skrining bakteri indigenous oil sludge dari

Skrining Bakteri Indigenous…
SKRINING BAKTERI INDIGENOUS OIL SLUDGE DARI KALIMANTAN PADA
MEDIAPOLYAROMATIC HIDROKARBON (NAPHTHALENE)
Anthofani Farhan, Ni’matuzahroh, Ganden S.
Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya
[email protected]
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui: (1) Jumlah isolate bakteri indigenous yang mampu tumbuh
pada substrat napthalene; (2) Nilai pH bakteri indigenous dari oil sludge pada substrat hidrokarbon
(napthalene); (3) Respon pertumbuhan isolat bakteri dari oil sludge yang diamati dari nilai Total Plate
Count (TPC) (CFU/mL) pada konsentrasi 100 ppm; (4) Nama spesies isolate bakteri yang terpilih yang
memiliki kemampuan mendegradasi napthalene. Uji respon pertumbuhan isolat bakteri dari oil sludge
dilakukan pada kultur cair yang mengandung napthalene pada konsentrasi 100 ppm, diamati
pertumbuhannya pada waktu 0, 2, 4, 6, 8, dan 10 hari. Data logaritma Total Plate Count bakteri isolat
indigenous(CFU/mL) dianalisis secara deskriptif. Hasil penelitian menunjukkan didapatkan 7
isolatbakteri yang mampu tumbuh pada substrat napthalene. Isolat mampu tumbuh menggunakan substrat
naphthalene dengan konsentrasi 100 ppm.Nilai pH bakteri indigenous menunjukkan bahwa pH
masihberkisar normal padawaktu 0, 2, 4, 6, 8, dan 10 hari.Bakteri indigenous terbaik adalah isolat D.
Nama spesies isolat bakteri terbaik berdasarkan uji kit 12A dan 12B menunjukan kesamaan 99,79%
dengan Pseudomonas aeruginosa.
Kata kunci: skrining, bakteri indigenous, oil sludge, napthalene.
PENDAHULUAN
Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)
merupakan salah satu bahan pencemar berbahaya yang
berasal dari limbah lumpur minyak bumi. PAHs
diputuskan menjadi karsinogenik, karena metabolitnya
menunjukkan aktifitas mutagenic dan karsinogenik
terhadap manusia dan hewan (Skupinskaet al., 2004).
Menurut Yuliani (2014) komposisi kimia dari oil sludge
salah satunya napthalene memiliki konsentrasi 6.4 g/ kg
oil sludge.
Napthalene merupakan salah satu jenis PAHs
yang terdiri dari 2 cincin aromatik yang termasuk
kedalam LMW (Low Molecular Weight) sehingga lebih
mudah didegradasi dibandingkan dengan HMW (High
Molecular Weight) danbiasanyadigunakansebagaicontoh
PAHs untuk pemahaman mekanisme degradasi pada
HMW-PAHs (Cerniglia dan Sutherland, 2010).United
State Environmental Protection Agency (USEPA) telah
menetapkan daftar 16PAHs yang menjadi senyawa
pencemar utama di lingkungan, salah satunya adalah
napthalene (Koch, 2011). Napthalene berdasarkan
International Agency for Research on Cancer [IARC]
150ppm naphthalene dalam jumlah besar dapat
mengakibatkan kerusakan pada sel darah, dan
menyebabkan
penyakit
yang
dikenal
sebagai
haemolytikanaemia (Goldman, 2001).
Beberapa penelitian telah mengidentifikasi bakteri
terutama dari genus Pseudomonas, Arthrobacter,
Aeromonas, Sphingomonas, Acidovorax, Burkholderia,
Brevibacillus, Mycobacterium, Corynebacterium dan
Prosiding Seminar Nasional Biologi 2016_ ISBN: 978‐602‐0951‐11‐9
Nocardia (Lin et al., 2014). Penelitian dari Lin et al.,
(2014) juga menunjukkan degradasi naphthalene pada
konsentrasi 50 mg/L di bawah salinitas 20 g/L selama 7
hari sebesar 75% oleh bakteri Pseudomonassp BZ-3.
Skrining bakteri indigenous dari oil sludge yang
berasal dari KalimantanTimur khususnya daerah Muara
Badak perlu untuk dikaji lebih lanjut. Oleh karena itu,
penelitianinibertujuanuntukmengetahuibakteriindigenous
yang mampu tumbuh dengan baik pada senyawa
hidrokarbon napthalene.
METODE PENELITIAN
Napthalene (98%).Konsentrasinapthalene yang
digunakanadalah 100, Crystal violet, lugol, alkohol,
dansafranin untuk pewarnaanGram, Yeast Extract,HCl,
dan NaOH. Media yang digunakan adalah Air Mineral
Sintetis (AMS) yang mengandung makronutrien
((NH4)2SO4 3g; MgSO4.7H2O 0,2g; NaCl 10g);
mikronutrien (CaCl2 0,01g; MnSO4. H2O 0,001g; H3BO3
0,001g; ZnSO4.7H2O 0,001g; CuSO4.5H2O 0,001g;
CoCl2.6H2O 0,005g; Na2MoO4.2H2O 0,001g); buffer
KH2PO4 2,6g dan K2HPO4 5g ; Besi (FeSO4.7H2O
0,0006g) dalam 1 Liter akuades. Pemurnian bakteri
menggunakan medium Nutrient Agar(NA) dan Nutrient
Broth(NB). Pelarut organik yang digunakan adalah nheksana (Baker Analyzed). Peralatan yang digunakan
untuk produk konversi adalah GC-MS dengan
kolomkapiler HP 5-MS 5% Phenyl Methyl Siloxane.
151
Skrining Bakteri Indigenous…
Skrining Isolat Bakteri Indigenous Pendegradasi
Napthalene
Sebelumnya dibuat prekultur isolat bakteri
indigenous yang diperoleh dalam 20 mL media NB,
kemudian diinkubasi selama 24 jam. Kultur isolat bakteri
ini diukur kerapatan optiknya (OD) sebesar 0,5 dengan
panjang gelombang 600 nm. Sebanyak 1 mL (2%) Kultur
isolat bakteri ditambahkan ke dalam 49 ml media AMS
yang mengandung napthalene dengan konsentrasi 100
ppm dan 0,5% Yeast Extract. Kemudian diinkubasi
selama 10 hari pada shaker dengan kecepatan 120 rpm
dalam suhu ruang. Pertumbuhan bakteri pada kultur
hidrokarbon naphthalene dipantau dengan cara
penghitungan jumlah selviable dengan metode pour
plate. Penghitungan jumlah dilakukan dengan interval 0,
2, 4, 6, 8, 10. Sebanyak 1 mL kultur bakteri diambil
dengan mikro pipet kedalam seri tabung pengenceran
berisi 9 mL larutan garam fisiologis 0,85%. Seri
pengenceran dibuat dengan seri tertentu sampai jumlah
sel memenuhi persyaratan. Dari masing-masing tiga seri
pengenceran terakhir dilakukan pencawanan pada media
NA. Isolat bakteri indigenous yang memiliki kemampuan
tumbuh paling baik ditinjau dari nilai TPC.
Karakterisasi dan Identifikasi Bakteri Indigenous
Karakterisasi bakteri meliputi morfologi koloni,
morfologi sel bakteri indigenous dan uji fisiologi
biokimia .Morfologi koloni diamati pada media NA.
Morfologi yang diamati adalah bentuk, warna, ukuran,
tepian, dan elevasi. Morfologi sel bakteri dapat dilakukan
dengan pewarnaan Gram.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Gambar 1. Isolat bakteri indigenous oil sludge pada
media NA miring.
Prosiding Seminar Nasional Biologi 2016_ ISBN: 978‐602‐0951‐11‐9
a
b
10μm
Gambar 2.
Tabel 1.
Karakteristik makroskopis dan mikroskopis
isolate bakteri indigenous oil sludge pada
media NA. (a) Karakteristik makroskopis
isolat (D) pada media NA; (b) Karakteristik
mikroskopis sel bakteri isolat (D) dengan
pengecatan Gram
pH kultur bakteri indigenous oil sludge pada
substrat naphalene
Isolat
0
A ≠ napth
A + napth
B ≠ napth
B + napth
C ≠ napth
C + napth
D ≠napth
D + napth
E ≠ napth
E + napth
F ≠ napth
F + napth
G ≠ napth
G + napth
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
Lama inkubasi (hari)
2
4
6
8
7
7
7
7
7
7,2
7
7
7
7,2
7
7
7
7
7
7,1
7,2
7,2
7
7
7
7
7
7
7,1
7
7,1
7
7,1
7,2
7,2
7,2
7,2
7,1
7,2
7,1
7,2
7
7,2
7,1
7,2
7,1
7,1
7,2
7,2
7,3
7,2
7,2
7,2
7,2
7,2
7,2
7,2
7,3
7,2
7,3
10
7,2
7,3
7,3
7,5
7,3
7,4
7,3
7,3
7,4
7,5
7,3
7,5
7,4
7,5
Berdasarkan tabel 1,menunjukkan bahwa ke-7
isolat bakeri yang ditumbuhkan pada media yang
mengandung naphthalene memiliki rentang nilai pH yang
masih bias dibilang pH normal pada semua bakteri
indigenous sampai akhir masa inkubasi yaitu 10 hari, pH
kultur pada semua isolate bakteri indigenous dari hari ke0 sampai hari ke-10 yaitu 7-7,5. Hal ini menujukkan
bahwa semua isolate bakteri mampu menggunakan
substrat napthalene. Zam (2011), menyatakan pada
umumnya kisaran pH optimum bagi pertumbuhan bakteri
adalah 6,5 – 7,5. Berdasarkan hasil penelitian pH akhir
adalah ± 7 sehingga masih termasuk rentang yang
mendukung pertumbuhan bakteri indigenous. (Alexander
dan Murzhak, 1999) menambahkan pH netral atau
mendekati netral merupakan faktor yang mendukung
optimalnya proses biodegradasi dan jika komponen
lingkungan yang khas dapat dimetabolisme oleh
organisme yang berbeda.
152
Skrining Bakteri Indigenous…
Tabel 2. Uji biokimia isolate bakteri indigenous terpilih
yang mampu mendegradasi napthalene
5
Acid from
Mannitol (MAN)
-
6
Acid from Xylose
(XYL)
+
7
ONPG
-
8
Indole (IND)
-
9
10
11
12
Urea Hydrolysis
(UR)
Voges Proskauer
(VP)
Citrate Utilization
(CIT)
Tryptophan
Deaminase (TDA)
+
+
+
Uji
biokimia
dapat
digunakan
untuk
mengidentifikasi mahluk hidup berdasarkan rekasi kimia
yang terjadi dalam tubuh (Yulia et al., 2005). Uji
biokimia hanya dilakukan pada isolat yang terbaik.
BerdasarkanTabel 2 di atas menunjukkan bahwa P.
aeruginosa pada uji oksidase menunjukkan hasil positif,
hal ini menandakan bahwa P. aeruginosa memiliki
aktivitas oksidase.Uji reaksi fermentasi karbohidrat
(penggunaan gula-gula) yaitu uji glukosa dan xilosa
diperoleh hasil positif, artinya bakteri P. aeruginosa
membentuk asam dari fermentasi glukosa dan xilosa.
Pada sorbitol, laktosa, rafinosa, manitol, rhamnosa,
arabinosa, salisin, inositol, sukrosa, dan adonitol
diperoleh hasil negatif, hal ini menandakan bahwa bakteri
P. aeruginosa tidak membentuk asam dari fermentasi
sorbitol, laktosa, rafinosa, manitol, rhamnosa, arabinosa,
salisin, inositol, sukrosa, dan adonitol serta tidak
membutuhkan gula-gula tersebut untuk proses
metabolismenya.
Respon pertumbuhan bakteri tersebut pada
substrat naphthalene dengan konsentrasi 100 ppm.Respon
pertumbuhan terbaik dilihat berdasarkan dari nilai log
TPC bakteri selama waktu inkubasi 10 hari. Respon
pertumbuhan bakteri ini disajikan pada Grafik1.
Prosiding Seminar Nasional Biologi 2016_ ISBN: 978‐602‐0951‐11‐9
Jumlah sel bakteri (CFU/mL)
jumlah sel bakteri (CFU/mL)
4
perlakuan
Isolat B
25
20
15
10
5
0
Jumlah sel bakteri (CFU/mL)
3
kontrol
0 2 4 6 8 10
Waktu inkubasi (hari)
jumlah sel bakteri(CFU/mL)
2
Uji fermentasi gula-gula
12B
Hasil
Gelatin
Liquefaction
(GEL)
Malonate
Inhibition
+
(MAL)
Acid from
Inositol (INO)
Acid from
Sorbitol (SOR)
Acid from
Rhamnose
(RHA)
Acid from
Sucrose (SUC)
Acid from
Lactose (LAC)
Acid from
Arabinosa
(ARA)
Acid from
Adonitol (ADO)
Acid from
Raffinose (RAF)
Acid from
Salicin (SAL)
Arginine
Dihydrolase
+
(ARG)
jumlah sel bakteri (CFU/mL)
1
Uji Fisiologis
12A
hasil
Lysine
Decarboxylase
+
(LYS)
Ornithine
Decarboxyl
+
(ORN)
H2S production
(H2S)
Acid from
+
Glucose (GLU)
kontrol
perlakuan
0
2 4 6 8 10
Waktu inkubasi (hari)
isolat C
25
20
15
10
5
0
kontrol
perlakuan
0
2
4
6
8 10
Waktu inkubasi (hari)
Isolat D
25
20
15
10
5
0
kontrol
perlakuan
0 2 4 6 8 10
Waktu inkubasi (hari)
Isolat E
25
20
15
10
5
0
kontrol
perlakuan
0
2
4
6
8
10
Waktu inkubasi (hari)
Isolat F
Jumlah bakteri sel (CFU/mL)
No
Isolat A
25
20
15
10
5
0
25
15
5
-5
0
2
4
6
8
10
kontrol
perlakuan
Waktu inkubasi (hari)
153
Skrining Bakteri Indigenous…
jumlah sel bakteri (CFU/mL)
Isolat G
25
20
15
10
5
0
kontrol
substrat naphthalene dengan konsentrasi 100 ppm. Dari
ketujuh isolat yang ditemukan dan di uji pada substrat
naphthalene didapatkan bahwa isolate terbaik adalah
isolat D. Nilai pH dari ketujuh isolate selama masa
inkubasi adalah 7-7,5, termasuk dalam rentang pH
normal. Nama spesies isolate bakteri indigenous terbaik
(isolate D) yang memiliki kemampuan biodegradasi
naphthalene adalahPseudomonas aeruginosa.
perlakuan
0
2 4 6 8 10
Waktu inkubasi (hari)
Grafik 1. Respon pertumbuhan ke-7 bakteri tersebut
pada substrat naphthalene dengan konsentrasi
100 ppm.
Grafik 1
menunjukkan bahwa isolat ke-7
bakteri indigenous dapat menggunakan susbtrat
hidrokarbon uji (naphtalene) dengan konsentrasi 100 ppm
sebagai substrat pertumbuhannya. Respon positif
pertumbuhan isolat ke-7 bakteri indigenous yaitu adanya
pertambahan jumlah sel bakteri melalui pengamatan TPC
(Total Plate Count). Dari Grafik 1 dapat dilihat bahwa
bakteri yang mampu tumbuh paling optimal dari ke-7
isolat adalah isolat D. Ke-7 isolat terbukti dapat
menggunakan substrat naphtalene sebagai nutrisi
pertumbuhan karena jumlah sel bakteri meningkat seiring
waktu inkubasi dibandingkan dengan kontrol tanpa
penambahan naphtalene. Kultur ke-7 isolat tanpa
penambahan naphtalene nampak mengalami penurunan
jumlah sel pada hari yang berbeda-beda tiap isolat.
(Koch., 2011 ) menyatakan berkurangnya nutrisi
pertumbuhan, faktor aerasi serta produk metabolit
sekunder yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri.
Berdasarkan Grafik 1 dapat diketahui bahwa
pertumbuhan bakteri pada media AMS yang mengandung
naphthalene dengan konsentrasi 100 ppm sebagai uji
skrining, isolate terbaik adalah isolat D dibandingkan ke6 isolat lainnya. Isolat D diduga memiliki kemampuan
enzimatis dan menghasilkan biosurfaktan yang mampu
mendegradasi naphthalene melalui jalur metabolic
bakteri. Hal ini bukan berarti ke-6 isolat yang lain tidak
memiliki kemampuan yang sama, meskipun respon
pertumbuhan pada substrat naphthalene tidak sebaik
isolat D.
KESIMPULAN
Kesimpulan dari penelitian ini adalah terdapat
tujuh isolate bakteri indigenous oil sludge yang mampu
tumbuh pada substrat napthane.Respon pertumbuhan
isolate bakteri dari oil sludge yang diamati dari nilai
Total Plate Count (TPC) (CFU/mL) menunjukkan
pertumbuhan yang berbeda ketika ditumbuhkan pada
Prosiding Seminar Nasional Biologi 2016_ ISBN: 978‐602‐0951‐11‐9
DAFTAR PUSTAKA
Alexander F and Murzhak T. 1999. Public
HealthStatement,
Polycyclic
AromaticHydrocarbons. Atlanta, GA: U.S.
Department of Health and Human Services.
Zam T. 2011. Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater.21st Ed. American Public
Health Association. Washington D.C.
Cernigliaand Sutherland, 2010.Quantitative analysis of
biodegradation of PAHs by usingmicrobes in oil
sludge.Master dissertation, Department of
Environment,vilEngineering, UniversitiTeknologi
MARA (Unpublish).
Goldman R. 2001. Smoking Increases Carcinogenic
Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Human
Lung Tissue. Cancer Research 61: 6367-6371.
Koch,E. 2011. Biodegradation of Polycyclic Aromatic
Hydrocarbons by Arthrobactersp. Ug50 Isolated
from Petroleum Refinery Wastes. Thesis.The
University of Guelph.
Lin,M., Hu, X., Chen, W., Wang, H., Wang, C. 2014.
Biodegradation of Naphthalene by Pseudomonas
sp. BZ-3, Isolated from Crude Oil Contaminated
Soil.
International
Biodeterioration&
Biodegradation. Vol. 94, 176-181.
Skupinska, K., Misiewicz, I., and Guttman, T. 2004.
Polycyclic
Aromatic
Hydrocarbons:
Physicochemical
Properties,
Environmental
Appearance and Impact on Living Organism.
ActaPoloniaePharmaccutica-Drug
Research.
Vol.3, No. 3 pp. 233-240
Yulia,
L.R., Marsa, B., Juliastuti, S.R. 2005.
Bioremediasi Air Laut Terkontaminasi Minyak
Bumi dengan Menggunakan Bakteri Pseudomonas
aeruginosa. Teknik Kimia, Teknologi Industri,
Institut Teknologi Sepuluh Nopember.
Yuliani, H. 2014. Biodegradasi poliaromatik hidrokarbon
pirena oleh bakteri yang diisolasi dari laut cilacap
dan laut marina. Disertasi. Fakultas Teknik,
Program Studi Teknik Kimia, Universitas
Indonesia.
154