2011. Identification of Novel and Potent Inhibitors Against Inha Reductase of Mycobacterium Tuberculosis Through a Ligand-based Virtual Screening Approach. Advances in Natural and Applied Sciences, 5(1): 58-63, 2011. ISSN 1995-0772 Lakshmanan, D., Werngren, J., Jose, L., Suja, K.P., Nair, M.S., Varma, R.L., Mundayoo, S., Hoffner, S., Kumar, R.A. 2011. Ethyl p-methoxycinnamate Isolated From a Traditional Anti-tuberculosis Medicinal Herb Inhibits Drrug Resistant Strains of Mycobacterium Tuberculosis In Vitro. Fitoterapia 82 (2011) 757-761. Niemann, S., Gerdes, S.R. 2003. Mycobacteria and TB-Therapy and Drug Resistance. Dalam Mycobacteria and TB. Issues Infect Dis. Basel , Karger, Vol.2 , p. 67-83. Pfyffer, G.E. 2003 . Laboratory Diagnosis of Tuberculosis. Dalam Mycobacteria and TB. Issues Infect Dis. Basel , Karger, Vol.2 , p. 67-83. Poeloengan, M., I. Komala and S.M. Noor . 2007 . Bahaya dan Penanganan Tuberculosis. Lokakarya Nasional Zoonosis . Balai Penelitian Veteriner Bogor. Rifai, A.A, Kasmui, Hadisaputro, S. 2014. Kajian Hksa Senyawa Turunan Deoksibenzoin Terhadap Aktivitas Antioksidan Menggunakan Analisis Regresi Multilinear. Indo. J. Chem. Sci. 3 (3) (2014) Siswandono dan Soekardjo, B., (2000). Kimia Medisinal. Edisi 2. Surabaya: Airlangga University Press. Stigliani, J.-L., Arnaud, P., Delaine, T., Vania B.-G, Meunier, B., Bernadou, J. 2008. Binding of the tautomeric forms of isoniazid-NAD adducts to the active site of the Mycobacterium tuberculosis enoyl-ACP reductase (InhA): A theoretical approach. Journal of Molecular Graphics and Modelling 27 (2008) 536–545. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 37 Tamires ,C., Roner, F., Eveline, M.B., Valder, N.F., Marcelo, L.L., Vinicius, M. 2014. The quantum biophysics of the isoniazid adduct NADH binding to its InhA reductase target. New J. Chem., 2014, 38, 2946—2957 Ulrichs, T., Kaufmann , S.H.E. 2003 . Immunology and Persistence. Dalam Mycobacteria and TB. Issues Infect Dis. Basel , Karger, Vol.2 , p. 122127. Ward JPT, Ward J, Leach RM, Wiener C. 2007. At a Glance Sistem Respirasi. Airlangga. Jakarta. World Health Organization. 2013. Tuberkulosis. Dalam http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ . diakses pada 23/5/2015. Yanuar, Arry, 2012, Penambatan Molekular : Praktek dan Aplikasi Virtual Screening, Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 38 Lampiran 1. Alur Penelitian Pemilihan deskriptor HKSA Hansch, yaitu Log P (koefisien partisi), CPSA (elektronik), dan Indeks harary (sterik) Menyiapkan data Training set, Test set, dan Sample set Menyingkirkan outlier Membuat persamaan regresi dari data struktur dan aktifitas (MIC) senyawa training set Menilai kualitas persamaan linear HKSA dari nilai RMSD Menilai kualitas persamaan linear HKSA dari nilai RMSD Penyiapan reseptor 1ZID dan ligan. Reseptor diunduh dari http://www.rcsb.org/pdb , dan ligan dibuat dengan Marvin Sketch Preparasi reseptor dan ligand. Reseptor dihilangkan dari ligand dan air yang mtengikat. Ligand dibuat dalam clean 3D Penambatan molekul dengan AutoDock Vina Analisa dan visualisasi hasil penambatan molekul dengan PyMol dan LigPlot UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 39 Lampiran 2. Prosedur Kerja A. Langkah Kerja Hksa 1. Buka aplikasi CDK Descriptor 2. Input file dengan nama-nama molekul senyawa training set, test set, dan sampel set dengan format .mol , lalu isi ouput file dengan format .xls. 3. Deskriptor yang dipilih adalah CPSA saja dari folder elektronik, lalu klik Go 4. Hasil akan muncul dalam bentuk Microsoft Exel. Buka file output masing-masing senyawa. Ambil data PPSA1 saja, lalu pindahkan ke file exel yang baru. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 40 5. Untuk memperoleh nilai LogP, dan nilai sterik, gunakan software Marvin Scetch. 6. Buka file molekul senyawa untuk training set, test set, dan sampel dengan marvin scetch. 7. Convert bentuk senyawa menjadi bentuk aromatik, dan dibersihkan secara 3dimensi. 8. Pilih calculating – partition – logp – pilih PHY – ok – ok, maka akan muncul tampilan sebagai berikut. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 41 Muncul kotak peringatan seperti berikut, lalu klik Ok. Maka hasilnya muncul seperti berikut. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 42 9. Pilih calculating – geometric – topological – pilih index hirary – ok, akan muncul tampilan seperti berikut. Pilih type yang diinginkan sepert berikut. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 43 Muncul kotak peringatan seperti berikut, lalu klik Ok. Hasilnya akan muncul sebagai berikut. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 44 10. Masukkan masing-masing nilai deskriptor pada senyawa yang sesuai. 11. Kelompokan masing-masing senyawa pada satu sift senyawa sesuai setnya. Lalu hitung nilai LogMIC, LogCPSA, Log Sterik . Pada kolom nilai log dimasukan formula =Log(sel yang akan di log-kan) 12. Pada sift training set, untuk membuat persamaan regresi, blok 4 baris dan 4 kolom, lalu masukan rumus =Linest(nilai log MIC,(nilai logP; logCPA; dan Log Sterik),true,true) <ctrl+shift+enter>. Maka akan muncul hasil berikut. LogMIC=2.851051-0.15861AlogP-0.160391logPPSA UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 45 Nilai pada kolom D12 manunjukan nilai variable Log sterik, E12 untuk variabel LogCPSA(c), dan F12 untuk variable ALogP, N3 menunjukan konstanta (a) , dan E14 menunjukan nilai R2. Untuk persamaan linear LogMIC=a+bx+cy+dz Maka persamaan yang diperoleh sebagai berikut: 13. Selanjutnya nilai ini digunakan untuk medapatkan nilai MIC senyawa uji . UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 46 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 47 14. Selanjutnya persamaan divalidasi dengan nilai RSMD. Data yang diperlukan yaitu nilai SD, SD2, dan total SD2 shift tes set. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 48 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 49 15. Hasilnya akan muncul seperti ini. 16. Cara yang sama digunakan untu memperoleh nilai MIC uji sample set. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 50 B. Optimasi Ligan Dan Reseptor. 1. Dalam penambatan molekul menggunakan AutodockTools, file yang digunakan harus dalam format .pdb dan .pdbqt . jika molekul ligan atau senyawa uji belum disimpan dalam bentuk .pdb , maka harus diubah sebelumnya dengan software OpenBabel. 2. Masukan file yang akan diubah formatnya pada kolom INPUT FORMAT, lalu tentukan tempat penyimpanan file yang baru dan format hasil yang diinginkan pada OUTPUT FORMAT. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 51 3. Lalu klik CONVERT. Maka data telah berhasil diconvert. 4. Selanjutnya optimasi ligand menggunakan AutoDoockTools. Input ligand yang akan dioptimasi. Ligand – input – open – pilih nama ligand – open . Seperti berikut. 5. Selanjutnya atur jumlah torsi. Ligand – Torsion Tree – Set Number of Torsion – Dismiss. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 52 6. Selanjutnya save dengan format .pdbqt . Ligand – Outpu – Save as PDBQT 7. Selanjutnya sebelum docking, protein reseptor harus dioptimasi, dapat menggunakan Discovery Studio. Buka reseptor yang akan digunakan dengan software Discovery Studio. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 53 8. Selanjutnya menghilangkan molekur air yang ada. Scripts – Selection – Select Water Molekules – delete 9. Selanjutnya menghilangkan ligan yang masih terikat pada reseptor. Scripts – Selections – Select Ligand – delete . Lalu disimpan dalam bentuk .pdb . UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 54 10. Buka molekul reseptor pada AutoDockTools. Tambahkan atom hidrogen pada molekur reseptor. Edit – Hidrogen – Add – Ok Disesuaikan dengan pengaturan seperti berikut. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 55 11. Lalu untuk optimasi selanjutnya, molekul reseptor diatur kotak grid-nya dan disimpan dalam format .pdbqt. Grid – Macromolekul – Choose – pilih 1ZID – Select Molekul – Save. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 56 12. Isi kotak pilihan pada grid box sesuai dengan pengaturan yang diinginkan (literatur). Grid – Grid Box – Save As Current. C. Penambatan Molekular 1. Sebelum memulai penambatan, pada folder vina harus sudah ada file-file seperti berikut. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 57 2. Pada file conf.txt diisi data sesuai pada grid box yang telah diatur pada autoDockTools sebelumnya. 3. Penambatan dimulai dengan membuka program Command Prompt, dan ditulis perintah sebagai berikut. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 58 Maka akan muncul hasil seperti berikut, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 59 Lampiran 3. Hasil Penambatan Molekuler Dengan Autodockvina Beserta Visualisasi Dengan Pymol (Kiri), Dan Ligplot (Kanan). 1. 4-nitrocinnamic acid: Mode 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Affinity (kcal / mol) -9.2 -9.0 -9.0 -8.9 -8.5 -8.4 -8.4 -8.3 -8.2 Dist. From rmsd I.b 0.000 3.625 3.783 3.765 4.006 3.583 3.687 3.921 4.448 Best mode rmsd u.b 0.000 5.724 5.343 9.591 10.194 9.750 9.942 10.239 9.488 Keterangan: Hijau : C Merah : O Biru :N Putih : H Jingga : P UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 60 2. 3-nitrocinnamic acid Mode 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Affinity (kcal / mol) -10.5 -10.4 -10.4 -10.2 -10.1 -10.1 -10.0 -9.9 -9.9 Dist. From rmsd I.b 0.000 3.098 2.778 3.586 3.345 4.004 5.097 3.971 5.447 Best mode rmsd u.b 0.000 12.685 13.478 12.003 12.549 11.809 11.684 12.328 12.037 Keterangan: Hijau : C Merah : O Biru :N Putih : H Jingga : P UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 61 3. 4-nitrophenyl 4-coumarate Mode 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Affinity (kcal / mol) -11.2 -10.6 -10.4 -9.9 -9.8 -9.8 -9.6 -9.6 -9.3 Dist. From rmsd I.b 0.000 2.807 1.906 4.544 4.442 4.248 1.683 5.273 3.936 Best mode rmsd u.b 0.000 4.814 3.895 7.294 6.472 6.539 2.319 6.756 6.027 Keterangan: Hijau : C Merah : O Biru :N Putih : H Jingga : P UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 62 4. 2-nitro-4-methylcinnamaldehyde Mode 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Affinity (kcal / mol) -10.9 -10.7 -10.3 -10.2 -10.2 -10.0 -9.9 -9.8 -9.4 Dist. From rmsd I.b 0.000 3.977 2.556 2.856 3.028 3.660 2.682 4.021 3.192 Best mode rmsd u.b 0.000 7.462 4.097 13.029 10.875 5.647 4.782 7.166 6.016 Keterangan: Hijau : C Merah : O Biru :N Putih : H Jingga : P UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 63 5. Nitrasi 4 Mode Affinity (kcal / mol) Dist. From rmsd I.b Best mode rmsd u.b 1 -10.2 0.000 0.000 2 -10.0 4.148 6.710 3 -9.8 3.826 12.301 4 -9.7 3.506 5.353 5 -9.7 5.429 7.652 6 -9.6 4.772 7.516 7 -9.5 5.648 12.461 8 -9.4 3.600 5.273 9 -9.2 5.640 5.117 Keterangan: Hijau : C Merah : O Biru :N Putih : H Jingga : P UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 64 6. Nitrasi 5 Mode Affinity (kcal / mol) Dist. From rmsd I.b Best mode rmsd u.b 1 -10.5 0.000 0.000 2 -10.4 3.098 12.685 3 -10.4 2.778 13.478 4 -10.2 3.586 12.003 5 -10.1 3.345 12.549 6 -10.1 4.004 11.809 7 -10.0 5.097 11.684 8 -9.9 3.971 12.328 9 -9.9 5.447 12.037 Keterangan: Hijau : C Merah : O Biru :N Putih : H Jingga : P UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 65 7. Isoniazid Mode 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Affinity (kcal / mol) -10.5 -10.5 -10.4 -10.4 -10.1 -9.9 -9.7 -9.7 -9.6 Dist. From rmsd I.b 0.000 1.569 3.695 2.428 4.101 2.439 2.501 3.293 2.428 Best mode rmsd u.b 0.000 2.013 10.383 12.296 10.392 11.069 11.236 5.901 11.485 Keterangan: Hijau : C Merah : O Biru :N Putih : H Jingga : P UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 66 Lampiran 4. Reseptor Inha yang Diunduh UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
