III. METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian

III.
METODE PENELITIAN
A. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung dari bulan
Februari sampai dengan Mei 2015.
B. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah laminar air flow
cabinet, autoclave, neraca analitik, neraca, inkubator, oven, jarum
ose,erlenmeyer, hot plate stirer, vortex mixer, micropipette, tip pipet, cawan
petri, kapas, tabung reaksi, alumunium foil, bunsen, gelas ukur, gunting,
pinset, dan colony counter.
2. Bahan
Isolat bakteri yang digunakan yaitu BT1, BT2, BT3, dan BT4 yang
merupakan isolat BAL yang diisolasi dari tempoyak; daging yang digunakan
adalah daging sapi dan ayam potong; bahan lain yang digunakan yaitu MRSB
17
(de Man Rogosa Sharpe Broth), MRSA (de Man Rogosa Sharpe Agar),
NA(nutrien agar),tempoyak, nitrit, aquades, alkohol 70%, dan NaCl.
C. Metode Penelitian
Penelitian ini dibagi menjadi dua tahap. Tahap pertama ialah uji kemampuan
ekstak metabolit BAL dalam menghambat pertumbuhan bakteri daging.
Terhambatnya pertumbuhan bakteri daging ditunjukan dengan luas zona hambat
yang terbentuk dengan mengunakan metode difusi sumur (Harley dan Prescott,
2002). Tahap kedua yaitu uji kemampuan ekstrak metabolit BAL dalam
menghambat populasi bakteri daging. Parameter yang diamati adalah penurunan
populasi bakteri daging. Dua isolat yang memiliki kemampuan menghambat
pertumbuhan bakteri daging terbesar diuji dengan mengunakan metode TPC
(Total plate count). Uji penghambatan populasi disusun dengan Rancangan Acak
Kelompok Lengkap (RAKL) dengan 3 ulangan sebagai kelompok. Perbedaan
tiap isolat ditentukan dengan Rancangan Perlakuan Faktorial 2 x 2 x 6, yaitu
isolat bakteri (2 isolat yang memiliki daya hambat terbesar), sampel daging
(daging ayam dan daging sapi), dan lama pemaparan diruang terbuka (0 jam, 2
jam, 4 jam, dan 6 jam).
18
D. Analisis Data
Data yang diperoleh pada penelitian ini di analisis dengan Anova untuk melihat
ada tidaknya efek penggunaan ekstrak metabolit bakteri asam laktat terhadap
pertumbuhan bakteri daging serta perbedaan efek masing-masing isolat. Untuk
menyimpulkan ada atau tidak adanya pengaruh yang signifikan secara statistik
digunakan nilai P < 0,05 dan dilanjutkan dengan menggunakan BNT (Beda
Nyata Terkecil).
E. Cara Kerja
1. Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Tempoyak
Tempoyak yang berasal dari tiga tempat berbeda di campur di dalam suatu
wadah lalu diambil sebanyak 5 gram. Tempoyak dilarutkan ke dalam 45 ml
larutan garam fisiologis, setelah itu tempoyak diambil menggunakan ose
steril lalu diinokulasikan dengan metode goresan pada media MRSA.
Inokulan diinkubasi pada suhu 30oC selama 48 jam. Setelah 48 jam, dipilih
beberapa koloni yang memiliki bentuk dan warna koloni yang berbeda untuk
dimurnikan.
2. Peremajaan
Bakteri isolat BT1, BT2, BT3, dan BT4 dari tempoyak diremajakan pada
tabung reaksi yang berisi medium MRSA padat miring kemudian diinkubasi
selama 48 jam di dalam inkubator pada suhu 30oC.
19
3. Preparasi Sampel Daging
Sampel daging sapi dan ayam dipotong kecil - kecil kemudian ditimbang
sebanyak 10 gram. Sampel kemudian dimasukan ke dalam erlenmeyer berisi
garam fisologis sebanyak 90 mL sebagai pengenceran 10-1 untuk selanjutnya
diencerkan menjadi 10-2. Pengenceran 10-2 ini yang akan digunakan pada uji
daya hambat BAL dari tempoyak.
4. Uji Daya Hambat BAL dari Tempoyak
Mikroorganisme pada daging ayam dan sapi yang telah diencerkan menjadi
10-2 diinokulasikan ke dalam cawan petri steril sebanyak 1mL, kemudian
ditambahkan media NA sebanyak 25 mL kemudian dihomogenkan dan di
padatkan. Dibuat empat lubang sumur pada setiap cawan dengan diameter
sekitar 7 mm menggunakan tip pipet 1 mL steril. Ke dalam sumur pertama
dimasukan kultur isolat BT1, sumur kedua kultur isolat BT2, sumur ketiga
kultur isolatt BT3 dan sumur keempat kultur isolat BT4 sebanyak 100 µL.
Inokulan diinkubasi dengan posisi cawan tidak terbalik pada suhu 30oC
selama 18 jam. Pada cawan yang berbeda dibuat empat lubang kontrol yang
berisi 100 μL MRSB. Zona bening di sekitar sumur sebagai zona
penghambatan BAL terhadap bakteri daging (Harley dan Prescott, 2002).
20
5. Penghitungan Luas Zona Hambat
Perhitungan luas zona hambat dilakukan dengan menggambar luas zona
hambat pada plastik kaku. Plastik digunting sesuai zona dan ditimbang.
Luas zona hambat diketahui dengan mengkonversikan berat masing – masing
plastik kaku dengan berat plastik kaku berukuran 1cm2 dan dikurangi dengan
luas lingkaran lubang sumur.
B
C
A
Gambar 1. Perhitungan luas zona hambat
Keterangan :
A
= Luas lingkaran lubang sumur (cm2)
B
= Luas zona hambat (gram)
C
= Luas plastik kaku 1 cm2 (gram)
Luas Zona Hambat =
21
6. Produksi Antibakteri
Dua stater isolat yang memiliki daya hambat terbesar terhadap bakteri daging
yang berasal dari daging sapi dan ayam masing - masing diinokulasikan
sebanyak 10% ke dalam 50 mlmedia MRS Broth. Inokulan diinkubasi
diinkubator selama 48 jam pada suhu 30oC. Kultur BAL yang yang telah
diproduksi disentrifuge selama 20 menit dengan kecepatan 5000 rpm untuk
memisahkan supernatan dan pelet. Supernatan yang didapat akan digunakan
dalam uji penghambatan pertumbuhan bakteri daging.
7. Uji Penghambatan Pertumbuhan BakteriDaging dan Ayam
Daging sapi dan ayam segar dipotong dadu atau filet seberat 5 gram, masing masing sebanyak 4 potongan untuk perlakuan kontrol, hasil metabolit (dua
isolat bakteri tempoyak), tempoyak 10%, dan nitrit 1%. Setiap potongan
daging dicelupkan kedalam ekstrak metabolit bakteri asam lakat, tempoyak
10% dan nitrit 1% selama satu menit (Hadiwiyoto et al., 2005). Masingmasing 3 potong sampel diletakan di atas alumunium foil di ruangan terbuka
dengan lama waktu 2 jam, 4 jam dan 6 jam. Sampel yang digunakan untuk 0
jam dipotong kembali menjadi 1 gram, kemudian dimasukkan ke dalam
tabung reaksi berisi larutan garam fisiologis 9 mL. Sampel selanjutnya
dihomogenkan menggunakan vortex mixer. Sampel tersebut adalah sampel
dengan pengenceran 10-1, yang kemudian diambil sebanyak 1 mL dan
dimasukkan ke dalam larutan pengencer 9 mL untuk memperoleh
22
pengenceran 10-2. Cara yang sama dilakukan untuk pengenceran 10-3, 10-4
dan 10-5. Dari pengenceran 10-5 untuk daging sapi dan 10-6 untuk daging
ayam diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang
kemudian ditambah medium NA. Setelah medium padat,cawan-cawan
diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 30oC selama 48 jam. Setelah 48
jam dihitung total bakteri yang tumbuh.
8. Penghitungan Jumlah Total Mikroba
Perhitungan jumlah total mikroba dilakukan dengan metode Harrigan dan
McCance (2014), dengan rumus :
N = ∑C/ [(1 x n1) + (0.1 x n2)] x d
Keterangan:
N
= Jumlah koloni per gram
∑C
= Jumlah total koloni yang tumbuh dalam cawan yang dihitung
n1
= Jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung
n2
= Jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung
d
= Tingkat pengenceran pertama
23
F. Diagram Alir
Diagram alir penelitian adalah sebagai berikut.
Isolasi BAL
Tempoyak
Identifikasi
Kultur Murni
Uji Ekstrak Metabolit
BAL Tempoyak
Uji Kualitatif
Uji Kuantitatif
Zona Jernih
Total Plate Count
Bakteri Daging
Indeks Antibakteri
Data Total Plate
Count
Gambar 2. Diagram Alir Penelitian