zafran_isolasi (933-938).pmd - Agency for Marine and Fisheries

933
Isolasi, karakteristik, dan uji patogenisitas... (Zafran)
ISOLASI, KARAKTERISASI, DAN UJI PATOGENISITAS BAKTERI VIBRIO YANG DIISOLASI
DARI LARVA ABALON SAKIT DI HATCHERI
Zafran, Indah Mastuti, dan Yasmina Nirmala Asih
Balai Besar Riset Perikanan Budidaya Laut
Jl. Br. Gondol Kecamatan Gerokgak Kabupaten Buleleng, Kotak Pos 140 Singaraja, Bali 81101
E-mail: [email protected]
ABSTRAK
Pembenihan abalon dari spesies Haliotis squamata baru dimulai beberapa tahun belakangan ini dan kematian
abalon secara massal sering terjadi tanpa diketahui penyebabnya. Suatu penelitian untuk mengetahui
tingkat patogenisitas bakteri vibrio terhadap yuwana abalon (H. squamata) telah dilakukan di laboratorium
patologi Balai Besar Riset Perikanan Budidaya Laut Gondol, Bali. Tahap pertama dari peneltian ini adalah
mengisolasi bakteri vibrio dari yuwana abalon sakit menggunakan media Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose
(TCBS) agar, yaitu media spesifik untuk bakteri vibrio. Bakteri yang tumbuh dominan selanjutnya dimurnikan
dan diidentifikasi berdasarkan uji biologis dan biokimia. Uji virulensi dilakukan dengan cara menginfeksikan
isolat bakteri dengan berbagai kepadatan (konsentrasi akhir 103–106 CFU/mL) terhadap masing-masing 20
ekor yuwana abalon yang dipelihara dalam stoples kaca berisi 1 L air laut yang sudah disaring dengan ultramembran filter (0,05 μm). Setiap perlakuan diulang 3 kali. Pengamatan dilakukan terhadap kematian larva
selama 3 hari pemeliharaan. Dari penelitian diperoleh 3 isolat vibrio dan berdasarkan karakternya ketiga
isolat diidentifikasi sebagai Vibrio cincinnatiensis. Hasil uji virulensi menunjukkan bahwa ketiga isolat patogen
pada yuwana abalon. Rata-rata mortalitas setelah tiga hari pemeliharaan untuk isolat–1, isolat–2, dan
isolat–3 pada perlakuan kepadatan bakteri 106 CFU/mL adalah 13,33%; 18,33%; dan 21,67%; sedangkan
mortalitas pada kelompok kontrol hanya 3,33%.
KATA KUNCI:
abalon, Haliotis squamata, vibriosis, Vibrio cincinnatiensis
PENDAHULUAN
Abalon, Haliotis spp. merupakan komoditas perikanan yang bernilai ekonomis tinggi. Untuk
memenuhi permintaan pasar akan abalon ukuran konsumsi tidak dapat lagi mengandalkan hasil
tangkapan dari alam melainkan harus melalui usaha budidaya. Di Cina usaha budidaya abalone
telah berkembang dengan pesat sejak tahun 1986 (Yang & Ting, 1986 dalam Cai et al., 2006). Di
antara berbagai spesies yang dibudidayakan, Haliotis diversicolor supertexta merupakan yang paling
penting secara komersial (Cheng et al., 2002 dalam Cai et al., 2006). Sejak akhir tahun 2000 budidaya
abalon menghadapi masalah serius di Cina yaitu terjadinya kematian massal dan kegagalan
penempelan larva di kolam-kolam pembesaran (Lee et al., 2001 dalam Cai et al., 2006). Tahun 2002
kematian massal (di atas 90%) juga terjadi pada post larva umur antara 7 dan 30 hari secara mendadak
sehingga banyak usaha budidaya abalon ditutup (Cai et al., 2006) Penyebab kematian abalon tersebut
telah diidentifikasi sebagai Vibrio parahaemolyticus (Cai et al., 2006). Vibrio memang sudah dikenal
sebagai ancaman utama dalam budidaya laut (Egidius, 1987; Austin & Austin, 1993; AnguianoBeltran et al., 1998).
Di Balai Besar Riset Perikanan Budidaya Laut (BBRPBL) Gondol, Bali, pembenihan abalon, Haliotis
squamata mulai dikembangkan sejak tahun 2006 melalui kerja sama dengan perusahaan swasta
“Maritech” dari Jepang dan melalui dana APBN. Abalon dipilih karena spesies ini mempunyai nilai
ekonomis yang tinggi, terutama di Jepang. Di Jepang, H. squamata dikenal dengan nama ‘tokobushi”.
Sampai saat ini penelitian abalon di Gondol sudah sampai tahap pembesaran benih di keramba
jaring apung (KJA). Namun demikian induk abalon yang baru ditangkap dari alam dan larva/benih
yang dihasilkan sering mengalami kematian setelah dipelihara di hatcheri BBRPBL Gondol, Bali.
Peluang keberhasilan pembenihan abalon untuk daerah tropis cukup besar mengingat Thailand
sebelumnya telah berhasil membenihkan Haliotis asinina secara massal (Singhagraiwan & Masanori,
1993). Mengingat abalon adalah spesies yang baru dikembangkan di Indonesia maka disadari informasi
tentang penyakit masih sangat minim. Berdasarkan literatur yang sudah ada diketahui bahwa salah
Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2010
934
satu penyakit yang sering menyerang abalon adalah vibriosis. Diduga abalon yang hidup di Indonesia juga rentan terhadap vibriosis.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan isolat vibrio dari abalon sakit, mengetahui
spesiesnya, dan mengetahui tingkat patogenisitasnya terhadap yuwana abalon, Haliotis squamata.
BAHAN DAN METODE
Isolasi Bakteri
Sepuluh ekor abalon sakit diambil dengan pipet steril dan dimasukkan ke dalam petridish steril
berisi 0,5 mL PBS steril dan dicuci beberapa kali dengan PBS. Larva selanjutnya digerus dalam tabung
steril berisi 0,5 mL PBS steril. Setelah melalui serangkaian pengenceran 10 kali maka 100 μL dari
masing-masing pengenceran diinokulasikan pada media Marine Agar (MA) dan Thiosulphate Citrate
Bile Salt Sucrose (TCBS) agar dan diinkubasi pada suhu 27°C. Setelah 2–3 hari inkubasi, masingmasing koloni yang terlihat dominan dan berbeda morfologinya dipindahkan ke media baru sehingga
didapatkan isolat murni. Isolat murni tersebut selanjutnya disimpan dalam Marine Broth yang
ditambah 10% glycerol pada suhu –20°C.
Identifikasi Bakteri
Isolat bakteri diidentifikasi secara biologis dan biokimia di Laboratorium Penyakit Ikan Jurusan
Perikanan, Fakultas Pertanian, Universitas Gajah Mada Yogyakarta, berpedoman pada Holt et al. (1994).
Uji Patogenisitas
Yuwana abalon sehat (dilihat secara visual) umur sekitar dua bulan (panjang cangkang sekitar 0,9
cm) diambil dan dibawa ke laboratorum patologi BBRPBL Gondol. Yuwana abalon selanjutnya
ditempatkan dalam sebuah botol volume 2 L dan dicuci dengan 500 mL air laut steril (dengan cara
diautoclave) yang mengandung antibiotik Vet Strep (dengan bahan aktif Streptomycin dan Dihydrostreptomycin) 3 mg/L.dan selanjutnya direndam selama 6 jam. Setelah yuwana bebas bakteri, yaitu
setelah melalui uji dengan menginokulasikan pada media tumbuh bakteri, barulah yuwana siap
digunakan untuk uji virulensi.
Uji patogenisitas dilakukan dengan cara menempatkan masing-masing 20 ekor yuwana abalon
ke dalam 2 L beacker yang berisi 1 L air laut yang sudah disaring dengan ultra membrane filter (0,05
μm) pada suhu kamar. Ke dalam masing-masing beacker tersebut selanjutnya diinokulasikan bakteri
uji dengan berbagai kepadatan (bakteri umur 24 jam, konsentrasi akhir 103–106 CFU/mL). Sedangkan
untuk kontrol hanya ditambah PBS. Penelitian dilakukan di Laboratorium Patologi BBRPBL Gondol,
Bali dalam Rancangan Acak Lengkap dengan 3 ulangan. Mortalitas diamati tiap hari selama 3 hari.
Re-isolasi dan identifkasi bakteri juga dilakukan terhadap yuwana yang sakit sebagai konfirmasi
penyebab kematian yuwana abalon.
HASIL DAN BAHASAN
Isolasi Bakteri
Dari abalon sakit telah diisolasi tiga isolat vibrio yang terlihat dominan tumbuh pada media agar
TCBS dengan membentuk koloni berwarna kuning. Karakteristik ketiga isolat tersebut disajikan dalam
Tabel 1. Secara visual isolat–1 membentuk koloni paling besar di antara ketiga isolat uji dengan
bentuk pinggir koloni yang bergerigi pada media TCBS; Sedangkan isolat–3 adalah paling kecil dan
pinggirannya terlihat rata seperti isolat–2.
Identifikasi Bakteri
Hasil pengujian biologi dan biokimia menunjukkan bahwa ketiga isolat menunjukkan karakter
yang sama kecuali untuk uji pada media TSIA di mana isolat–2 memberikan reaksi berbeda dengan
isolat–1 dan isolat–3. Ketiga isolat adalah Gram-negatif, berbentuk batang pendek, oksidase dan
katalase positif, fakultatif anaerobik, dan sensitif terhadap 0/129. Data hasil uji menunjukkan kemiripan
yang mencapai 95% dengan karakter Vibrio cincinnatiensis yang dikemukakan oleh Holt et al. (1994).
935
Isolasi, karakteristik, dan uji patogenisitas... (Zafran)
Hasil yang berbeda antara ketiga isolat dengan V. cincinnatiensis hanya pada pemanfaatan sorbitol di
mana ketiga isolat yang dipakai dalam penelitian ini mampu memanfaatkan sorbitol sedangkan
menurut Holt et al. (1994) bakteri V. cincinnatiensis tidak mampu memanfaatkan sorbitol. Hasil lengkap
uji biologi dan uji kimia ketiga isolat disajikan dalam Tabel 1. Berdasarkan karakter tersebut ketiga
isolat diidentifikasi sebagai Vibrio cincinnatiensis. Spesies tersebut belum pernah dilaporkan sebelumnya
patogen pada abalon, V. cincinnatiensis pertama kali dilaporkan pada manusia penderita meningitis
Tabel 1. Karakteristik biologi dan biokimia 3 isolat Vibrio yang diisolasi dari abalon sakit
dibandingkan dengan Vibrio cincinnatiensis
Karakteristik
Bentuk sel
Gram
Motility
Aerobiosis
Isolat
Isolat
Isolat
Batang pendek Batang pendek Batang pendek
+
+
+
Facultative
anaerob
Facultative
anaerob
Facultative
anaerob
O/F
F
F
F
Pertumbuhan pada 30°C
+
+
+
Gelatinase
Oksidasi
+
+
+
Indole production
Katalase/Catalase
+
+
+
Pemanfaatan
Trehalose
+
+
+
D-Glucose
+
+
+
Maltose
+
+
+
D-Mannose
+
+
+
Galactose
+
+
+
Lactose
Mannitol
+
+
+
Sorbitol
+
+
+
Sucrose
+
+
+
D-Xylose
+
+
+
Ornithin
Simmon Citrate
+
+
+
Asculin
Raffinose
Lysine decarboxylase
TSIA
Acid/Acid
Catalis/Acid
Acid/Acid
Sensitivitas
0/129
S
S
S
Novobiocin (200 μg)
S
S
S
OTC (200 μg)
S
S
S
Erythromycin (50 μg)
S
S
S
Morfologi koloni
- Warna TCBS
Kuning
Kuning
Kuning
- Bentuk/form on TSA salt
Circulair
Circulair
Circulair
Similaritas terhadap Vibrio 19/20 karakter 19/20 karakter 19/20 karakter
cincinnatiensis
= 95%
= 95%
= 95%
Keterangan:
ND: Tidak ada data; S: Sensitif
V. cincinnatiensis
(Holt et al ., 1994)
Batang
+
Facultative anaerob
F
+
+
+
+
+
+
+
ND
+
+
+
+
ND
ND
ND
ND
S
ND
ND
ND
ND
ND
936
Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2010
di Cincinnati, Ohio (Brayton et al., 1986). Pada tahun 1999 bakteri V. cincinnatiensis diisolasi dari
kerang Mytilus galloprovincialis di Italia (Ripabelli et al., 1999).
Uji Patogenisitas
Hasil uji patogenisitas menunjukkan bahwa ketiga isolat vibrio adalah patogen bagi abalon,
terutama isolat–2 dan isolat–3. Mortalitas abalon yang diberi perlakuan infeksi bakteri terlihat
meningkat sesuai dengan peningkatan kepadatan bakteri dan waktu pemeliharaan. Setelah tiga hari
pemeliharaan dengan perlakuan kepadatan bakteri 106 CFU/mL, mortalitas pada perlakuan isolat–1,
isolat–2, dan isolat–3 masing-masing adalah 13,33%; 18,33%; dan 21,67%. Sedangkan pada kontrol
mortalitas larva setelah tiga hari pemeliharaan hanya 3,33%. Data lengkap mortalitas larva pada
masing-masing perlakuan disajikan dalam Tabel 2. Tingkat patogenisitas ketiga isolat vibrio yang
digunakan dalam penelitian ini tampaknya tidak setinggi Vibrio parahaemolyticus yang diisolasi dari
H. diversicolor supertexta di mana LD50 dari bakteri tersebut sangat rendah (< 103 CFU/mL) dalam
waktu pemeliharaan hanya tiga hari (Cai et al., 2006). Namun demikian dari penelitian ini terindikasi
bahwa keberadaan vibrio tetap menjadi ancaman serius bagi budidaya abalon (H. squamata) karena
dapat menimbulkan penurunan sintasan secara signifikan.
Tabel 2. Patogenisitas tiga isolat vibrio terhadap yuwana abalon,
Haliotis squamata
Mortalitas (%)
Dosis
(CFU/mL)
24 jam
48 jam
72 jam
1
106
105
104
103
0.00
0.00
0.00
0.00
5.00
3,33
1,67
0.00
13,33 ± 2,89
8,33 ± 2,89
5,00 ± 0
1,67 ± 2,89
2
106
105
104
103
0.00
0.00
0.00
0.00
13,33
6,67
1,67
0.00
18,33 ± 5,77
13,33 ± 5,77
11,67 ± 5,77
5,00 ± 0
3
106
105
104
103
0.00
0.00
0.00
0.00
16,67
8,33
6,67
1,67
21,67 ± 2,89
13,33 ± 5,77
8,33 ± 5,77
3,33 ± 2,89
Kontrol
-
0.00
1,67
3,33 ± 2,89
Isolat
Gejala klinis abalon yang sakit/mati pada perlakuan infeksi bakteri vibrio terlihat sama dengan
gejala klinis pada kasus kematian alami, yaitu daging abalon jadi putih dan mengkerut sehingga
bagian pinggir cangkang terlihat kosong. Kematian mulai terlihat pada hari kedua pasca inokulasi
bakteri uji ke dalam air media pemeliharaan abalon. Abalon sakit/mati mudah dibedakan dari abalon
sehat dengan cara menyentuh tubuh abalon dengan benda padat berupa sendok atau pinset. Abalon
hidup/sehat akan menempel dengan kuat pada substrat atau wadah penelitian, sedangkan yang
lemah/mati akan lepas dari substrat. Bahkan dengan hanya memiringkan wadah penelitian saja abalon
sakit/mati akan terbawa bersama gerakan air.
Kematian massal abalon akibat infeksi vibrio (vibriosis) sebetulnya bukan informasi baru. Berbagai
spesies vibrio telah dilaporkan sebagai patogen pada berbagai spesies abalon, antara lain Vibrio
alginolyticus pada Haliotis rufescens (Anguiano-Beltran et al., 1998), V. carchariae pada H. tuberculata
(Nicolas et al., 2000), V. harveyi dan V. splendidus I pada H. iris (Bower, 2003), dan V. parahaemolyticus
pada H. diversicolor supertexta (Liu et al., 2000; Cai et al., 2006). Ancaman kematian oleh vibriosis
kelihatannya tidak hanya pada abalon stadia larva/pasca-larva tapi juga pada abalon dewasa. Zafran
937
Isolasi, karakteristik, dan uji patogenisitas... (Zafran)
& Susanto (2007) melaporkan bahwa induk H. squamata juga rentan terhadap vibrio yang diisolasi
dari abalon yang mengalami borok. Ke depan, perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mengetahui
spesies apa saja dari vibrio yang jadi patogen pada H. squamata, khususnya di Indonesia.
Untuk mencegah kematian abalon akibat vibriosis maka keberadaan vibrio dalam lingkungan
pemeliharaan abalon perlu dikendalikan, antara lain dengan penerapan “biosecurity”. Selain itu,
perlu dicari obat/antibiotik yang tepat dan efektif untuk pengendalian vibriosis pada abalon. Beberapa
peneliti melaporkan bahwa kasus kematian massal abalon akibat vibriosis berkaitan erat dengan
peningkatan suhu air (Anguiano-Beltran et al., 1998; Liu et al., 2000; Lee et al., 2001 dalam Cai et al.,
2006; Raimondi et al., 2002). Karena itu, kestabilan suhu air pemeliharaan abalon pada level optimum, terutama di hatcheri, perlu mendapat perhatian serius guna mencegah terjadinya kematian
abalon yang dipelihara akibat vibriosis.
KESIMPULAN DAN SARAN
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa bakteri yang diisolasi dari abalon (Haliotis
squamata) sakit adalah bersifat patogen terhadap yuwana abalon. Berdasarkan karakter biologi dan
biokimianya ketiga isolat yang diuji diidentifkasi sebagai Vibrio cincinnatiensis. Perlu penelitian lebih
lanjut untuk mengetahui spesies lain dari vibrio yang patogen pada abalon, baik pada larva di
hatcheri maupun pada pembesaran.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini dibiayai dari Dana Hibah Penelitian bagi peneliti dan perekayasa kerja sama Depdiknas
dan DKP Tahun 2009. Penulis mengucapkan terimakasih kepada Muhamad Ansyari dan Slamet Haryanto
sebagai teknisi Laboratorium Patologi Balai Besar Riset Perikanan Budidaya Laut Gondol, Bali atas
bantuannya sehingga penelitian ini dapat berjalan lancar sesuai rencana.
DAFTAR ACUAN
Anguiano-Beltran, C., Searcy, B.R., & Lizarraga, P.M.L.. 1998. Pathogenic effects of Vibrio algynolyticus
on larvae and postlarvae of the red abalone, Haliotis rufescens. Dis. Aquat. Org., 33: 119–122.
Austin, B. & Austin, D.A. 1993. Vibrionaceae representative. In : Austin, B & Austin, D.A. (Eds.), Bacterial Fish Pathogens: Diseases in farmed and wild fish. Ellis Horwood Ltd, Chichester, p. 265–307.
Bower, S.M. 2003. Update on emerging abalone diseases and techniques for health assassment. J. of
Shellfish Research, 22: 805–810.
Brayton, P.R., Bode, R.B., Colwell, R.R., Mac Donell, M.T., Hall, H.L., Grimes, D.J., West, P.A., & Bryant,
T.N. 1986. Vibrio cincinnatiensis sp. Nov., new human pathogen. J. of Clinical Microbiology, 23(1):
104–108.
Cai, J., Han, Y., & Wang, Z. 2006. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from abalone (Haliotis diversicolor
supertexta L.) postlarvae associated with mass mortalities. Aquaculture, 257:161–166.
Cheng, Q.Z., Hu, X.G., Gao, A.G., & Yang, J.Y. 2002. Studies on the technology for mass production of
abalone breeding. Mar. Sci. Bull., 4: 82–86.
Egidius, E. 1987. Vibriosis: pathogenicity and pathology. Aquaculture, 67: 15–28.
Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T., & Williams, S.T. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition. Maryland. USA. 787 pp.
Liu, P.C., Chen, Y.E., Huang, C.Y., & Lee, K.K. 2000. Virulence of Vibrio parahaemolyticus isolated from
cultured small abalone, Haliotis diversicolor supertexta, with withering syndrome. Let. Appl. Microbiol.,
31(6): 433–437.
Nicolas, J.L., Basuyaux, D., Mazurie, J., & Thebault, A. 2002. Vibrio carchariae, a pathogen of the
abalone Haliotis tuberculata. Dis. Aquat. Org., 50: 35–43.
Raimondi, P.T., Wilson, C.M., Ambrose, R.F., Engle, J.M., & Minchinton, T.E. 2002. Continued declines
of black abalone along the coast of California: are mass mortalities related to El Niño events?. Mar.
Ecol. Prog. Ser., 242: 143–152.
Ripabelli, G., Sammarcoa, M.L., Grasso, G.M., Fanellia, I., Capriolib, A., & Luzzic, I. 1999. Occurrence
of Vibrio and other pathogenic bacteria in Mytilus galloprovincialis (mussels) harvested from Adriatic
Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2010
938
Sea, Italy. International J. of Food Microbiology, 49: 43–48.
Singhagraiwan, T. & Masanori, D. 1993. Seed production and culture of a tropical abalone, Haliotis
asinina Linn. The Eastern Marine Fisheries Development Center (EMDEC) of Thailand & The Japan
International Cooperation Agency (JICA). 32 pp.
Yang, H.H. & Ting, Y.Y. 1986. Artificial propagation and culture of abalone (Haliotis diversicolor supertexta,
Lischke). Bull. Taiwan Fish. Res. Inst., 40: 195–201.
Zafran & Susanto, B. 2007. Infeksi Vibrio pada induk abalone (Haliotis squamata) di hatchery (Suatu
Studi Pendahuluan). Prosiding Konferensi Aquaculture Indonesia, Surabaya, 5–7 Juni 2007, MAI, hlm.
73–76.