Templat tugas akhir S1
advertisement
13 Bagian organ larva ikan zebra yang diamati meliputi sumbu tubuh, panjang tubuh, pigmentasi, kantong kuning telur, jantung, warna mata, telinga, dan sirkulasi darah (Kumar et al. 2013) 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Identitas Sampel Tanaman Kunyit Putih Identifikasi sampel tanaman dilakukan untuk mengkonfirmasi kembali kebenaran dari identitas sampel yang digunakan. Karakteristik morfologi yang diamati antara lain warna rimpang, bentuk rimpang, aroma rimpang, bentuk daun, dan warna tulang tengah daun. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa ketiga sampel tanaman tersebut adalah C. zedoaria (Christm.) Roscoe, yang termasuk dalam genus Curcuma dalam famili Zingiberaceae (Tabel 3). Tabel 3 Hasil identifikasi sampel tanaman kunyit putih di Herbarium Bogoriense Lokasi sampel Nama koleksi Famili Species Bojong Gede Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe LIPI, Cibinong Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe IPB, Dramaga Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe Kelimpahan Bakteri Endofit Isolasi bakteri endofit dilakukan dari tanaman kunyit putih yang diambil dari lokasi tanam yang berbeda berdasarkan metode sterilisasi permukaan. Metode sterilisasi permukaan yang digunakan pada penelitian ini dikatakan berhasil karena tidak ada pertumbuhan mikrob pada cawan Petri kontrol. Hasil isolasi menunjukkan bahwa bakteri endofit ditemukan pada semua bagian tanaman kunyit putih meliputi bagian rimpang, batang dan daun. Keberadaan bakteri endofit ditemukan hampir pada semua bagian tanaman inang termasuk akar, batang, daun, biji, buah, umbi, dan juga dalam nodul tanaman legum (Sturz et al. 1997; Jalgaonwala dan Mahajan 2011). Struktur populasi bakteri endofit pada suatu tanaman dipengaruhi oleh banyak faktor diantaranya adanya rotasi tanaman, kondisi tanah, umur tanaman, musim ketika dilakukan isolasi, jaringan tanaman, dan keberadaan patogen tanaman. Populasi bakteri endofit berbeda antar lokasi, umur, bagian tanaman (rimpang, batang, daun), dan hal ini juga dipengaruhi oleh jenis media isolasi yang digunakan. Tiga sampel tanaman kunyit putih yang diambil dari lokasi berbeda diisolasi menggunakan empat macam media dan dua jenis metode menunjukkan kelimpahan bakteri endofit yang berbeda. Sampel tanaman dari CBN menunjukkan kelimpahan bakteri 3 log (CFU/g) sampel, sampel dari BG adalah berkisar 2 sampai 3 log (CFU/g) sampel, dan sampel dari DRMG adalah 3 sampai 4 log (CFU/g) sampel (Gambar 4). 14 Gambar 4 Populasi bakteri endofit tanaman kunyit putih yang diambil dari tiga lokasi menggunakan metode spread plate NA adalah media yang lebih cocok untuk isolasi bakteri endofit dibandingkan dengan WYEA. Bakteri endofit yang diisolasi menggunakan media NAT dan WYEAT menunjukkan jumlah populasi bakteri endofit yang lebih rendah dibandingkan dengan media NA dan WYEA dan hal ini juga berpengaruh terhadap jumlah isolat yang diperoleh. Berdasarkan metode isolasi, jumlah bakteri endofit yang diperoleh menggunakan metode spread plate lebih tinggi dibandingkan dengan metode plant piece. Hal ini disebabkan oleh perbedaan pada saat persiapan sampel. Metode spread plate, sampel dihaluskan terlebih dahulu dan disebar di atas permukaan media. Metode ini tampaknya memberikan peluang lebih banyak bagi bakteri endofit untuk tumbuh. Bakteri endofit tumbuh lebih terbatas pada metode plant piece, dikarenakan sampel tanaman dipotong menjadi potongan kecil dan langsung diletakkan di atas permukaan media. Jumlah populasi tertinggi ditemukan pada sampel yang diambil dari DRMG, dan jumlah populasi bakteri dari masing-masing bagian tanaman berbeda antara rimpang, batang dan daun. Jumlah populasi tertinggi dari ketiga bagian tanaman adalah pada bagian rimpang. Family Zingiberaceae tidak memiliki akar, dan dalam hal ini keberadaan rimpang adalah sama dengan akar. Jumlah populasi mikrob endofit pada hampir semua tanaman, akar menunjukkan angka yang lebih tinggi dibandingkan dengan jaringan lain (Rosenblueth dan Martinez 2006), dan berdasarkan McInroy dan Kloepper (1995) jumlah tertinggi bakteri endofit ditemukan pada akar tanaman yang berkisar 4-6 log (CFU/g) sampel. Akar menunjukkan populasi tertinggi, diikuti daun dan batang, dikarenakan akar merupakan tempat paling awal untuk masuknya segala sesuatu ke dalam tanaman (Dalal dan Kulkarni 2013). Tanaman obat merupakan salah satu tanaman yang sensitif terhadap lingkungan tumbuh. Lingkungan tumbuh yang tidak sesuai akan mengurangi kualitas maupun kuantitas yang dihasilkan tanaman obat. Hal ini juga berpengaruh terhadap mikrob yang terdapat pada tanaman tersebut. Sampel dari CBN memiliki kelimpahan bakteri endofit paling rendah dikarenakan sampel tanaman pada awalnya merupakan hasil kultur jaringan yang selanjutnya didomestikasi di kebun percobaan Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong (Tabel 4). Lama waktu 15 aklimatisasi juga berpengaruh terhadap populasi mikroba yang terdapat dalam tanaman. Mikrob tertentu yang mampu menyesuaikan dengan habitat baru yang akan hidup dan berkembang biak. Keragaman tanaman di lingkungan CBN relatif lebih rendah jika dibandingkan dengan kebun di BG dan DRMG. Kebun percobaan CBN lebih banyak didominasi oleh tanaman hortikultura dengan curah hujan yang relatif lebih rendah sekitar 217 mm/tahun dibandingkan DRMG 10001500 mm/tahun. Kondisi ini berbeda dengan kebun koleksi tanaman obat Biofarmaka DRMG yang mempunyai diversitas tanaman yang sangat tinggi. Kebun dengan luas lahan sekitar 3,5 ha tersebut memiliki sekitar tiga ratus jenis tanaman obat yang berasal dari berbagai daerah di Indonesia. Hal ini menunjukkan bahwa populasi endofit dipengaruhi oleh beberapa faktor termasuk kondisi lingkungan, lokasi geografis dan aklimatisasi. Bakteri endofit terseleksi dari lokasi tanam yang berbeda menunjukkan jumlah yang berbeda pula. Sampel yang digunakan memiliki tingkat umur yang berbeda. Tahap reproduksi C. zedoaria adalah 11-12 bulan, sehingga sampel yang digunakan diharapkan berada pada masa reproduksi. Sampel dari DRMG adalah paling tua (12 bulan), diikuti sampel dari BG (11 bulan), dan kemudian sampel dari CBN (8 bulan). Jumlah bakteri endofit akan bervariasi tergantung pada lokasi dan umur tanaman. Usia tanaman dapat mempengaruhi variasi komunitas endofit dalam tanaman gingseng (Vendan et al. 2010). Keragaman mikrob endofit merupakan suatu fungsi dari tahap pematangan yang berbeda untuk setiap tanaman, yang mungkin berpengaruh terhadap jenis dan jumlah eksudat akar yang dihasilkan (Ferreira et al. 2008). Tabel 4 Jumlah bakteri endofit terisolasi dari tanaman kunyit putih (C. zedoaria) pada media dan metode isolasi yang berbeda Asal sampel Bojong Gede Cibinong Dramaga Bagian tanaman Rimpang Batang Daun Rimpang Batang Daun Rimpang Batang Daun NA S 6 7 4 2 3 5 4 5 3 39 NAT P 2 4 5 6 4 4 2 27 Total S: metode spread plate; P: metode plant piece S 1 2 7 3 1 1 4 3 2 24 P 3 3 3 3 3 6 5 4 4 34 207 WYEA S P 2 1 2 2 4 2 1 1 4 4 5 2 3 2 3 2 28 12 WYEAT S P 1 3 1 8 2 1 1 2 2 3 4 2 4 3 5 1 31 12 16 Populasi bakteri endofit dipengaruhi oleh fase pertumbuhan tanaman. Kondisi fase reproduksi, populasi mikrob akan mencapai maksimal dibandingkan dengan fase pertumbuhan lainnya. Perbedaan yang signifikan dalam jumlah populasi bakteri ditemukan oleh Kuklinsky-Sobral (2004) dan hal ini dipengaruhi oleh fase pertumbuhan dan jenis jaringan tanaman. Penurunan jumlah populasi endofit dari fase vegetatif ke reproduksi dikarenakan tidak tersedianya nutrisi penting selama pematangan dan penuaan tanaman. Tahap tanaman dewasa, semua nutrisi yang diperlukan oleh bakteri berada dalam kondisi optimum dan akan diperoleh populasi endofit yang stabil (Dalal dan Kulkarni 2013). Sebanyak 207 isolat bakteri berhasil diisolasi dari tanaman kunyit putih dari tiga lokasi yang berbeda. Berdasarkan karakteristik morfologi sebagian besar isolat bakteri endofit berwarna putih susu, bentuk circular, tepian entire, elevasi raised dan convex, serta permukaan shiny/opaque (Gambar 5 dan Lampiran 3). Isolat selanjutnya dipilih berdasarkan koloni morfologi dan berdasarkan karakteristik morfologi yang berbeda dari masing-masing lokasi sampel diperoleh total 73 isolat terseleksi, yaitu 23 isolat dari BG (32%), 16 isolat dari CBN (22%) dan 34 isolat dari DRMG (46%). Sebanyak 28 isolat dari rimpang (38%), 23 isolat dari batang (32%) dan 22 isolat dari daun (30%) (Gambar 6). Hasil penentuan sifat Gram melalui uji antara bakteri endofit terisolasi dengan larutan KOH 3% (w/v) menunjukkan bahwa terdapat 30 isolat bakteri Gram positif dan 44 isolat bakteri Gram negatif. Hal ini dapat dikatakan bahwa bakteri endofit di tanaman kunyit putih didominasi oleh bakteri Gram negatif. Gambar 5 Beberapa karakteristik fenotip bakteri endofit terseleksi Gambar 6 Total bakteri endofit terseleksi dari tiga lokasi tanaman (A); total bakteri endofit terseleksi dari bagian rimpang, batang dan daun (B) 17 Hasil Analisis Berdasar Sekuen 16S rDNA Isolat bakteri terpilih selanjutnya diidentifikasi pada tingkat spesies dengan analisis 16S rDNA. Sekuen 16S rDNA merupakan komponen subunit kecil 30S dari ribosom prokariot bakteri dengan panjang 1.542 bp. Sekuen ini bersifat spesifik, conserve antara spesies yang berbeda pada bakteri dan arkea, sangat akurat dan bermanfaat dalam klasifikasi dan identifikasi bakteri, dan dapat digunakan untuk membuat pohon kekerabatan dalam identifikasi bakteri (Xiang 2006; Sun et al. 2008). Amplifikasi sekuen 16S rDNA pada penelitian ini menggunakan primer universal, yaitu primer forward dan reverse (27F dan 1492R), sehingga diperoleh daerah teramplifikasi sebanyak ~ 1500 bp (Gambar 7) (Palaniappan et al. 2010). Identifikasi bakteri endofit berdasar sekuen 16S rDNA dilakukan sekuensing secara parsial menggunakan primer 27F dan diperoleh jumlah basa yang teramplifikasi sekitar 700−1200 pb. Sekuen 16S rDNA bakteri terisolasi yang diperoleh ditentukan dan dicocokkan dengan strain referensi yang terdapat di bank data NCBI dalam rangka memperoleh sekuen yang memiliki kesamaan maksimal, dan hanya hasil sekuen yang bersih yang digunakan dalam identifikasi 16S rDNA. Semua sekuen yang dihasilkan oleh program BLAST menunjukkan kesamaan yang tinggi (≥ 97%) dengan spesies terdekat. M - 1 2 3 4 5 6 7 M 1500 pb Gambar 7 Hasil amplifikasi sekuen 16S rDNA ~ 1500 bp (M: marker; -: kontrol negatif; 1−7 : sampel DNA teramplifikasi) Keragaman Bakteri Endofit asal Bojong Gede (BG) Sebanyak 23 isolat diperoleh dari sampel yang diambil di BG. Delapan isolat diisolasi dari bagian rimpang, 9 isolat dari batang dan 6 isolat dari daun. Populasi mikrob endofit pada bagian batang adalah lebih tinggi jika dibandingkan dengan bagian daun (Bhore et al. 2010). Jumlah isolat Gram positif (12 dari 23 isolat) yang diperoleh lebih banyak dengan jumlah Gram negatif (11 dari 23 isolat). Hasil analisis seken 16S rDNA seperti yang ditunjukkan pada Tabel 5, sebanyak 22 isolat menunjukkan kesamaan yang tinggi antara 99% dan 100%, dan satu kandidat spesies baru yaitu isolat BB.S.5. Dua organisme yang memiliki homologi sekuen 16S rDNA kurang dari 97.5%, maka kedua organisme tersebut merupakan spesies yang berbeda (Stackebrandt dan Goebel 1994). Isolat BB.S.5 18 yang teridentifikasi sebagai Microbacterium hominis dengan homologi 97% merupakan kandidat spesies baru. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat didominasi oleh genus Klebsiella, Microbacterium dan diikuti oleh Pseudomonas. Populasi bakteri endofit terdiri dari genus Pseudomonas (3 isolat), Microbacterium (5 isolat), Bosea (2 isolat), Klebsiella (4 isolat), Bacillus (2 isolat), Agrobacterium, Mycobacterium, Erwinia, Xanthobacter, Enterobacter, Pantoea, dan Cellulomonas (Tabel 5). Isolat bakteri terbagi ke dalam 4 kelompok yaitu γ-Proteobacteria (10 isolat), Actinobacteria (7 isolat), α-Proteobacteria (4 isolat) dan Firmicutes (2 isolat). Genus Klebsiella ditemukan pada semua bagian tanaman dan kelompok γ-Proteobacteria diantaranya Pseudomonas, Erwinia, Pantoea, dan Klebsiella tersebar pada semua bagian tanaman. Tabel 5 Tingkat kesamaan sekuen 16S rDNA dari bakteri endofit tanaman kunyit putih asal Bojong Gede (BG) DB.S.1 DB.S.2 DB.S.3 DB.S.4 DB.P.1 DB.P.2 BB.P.1 BB.P.3 BB.P.4 BB.S.1 BB.S.3 Bagian tanaman D D D D D D B B B B B BB.S.5 BB.S.6 BB.S.7 BB.S.8 RB.P.1 RB.P.2 RB.P.3 B B B B R R R RB.P.4 RB.S.2 RB.S.3 RB.S.4 RB.S.5 R R R R R Isolat Identitas terdekat dengan referensi bank data NCBI Pseudomonas stutzeri strain TRA27A Microbacterium laevaniformans strain G24a Bosea thiooxidans strain RpPl3-VS Micrococcus yunnanensis strain UAC-84 Klebsiella pneumoniae strain EB55-THQ Agrobacterium larrymoorei strain EG27 Bacillus pumilus strain BVC9 Klebsiella pneumoniae strain SC Erwinia chrysanthemi strain D4 Microbacterium laevaniformans strain G24a Microbacterium trichothecenolyticum strain Nomor asesi JQ782508 KC136835 AJ250798 KC634108 GQ166865 KC122702 JQ660592. FJ232952 JF779683 KC136835 JQ039976 Persen kesamaan 99% 100% 99% 100% 99% 100% 100% 99% 100% 99% 99% HM629351 KF028777 JQ995474 JX088114 KF017557 KC211309 NR102805 97% 99% 100% 99% 100% 99% 100% KF000099 KC510017 KC456523 JQ659804 FN392632 100% 100% 100% 99% 99% YNA102 Microbacterium hominis strain B-LS-R2A3 Mycobacterium simiae strain AW27-2 Xanthobacter flavus strain ICS1 Enterobacter oryzae Bacillus subtilis strain KtRA5-91 Klebsiella pneumoniae strain SI-2 Pseudomonas denitrificans strain ATCC 13867 Pseudomonas stutzeri strain PW1 Pantoea dispersa strain XJ18 Klebsiella variicola strain ALK036 Cellulomonas hominis strain R6-344 Bosea thiooxidans D: daun; B: batang; R: rimpang Keragaman Bakteri Endofit asal Cibinong (CBN) Keragaman bakteri endofit yang diisolasi dari CBN, diperoleh 13 spesies yang berbeda dari 16 isolat terseleksi. Tujuh isolat dari bagian daun, 5 isolat dari rimpang dan 4 isolat dari bagian batang. Keragaman bakteri endofit pada sampel kurang beragam dibandingkan sampel lainnya. Jumlah bakteri Gram negatif (9 dari 16 isolat) lebih banyak daripada bakteri Gram positif (7 isolat). Hasil analisis sekuen 16S rDNA menunjukkan semua isolat memiliki tingkat kesamaan yang tinggi dengan referensi yaitu 99%-100% (Tabel 6). Genus Bacillus ditemukan 19 pada semua bagian tanaman, sedangkan Pseudomonas dan Stenotrophomonas hanya ditemukan pada bagian daun dan batang. Populasi bakteri endofit terdiri dari genus Bacillus (3 isolat), Pseudomonas (2 isolat), Enterobacter (2 isolat), Stenotrophomonas (2 isolat), Microbacterium, Methylobacterium, Providencia, Mycobacterium, Phenylobacterium, dan Roseomonas. Empat kelompok bakteri ditemukan dari analisis hubungan kekerabatan bakteri dari tanaman yang diambil dari CBN, diantaranya adalah γ-Proteobacteria (7 isolat), Actinobacteria (2 isolat), Firmicutes (4 isolat) dan α-Proteobacteria (3 isolat). Populasi bakteri dari sampel ini didominasi bakteri dari kelompok γ-Proteobacteria, dengan jumlah Bacillus lebih tinggi dibanding lainnya. Tabel 6 Tingkat kesamaan sekuen 16S rDNA dari bakteri endofit tanaman kunyit putih asal Cibinong (CBN) DL.P.1 DL.P.2 DL.P.3 Bagian tanaman D D D DL.P.4 D DL.P.5 DL.P.6 DL.S.1 RL.P.1 RL.P.4 RL.S.1 RL.S.2 RL.S.3 BL.P.1 BL.P.2 BL.S.1 BL.S.2 D D D R R R R R B B B B Isolat Identitas terdekat dengan referensi bank data NCBI Microbacterium testaceum strain: StLB018 Stenotrophomonas maltophilia strain SO Pseudomonas denitrificans strain ATCC 13867 Enterobacter cancerogenus strain GRM903b Bacillus safensis strain BAB-1846 Bacillus subtillis strain yxw5 Methylobacterium organophilum strain: NS8 Providencia vermicola strain Cu12a Phenylobacterium koreense isolate MKC7 Bacillus safensis strain AL-A32 Enterobacter aerogenes strain NC4211 Roseomonas mucosa strain ES_21con Stenotrophomonas maltophilia strain Kb2 Bacillus safensis strain WBD7 Pseudomonas otitidis strain PB5 Mycobacterium cosmeticum strain 2003-11-06 Nomor Asesi AB478964 HQ631975 NR102805 Persen kesamaan 100% 99% 100% HM209774 99% KF535137 KF278951 AB298393 KF471514 EF173338 KC844810 AB244472 EU934085 KC878468 KF550439 KC967287 AY44929 100% 100% 100% 99% 99% 100% 99% 100% 100% 100% 99% 99% D: daun; B: batang; R: rimpang Keragaman Bakteri Endofit asal Dramaga (DRMG) Sebanyak 34 isolat dipilih dari sampel tanaman yang diambil dari DRMG. Lima belas isolat diisolasi dari bagian rimpang, 10 isolat dari batang dan 9 isolat dari daun. Bakteri endofit dari sampel ini lebih beragam dibanding sampel yang lain. Keragaman bakteri endofit pada rimpang dan batang lebih bervariasi dibandingkan bagian daun. Jumlah bakteri Gram negatif lebih banyak (23 dari 34 isolat) dibandingkan dengan bakteri Gram positif (11 dari 34 isolat). Hasil analisis 16S rDNA menunjukkan bahwa 33 isolat memiliki persentase kesamaan yang tinggi dengan referensi yaitu antara 99% - 100% dan satu kandidat spesies baru isolat BI.P.1 dengan homologi 98% (Tabel 7). Nilai persentase homologi untuk penentuan spesies baru pada tahun 2006 meningkat menjadi 98.7% (Stackebrandt dan Ebers 2006), sehingga isolat BI.P.1 yang teridentifikasi sebagai Microbacterium resistens dengan homologi 98% merupakan kandidat spesies baru. 20 Genus pada sampel ini lebih beragam dibanding sampel yang lain dan sampel ini didominasi oleh bakteri genus Microbacterium. Populasi bakteri endofit terdiri dari genus Microbacterium (6 isolat), Pseudomonas (5 isolat), Enterobacter (4 isolat), Klebsiella (4 isolat), Bacillus (2 isolat), Stenotrophomonas (2 isolat), Acinetobacter (2 isolat), Citrobacter, Ralstonia, Brevibacterium, Alcaligenes, Pantoea, Rhizobium, dan Burkholderia. Bakteri dari genus Microbacterium, Pseudomonas, Bacillus, dan Enterobacter ditemukan pada semua bagian tanaman. Hal ini berbeda dengan genus Stenotrophomonas, Bacillus dan Acinetobacter yang hanya ditemukan pada bagian rimpang dan batang. Tabel 7 Tingkat kesamaan sekuen 16S rDNA dari bakteri endofit tanaman kunyit putih asal Dramaga Identitas terdekat dengan referensi bank data NCBI DI.P.1 Enterobacter cancerogenus strain cifa_chp29 DI.P.2 Brevibacterium epidermidis strain CICR-G1 DI.P.3 Alcaligenes faecalis subsp. Faecalis strain fwzb2 DI.P.4 Klebsiella variicola strain R5-431 DI.S.1 Pseudomonas moraviensis strain IARI-HHS1-33 DI.S.2 Microbacterium resistens strain DMMZ DI.S.3 Microbacterium testaceum strain BAC2029 DI.S.4 Microbacterium laevaniformans strain G24a DI.S.5 Rhizobium tarimense strain PL-41 RI.P.1 Burkholderia cenocepacia AU 1054 RI.P.2 Enterobacter cloacae strain FCC56 RI.P.3 Pantoea dispersa strain REB2 RI.P.4 Microbacterium trichothecenolyticum strain A5 RI.P.5 Bacillus cereus strain IAM 1561257 RI.P.6 Pseudomonas geniculata strain R6-798 RI.P.7 Stenotrophomonas maltophilia strain JN263 RI.P.8 Enterobacter ludwigii strain EG16 RI.S.2 Klebsiella pneumoniae strain cifa_chp15 RI.S.3 Acinetobacter calcoaceticus strain c33 RI.S.4 Pseudomonas nitroreducens strain B30 RI.S.5 Burkholderia phenoliruptrix BR3459a RI.S.6 Pseudomonas gessardii strain KMBMa1 RI.S.7 Pantoea agglomerans strain BJCP3 RI.S.8 Klebsiella variicola strain DPMH BI.P.1 Microbacterium resistens strain 3352 BI.P.2 Stenotrophomonas maltophilia strain JN263 BI.P.3 Enterobacter ludwigii strain EG16 BI.P.4 Acinetobacter calcoaceticus strain EU04 BI.P.6 Microbacterium laevaniformans strain G24a BI.P.7 Bacillus cereus strain IAM 1561257 BI.S.1 Ralstonia mannitolilytica strain PapInBa6 BI.S.2 Klebsiella variicola strain R5-431 BI.S.3 Citrobacter freundii strain: GTC 09502 BI.S.4 Pseudomonas moraviensis strain IARI-HHS1-33 D: daun; B: batang; R: rimpang Isolat Bagian tanaman D D D D D D D D D R R R R R R R R R R R R R R R B B B B B B B B B B Nomor asesi KC895920 JQ284034 KF208485 JQ659780 KF054775 NR026437 HM355620 KC136835 HM371420 CP000378 JF772094 KF036178 JX426095 JX519363 JQ659864 KF150498 KC122712 KC895887 JQ781531 KC415112 NR102849 KF481916 HM130694 JX968498 EU714361 KF150498 KC122712 JF681282 KC136835 JX519363 EU839654 JQ659780 AB741675 KF054775 Persen kesamaan 99% 100% 100% 99% 100% 99% 99% 100% 99% 99% 99% 100% 100% 100% 100% 100% 99% 99% 100% 99% 99% 99% 99% 100% 98% 100% 99% 100% 100% 100% 99% 99% 100% 100% 21 Tabel 8 Keragaman bakteri endofit tanaman kunyit putih berdasarkan analisis 16S rDNA Gram + Rimpang Bojong Gede 1. Bacillus subtilis 2. Cellulomonas hominis Cibinong 1. Bacillus safensis 1. Klebsiella pneumoniae 2. Klebsiella variicola 3. Pseudomonas denitrificans 4. Pseudomonas stutzeri 5. Pantoea dispersa 6. Bosea thiooxidans 1. Providencia vermicola 2. Phenylobacterium koreense 3. Enterobacter cancerogenes 4. Roseomonas mucosa - Batang + 1. Bacillus pumilus 2. Microbacterium laevaniformans 3. Microbacterium trichothecenolyticum 4. Microbacterium hominis 5.Mycobacterium simiae 1. Bacillus safensis 2. Mycobacterium cosmeticum Dramaga 1. Bacillus cereus 2. Microbacterium trichothecenolyticum 1. Burkholderia cenocepacia 2. Burkholderia phenoliruptrix 3. Enterobacter cloacae 4. Enterobacter ludwigii 5. Pantoea dispersa 6. Pantoea agglomerans 7. Pseudomonas geniculata 8. Pseudomonas gessardii 9. Pseudomonas nitroreducens 10. Stenotrophomonas maltophilia 11. Klebsiella pneumoniae 12. Klebsiella variicola 13. Acinetobacter calcoaceticus 1. Bacillus cereus 2. Microbacterium resistens 3. Microbacterium laevaniformans Total 5 23 10 22 Tabel 8 Keragaman bakteri endofit tanaman kunyit putih berdasarkan analisis 16S rDNA (Lanjutan) Gram Batang - + Daun - Bojong Gede 1. Klebsiella pneumoniae 2. Erwinia chrysanthemi 3. Xanthobacter flavus 4. Enterobacter oryzae Cibinong Dramaga 1. Stenotrophomonas maltophilia 1. Stenotrophomonas maltophilia 2. Pseudomonas otitidis 2. Enterobacter ludwigii 3. Acinetobacter calcoaceticus 4. Ralstonia mannitolilytica 5. Klebsiella variicola 6. Citrobacter freundii 3. 7. Pseudomonas moraviensis 1. Microbacterium 1. Bacillus safensis 1. Microbacterium resistens laevaniformans 2. Bacillus subtillis 2. Microbacterium testaceum 2. Micrococcus yunnanensis 3. Microbacterium testaceum 3. Microbacterium laevaniformans 4. Brevibacterium epidermidis 1. Pseudomonas stutzeri 1. Stenotrophomonas maltophilia 1. Enterobacter cancerogenus 2. Klebsiella pneumoniae 2. Pseudomonas denitrificans 2. Alcaligenes faecalis subsp. 3. Agrobacterium larrymoorei 3. Enterobacter cancerogenus faecalis 4. Bosea thiooxidans 4.Methylobacterium 3. Klebsiella variicola organophilum 4. Pseudomonas moraviensis 5. Rhizobium tarimense Total isolat +: Gram positif; -: Gram negatif 23 16 34 Total 13 9 13 73 23 γ-Proteobacteria β-Proteobacteria α-Proteobacteria Actinobacteria Firmicutes Outgroup Gambar 8 Dendogram bakteri endofit berdasarkan sekuen gen 16S rDNA menggunakan metode neighbor-joining, model Kimura-2-parameter dan Gamma distributed dengan nilai bootstrap 1000 replikasi 24 Hubungan kekerabatan yang terbentuk antara isolat dan referensi ditunjukkan pada Gambar 8. Berdasarkan hasil analisis, bakteri endofit dikelompokkan menjadi lima kelompok yang berbeda: Firmicutes, Actinobacteria, α-Proteobacteria, β-Proteobacteria, dan γ-Proteobacteria. Kelompok γ-Proteobacteria 37 isolat (51%) adalah kelompok yang paling dominan di antara isolat bakteri endofit terseleksi, meliputi genus Stenothropomonas, Pseudomonas, Enterobacter, Providencia, Klebsiella, Dickeya, Pantoea, Acinetobacter, dan Citrobacter, diikuti oleh kelompok Actinobacteria 16 isolat (21.92%) termasuk Mycobacterium, Cellulomonas dan didominasi oleh Microbacterium. Kelompok α-Proteobacteria 8 isolat (10.96%) meliputi Methylobacterium, Penylobacterium, Roseomonas, Agrobacterium, Bosea, Xanthobacter, Rhizobium, kelompok Firmicutes 8 isolat (10.96%) didominasi oleh Bacillus, dan gugus β-Proteobacteria 4 isolat (5.48%) terdiri dari Burkholderia, Ralstonia, dan Alcaligenes (Gambar 8). Bakteri endofit yang berhasil diisolasi sangat beragam dan genus yang paling banyak ditemukan adalah Entrobacter, Klebsiella, dan Pseudomonas. Kelompok γ-Proteobacteria mendominasi semua sampel tanaman kunyit putih. Bakteri yang termasuk dalam genus Pseudomonas, Klebsiella, Bacillus, Enterobacter, dan Microbacterium ditemukan pada semua sampel. Keberadaan mikrob dalam tanaman inang dapat dipengaruhi oleh senyawa yang terkandung dalam tanaman tersebut (Strobel and Daisy 2003) dan tanaman dengan spesies yang sama kemungkinan menghasilkan senyawa bioaktif yang relatif sama (Bernhoft 2010). Genus Enterobacter, Pseudomonas, dan Bacillus merupakan bakteri endofit yang paling banyak ditemukan pada tanaman legum dan lainnya seperti kentang dan sorgum (Wang et al. 2006). Hasil penelitian menunjukkan keberadaan dan distribusi yang luas dari genus Pseudomonas and Bacillus, yaitu ditemukannya kedua genus tersebut pada semua sampel tanaman. Hal ini dikarenakan genus Pseudomonas dan Bacillus sangat mudah untuk ditumbuhkan dan berpotensi sebagai agen biokontrol (Miller et al. 2012). Sifat ini menyebabkan Pseudomonas dan Bacillus dapat ditemukan pada semua tanaman. Hal yang hampir sama juga dilaporkan oleh Vendan et al. (2010), yang menyatakan bahwa bakteri dari genus Bacillus mendominasi pada semua umur tanaman. Gambar 9 Komposisi kelompok bakteri endofit yang ditemukan pada bagian rimpang, batang, dan daun tanaman kunyit putih (C. zedoaria) 25 Beberapa studi melaporkan bahwa telah banyak mikrob endofit yang berhasil diisolasi dari famili Zingiberaceae, namun mikrob tersebut bukan berasal dari tanaman C. zedoaria dan sebagian besar mikrob terisolasi merupakan kelompok cendawan dan aktinomisetes. Hasil penelitian ini menambah daftar jumlah jenis mikrob endofit terutama bakteri dari famili Zingiberaceae khususnya tanaman C. zedoaria. Sebanyak 73 bakteri endofit yang termasuk dalam 23 genus yang berbeda, merepresentasikan 46 spesies telah berhasil diidentifikasi dari tiga lokasi, usia dan bagian tanaman kunyit putih yang berbeda (Tabel 8). Sebanyak 13 genus yang berbeda dari 63 isolat endofit berhasil diisolasi dari bagian akar gingseng yang dibudidayakan di tiga wilayah yang berbeda (Cho et al. 2007). Hasil penelitian Vendan et al. (2010) telah berhasil mengisolasi 51 isolat bakteri endofit dari tanaman gingseng yang terdiri atas sembilan genus dalam empat kelompok besar. Akar dan batang dari tanaman kapas dan jagung manis memiliki 1029 bakteri endofit yang terdiri dari 34 genus berbeda (McInroy dan Klopper 1995). Sebanyak 114 isolat endofit dalam 23 genus yang berbeda telah diisolasi dari tanaman bit oleh Lilley et al. (1996). Akar tanaman Canola yang ditanam pada tiga lokasi berbeda juga mengandung 220 isolat yang terdiri dari 18 genus berbeda (Germida et al. 1998). Beberapa hasil penelitian ini menunjukkan bahwa keragaman bakteri endofit dalam tanaman kunyit putih yang diambil di Bogor, Jawa Barat, Indonesia dapat memberikan perkiraan bahwa keragaman bakteri pada tanaman obat yang tumbuh di Indonesia lebih beragam dibandingkan dengan hasil penelitian yang diperoleh negara lain. Bakteri Endofit Penghasil Senyawa Antimikrob Mikrob endofit dipercaya berperan dalam resistensi terhadap serangan patogen melalui senyawa metabolit sekunder yang dihasilkannya (Tan dan Zou 2001). Beberapa studi melaporkan bahwa sejumlah senyawa antimikrob telah berhasil diperoleh dari mikrob endofit, diantaranya senyawa yang termasuk dalam alkaloid, peptida, steroid, terpenoid, fenol, quinon, dan flavonoid (Yu et al. 2010). Penemuan senyawa antimikrob baru dari mikrob endofit merupakan alternatif penting untuk mengatasi peningkatan masalah resistensi obat terhadap tanaman dan patogen manusia. Senyawa antimikrob tidak hanya digunakan sebagai obat oleh manusia. Senyawa ini juga digunakan sebagai pengawet makanan dalam mengontrol pembusukan makanan dan penyakit terbawa makanan yang merupakan salah satu masalah serius di dunia. Mikrob uji yang digunakan dalam penelitian adalah B. subtilis dan S. aureus mewakili bakteri Gram positif, P. aeruginosa dan E. coli mewakili bakteri Gram negatif, C. albicans, dan S. cerevisiae mewakili yeast. Mikrob tersebut merupakan mikrob patogen terhadap manusia dan hewan yang sudah banyak dipelajari dan diketahui informasi genetiknya. Hasil uji antimikrob menunjukkan bahwa beberapa bakteri endofit tanaman kunyit putih memiliki potensi dalam menghasilkan senyawa antimikrob. Sebanyak 16 bakteri endofit dari 73 bakteri terseleksi mampu menghasilkan senyawa antimikrob yang aktif terhadap bakteri Gram positif, Gram negatif dan yeast. Bakteri endofit penghasil antimikrob sebagian besar merupakan bakteri yang diisolasi dari DRMG (68.75%) diikuti CBN (18.75%) dan BG (12.5%). Perbedaan ini kemungkinan disebabkan oleh asal lokasi pengambilan sampel. DRMG merupakan kebun koleksi tanaman 26 obat yang mempunyai diversitas tanaman obat yang sangat tinggi. Sebanyak tiga ratus jenis tanaman obat dapat ditemukan di tempat ini dan hal ini akan berpengaruh terhadap senyawa yang terkandung dalam tanaman tersebut. Aktivitas antimikrob yang dihasilkan bervariasi dari 1−22 mm. Berdasarkan spektrum aktivitas penghambatannya, sebagian besar bakteri menunjukkan diameter penghambatan yang relatif kecil dan berspektrum sempit. B. subtilis (RB.P.1) dan B. cenocepacia (RI.P.1) hanya mampu menghambat satu jenis mikrob uji dengan diameter penghambatan yang cukup besar yaitu >10 mm. B. subtilis (RB.P.1) aktif terhadap C. albicans dan S. cerevisiae, sedangkan B. cenocepacia (RI.P.1) aktif terhadap B. subtilis. Bakteri endofit lain yang menghasilkan senyawa antimikrob adalah P. otitidis (BL.S.1) dan C. freundii (BI.S.3) dengan spektrum penghambatan luas dan mampu menghambat bakteri Gram positif dan negatif. P. otitidis (BL.S.1) mampu menghambat pertumbuhan B. subtilis, S. aureus, dan P. aeruginosa, sedangkan C. freundii (BI.S.3) mampu menghambat B. subtilis dan E. coli (Tabel 9 dan Gambar 10). Data diameter zona hambat pada Tabel 9 menunjukkan bahwa sebagian besar senyawa antimikrob yang dihasilkan bersifat lemah dikarenakan diameter zona hambat aktivitas antimikrob yang dihasilkan adalah di bawah 5 mm. Daya hambat kuat dihasilkan oleh dua bakteri endofit yaitu B. subtilis (RB.P.1) dan B. cenocepacia (RI.P.1) dengan diameter sebesar 13 mm. Tabel 9 Aktivitas antimikrob bakteri endofit tanaman kunyit putih Mikrob uji Bakteri endofit Gram positif Gram negatif Yeast BS SA EC PA CA SC B. subtillis (RB.P.1) ++++ +++ P. denitrificans (RB.P.3) + P. otitidis (BL.S.1) + ++ + M. cosmeticum (BL.S.2) + P. denitrificans (DL.P.3) ++ E. cancerogenus (DI.P.1) + B. cenocepacia (RI.P.1) +++ B. cereus (RI.P.5) + P. geniculata (RI.P.6) + E. ludwigii (RI.P.8) + P. nitroreducens (RI.S.4) + S. maltophilia (BI.P.2) + E. ludwigii (BI.P.3) + A. calcoaceticus (BI.P.4) ++ C. freundii (BI.S.3) + + P. moraviensis (BI.S.4) + -: tidak menghambat; +: menghambat < 2 mm; ++ : < 5 mm; +++:>10 mm; ++++: >20 mm; BS: B. subtilis; SA: S. aureus; PA: P. aeruginosa; EC: E. coli; CA: C. albicans; SC: S. cerevisiae. 27 Senyawa antimikrob yang dihasilkan relatif lebih aktif terhadap bakteri dibandingkan yeast. Bakteri cenderung lebih sensitif terhadap komponen antibiotik jika dibandingkan dengan yeast. Bakteri merupakan sel prokariot dengan struktur dinding sel yang sederhana terbuat dari peptidoglikan sehingga memudahkan senyawa antibiotik masuk ke dalam sasaran untuk bekerja sedangkan yeast merupakan sel eukariot yang memiliki komponen struktur dinding sel yang ekstensif terdiri dari beta-glukan dan mannan-oligo-sakarida (Aguilar-Uscanga dan Francois 2003). Hasil juga menunjukkan bahwa senyawa antimikrob yang dihasilkan lebih aktif terhadap bakteri Gram positif dibandingkan Gram negatif. Perbedaan ini disebabkan oleh perbedaan sensitifitas yang dapat dilihat dari perbedaan morfologi antara bakteri Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif lebih rentan karena pada bagian luar hanya memiliki lapisan peptidoglikan yang tidak efektif sebagai penghalang, sedangkan bakteri Gram negatif memiliki membran luar polisakarida yang menyebabkan dinding sel tidak dapat ditembus oleh antibiotik, pewarna dan deterjen (Pandey et al. 2011). Beberapa bakteri endofit telah dilaporkan mampu menghasilkan senyawa antimikrob, diantaranya Bacillus pumilus dari cassava yang mampu menghasilkan lipopeptida pumilacidin (Melo et al. 2009), Serratia, Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, dan Enterobacter dari tanaman Rhizophora mucronata mampu menghasilkan senyawa antimikrob yang aktif terhadap bakteri dan cendawan patogen (Jose dan Christy 2013), Paenibacillus polymyxa, Pseudomonas poae, Bacillus sp. dari tanaman gingseng mampu menghasilkan senyawa antifungi berspektrum luas (Cho et al. 2007). P. otitidis memiliki aktivitas antimikrob yang kuat terhadap C. albicans and E.coli (Kristija et al. 2013). Burkholderia cepacia mampu menghasilkan senyawa antimikrob berspektrum luas phenylpyrole yang aktif terhadap cendawan, yeast, dan bakteri Gram positif (El-Banna dan Winkelmann 1998). Tanaman obat dengan sejarah etnobotani tinggi memiliki peluang ditemukannya spesies bakteri endofit yang membawa karakteristik tanaman inangnya. Hal ini sesuai dengan pendapat Tan dan Zou (2001) yang menyatakan bahwa beberapa bakteri endofit penghasil senyawa bioaktif biasanya berhubungan dengan karakteristik tanaman inangnya. Hasil ini juga sesuai dengan hasil studi Banisalam et al. (2012), bahwa ekstrak rimpang kunyit putih memiliki efek farmakologis sebagai antibakteri terhadap bakteri patogen E. coli, P. aeruginosa, B. cereus dan Staphylococcus aureus. Hasil ini diharapkan mampu menghasilkan senyawa antimikrob baru yang relatif sama dengan karakter tanaman kunyit putih yang dapat diaplikasikan pada bidang kesehatan. A C B A B C c Gambar 10 Hasil uji aktivitas antimikrob terhadap mikrob uji (A: aktif terhadap C. albicans; B: S. cerevisiae; C: B. subtilis) 28 Toksisitas Akut terhadap Embrio Ikan Zebra Bakteri endofit terpilih yang memiliki aktivitas antimikrob yang besar dalam menghambat pertumbuhan mikrob uji dilanjutkan dengan uji in vitro dan in vivo toksisitas terhadap embrio ikan zebra. Bakteri terpilih yang digunakan untuk uji toksisitas diantaranya C. freundii (BI.S.3), B. subtilis (RB.P.1), P. otitidis (BL.S.1), dan B. cenocepacia (RI.P.1). Uji toksisitas akut dilakukan melalui uji in vitro dengan penentuan nilai LC50. Lethal Concentration 50 (LC50) adalah konsentrasi yang menyebabkan kematian pada 50% hewan percobaan. Penentuan nilai LC50 menggunakan ikan zebra membantu lebih baik untuk memahami pengaruh toksik dari senyawa obat terhadap mamalia (Kari et al. 2007). Penentuan toksisitas akut dilakukan terhadap embrio ikan zebra yang telah terpapar ekstrak selama 72 jam. Bakteri endofit yang digunakan adalah isolat BI.S.3, RB.P.1, BL.S.1, RI.P.1 dengan identitas berturut-turut C. freundii, B. subtilis, P. otitidis, dan B. cenocepacia. Tingkat kematian embrio serta kelainan dalam pertumbuhannya diamati setelah pemberian fase ekstrak etil asetat dan fase air. Tingkat kematian embrio disajikan dalam nilai LC50. Hasil nilai LC50 menunjukkan bahwa ekstrak dari semua bakteri endofit terpilih bersifat toksik terhadap embrio ikan zebra. Fase ekstrak etil asetat lebih toksik dibandingkan dengan fase air. Hal ini terlihat dari nilai LC50 fase ekstrak etil asetat lebih rendah dibandingkan fase air. Ekstrak etil asetat dari C. freundii (BI.S.3), B. subtilis (RB.P.1), P. otitidis (BL.S.1), dan B. cenocepacia (RI.P.1) memiliki nilai LC50 berturut-turut 63.5 ppm, 24.7 ppm, 13.4 ppm, dan 12.6 ppm, sedangkan nilai LC50 dari fase air adalah 109.9 ppm, 252.3 ppm, 132.4 ppm, 120.8 ppm (Lampiran 4 sampai 7). Hasil ini diringkaskan pada Gambar 11. Gambar 11 menunjukkan bahwa nilai LC50 yang diperoleh berbeda antara fase ekstrak etil asetat dan fase air. Konsentrasi yang menyebabkan kematian 50% embrio ikan zebra pada fase ekstrak etil asetat lebih rendah dibandingkan fase air. Hal ini disebabkan senyawa aktif sebagian besar sudah terbawa oleh etil asetat, meskipun sebagian dari senyawa aktif yang dihasilkan oleh bakteri endofit masih tertinggal dalam fase air. Rendahnya nilai LC50 fase etil asetat mengindikasikan bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh bakteri endofit sangat toksik dengan tingkat urutan toksisitas B. cenocepacia (RI.P.1), diikuti P. otitidis (BL.S.1), B. subtilis (RB.P.1), dan C. freundii (BI.S.3). Semakin toksik senyawa yang dihasilkan, maka semakin rendah konsentrasi yang diperlukan untuk mematikan 50% dari total hewan percobaan. Gambar 11 Nilai LC50 uji toksisitas terhadap ikan zebra 29 Efek Ekstrak Bakteri Endofit terhadap Organ Embrio Ikan Zebra Langkah pertama dalam pengujian obat ke tahap penggunaan manusia setelah uji in vitro adalah melalui uji in vivo yaitu bagaimana tubuh dapat memetabolisme obat tersebut. Ikan zebra adalah vertebrata yang telah terbukti menjadi model untuk analisis penyakit manusia, dikarenakan tingginya tingkat kesamaan antara genom manusia dengan ikan zebra. Studi menunjukkan bahwa ikan zebra dapat digunakan dalam pengembangan jenis obat tumor (Feitsma dan Cuppen 2008), sehingga sangat bermanfaat untuk mengobati karsinoma manusia. Uji in vivo yang dilakukan melalui pengamatan morfologi bertujuan untuk mengetahui apakah toksisitas dari suatu senyawa hanya terfokus pada organ-organ tertentu dalam tubuh ikan zebra. Pengamatan morfologi dilakukan terhadap embrio ikan zebra yang telah terpapar ekstrak bakteri endofit selama periode tertentu. Pengaruh pemberian ekstrak tersebut dapat menyebabkan kelainan pada organ-organ tertentu pada larva ikan, diantaranya sumbu tubuh, otak, sirip, sirkulasi darah, mata, telinga, rahang, jantung, tulang belakang, panjang tubuh, pigmentasi, dan kantong kuning telur. Nilai LC50 dari uji in vitro yang dihasilkan menunjukkan bahwa fase ekstrak etil asetat dan fase air memberikan nilai yang berbeda dan hal ini juga akan memberikan pengaruh yang berbeda terhadap organ ikan zebra. a a a a b b b b c c c c d d d d e e f e f e f f A B C D Gambar 12 Embrio ikan zebra dengan penambahan fase ekstrak etil asetat bakteri (A) C. freundii; (B) B. subtilis; (C) P. otitidis; (D) B. cenocepacia (a: 0 ppm; b: 50 ppm; c: 100 ppm; d: 150 ppm; e: 200 ppm; f: 250 ppm) 30 Pemberian fase ekstrak etil asetat dari bakteri endofit terpilih menunjukkan perbedaan morfologi yang signifikan antara kontrol dengan perlakuan. Beberapa telur mengalami koagulasi pada jam ke-24 dan tidak ada alasan yang spesifik mengapa telur terkoagulasi. Koagulasi biasanya terjadi secara alami yaitu sekitar 4-5% dari jumlah telur yang dihasilkan, dan hal ini kemungkinan disebabkan oleh kurangnya nutrisi yang diperoleh oleh induk ikan zebra (Kumar et al. 2013). Embrio ikan zebra yang tidak diberi perlakuan (0 ppm), 48 jam setelah fertilisasi embrio menetas dan berkembang menjadi larva dengan organ-organ yang berkembang secara sempurna. Sumbu tubuh lurus, mata, ekor, kepala, tulang belakang, dan pigmentasi normal (a). Larva ikan zebra yang normal akan memiliki sumbu tubuh yang lurus (Heiden et al. 2007) dan jika larva ikan zebra mengalami kelainan maka pigmentasinya akan berbeda dengan kontrol (Wei et al. 2010). Embrio ikan zebra yang telah terpapar oleh beberapa fase ekstrak etil asetat bakteri endofit C. freundii, B. subtilis, P. otitidis, dan B. cenocepacia pada konsentrasi 50, 100, 150, 200, 250 ppm setelah 72 jam inkubasi menghasilkan koagulasi embrio dan kelainan pada beberapa organ (Gambar 12). Embrio yang telah menetas sebagian besar mengalami kelainan mayor pada organ sumbu tubuh, kantong kuning telur, jantung, koagulasi darah, dan pigmentasi tubuh. Perubahan ukuran kantong kuning telur terjadi pada semua embrio yang terpapar ekstrak. Kantong kuning telur merupakan membran yang membungkus kuning telur dan berisi makanan yang dibutuhkan selama minggu pertama pembentukan embrio. Perubahan ukuran kantong kuning telur merupakan salah satu indikasi terganggunya sistem pencernaan sehingga makanan tidak terdistribusi secara sempurna pada embrio dan hal ini akan berakibat pada kematian embrio. Koagulasi darah dan pembengkakan jantung juga mengalami kelainan akibat paparan ekstrak. Koagulasi darah menyebabkan pembengkakan jantung dan hal ini berakibat pada kematian larva dikarenakan tidak sempurnanya sirkulasi darah. Koagulasi darah menyebabkan laju aliran darah menjadi terhambat dan hal ini akan berakibat sel-sel dalam tubuh embrio ikan tidak akan mendapatkan nutrisi (Wei et al. 2010). Hal yang sama juga terjadi pada hasil penelitian Kumar et al. (2013) yang menyatakan bahwa pada jam ke-72 setelah pemaparan ekstrak metanol dari kulit Streblus asper konsentrasi 100 ppm terjadi pembengkakan jantung yang diakibatkan oleh meningkatnya denyut jantung. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak yang diaplikasikan, maka semakin tinggi kelainan organ yang dihasilkan. Pemberian ekstrak bakteri endofit yang berbeda pada konsentrasi yang sama menghasilkan kelainan yang hampir serupa. Pemberian ekstrak 50 ppm menunjukkan kelainan, terutama pada bentuk kantong kuning telur yang lebih besar dibandingkan dengan kontrol. Perlakuan dengan ekstrak B. subtilis konsentrasi 50 ppm, embrio mampu menetas menjadi larva namun tidak berkembang menjadi larva yang sempurna karena mengalami kelainan pada intensitas warna mata dan pigmentasi. Efek terbesar diakibatkan oleh pemberian ekstrak C. freundii yang terlihat dari perbedaan sumbu tubuh yang melengkung dan kantong kuning telur yang membesar. Hasil yang hampir sama juga terjadi pada pemberian ekstrak bakteri endofit konsentrasi 100 ppm. Kelainan yang terjadi adalah sumbu tubuh melengkung, ukuran kantong kuning telur menjadi besar dan berubah bentuk, begitu pula dengan jantungnya. Berbeda halnya dengan pemaparan ekstrak C. freundii yang tidak menyebabkan 31 pembengkakan jantung. Ekstrak B. cenocepacia menunjukkan kelainan yang paling berat jika dibandingkan ekstrak lainnya yaitu pembesaran ukuran kantong kuning telur, koagulasi darah yang berakibat pada pembengkakan jantung, sumbu tubuh dan ukuran yang lebih panjang dibandingkan kontrol. Kelainan yang sudah ditimbulkan pada konsentrasi 50 ppm mengindikasikan bahwa pada konsentrasi yang rendah, ekstrak sudah bersifat toksik terhadap embrio ikan zebra. Perlakuan dengan konsentrasi 150 ppm setelah 72 jam pemaparan ekstrak, embrio setelah menetas menjadi larva mengalami kelainan pada sumbu tubuh, kantong kuning telur, jantung, warna mata, dan pigmentasi warna. Kelainan yang terjadi lebih kompleks dibanding konsentrasi 100 ppm. Sumbu tubuh sedikit melengkung pada bagian ekor, ukuran kantong kuning telur yang membesar, terjadi koagulasi darah sehingga jantung juga menjadi bengkak, dan pigmentasi yang berbeda dengan kontrol. Pigmentasi yang disebabkan oleh pemaparan ekstrak C. freundii, P. otitidis, dan B. cenocepacia lebih rendah dibandingkan kontrol, berbeda dengan ekstrak B. subtilis yang menyebabkan pigmentasi lebih gelap dibanding kontrol. Hal ini sesuai dengan Wei et al. (2010) yang menyatakan bahwa embrio yang mengalami kelainan menunjukkan pigmentasi yang berbeda dengan kontrol. Ekstrak B. cenocepacia menghasilkan kelainan yang paling berat, terlihat dari pigmentasi tubuh, berubahnya warna kantong kuning telur, dan intensitas warna mata yang berbeda dari kontrol. Warna mata embrio normal adalah hitam, sedangkan warna mata embrio yang terpapar ekstrak B. cenocepacia berubah menjadi putih. Pemaparan ekstrak konsentrasi 200 ppm memberikan pengaruh yang signifikan pada seluruh embrio ikan zebra. Pemaparan ekstrak P. otitidis, embrio menetas menjadi larva namun belum sempat berkembang dengan sempurna. Larva diperkirakan setelah menetas langsung mengalami kematian, hal ini terlihat dari organ tubuh yang belum berkembang dan warna yang lebih gelap dibandingkan dengan larva hidup. Pemaparan ekstrak B. cenocepacia menyebabkan embrio tidak mampu menetas akan tetapi telah mengalami perkembangan di dalam telurnya. Hal ini berbeda dengan perlakuan menggunakan ekstrak 250 ppm yang menyebabkan kematian pada semua embrio. Embrio yang terpapar ekstrak C. freundii mampu menetas menjadi larva akan tetapi larva mati dikarenakan kantong kuning telur pecah. Pemaparan ekstrak B. subtilis, P. otitidis, dan B. cenocepacia menyebabkan embrio tidak sempat menetas. Embrio yang terpapar ekstrak P. otitidis tidak menetas, namun mengalami perkembangan di dalam telurnya yaitu terlihat dari adanya larva dalam telur. Embrio yang mendapat perlakuan dengan ekstrak B. subtilis dan B. cenocepacia telah mengalami koagulasi setelah 24 jam pemaparan ekstrak. Senyawa yang terdapat dalam ekstrak diperkirakan menghambat perkembangan embrio menjadi larva. Hasil ini menunjukkan bahwa daya toksisitas ekstrak konsentrasi 250 ppm sangat tinggi, terlihat dari tidak adanya embrio yang menetas. Kelainan yang terjadi akibat pemaparan ekstrak bakteri endofit ekstrak C. freundii, B. subtilis, P. otitidis, dan B. cenocepacia sebagian besar terjadi pada organ sumbu tubuh, kantong kuning telur, jantung, adanya koagulasi darah, dan pigmentasi tubuh. Kelainan kompleks yang ditimbulkan oleh pemaparan ekstrak B. cenocepacia (RI.P.1), menunjukkan bahwa ekstrak dari B. cenocepacia (RI.P.1) bersifat paling toksik dibandingkan dengan ekstrak ketiga bakteri endofit lainnya. Hasil ini sebanding dengan nilai LC50 yang diperoleh yaitu ekstrak 32 B. cenocepacia (RI.P.1) memiliki nilai LC50 yang paling rendah. Hasil pemaparan beberapa ekstrak bakteri endofit menunjukkan fenotif yang hampir sama dengan penelitian Wei et al. (2010) yaitu pemaparan senyawa amphimedine dari sponge Xestospongia cf. carbonaria pada konsentrasi 30 µM dan 50 µM selama 48 jam menyebabkan embrio mengalami nekrosis, pembesaran ukuran kantong kuning telur, sumbu tubuh melengkung, dan tubuh menjadi lebih pendek. Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh bakteri endofit memiliki efek yang hampir sama seperti amphimedin. Konsentrasi amphimedin yang digunakan rendah karena amphimedin merupakan senyawa yang sudah murni, sedangkan ekstrak yang digunakan dalam penelitian ini merupakan campuran dari berbagai macam senyawa yang dihasilkan oleh bakteri endofit. Hasil pengamatan pada perlakuan menggunakan fase air menunjukkan perbedaan yang signifikan. Embrio yang diberi perlakuan fase air tidak banyak menunjukkan kelainan. Kelainan yang dialami oleh sebagian besar larva adalah pembengkakan ukuran kantong kuning telur dan rendahnya intensitas pigmen warna. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh belum sempurnanya proses ekstraksi dan diduga masih terdapat senyawa aktif yang tertinggal dalam fase air. Data-data yang diperoleh dari hasil pengamatan menunjukkan bahwa fase ekstrak etil asetat dari ekstrak bakteri endofit C. freundii (BI.S.3), B. subtilis, (RB.P.1), P. otitidis (BL.S.1) dan B. cenocepacia (RI.P.1) dapat menghambat pertumbuhan embrio ikan zebra. Hasil ini diharapkan dapat memberikan efek yang sama terhadap pertumbuhan sel kanker. Fase ekstrak etil asetat dapat menghambat pertumbuhan dan merusak organ-organ embrio ikan zebra. Kematian sel akan terjadi apabila hal ini berlangsung dalam waktu yang lama.. Efek ini diharapkan dapat membunuh sel kanker di dalam tubuh manusia, sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui kinerja spesifik senyawa toksik dari ekstrak bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman kunyit putih. 5 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman kunyit putih dari tiga lokasi tanam yang berbeda memiliki komposisi yang beragam. Sampel dari Dramaga memiliki keragaman tertinggi dibandingkan sampel dari Bojong Gede dan Cibinong. Bakteri dari kelompok γ-Proteobacteria mendominasi semua sampel tanaman dan bakteri yang termasuk dalam genus Pseudomonas, Klebsiella, Bacillus, Enterobacter, and Microbacterium ditemukan pada semua bagian tanamnan. Lokasi tanaman, umur, bagian tanaman, media, dan metode isolasi berpengaruh terhadap banyak dan jenis bakteri endofit yang diperoleh. Sebanyak enam belas bakteri endofit asal tanaman kunyit putih memiliki aktivitas dalam menghambat pertumbuhan B. subtilis, S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, C. albicans, dan S. cerevisiae. Hasil uji toksisitas yang merupakan langkah awal untuk penapisan senyawa yang berpotensi menghasilkan senyawa aktif, menunjukkan aktivitas tertinggi diperoleh dari ekstrak bakteri endofit B. cenocepacia (RI.P.1). Empat bakteri endofit terpilih yang memilki kemampuan
