Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion

Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok
Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput
Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok;
(Studi eksperimental pada mencit)
Handi Priambodo,1 Suradi,1 Reviono,1 Yusup S Sutanto,1 Ana Rima,1 Harsini,1 Yuyun Rindiastuti,2
Abdurahman Laqif,3 Indah Julianto2
1
Departemen Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret,
RSUD Dr. Moewardi, Surakarta
2
Departemen Kulit dan Kelamin, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret,
RSUD Dr. Moewardi, Surakarta
3
Departemen Obstetri dan Ginekologi, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret,
RSUD Dr. Moewardi, Surakarta
Abstrak
Latar belakang: Asap rokok menyebabkan peradangan paru dan apoptosis yang bermuara terjadinya PPOK. Sekresi sel punca mesenkimal
(SPM) berperan penting dalam regenerasi jaringan paru. Penggunaan media terkondisi sel punca mesenkimal dapat menjadi alternatif untuk
transplantasi sel punca mesenkimal. Media terkondisi yang diperoleh dari biakan3D SPM selaput amnion dalam kondisi hipoksia. Tujuan penelitian
ini untuk menganalisis pengaruh media terkondisi SPM selaput amnion sebagai anti apoptosis pada kerusakan paru akibat asap rokok.
Metode: Penelitian dilakukan dari Februari-Juni 2015. Penelitian ini dilakukan setelah mendapat persetujuan dari komite etik hewan. Untuk
menyelesaikan penelitian ini digunakan sebanyak 30 ekor mencit yang diberi asap rokok selama 12 minggu, 15 ekor mencit diberi media
terkondisi sel punca mesenkimal selaput amnion dan sisanya tidak, selanjutnya dilakukan pemeriksaan histopatologi melalui nilai mean linier
intercept dan ekspresi active caspase 3 pada jaringan paru hewan coba yang dipapar asap rokok. Dengan uji in vitro sel fibroalveolar yang
telah diberi media terkondisi sel punca mesenkimal dan diberi ekstrak asap rokok dinilai menggunakan MTT asay dan konsentrasi VEGF A.
Hasil: Media terkondisi sel punca mesenkimal menghambat kerusakan paru yang dikonfirmasi dengan mLi yang rendah, selanjutnya
menghambat terjadinya apoptosis sel paru yang dikonfirmasi dengan rendahnya tingkat caspase-3 (p=0.00). selanjutnya secara In-vitro
menjelaskan bahwa media terkondisi sel punca mesenkimal selaput amnion mendorong proliferasi sel fibroalveolar (MTT assay; p=0.00),
efek anti apoptosis dengan VEGF (VEGF pada media terkondisi sel punca mesenkimal =1082.06 pg/ml; grup kontrol= 261.027 pg/ml)
Kesimpulan: Media terkondisi sel punca mesenkimal selaput amnion berpotensi menghambat kerusakan paru akibat asap rokok pada
mencit dengan menghambat apoptosis sel dengan merangsang VEGF. (J Respir Indo. 2016; 36: 249-56)
Kata kunci: Media terkondisi sel punca smesenkimal, apoptosis, asap rokok.
The Effect of Amniotic Membrane Mesenchymal Stem Cell Conditioned
Media (MSC-CM) on Cigarette Smoke Induced Lung Damage
(an experimental study in mice)
Abstract
Background: Cigarette smoking causes pulmonary inflammation and apoptosi simplicated in COPD. MSC secreting factors plays crucial
role in tissue regeneration. Using MSC conditioned media (MSC-CM) might be an alternativeto MSC transplantation. Conditioned media
was obtained from hypoxic 3D culture of amniotic membrane MSC. This study aimed to test the effect of administration of MSC-CM in
inhibiting apoptosis in cigarette smoke lung damage. The aim of this study is to test the effect of administration of MSC-CM in inhibiting
apoptosis in cigarette smoke induced lung damage
Methods: Research was conducted in 5 months from February to Juni 2015 and under ethical clearance approval. To accomplish this study,
30 mice were exposed to cigarrete smoke for 12 weeks, 15 mice followed by MSC-CM administration and others with unconditioned media,
mean linier intercept (mLi) and Caspase-3 were measured from lung histophatology. In vitro study using fibroalveolar cell exposed to cigarette
smoke exctract (2%CSE) followed with MSC-CM was conducted to confirm effect of MSC-CM by MTT assay and VEGF level measurement.
Result: This research revealed that MSC-CM inhibit lung damage confirmed with significantly lower mLi, while inhibit pulmonary cell
apoptosis with significantly lower Caspase-3 level in mice administered with MSC-CM (p=0.00). In vitro study provides the evidence
that MSC-CM promote fibroalveolar proliferation (MTT assay; p=0.00), while mediates anti-apoptosis effect which partly depends on up
regulating of VEGF (VEGF level of MSC-CM group=1082.06 pg/ml; control group 261.027 pg/ml)
Conclusion: MSC-CM has therapeutic potential in cigarette smoke induced lung damage in mice by inhibiting cell apoptosis as well as
upregulating VEGF. (J Respir Indo. 2016; 36: 249-56)
Keywords: Cigarette smoke, apoptosis, stem cell conditioned media
Korespondesi: Handi Priambodo
E-mail: [email protected]; Hp: 08123185027
J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016
249
Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok
PENDAHULUAN
media terkondisi sel punca mesenkimal mencegah
Pajanan asap rokok menyebabkan kerusakan
jaringan paru melalui mekanisme stress oksidatif, infla­
masi menetap, degradasi matriks ekstraseluler oleh
akti­vitas protease, apoptosis, serta perbaikan abnormal
jaringan paru yang bermuara pada terjadinya penyakit
paru obstruksi kronik (PPOK).1 Penyakit paru obstruksi
kronik adalah salah satu penyebab kematian utama
karena merokok dan telah menjadi masalah kesehatan
global.2
Stres oksidatif menyebabkan apoptosis sel epi­
tel alveolar dan emfisema melalui blokade reseptor
vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A).3 Tera­pi
terkini PPOK meliputi terapi suportif dan belum terdapat
bukti yang cukup mengenai terapi regenerasi untuk
memperbaiki
emfisema.2 Schweitzer
dkk1
me­nun­
jukkan penurunan infiltrasi mediator inflamasi dan peru­­
bahan emfisematous dengan transplantasi sel punca
mesenkimal (SPM) jaringan adiposit dan didapatkan
perbaikan endotel paru dengan pemberian media
terkondisi sel punca mesenkimal pada jaringan paru tikus
model yang dirusak dengan asap rokok. Hal ter­
sebut
menunjukkan bahwa efek perbaikan sel punca mesen­
kimal mungkin dimediasi oleh mekanisme parakrin.4
Selaput amnion merupakan salah satu sumber
sel punca mesenkimal yang berasal dari jaringan fetal.
Selaput amnion telah menjadi sumber sel punca pilihan
karena
pengambilan sampel
yang mudah, tidak
dibatasi kendala etik, potensi diferensiasi lebih baik
daripada sel punca jaringan dewasa, serta toleransi
imunologis yang lebih baik sehingga mudah dan aman
untuk ditransplantasikan.5,6
Penelitian mengenai pengaruh media terkondisi
sel punca mesenkimal (MT SPM) selaput amnion
yang dihasilkan melalui metode biakan 3 dimensi
kondisi hipoksia pada hewan model yang dipapar
asap rokok untuk menginduksi kerusakan jaringan
paru belum pernah dilakukan. Penelitian ini dilakukan
untuk menganalisis kemampuan MT SPM dalam
menghambat apoptosis jaringan paru akibat pajanan
asap rokok melalui upregulasi VEGF A yang sejalan
dengan peningkatan viabilitas dan proliferasi sel
fibroalveolar. Penelitian ini menunjukkan kemampuan
250
apoptosis jaringan paru mencit (mus musculus) galur
Balb-c yang dipapar dengan asap rokok. Uji in-vivo
menunjukkan bahwa pada kelompok II yang diberi
media terkondisi sel punca mesenkimal didapatkan
nilai mLi sebagai penanda kerusakan alveolar yang
lebih rendah dan ekspresi active caspase-3 sebagai
penanda apoptosis yang lebih rendah. Uji in-vitro
menunjukkan bahwa pada biakan sel fibroalveolar
yang diberi ekstrak asap rokok 2% bersama media
terkondisi sel punca mesenkimal memiliki viabilitas
dan tingkat proliferasi sel yang lebih tinggi dengan
kadar VEGF-A 4 kali lebih tinggi.7
METODE
Cell line yang berasal dari biakan SPM selaput
amnion P-1 yang dikembangkan oleh Laqif.7 di thawing
untuk dibiakkan kembali dalam media tumbuh (alpha
MEM (Gibco), 1% NEAA 100x(Gibco), 1% penstrep
(10.000U/10.000ug/ml), 1% fungizone 250ug/ml, dan
10% fetal bovine serum (Gibco) pada inkubator dengan
CO2 5% dan 370C. Subkultur sel punca dilakukan
pada biakan sel yang telah mencapai konfluensi
70%. Subkultur dilakukan dengan metode tripsinasi
hangat. Sel punca mesenkimal selaput am­nion P-2
dilakukan purifikasi dengan imunomagnetik sorting.
Biakan sel punca dilabel dengan antibodi microbeads
anti human CD105 kemudian dilewatkan dalam kolom
magnetik yang dipasang dalam magnetic stand untuk
memperoleh biakan sel dengan CD105 positif sesuai
protokol yang dianjurkan oleh Myltenill Biotech.7
Uji diferensiasi dilakukan untuk memastikan
multipotensi dan kemampuan diferensiasi SPM. Sel
punca mesenkimal P-3 dibiakkan dalam osteogenik
media: 192ml media kultur, 10nM dexametason, 20nM
beta gliserolfosfat, 50uM L-ascorbic acid; atau adipogenik
media: 200ml media kultur, 0.5uM dexametason, 0.5uM
IBMX, 50uM indometasin. Setelah 21 hari, biakan SPM
diwarnai dengan alizarin red dan oil red. Biakan SPM
P-3 dibiakkan dalam neurogenik media: 200ml
media kultur, 5ng/ml all trans retinoid acid, untuk
mengetahui kemampuan transdiferensiasi menjadi
galur sel lain. Setelah 5 hari, biakan sel tersebut
diwarnai dengan neural specific enolase (NSE).7
J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016
Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok
Media terkondisi sel punca mesenklimal dibuat
Yong Kim dkk.9 40 ml asap rokok yang berasal dari
dari biakan sel punca mesenkimal pasase-4 dengan
rokok filter yang mengandung 8,5mg tar dan 0,9mg
modifikasi metode biakan badan embrioid sel punca dan
nikotin dialirkan melalui spuit injeksi steril ukuran 50ml
biakan dalam stirred bioreaktor pada kondisi hipoksia
ke dalam 10ml DMEM tanpa serum sambil diagitasi.
(2.2% O2, 5%CO2, dan nitrogen balanced). Setelah 24
Ekstrak asap rokok tersebut disterilisasi menggunakan
jam inkubasi, media terkondisi sel punca mesenkimal
filter millipore 0.22um dan merupakan ekstrak dengan
dikumpulkan kemudian difilter dengan millipore 45um
konsentrasi 100%.10
dan disimpan dalam suhu -20oC sampai digunakan.8
Penelitian dilakukan di LPPT unit IV UGM
berdasarkan ethical clearance yang diterbitkan oleh
panitia kelaikan etik UGM. Sebanyak 30 mencit galur
Balb-c dengan berat badan 20-30 gram diasapi dengan
rokok 5 batang/hari selama 12 minggu. Mencit dibagi
menjadi 2 kelompok yang masing-masing terdiri dari
15 mencit. Mencit pada kelompok I diberi suntikan
DMEM 30ul iv, sedangkan kelompok II diberi suntikan
30ul MT SPM iv. Penyuntikan dilakukan pada minggu
kedua sampai ke-12, satu jam sebelum pengasapan.
Pengambilan jaringan paru dilakukan pada hari ke-90
untuk dilakukan pemeriksaan histopatologi.7
Potongan longitudinal jaringan paru diwarnai
dengan hematoksilin eosin (HE) untuk analisis mean
linier intercept (mLi) dan dengan antibodi anti caspase-3
sebagai penanda apoptosis. Analisis mLi dilakukan ber­
dasarkan protokol yang dikembangkan oleh Masaru
Suzuki M dkk.8 dengan modifikasi menggunakan soft­
ware Image J. Penghitungan intercept dilakukan pada
20 lapang pandang (per­besaran 200x) secara acak
dalam setiap potongan jaringan paru. Intercept yang
dihitung adalah jarak antara dinding alveolar, sedang­
kan gambaran dengan bronkus, pembuluh darah, dan
ruang alveolar yang terkompresi dieksklusikan dari
penghitungan.8
Ekspresi active caspase-3 ditentukan secara
Isolasi jaringan fibroblas dilakukan dengan
metode eksplan dan dibiakkan dengan media kultur
DMEM, 10% bovine serum, 1% penstrep, 1% fungizone
dalam inkubator CO2 5% dan suhu 370C. Isolasi dan
biakan sel epitel alveolar dilakukan berdasarkan
metode yang dikembangkan oleh Robert dkk10
dan dimodifikasi di laboratorium. Sel epitel alveolar
dibiakkan dengan media kultur: DMEM-HamF12, 10%
fetal bovine serum, 1% penstrep, 1% fungizone, 1%
L glutamin, 10ng/ml EGF dalam inkubator CO2 5%
dan suhu 370C. Subkultur dilakukan pada biakan sel
dengan konfluensi 70-80% dengan metode tripsinasi
hangat. Kokultur dilakukan dengan membiakkan sel
fibroblas bersama dengan sel epitel alveolar P-3
dalam media: DMEM-HamF12, 10% fetal bovine
serum, 1% penstrep, 1% fungizone, 1%NEAA, 1%
L-glutamin, 10ng/ml bFGF, 10ng/ml EGF.10
Uji in-vitro dilakukan pada biakan ko kultur
yang telah diinkubasi selama 24 jam. Biakan sel
fibroalveolar dibagi menjadi 2 kelompok, Kelompok
I diberi ekstrak asap rokok 2% dalam DMEM +
1% FBS, sedangkan kelompok II diberi ekstrak
asap rokok 2% dalam media terkondisi sel punca
mesenkimal dan diinkubasi selama 24 jam. Biakan
sel fibroalveolar dalam piring mikro bersumur 96
digunakan untuk uji proliferasi sel dengan MTT
otomatis dengan software Image J dengan menentukan
((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium
resolusi pixel tertentu sesuai dengan intensitas eks­
bromide) assay. MTT assay((3-(4,5-dimethylthiazol-
presi positif yang telah ditentukan oleh ahli Patologi
2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide) assay pada
Anatomi. Ekspresi active caspase-3 (+) dinyatakan
penelitian ini dilakukan untuk mengukur jumlah sel
sebagai persentase intensitas warna dalam pixel yang
yang viabel dan proliferasi sel dengan reagen Thiazolyl
membandingkan ekspresi sel (+) dengan total seluruh
blue tetrazolium bromide berdasarkan protokol yang
sel dalam area perhitungan.7
diberikan oleh Sigma.7-10
Preparasi ekstrak asap rokok dilakukan ber­
Supernatan biakan sel tersebut dikumpulkan
dasarkan metode yang di kembangkan oleh Sun
untuk mengetahui sitokin yang dilepaskan dalam
J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016
251
Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok
media dengan uji ELISA. Dalam uji ELISA ini akan
Media terkondisi diperoleh dari biakan badan
dilakukan pemeriksaan VEGF-A. Uji ELISA dilakukan
embrioid 3D dalam stirred bioreaktor sederhana pada
berdasarkan protokol yang diberikan oleh reagen
kondisi hipoksia dengan 2.2% O2, 5% CO2, dan nitrogen
VEGF-A ELISA kit (RayBio). Kadar VEGF supernatan
balance. Teknik ini memungkinkan aliran oksigen, nut­
pada masing-masing kelompok dihitung menggunakan
rien, dan hasil metabolisme yang menyerupai kondisi
rumus regresi yang diperoleh dari larutan standar yang
in-vivo. Pada teknik ini didapatkan peningkatan via­
ditentukan dengan software curve expert 1.4.
bilitas dan proliferasi sel yang ditunjukkan dengan
Perbedaan rerata nilai mLi, ekspresi active
caspase-3, serta viabilitas dan tingkat proliferasi sel
peningkatan diameter koloni 3D setelah 24 jam seperti
pada gambar berikut
dianalisis menggunakan uji t tidak berpasangan dengan
software SPSS 19.0 Nilai signifikansi, p<0.05 digunakan
untuk menentukan kemaknaan hasil uji statistik.
a
HASIL
Sel punca mesenkimal selaput amnion yang
digunakan dalam penelitian ini merupakan cell line
P-1 yang telah dikembangkan oleh Laqif7 dengan
penanda permukaan CD44 dan CD105 (+) >95%
serta CD45 dan CD34 (-)<2%.
Uji diferensiasi dilakukan pada biakan sel punca
P-3 yang telah disorting dengan metode MACS menggu­
nakan antibodi anti CD105 untuk menjamin plastisitas
sel. Gambar berikut menunjukkan hasil uji difersensiasi
SPM menjadi sel osteoblas, adiposit, dan neuron.
b
Gambar 3. Gambaran badan embrioid 3D. (A) koloni badan embrioid
3D pada piring mikro berdasar bulat (B) Koloni badan
embrioid 3D dalam stirred bioreaktor-hipoksia setelah 24
jam. Terlihat diameter 1.5x lebih besar daripada koloni
sebelum dibiakkan dalam stirred bioreaktor-hipoksia.
Diamati dengan mikroskop inverted perbesaran 100x
Uji in vivo dilakukan pada hewan coba mencit
(Mus musculus) jantan galur Balb-c yang berusia
10 minggu. Rata-rata berat badan mencit sebelum
perlakuan pada kelompok I adalah 26.55 ± 2.73 gram
dan pada kelompok II adalah 28.56 ± 1.46 gram.
Pada akhir penelitian didapatkan rata-rata berat
badan mencit kelompok I sebesar 37.07 ± 3.49 gram
dan kelompok II sebesar 35.64 ± 2.83 gram. Jaringan
a
b
c
Gambar 1.
Gambar (a) biakan sel setelahthawing, viabilitas
94% (b) biakan sel 24 jam setelah ditanam dengan
kepadatan 60% (c) biakan sel 48 jam setelah ditanam
dengan kepadatan 70-80%. Diamati dengan mikroskop
inverted perbesaran 100x
a
b
c
Gambar 2.Uji diferensiasi sel punca mesenkimal. (A) sel
osteoblas dengan pewarnaan alizarin red (B) sel
adiposit dengan pewarnaan oil red (C) sel neuron
dengan pewarnaan NSE. Diamati dengan mikroskop
inverted perbesaran 100x.
252
paru pada kedua kelompok diambil setelah 90 hari
perlakuan dan dilakukan pewarnaan menggunakan
HE. Berikut adalah gambaran sediaan histopatologi
jaringan paru yang telah diwarnai dengan HE.
Gambar 4.
Gambaran histopatologi jaringan paru dengan
pewarnaan HE (pelebaran ruang alveolar; infiltrasi
sel radang). (A) Kelompok I, terlihat pelebaran ruang
alveolar dan inflitrasi sel radang (B) Kelompok II, terlihat
pelebaran ruang alveolar dan infiltrasi sel radang lebih
ringan daripada kelompok I. Diamati dengan mikroskop
perbesaran 200x.
J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016
Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok
Analisis kerusakan jaringan paru dilakukan
dengan analisis mLi. Rata-rata mLi pada kelompok satu
didapatkan 693.43 ± 30.1 um, sedangkan pada kelompok
II 480.74 ± 38.0 um. Pada penelitian ini didapatkan
perbedaan nilai mLi yang bermakna secara statistik
antara kelompok I dan II yang ditunjukkan dengan nilai
p=0.000 (p<0.05) pada uji t tidak berpasangan, dengan
rerata perbedaan 212.67. Nilai mLi pada kelompok I
didapatkan lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok
Gambar 6. Ko-kultur sel fibroalveolar (A) Kelompok I: sel
fibroalveolar yang diberi ekstrak asap rokok 2% dalam
DMEM 1% FBS (B) Kelompok II: sel fibroalveolar
yang diberi ekstrak asap rokok 2% dalam MT SPM.
II yang mengindikasikan kemampuan MT SPM dalam
Rata-rata viabilitas dan tingkat proliferasi sel
menghambat kerusakan paru yang dipapar asap rokok.
kelompok satu didapatkan 58.0 ± 1.31%, sedangkan
Pada penelitian ini dilakukan pewarnaan imuno­
pada kelompok II 89.6 ± 7.9%. Pada penelitian ini
histokimia dengan antibodi anti mouse active caspase-3
didapatkan perbedaan viabilitas dan tingkat proliferasi
untuk mengetahui tingkat apoptosis jaringan paru
sel yang bermakna secara statistik antara kelompok I
pada kedua kelompok. Berikut merupakan gambaran
dan II yang ditunjukkan dengan nilai p=0.000 (p<0.05)
sediaan histopatologi yang diwarnai antibodi anti
pada uji t tidak berpasangan, dengan rerata perbedaan
mouse active caspase-3.
31.63. Pada penelitian ini didapatkan via­bilitas dan
tingkat proliferasi sel pada kelompok II lebih tinggi secara
bermakna daripada kelompok I yang mengindikasikan
kemampuan MT SPM dalam menghambat apoptosis
dan menjaga viabilitas serta meningkatkan kemampuan
proliferasi sel fibroalveolar in-vitro.
Gambar 5. Gambaran histopatologi jaringan paru dengan pewar­
naan imunohistokimia antibodi anti mouse active
caspase-3 (active caspase-3 positif). (A) Kelompok I
(B) Kelompok II. Diamati dengan mikroskop perbesaran
200x.
Rata-rata ekspresi active caspase-3 pada
kelompok satu didapatkan 0.033 ± 0.09 %, sedangkan
pada kelompok II 0.0045 ± 0.001%. Pada penelitian
ini didapatkan perbedaan ekspresi active caspase-3
yang bermakna secara statistik antara kelompok I
dan II yang ditunjukkan dengan nilai p=0.000 (p<0.05)
pada uji t tidak berpasangan, dengan rerata perbedaan
0.0285. Pada penelitian ini didapatkan ekspresi
active caspase-3 pada kelompok I lebih tinggi secara
bermakna daripada kelompok II yang mengindikasikan
kemampuan MT SPM dalam menghambat apoptosis.
Biakan fibroalveolar yang diberi ekstrak asap
rokok bersama MT SPM menunjukkan konfluensi sel
yang lebih banyak dengan gambaran morfologi yang
lebih intak. Sedangkan biakan fibroalveolar yang
diberi ekstrak asap rokok dalam 1% FBS mengalami
Berdasarkan
persamaan
regresi
larutan
standar, diperoleh kadar VEGF-A pada kelompok I
261.027 pg/ml dan pada kelompok II 1082.06 pg/ml.
Kadar VEGF-A kelompok II didapatkan 4.2 kali lebih
tinggi (CI 95%) daripada kelompok I sejalan dengan
tingkat proliferasi dan viabilitas sel yang lebih tinggi
serta ekspresi active caspase-3 pada jaringan paru
mencit yang lebih rendah daripada kelompok II. Hal
tersebut mengindikasikan bahwa pengaruh MT SPM
dalam meningkatkan proliferasi dan viabilitas sel
fibroalveolar serta menghambat apoptosis jaringan
paru yang dirusak dengan ekstrak asap rokok yang
dimediasi oleh upregulasi VEGF-A.
PEMBAHASAN
Beberapa penelitian menyebutkan bahwa efek
regenerasi sel punca tidak dimediasi oleh kemampuan
diferensiasi sel punca untuk memperbaiki jaringan yang
rusak, melainkan oleh kemampuan sel punca untuk
mensekresikan metabolit bioaktif. Faktor-faktor yang
apoptosis dan kerusakan struktur sel yang ditandai
disekresikan oleh sel punca meliputi growth factor dan
dengan bentuk sitoplasma sel ireguler
sitokin (secretome), exosome, dan mikrovesikel yang
J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016
253
Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok
ditemukan dalam media tumbuh dan disebut sebagai
yang menyebabkan kematian sel endotel alveolar.
media terkondisi sel punca.
Gangguan mikrosirkulasi akibat kerusakan sel endotel
11
Sel punca mesenkimal selaput amnion P-3
menyebabkan kematian sel pneumosit. Apoptosis
digunakan untuk membuat media terkondisi dengan
sel epitel alveolar merupakan mekanisme penting
teknik badan embrioid 3D pada stirred bioreaktor dalam
yang terlibat dalam kerusakan dinding alveolar yang
kondisi hipoksia. Penggunaan sel pada P-3 sejalan
bermuara pada terjadinya emfisema.17,18
dengan penelitian yang menyebutkan bahwa pada
Ekspresi active caspase-3 pada kelompok I
tingkatan ini sel bersifat lebih stabil dengan stabilitas
didapatkan lebih tinggi secara signifikan dibandingkan
kromosom yang baik. Penelitian menyebutkan bahwa
dengan kelompok II yang diinjeksi MT SPM yang
metode biakan sel punca dalam kondisi hipoksia dapat
menunjukkan kemampuan media terkondisi dalam
meningkatkan pluripotensi, kemampuan diferensiasi
menghambat apoptosis pada jaringan paru yang
sel punca, stabilitas genetik, dan meningkatkan ber­
dipapar asap rokok. Hal ini sejalan dengan penelitian
bagai sitokin dan growth factor dalam media terkondisi
yang menyebutkan bahwa transplantasi sel punca
sel punca. Pada penelitian ini, biakan badan embrioid
mesenkimal sum-sum tulang dapat memperbaiki
3D dalam stirred bioreaktor meningkatkan jumlah
emfisema akibat pajanan asap rokok. Pada penelitian
dan viabilitas sel yang ditunjukkan dengan pertam­
tersebut tidak didapatkan engraftment sel punca pada
bahan diameter badan embrioid. Hal ini sesuai
jaringan paru tikus setelah 2 bulan yang menunjukkan
dengan penelitian yang menunjukkan bahwa biakan
bahwa sel punca memperbaiki emfisema melalui
3D meningkatkan jumlah sel dan viabilitas bila di­
mekanisme parakrin yang dimediasi oleh sekresi
ban­
dingkan dengan biakan monolayer sehingga
metabolit bioaktif.14
12
jumlah growth factor yang disekresikan lebih banyak.
Penelitian menunjukkan bahwa peningkatan
Penggunaan bioreaktor memungkinkan aliran nutrisi,
apoptosis pada PPOK tidak diimbangi dengan pening­
oksigen, dan metabolit sel yang menyerupai ling­
kungan mikro dalam tubuh.13
katan kapasitas proliferasi.19 Kerusakan paru pada
emfisema ditentukan oleh kemampuan proliferasi sel
Kerusakan jaringan paru pada penelitian
alveolar yang mengikuti apoptosis sel alveolar.20 Uji
ini di­tunjukkan dengan nilai mLi. Nilai mLi pada
in-vitro pada sel fibroalveolar paru dilakukan untuk
kelompok I didapatkan lebih tinggi secara signifikan
mengetahui mekanisme yang mungkin terlibat dalam
daripada kelompok II yang diinjeksi media terkondisi
pengaruh MT SPM terhadap perbaikan jaringan paru
yang mengindikasikan kemampuan MT SPM dalam
mencit yang dipapar asap rokok. Pada penelitian ini
menghambat kerusakan jaringan paru. Penelitian
didapatkan tingkat proliferasi sel fibroalveolar paru
melaporkan bahwa pemberian SPM intrapulmonal
yang lebih tinggi secara signifikan pada kelompok
dapat memperbaiki kerusakan jaringan paru akibat
II dibandingkan dengan kelompok I melalui uji MTT
pajanan asap rokok melalui penurunan sitokin pro
assay. Hasil tersebut sejalan dengan penelitian yang
inflamasi seperti TNFα, IL-1β, MCP-1, IL-6, MMP-9,
menunjukkan kemampuan sel punca sum-sum tulang
dan MMP12, peningkatan aktivasi VEGF, VEGFR, dan
dalam meningkatkan survival dan proliferasi biakan
TGFβ1 yang sejalan dengan penurunan apoptosis.
sel fibroblas paru yang dirusak dengan ekstrak asap
14,15
Pajanan asap rokok meningkatkan ekspresi
rokok.1
cleaved caspase-3 pada sel alveolar tipe II yang
Penelitian menyebutkan bahwa sel punca
bermuara pada terjadinya apoptosis. Jalur apoptosis
mampu menginduksi aktivasi jalur Akt yang merupakan
ekstrinsik maupun intrinsik menyebabkan fragmentasi
sinyal penting dalam survival dan proliferasi sel.
DNA yang bermuara pada apoptosis melalui aktivasi
Selain itu, SPM dapat menekan apoptosis sel alveolar
cleaved caspase-3. Salah satu penyebab apoptosis
melalui modifikasi ekspresi protein apoptosis dan
sel epitel paru adalah penurunan ekspresi VEGF
antiapoptosis. Penelitian melaporkan bahwa SPM
16
254
J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016
Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok
mampu menekan ekspresi gen apoptosis Bax dan
SPM pada hewan model emfisema yang diinduksi
menginduksi ekspresi gen antiapoptosis Bcl-2 pada
dengan asap rokok menunjukkan kemampuan
hewan model emfisema yang diinduksi dengan
populasi sel tersebut dalam menghmbat apoptosis
papain. Selain itu, sel punca mesenkimal mampu
melalui stimulasi sekresi VEGF dan induksi VEGF
menekan tingkat ekspresi cleaved caspase-3 pada
reseptor 2 pada sel alveolar.19
sel alveolar yang mengindikasikan kemampuan
Penelitian ini belum dapat menentukan sumber
SPM dalam menurunkan apoptosis sel alveolar pada
VEGF yang berperan secara fungsional. Pada penelitian
emfisema. Metabolit bioaktif dalam media terkondisi
ini kemungkinan VEGF yang ber­peran dapat berasal
sel punca mampu meningkatkan proliferasi sel
dari kandungan VEGF MT SPM yang tinggi berkaitan
dengan menghambat interaksi antara p21 dengan
PCNA dan memacu pembentukan kompleks CDK4.9
Beberapa growth factor seperti FGF, EGF, dan
VEGF berperan dalam menghambat apoptosis sel
dengan induksi HIF 1A yang dapat meningkatkan
endotel dan sel alveolar melalui peningkatan ekspresi
tersebut disebabkan oleh beberapa kekurangan dalam
20
protein antiapoptosis Bcl-2 dan NOS melalui jalur
Akt. VEGF merupakan growth factor yang bersifat
pluripoten dan berperan penting dalam proliferasi sel
endotel, perkembangan jaringan paru, dan beberapa
kondisi patologis seperti PPOK, kanker paru, dan
cedera paru akut. Penelitian menyebutkan bahwa
pada pasien PPOK terjadi penurunan ekspresi
VEGF-A dan VEGFR 2. Selain itu, inhibisi VEGF-A
menginduksi apoptosis sel epitel alveolar yang
bermuara pada terjadinya emfisema.15 Di lain pihak,
penelitian menyebutkan bahwa pada PPOK terjadi
peningkatan kadar VEGF, tetapi kadar tersebut tidak
mencukupi untuk regenerasi sel alveolar paru. Pada
penelitian ini dilakukan pengukuran kadar VEGF-A
yang disekresikan oleh biakan sel fibroalveolar yang
dipapar ekstrak asap rokok dan diberi MT SPM untuk
mengetahui peran VEGF dalam meningkatkan viabilitas
dan proliferasi sel fibroalveolar yang sejalan dengan
kemampuannya dalam menghambat apoptosis.
Kadar VEGF-A supernatan didapatkan lebih
tinggi 4.2 kali pada kelompok II dibandingkan dengan
kelompok I yang mengindikasikan bahwa upregulasi
VEGF-A
secara
fungsional
berperan
dalam
meningkatkan survival dan proliferasi sejalan dengan
kemampuan dalam menghambat apoptosis sel
sekresi VEGF. Penelitian ini belum dapat menunjukkan
pengaruh MT-SPM dalam memperbaiki kerusakan
paru akibat asap rokok khususnya emfisema, Hal
penelitian ini, antara lain; penggunaan hewan model
pada penelitian ini belum dapat mewakili kompleksitas
kerusakan paru akibat asap rokok khususnya PPOK
dan masih dibutuhkan penelitian panjang dan lebih
mendalam untuk aplikasi MT SPM pada uji klinis.
Selain itu, rancangan penelitian yang digunakan pada
penelitian ini hanya dapat menunjukkan efek proteksi,
tetapi belum dapat menunjukkan kemampuan MTSPM dalam meregenerasi kerusakan jaringan paru
yang dipapar asap rokok.
KESIMPULAN
Media terkondisi sel punca mesenkimal
dapat menjadi modalitas terapi dalam menghambat
kerusakan jaringan paru akibat pajanan asap rokok.
Penelitian ini menunjukkan bahwa media terkondisi
sel punca mesenkimal yang dibuat dengan teknik
3D hipoksia dapat menghambat kerusakan dan
apoptosis jaringan paru pada mencit yang dipapar
asap rokok. Selain itu, media terkondisi sel punca
mesenkimaldapat mempertahankan viabilitas dan
tingkat proliferasi biakan sel fibroalveolar yang diberi
ekstrak asap rokok melalui upregulasi VEGF A.
fibroalveolar. Jin dkk19 menyatakan bahwa blokade
DAFTAR PUSTAKA.
jalur VEGF menyebabkan apoptosis sel alveolar
1. Huh JW, Kim SY, Lee JH. Bone marrow repair
dan penurunan interaksi VEGF-VEGF reseptor
cigarette smoke-induced emphysema in rats. Am
pada tingkat protein maupun mRNA ditemukan pada
J Physiol lung Cell mol physiol. 2011;301:255-
pasien perokok dengan emfisema. Transplantasi
66.
J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016
255
Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok
2. Barnes PJ. The cytokine network in asthma and
11.Lane SW, Williams DA, Watt FM. Modulating the
COPD. The journal of clinical investigation. Am J
stem cell niche for tissue regeneration. Nature
Respir Cell Mol Biol. 2008;41:3546-56.
Biotechnology. 2014;32:1-9.
3. Tuder RM, Zhen L, Cho CY, Stewart LT, Kasahara
12. Rungarunlert S, Techakumphu M, Pirity MK, Dinnyes
Y, Salvemini D. Oxidative stress and apoptosis
A. Embryoid body formation from embryonic and
interact and cause emphysema due to vascular
induced pluripotent stem cells: Benefits of bio­
endothelial growth factor receptor blockade. Am
J Respir Cell Mol Biol. 2003;29:88-97.
4. Schweitzer KS, Johnstone BH, Garrison J, Rush
NI, Cooper S, Traktuev DO. Adipose stem cell
treatment in mice attenuates lung and systemic
injury induced by cigarette smoking. Am J Respir
Crit Care Med. 2011;183:215-25.
5. Niknejad H, Pierovi H, Jorjani M. Properties of
the amniotic membrane for potential use in tissue
engineering. European
Cells and Materials.
2008;15:88-99.
6. Mihu CM, Ciuca DR, Soritau O. Isolation and
characterization of
mesenchymal stem cells
from amniotic membrane. Romanian Journal of
Morphology and Embryology. 2009;50:73-7.
7. Laqif A. Kajian terapi media terkondisi sel
punca mesenkimal (MT SPM) selaput amnion
terhadap folikulogenesis pada kasus kegagalan
ovarium prematur (penelitian pada hewan coba
tikus sprague dawley). Disertasi program studi
ilmu kedokteran dan kesehatan reproduksi
Universitas Gajah Mada. Yogyakarta; 2013.
8. Suzuki M, Betsuyuku T, Ito Y. Curcumin atte­
13. Pawitan JA. Prospect of stem cell conditioned
medium
in
regenerative
medicine.
BioMed
Research International. 2014;96:14.
14. Zang X, Zheng H, Zhang H, Ma W, Wang F, Liu C,
et al. Increased interleukin (IL)-8 and decreased
IL-17 production in chronic obstructive pulmonary
disease (COPD) provoked by cigarette smoke.
ELSEVIER. 2011;56:717-25.
15. Guan XL, Song L, Han FF, Cui ZL, Chen X, Guo
XJ, et al. Mesenchymal stem cells protect cigarette
smoke-damaged lung and pulmonary function
partly via VEGF–VEGF receptors. Journal of
Cellular Biochemistry. 2013;114:323-35.
16. Ahmed A, Thliveris JA, Shaw A, Sowa M, Gilchrist
J, Scott JJE. Cigarette smoke induces apoptosis
by activation of caspase-3 in isolated fetal rat
lung type II alveolar epithelial cells in vitro. Open
Journal of Respiratory Diseases. 2013;3:4-12.
17. Degterev A, Boyce M, Yuan J. A decade of
caspases. Oncogene. 2003;22:8543-67.
18. Platiki M, Eleni T, Raytila P. Apoptotic mechanism
in the pathogenesis of COPD. International
journal of COPD. 2006;1:161-17.
nuates elastaseand cigarette smokeinduced
19.Jin Z, Pan X, Zhou K, Bi H, Wang L, Yu L et al.
pul­monary emphysema in mice. Am J Physiol
Biological effects and mechanisms of action
Lung Cell Mol Physiol. 2009;296:L614-62.
of mesenchymal stem cell therapy in chronic
9. Kim SY, Lee JH, Kim HJ. Mesenchymal stem cell
conditioned media recovers lung fibroblast from
cigarette smoke induced damage. Am J Physiol
lung cell mol physiol. 2012;302:891-908.
10. Robert FG and Leland GD. Isolation and culture
of pulmonary alveolar epithelial type I and type
II cells from rat lungs. Methods Mol Biol. 2013;
945:145-59.
256
reactors. WJSC. 2009;1:1-11.
obstructive pulmonary disease. Journal of Inter­na­
tional Medical Research. 2015;43:303-10.
20. Rangasamay T, Misra V, Zhen L. Cigarette smoke
induced emphysema in A/J mice associated
with oxidative stress, apoptosis of lung cells,
and global alteration of gene expression. Am J
Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2009;296:888900.
J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016