Orthosiphon stamineus Benth
advertisement
KAJIAN KEAMANAN DAN AKTIVITAS IMMUNOMODULATOR EKSTRAK DAUN KUMIS KUCING (Orthosiphon stamineus Benth) DAN BUNGA KNOP (Gomphrena globosa L.) TRI HARI AQUARINI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006 2 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kajian Keamanan dan Aktivitas Immunomodulator Ekstrak Daun Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) dan Bunga Knop (Gomphrena globosa L.) adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Januari 2006 Tri Hari Aquarini NIM P09500014 3 ABSTRAK TRI HARI AQUARINI. Kajian Keamanan dan Aktivitas Immunomodulator Ekstrak Daun Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) Dan Bunga Knop (Gomphrena globosa L.). Di bawah bimbingan FRANSISKA RUNGKAT ZAKARIA dan MAGGY THENAWIJAYA SUHARTONO Daun kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) dan bunga knop (Gomphrena globosa L.) telah lama digunakan secara tradisional untuk mencegah atau mengobati berbagai macam penyakit. Daun kumis biasa digunakan untuk mencegah infeksi kandung kemih, kencing batu, infeksi saluran kemih dan mengobati diabetes melitus, rematik, dan asam urat. Bunga knop biasa digunakan untuk mengobati sesak napas karena asma, batuk rejan, radang saluran napas, disentri dan sakit panas. Walaupun demikian, belum ada informasi ilmiah mengenai keamanan kedua produk ini untuk dikonsumsi. Tujuan dari penelitian ini adalah menentukan metode pengeringan terbaik untuk membuat bubuk daun kumis kucing dan bunga knop dan untuk menguji pengaruh ekstrak kedua produk ini terhadap proliferasi sel limfosit manusia. Metode pengeringan terbaik untuk kumis kucing adalah pengeringan dengan sinar matahari, ditunjukkan oleh nilai rataan konsentrasi total fenol sebesar 123.434 + 12.159 mg fenolik/g berat kering yang lebih tinggi dari pada nilai rataan total fenol pada pengeringan dengan oven sebesar 16.918 + 0.174 mg fenolik/g berat kering dan oleh nilai rataan aktivitas antioksidan yang dinyatakan sebagai Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) sebesar 1354.756 + 1.515 mM/g berat kering dan 470.441 + 61.670 mM/g berat kering. Metode pengeringan terbaik untuk bunga knop adalah pengeringan dengan oven ditunjukkan oleh nilai rataan konsentrasi total fenolnya 3.069 + 0.168 mg fenolik/g berat kering yang lebih tinggi dari pada nilai rataan total fenol pada pengeringan dengan sinar matahari sebesar 2.239+0.055 mg fenolik/g berat kering dan oleh nilai rataan aktivitas antioksidannya berturut-turut sebesar nilai TEAC 108.346+14.166 mM/g berat kering dan 56.070 + 7.085 mM/g berat kering. Pengujian keamanan ekstrak air daun kumis kucing dan bunga knop dilakukan menggunakan sel limfosit manusia yang dikultur dengan menambahkan ekstrak keduanya dan atau mitogen. Untuk ekstrak daun kumis kucing peningkatan konsentrasi dari 1.203 mg/ml menjadi 2.406 mg/ml kemudian menjadi 4.812 mg/ml meningkatkan rataan indeks stimulasi (IS) berturut-turut sebesar 1.518 + 0.124 menjadi 1.819+0.031 kemudian menjadi 2.389+0.148. Untuk bunga knop peningkatan konsentrasi dari 0.4115 mg/ml menjadi 0.823 mg/ml juga meningkatkan rataan IS berturut-turut sebesar 1.011+0.082 dan 1.071 + 0.122. Sebaliknya, peningkatan konsentrasi menjadi 1.646 mg/ml kemudian menjadi 3.292 mg/ml menghambat proliferasi sel limfosit sebesar 0.938 + 0.041 dan 0.780 + 0.142. Tampaknya bubuk daun kumis kucing tidak bersifat racun terhadap sel limfosit, sebaliknya mempunyai aktivitas imunomodulator. Bubuk bunga knop pada konsentrasi yang lebih tinggi tampaknya bersifat racun. Kata kunci: daun kumis kucing, bunga knop, total fenol, aktivitas antioksidan, proliferasi sel limfosit. 4 © Hak cipta milik Tri Hari Aquarini, tahun 2006 Hak cipta dilindungi Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm dan sebagainya 5 KAJIAN KEAMANAN DAN AKTIVITAS IMMUNOMODULATOR EKSTRAK DAUN KUMIS KUCING (Orthosiphon stamineus Benth) DAN BUNGA KNOP (Gomphrena globosa L.) TRI HARI AQUARINI Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Pangan SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006 6 Judul Tesis : Kajian Keamanan dan Aktivitas Immunomodulator Ekstrak Daun Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) dan Bunga Knop (Gomphrena globosa L.) Nama : Tri Hari Aquarini NIM : P09500014 Disetujui Komisi Pembimbing Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria, M.Sc. Ketua Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono Anggota Diketahui Ketua Program Studi Ilmu Pangan Dekan Sekolah Pascasarjana Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, M.S. Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc. Tanggal Ujian : 12 Oktober 2005 Tanggal Lulus : 7 PRAKATA Alhamdulillah segala puji bagi Allah yang dengan seizinnya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis ini, yang berjudul Kajian keamanan dan aktivitas immunomodulator ekstrak daun kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) dan bunga knop (Gomphrena globosa L.). Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih kepada : 1. Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria selaku ketua komisi pembimbing yang selalu memberi semangat, motivasi dan bimbingan pada penulis dalam melaksanakan penelitian dan penulisan tesis ini. 2. Prof. Dr. Maggy T. Suhartono, selaku anggota komisi pembimbing yang juga selalu memberi semangat dan bimbingan selama penelitian dan penulisan tesis ini. 3. Ir. Didah Nur Faridah, MSi., atas segala bantuan dan bimbingannya selama penelitian dan penulisan tesis ini. 4. Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, MS, selaku ketua Program Studi Ilmu Pangan. 5. Program Hibah B Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian IPB yang telah mensponsori penelitian ini. 6. Ibu Prof. Dr. Aisjah Girindra yang terus memberi semangat agar penulis dapat menyelesaikan studinya. 7. Teman-teman di LPPOM-MUI atas segala dukungan dan doanya. 8. Laboran dan pegawai di Lab. PAU BIOTEK, Mbak Ika, Mbak Eni dan Novi yang selalu memberi semangat dan bantuan bila ada kesulitan selama penulis bekerja di laboratorium. 9. Teman-teman di Lab. Mikrobiologi PAU BIOTEK, Mbak Eko, Mbak Yuyun, Emma, Dina, Siti, Agnes, Rudi, Bobby, Eni dan Darta yang selalu berbagi ilmu dan saling mendukung. 10. Adik-adik satu penelitian Nora dan Inggrid yang selalu saling menyemangati dan bekerja sama. 11. Teman-teman pada Program Studi Ilmu Pangan yang selalu bersedia membantu dan memberi semangat kepada penulis untuk menyelesaikan penelitian. 12. Papa dan Mama juga Bapak (Soedibjo N.H) dan Ibu (Sumarti) atas segala dukungan dan bantuannya. 13. Suamiku tercinta Mas Upi dan anak-anakku tersayang Mbak Ima, Mbak Ifa, Mas Fawzan dan Adek Ira atas segala pengorbanan dan pengertiannya selama Ibu kuliah. 14. Kakak-kakakku Mas Eko, Bu Nien, Mbak Yanti dan Aa Bagus serta adikadikku De Ida dan Joko, De Ika dan Gandjar, De Dewi, dan De Rudi dan Fika atas segala doa dan dukungannya. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan tesis ini, oleh karena itu penulis mohon kritik dan saran untuk kesempurnaan tesis ini. Semoga penelitian ini bermanfaat bagi kita semua. Amin. Bogor, Januari 2006 Tri Hari Aquarini 8 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor, pada tanggal 18 Februari 1969 sebagai anak terakhir dari tiga bersaudara putra Bapak Prof. Dr. Harimurti Martojo dan Ibu Rastini Rasjid, MSc. Penulis menempuh pendidikan SD sampai SMA di Bogor. Tahun 1987 diterima di Institut Pertanian Bogor dan tahun 1988 diterima di Jurusan Teknologi Industri Pertanian, Fateta IPB. Penulis menyelesaikan studi Sarjananya pada tahun 1992. Sejak 1993 sampai sekarang penulis bekerja paruh waktu di Lembaga Pengkajian Pangan dan Obat-obatan-MUI (LPPOM-MUI). Penulis telah menikah dengan dr. Supriyadi Bektiwibowo SpA dan dikaruniai empat orang anak, Fathimah Hanun Syifaul Jannah, Hanifah Sakinatun Khalidah, Muhammad Khalid Fawzan ’Adziima dan Khadijah Zhafirah Nurul Ramadhani. 9 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL .............................................................................................. 11 DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... 12 DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... 13 PENDAHULUAN .............................................................................................. 14 Latar Belakang ........................................................................................... 14 Tujuan ....................................................................................................... 15 TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................... 16 Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) ........................................ 16 Bunga Knop (Gomphrena globosa L.) ....................................................... 18 Pengeringan ............................................................................................... 21 Senyawa Fenolik ........................................................................................ 23 Keamanan Pangan ..................................................................................... 25 Limfosit dan Proliferasi Sel Limfosit ......................................................... 26 Immunomodulator ...................................................................................... 29 Kultur Sel ................................................................................................... 30 BAHAN DAN METODE .................................................................................. 32 Bahan dan Alat .......................................................................................... 32 Metode Penelitian ....................................................................................... 33 Pembuatan Bubuk Daun Kumis Kucing dan Bubuk Bunga Knop ... 33 Metode Pengeringan Oven ....................................................... 33 Metode Pengeringan Sinar Matahari ...................................... 33 Pembuatan Ekstrak Air Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop Segar dan Bubuk .............................................................................. 33 Analisa Total Fenol modifikasi metode Chandler dan Dodds (Shetty et al. 1995)....................................................................................... 34 Analisa Aktivitas Antioksidan (Kubo et al. 2002) ......................... 34 Analisa Proksimat (Apriyantono et al. 1989).................................. 35 Analisa Proliferasi Limfosit ............................................................. 37 Persiapan Larutan Ekstrak Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop Serta Larutan Mitogen ……………………………....... 37 Persiapan Medium Kultur Sel Limfosit (Koesitoresmi 2002), Isolasi Limfosit (Nurrahman 1999) dan Penghitungan Sel ..... 38 Kultur Limfosit ........................................................................ 40 HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................................... 42 Daun Kumis Kucing ................................................................................. 42 Metode Pengeringan ......................................................................... 42 Total Fenol dan Aktivitas Antioksidan............................................. 44 Analisa Proksimat Bubuk Daun Kumis Kucing Hasil Pengeringan Dengan Sinar Matahari ................................................................... 49 Pengujian Ekstrak Daun Kumis Kucing Terhadap Proliferasi Sel Limfosit Dengan Metode MTT.........................................................49 10 Bunga Knop................................................................................................ 53 Metode Pengeringan......................................................................... 53 Total Fenol dan Aktivitas Antioksidan............................................ 55 Analisa Proksimat Bubuk Bunga Knop Hasil Pengeringan Dengan Oven ................................................................................................ 59 Pengujian Ekstrak Bunga Knop Terhadap Proliferasi Sel Limfosit Dengan Metode MTT........................................................................ 60 SIMPULAN DAN SARAN ................................................................................ 65 Simpulan ................................................................................................. 65 Saran ......................................................................................................... 65 DAFTAR PUSTAKA.......................................................................................... 66 LAMPIRAN ...................................................................................................... 72 11 DAFTAR TABEL Halaman 1 Mitogen-mitogen ”nonspecific” yang mengaktivasi sel limfosit manusia ... 28 2 Bahan-bahan yang ditanam ke dalam kultur sel............................................. 41 3 Perbandingan total fenol pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air daun kumis kucing segar ....... 45 4 Perbandingan aktivitas antioksidan pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air daun kumis kucing segar ..................… .................................................................. 47 5 Hasil analisa proksimat bubuk daun kumis kucing hasil pengeringan dengan sinar matahari .............................................................................................. 49 6 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak daun kumis kucing dengan mitogen (Con A, LPS dan PK) dengan yang ditambah ekstrak daun kumis kucing saja pada konsentrasi C2 (1.203 mg/ml) ,C4 (2.406 mg/ml) dan C8 (4.812 mg/ml) ..................... 50 7 Perbandingan total fenol pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air bunga knop segar................. 54 8 Perbandingan aktivitas antioksidan pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air bunga knop segar.......................................................................................................…… 57 9 Hasil analisa proksimat bubuk bunga knop hasil pengeringan dengan oven ............................................................................................................... 59 10 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak bunga knop dengan mitogen (Con A, LPS dan PK) dengan yang ditambah ekstrak bunga knop saja pada konsentrasi C1 (0.4115 mg/ml), C2 (0.8230 mg/ml), C4 (1.646 mg/ml) dan C8 (3.292 mg/ml)...................... 60 11 Perbandingan hasil penelitian ekstrak daun kumis kucing dengan bunga knop .............................................................................................................. 64 12 Hasil analisa total fenol dan aktivitas antioksidan.......................................... 77 13 Hasil analisa MTT ekstrak bunga knop ......................................................... 77 14 Hasil analisa MTT ekstrak daun kumis kucing... .......................................... 78 15 Absorbansi untuk Trolox (mM)... ................................................................. 79 16 Absorbansi untuk asam tanat... ..................................................................... 80 12 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Tanaman kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) .............................. 16 2 Tanaman bunga knop (Gomphrena globosa L.) ............................................ 19 3 Pengambilan darah secara aseptis................................................................. 39 4 Bubuk daun kumis kucing ............................................................................ 43 5 Ekstrak air bubuk daun kumis kucing........................................................... 43 6 Perbandingan total fenol ekstrak air masing-masing perlakuan pada daun kumis kucing ................................................................................................ 46 7 Perbandingan analisa aktivitas antioksidan masing-masing perlakuan pada daun kumis kucing ....................................................................................... 47 8 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak daun kumis kucing saja dengan yang ditambah mitogen (Con A, LPS dan PK ) saja dan dengan ekstrak daun kumis kucing ditambah mitogen ... 52 9 Bubuk bunga knop ........................................................................................ 54 10 Ekstrak air bubuk bunga knop.......... ........................................................... 54 11 Perbandingan total fenol ekstrak air masing-masing perlakuan pada bunga knop ............................................................................................................. 57 12 Perbandingan analisa aktivitas antioksidan masing-masing perlakuan pada Bungaknop................................................................................................... 58 13 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak bunga knop saja dengan yang ditambah mitogen (Con A, LPS dan PK ) saja dan dengan ekstrak bunga knop ditambah mitogen ......................... 61 14 Kurva standar Trolox .................................................................................. 79 15 Kurva standar Asam Tanat ......................................................................... 80 13 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Dosis dasar jumlah penggunaan daun segar dan bubuk daun kumis kucing untuk membuat ekstrak air …..……………………………………. 72 2 Dosis dasar jumlah penggunaan bunga segar dan bubuk bunga knop untuk membuat ekstrak air .........…………………………………………… 73 3 Contoh Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Daun Kumis Kucing .................. 74 4 Contoh Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Bunga Knop ................................ 75 5 Penentuan konsentrasi larutan mitogen (LPS, Con A dan Pokeweed) ........... 76 6 Master tabel data penelitian ......................................................................... 77 7 Tabel absorbansi dan kurva standar trolox .................................................... 79 8 Tabel absorbansi dan kurva standar asam tanat............................................. 80 9 Daftar singkatan ............................................................................................ 81 10 Hasil uji statistik (ANOVA) kadar total fenol ekstrak air daun kumis Kucing ..................................................................................................….... . 82 11 Hasil uji statistik (ANOVA) aktivitas antioksidan ekstrak air daun kumis Kucing .......................................................................................................... 84 12 Hasil uji statistik (ANOVA) indeks stimulasi ekstrak daun kumis kucing .... 86 13 Hasil uji statistik (ANOVA) kadar total fenol ekstrak air bunga knop .....… . 90 14 Hasil uji statistik (ANOVA) aktivitas antioksidan ekstrak air bunga knop.... 92 15 Hasil uji statistik (ANOVA) indeks stimulasi ekstrak bunga knop ........….. 94 14 PENDAHULUAN Latar Belakang Seiring dengan semboyan kembali ke alam, akhir-akhir ini minat masyarakat untuk menggunakan bahan-bahan alami semakin meningkat. Hal ini terbukti dengan semakin banyaknya industri-industri baik industri kecil maupun besar yang menggunakan tumbuh-tumbuhan yang banyak terdapat di Indonesia. Kenyataan ini mendorong dilakukannya penelitian-penelitian tentang tumbuhantumbuhan yang secara tradisional sering digunakan untuk mencegah atau mengobati berbagai penyakit. Di hutan tropik Indonesia terdapat sekitar 30.000 spesies tumbuhan berbunga. Dari jumlah tersebut, diperkirakan tidak kurang dari 9.606 spesies diketahui berkhasiat obat (Mahendra dan Fauzi 2005), diantaranya kumis kucing dan bunga knop (Dalimartha 2000). Dalam kehidupan sehari-hari, masyarakat biasa mengkonsumsi kumis kucing dan bunga knop dalam bentuk air rebusan. Kumis kucing secara tradisional biasa digunakan untuk mencegah infeksi kandung kemih, kencing batu, infeksi saluran kemih dan mengobati diabetes melitus, rematik, batu kemih, batu ginjal dan asam urat (Mahendra dan Fauzi 2005). Bunga knop secara tradisional biasa digunakan untuk mengobati sesak napas karena asma, batuk rejan (pertusis), radang saluran napas, radang mata, sakit kepala, disentri dan sakit panas (Dalimartha 2000). Daun kumis kucing dan bunga knop segar mempunyai kandungan air yang tinggi, sehingga tidak dapat disimpan dalam waktu yang relatif lama. Berdasarkan kenyataan tersebut, perlu dilakukan pengawetan terhadap kedua komoditas ini yaitu dalam bentuk bubuk. Penelitian perlu dilakukan untuk membuat bubuk dengan metode terbaik, sehingga komponen-komponen penting yang terkandung di dalam daun kumis kucing dan bunga knop tidak banyak yang hilang. Produk dalam bentuk bubuk ini dapat dikembangkan sebagai suatu produk minuman seduhan, sehingga dapat memberi nilai tambah terhadap daun kumis kucing dan bunga knop. Mengingat berbagai fungsinya secara tradisional, 15 minuman seduhan kedua komoditas tersebut dapat dijadikan sebagai minuman fungsional. Sebelum dapat dikonsumsi secara aman, minuman seduhan daun kumis kucing dan bunga knop terlebih dahulu harus diuji keamanannya ddan fungsi biologis lainnya. Untuk itu perlu diketahui dosis yang aman untuk dikonsumsi sehari-hari dengan cara pengujian secara in vitro terhadap proliferasi sel limfosit manusia. Penggunaan sel limfosit manusia adalah karena limfosit merupakan sel yang sangat rentan terhadap bahan kimia, sehingga pengujian dengan limfosit ini dapat memberikan hasil yang akurat dan sensitif. Di samping itu, penggunaan sel limfosit dapat menggambarkan adanya aktifitas immunomodulator, yaitu memacu atau menekan respon imun (Pranoto 2003 ; Wahyuni 2004 ; Lin et al. 2005). Penelitian-penelitian yang menggunakan sel limfosit untuk pengujian keamanan pangan antara lain cincau hijau (Zakaria dan Prangdimurti 2001 ; Koesitoresmi 2002), jahe (Tejasari et al. 2000 ; Nurrahman 1998) dan makanan jajanan (Zakaria et al. 1997). Tujuan Tujuan penelitian ini adalah 1) memilih metode pengeringan terbaik untuk membuat bubuk seduhan daun kumis kucing dan bunga knop 2) menentukan dosis yang aman dari kedua komoditas tersebut dengan pengujian secara in vitro terhadap proliferasi sel limfosit manusia 3) Menunjukkan adanya aktivitas immunomodulator dari kedua komoditas tersebut. 16 TINJAUAN PUSTAKA Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) Tanaman kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) diduga berasal dari daerah Afrika tropik, kemudian menyebar ke wilayah Georgia (Kaukasus), Kuba, Asia dan Australia Tropik. Penyebarannya di Indonesia, yaitu di Jawa sejak 1928, India, Malaysia, Vietnam dan Thailand (de Padua et al. 1999). Gambar 1 Tanaman kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) Menurut Dalimartha (2000) kumis kucing tersebar di Sumatera dengan nama daerah kumis kucing (bahasa Melayu), di Jawa dengan nama daerah kumis kucing (bahasa Sunda) atau remujung (bahasa Jawa) dan soengoet koceng (bahasa Madura). Sentra produksi kumis kucing yaitu Jawa Tengah (Ambarawa, Kopeng dan Blora), Jawa Barat (Sukabumi dan Bogor), Jawa Timur, Sumatera Barat, Sumatera Utara, Aceh dan Sulawesi Utara (Mahendra dan Fauzi 2005). Berdasarkan ilmu taksonomi (Mahendra dan Fauzi 2005) tata nama kumis kucing adalah sebagai berikut. Divisi : Spermatophyta Subdivisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledonae Subkelas : Sympetalae 17 Ordo : Tubiflorae Famili : Labitae (Laminaceae) Genus : Orthosiphon Spesies : Orthosiphon stamineus Benth Tanaman kumis kucing berakar tunggang, termasuk tanaman tahunan, tumbuh tegak dengan tinggi mencapai 100-150 cm. Batang berbentuk persegi empat agak beralur, bercabang-cabang, berambut pendek atau gundul, berwarna hijau atau keunguan dan berdiameter sekitar 1.5 cm. Daun berbentuk bulat telur, lonjong, lanset atau belah ketupat dengan permukaan berbintik-bintik dan licin karena adanya kelenjar dalam jumlah banyak dan berwarna hijau keunguan. Panjang daun sekitar 10 cm dan lebar 3-5 cm (Mahendra dan Fauzi 2000). Bunga majemuk dalam tandan yang keluar di ujung percabangan, berwarna ungu pucat atau putih, benang sari lebih panjang dari tabung bunga. Buah berupa buah kotak, bulat telur, masih muda berwarna hijau, setelah tua berwarna coklat. Biji kecil, masih muda berwarna hijau, setelah tua berwana hitam Kumis kucing biasa tumbuh liar di sepanjang anak sungai dan selokan atau ditanam di pekarangan sebagai tumbuhan obat. Tumbuhan ini dapat ditemukan di daerah dataran rendah sampai ketinggian 700 m diatas permukaan laut (Dalimartha 2000). Menurut Mahendra dan Fauzi (2005) serta Dalimartha (2000), kumis kucing mengandung banyak komponen bioaktif seperti orthosiphon glikosida, tanin, minyak atsiri, minyak lemak, saponin, sapofonin, garam kalium (0.6-3.5%) , myoinositol dan sinensetin. Berdasarkan hasil penelitian Olah et al. (2003), kumis kucing mengandung polifenol yaitu polymethoxylated flavonoid dan turunan caffeic acid. Identifikasi lebih lanjut menunjukkan adanya kandungan caffeic acid, cichoric acid, rosmarinic acid, sinensetin dan eupatorine. Loon et al. (2005) melakukan penentuan tiga jenis flavonoid dari kumis kucing di dalam plasma mencit dengan metode HPLC dan deteksi dengan sinar ultraviolet. Ketiga jenis flavonoid tersebut adalah sinensetin, eupatorin dan 3’-hydroxy5,6,7,4’tetramethoxyflavone. Kumis kucing rasanya manis sedikit pahit dan sifatnya sejuk. Penelitian yang dilakukan terhadap efek yang ditimbulkan setelah seorang responden yang sehat meminum teh kumis kucing adalah dapat mencegah 18 asam urat dan terbentuknya batu yang mengandung asam urat dalam kandung kemih. Hal ini disebabkan oleh meningkatnya alkalinitas urin (Nirdnoy dan Muangman 1991). Hasil penelitian Isparyanto (1999) menunjukkan bahwa pemberian infus daun kumis kucing berdosis 12.85 g/kg bobot badan selama 7 hari dapat menurunkan asam urat darah tikus dengan efek yang sama dengan pemberian obat kimia Alopurinol 42.85 mg/kg bobot badan. Efek diuretik dari ekstrak air kumis kucing pada mencit menunjukkan adanya peningkatan pengeluaran urin (Casadebaig-Lafon et al. 1989; Beaux et al. 1999) . Kandungan Natrium dalam urin mencit juga meningkat dengan pemberian ekstrak air kumis kucing (Beaux et al. 1999). Berdasarkan penelitian Sari (1985) efek maksimal terhadap sifat diuretikum dari rata-rata 1 ml infus dengan kandungan 5%, 10% dan 20% daun kumis kucing berturut-turut adalah 275.22%, 376.64% dan 646.12%. Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa kumis kucing mengandung Kalium yang berfungsi sebagai pelarut batu ginjal dan batu saluran kemih. Dibandingkan dengan batangnya potensi diuretikum daun kumis kucing lebih baik. Volume urin rata-rata kelinci yang diberi infus daun kumis kucing sebesar 27.0 ml sedangkan volume urin rata-rata kelinci yang diberi infus batang sebesar 22.4 ml (Garnadi 1998). Daun kumis kucing juga dapat berfungsi sebagai anti bakteri. Hasil penelitian Sofiani (2003) menunjukkan adanya sifat anti bakteri dari ektrak daun kumis kucing terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis dan Eschericia coli dengan daya penghambatan yang berbeda. Sinensetin yang terkandung di dalam daun kumis kucing juga menghambat relatif besar terhadap Staphylococcus epidermidis. Tanaman ini yang biasa digunakan adalah daun atau seluruh bagian tanamannya, baik segar maupun sudah dikeringkan (Anonim 2005). Bunga Knop (Gomphrena globosa L.) Bunga knop (Gomphrena globosa L.) berasal dari Amerika (Dalimartha 2000 ; Anonim 2005) dan Asia (Anonim 2005). Tanaman ini tumbuh liar di ladang yang cukup mendapat sinar matahari dan dapat ditemukan pada ketinggian 1- 1.300 m di atas permukaan laut (Dalimartha 2000). 19 Gambar 2 Tanaman bunga knop (Gomphrena globosa L.) Di Indonesia, bunga knop tersebar di Sumatera dengan nama daerah bunga knop, kembang puter dan ratnapakaja. Nama daerahnya di Jawa adalah adasadasan, kembang gundul dan bunga kancing Selain itu dikenal pula di Bali dengan nama daerah ratna serta di Gorontalo dengan nama daerah taimantulu (Dalimartha 2000). Berdasarkan ilmu taksonomi (Anonim 2000), tata nama bunga knop adalah sebagai berikut : Divisi : Spermatophyta Subdivisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledonae Bangsa : Caryophyllales Suku : Amaranthaceae Marga : Gomphrena Jenis : Gomphrena globosa L. Tanaman ini berupa perdu dengan batang hijau kemerahan, berambut dan bercabang-cabang serta tinggi mencapai 60 cm (Anonim 2005). Daun tunggal, bertangkai pendek, letak berhadapan bersilang. Helaian daun bentuknya bulat 20 telur sungsang sampai memanjang, ujung meruncing, tepi rata, berwarna hijau, berambut kasar berwarna putih di permukaan atas dan berambut halus di permukaan bawah. (Dalimartha 2000). Bunga bentuk bonggol seperti bola, berwarna merah tua keunguan, putih (Anonim 2005) atau merah muda (Dalimartha 2000). Bijinya banyak dengan ukuran kecil-kecil panjang (Anonim 2005), sedang buahnya buah kotak berbentuk segi tiga terbungkus oleh lapisan tipis berwarna putih, berbiji satu (Dalimartha 2000). Menurut Mahendra dan Fauzi (2005) serta Dalimartha (2000), bunga knop mengandung gomphrenin I, II, III, V dan VI, amaranthin, minyak atsiri, saponin dan flavon. Menurut Cai et al (2001), bunga knop banyak mengandung komponen pigmen alami yaitu dari kelompok betasianin sebesar 1.3 mg/g sampel segar. Betasianin ini terdiri dari komponen gomphrenin I (betanidin 6-0-â- glukosida) sebesar 16.9%, isogomphrenin I (isobetanidin 6-0-â-glukosida) sebesar 8.8%, gomphrenin II (betanidin 6-0-(6’ -0-E-4-coumarooyl)-â-glukosida) sebesar 11.1%, isogomphrenin II (isobetanidin 6-0-(6’ -0-E-4-coumarooyl)-âglukosida) sebesar 3.5%, gomphrenin III (betanidin 6-0-(6’ -0-E-4-feruroyl)-âglukosida) sebesar 40.8% dan isogomphrenin III (isobetanidin 6-0-(6’ -0-E-4feruroyl)-â-glukosida). Menurut Cai et al (2001), betasianin merah yang terdiri dari betanin dan amaranthin bersifat tahan terhadap panas dalam sistem buffer, tetapi bersifat tidak stabil pada suhu di atas 40oC dan bersifat lebih stabil pada suhu 40oC tanpa adanya udara dan sinar. Penelitian yang dilakukan terhadap Amaranthus spinosus L., yaitu tanaman yang biasa digunakan sebagai obat di Afrika menunjukkan adanya kandungan betalain utama yang diidentifikasi sebagai amaranthin dan isoamaranthin. Selain itu tanaman ini juga mengandung hidroksisinamat, quersetin dan kaempferol glikosida yang semuanya merupakan senyawa fenolik (Stintzing et al. 2004). Warna bunga dan buah tanaman dari famili Caryophyllales berasal dari betalain yang berwarna merah-ungu untuk betasianin dan kuning untuk betaxanthin, keduanya menggantikan anthosianin. Betalain biasa digunakan sebagai pewarna makanan dan mempunyai sifat antioksidan yang dapat mencegah stress oksidatif (Strack et al. 2003). Pengujian terhadap kandungan polifenol Amaranthus sp. menunjukkan bahwa penambahan ekstrak Amaranthus sp. dengan konsentrasi 21 polifenol sampai dengan 0.2 µg/ml dapat meningkatkan perlindungan terhadap stress oksidatif oleh H2O2 yang menginduksi kerusakan DNA dari limfosit (Kapiszewska et al. 2005). Aurone I (E) -3’ –O - ß- D- glucopyranosy l-4,5, 6,4’ - tetrahydroxy -7,2’ dimethoxyaurone dan dua senyawa lain yaitu aurantiamide acetate dan tiliroside diisolasi dari ekstrak etanol Gomphrena agretis. Evaluasi terhadap aktivitas biologis ekstrak etanol Gomphrena agretis dan ketiga senyawa di atas menunjukkan adanya penghambatan terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa (Ferreira et al. 2004). Ekstrak petroleum eter dari Gomphrena martiana dan Gompohrena boliviana yang kemudian difraksinasi menghasilkan lima jenis 5,6,7-trisubstituted flavon. Pengujian secara terpisah terhadap hasil fraksinasi ini menunjukkan aktivitas antimikrobial yang tinggi terhadap M. Phlei dengan minimum inhibitory concentration (MIC) 15, 20 dan 75 µ/ml, mendekati hasil yang didapat dengan bakterisida komersial (Pomilio et al. 1992). Kultur sel dari sel endotel tali pusat manusia (HUVEC) yang diberi ekstrak Amaranthus sp. menunjukkan tidak dihasilkannya IL-1 sebagai proinflamatory sitokin yang menginduksi aktivasi AP-1. Mekanisme aktivitas penghambatan ini belum jelas, tetapi kemungkinan kandungan polifenol dari tanaman merupakan salah satu mediatornya (Stalinska et al. 2005). Bunga knop rasanya manis, sifatnya netral dan biasa digunakan sebagai obat batuk, obat sesak, obat astma, obat bronkhitis kronis, peluruh dahak, panas pada anak, disentri dan penambah nafsu makan. Tanaman ini yang biasa digunakan adalah bunga atau seluruh bagian tanamannya baik segar maupun sudah dikeringkan (Anonim 2005). Pengeringan Pengeringan bahan-bahan pertanian seperti sayuran dan buah-buahan adalah suatu cara untuk mengawetkan bahan-bahan pertanian (Imre 1995). Produk pertanian yang sudah dikeringkan berkurang kadar air dan kelembabannya, sehingga tidak memberi kesempatan pada mikroorganisme seperti bakteri dan 22 kapang untuk hidup (Sokhansanj dan Jayas 1999; Jayaraman dan Das Gupta 1995). Menurut Jayaraman dan Das Gupta (1995), faktor-faktor yang mempengaruhi pemilihan metode pengeringan adalah bentuk dari bahan mentah dan sifatsifatnya, karakteristik dan bentuk fisik yang diinginkan untuk produk akhirnya dan biaya operasional. Tiga cara yang biasa digunakan untuk mengeringkan buah-buahan dan sayur-sayuran adalah pengeringan dengan sinar matahari, pengeringan atmosfirik baik secara batch (tower atau cabinet dryers) atau kontinyu (tunnel, belt, Spray atau pemanasan dengan microwave) serta dehidrasi subatmosfir (vacuum shelf belt dan freeze dryer). Perubahan warna, aroma dan penampakan terjadi pada produk yang dikeringkan. Pengeringan dapat pula meningkatkan kualitas dan nilai nutrisi suatu produk pangan dan pakan, seperti rasa yang lebih enak dan daya cerna serta perubahan metabolik yang meningkat (Sokhansanj dan Jayas 1995). Selama pengeringan terjadi degradasi senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun seperti klorofil yang memberi warna hijau pada daun. Degradasi klorofil tergantung pada ph, waktu, kerja enzim, oksigen dan cahaya (Jayaraman dan Das Gupta 1995). Pengeringan dengan sinar matahari adalah suatu metode pengeringan tradisional yang telah berabad-abad dilakukan. Pengeringan ini dilakukan pada waktu matahari bersinar dengan suhu produk sewaktu dikeringkan berkisar antara 5-15oC di atas suhu ambient (Sokhansanj dan Jayas 1999). Masalah yang mungkin timbul pada pengeringan dengan sinar matahari antara lain adalah terjadinya hujan atau mendung, kontaminasi oleh debu, serangga, burung dan binatang lainnya, kurangnya pengawasan sehinga terjadi pengeringan melewati batas dan kemungkinan terjadi pembusukan baik secara kimiawi, enzimatis atau mikrobiologis karena waktu pengeringan yang lama (Jayaraman dan Das Gupta 1995). Selain itu dapat terjadi penurunan mutu selama penyimpanan karena terjadi ketidakseragaman pengeringan (Imre 1995). Menurut Mahendra dan Fauzi (2005) pengeringan daun kumis kucing dengan sinar matahari dilakukan selama 2-3 hari (bila matahari bersinar penuh) dan dapat pula dilakukan dengan menggunakan oven yang dapat diatur suhunya sebesar 60oC selama 3 – 6 jam. 23 Senyawa Fenolik Senyawa fenolik dalam bahan pangan meliputi asam-asam fenolik, polimer fenolik yang dikenal sebagai tanin dan flavonoid. Asam-asam fenolik terdiri dari kelompok asam hidroksibenzoat dan asam hidroksisinamat. Senyawa polimer fenolik adalah senyawa dengan berat molekul tinggi seperti tanin. Flavonoid adalah kelompok fenolik terbanyak yang terkandung dalam tanaman dan biasanya ditemukan dalam bentuk glikosida. Fenol adalah antioksidan terbanyak dalam tumbuhan yang berperan sebagai antioksidan pemutus rantai. Hal ini disebabkan oleh adanya gugus –OH yang menghalangi senyawa radikal yang reaktif seperti radikal peroksil (RO2’) -OH + RO2’ R-O’ + ROOH Hasil reaksi di atas menghasilkan radikal fenoksil yaitu R-O’ yang cenderung mempunyai sifat kurang reaktif karena terjadi delokalisasi elektron ke cincin aromatik. Hal ini menyebabkan radikal reaktif RO2’ berkurang kereaktifannya. Fenol kadangkala mempunyai mekanisme reaksi antioksidan tambahan seperti reaksi mengkelat ion logam transisi (Halliwell 2002). Penelitian yang dilakukan Cai et al. (2004) terhadap 112 tanaman yang biasa digunakan dalam pengobatan kanker secara tradisional di Cina menunjukkan adanya hubungan yang positif dan berbanding lurus antara aktivitas antioksidan dengan kandungan total fenolik dalam tanaman-tanaman tersebut. Nilai TEAC tanaman-tanaman tersebut berkisar antara 46.7 sampai 17,323 µM dan GAE sebesar 0.22 sampai 50.3 g GAE/100g berat kering. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa- senyawa fenolik merupakan senyawa antioksidan yang dominan dalam tanaman-tanaman tersebut. Senyawasenyawa fenolik utama yang terkandung di dalam tanaman-tanaman tersebut yang telah diidentifikasi dan dianalisa adalah asam-asam fenolik, flavonoid, tanin, coumarin, lignan, quinon, stilbene dan curcuminoid. Tanaman-tanaman tersebut dengan demikian kemungkinan merupakan sumber potensial antioksidan alami dan kemopreventif untuk mencegah kanker. Penelitian yang dilakukan terhadap aktivitas antioksidan pigmen betalain dari beberapa tanaman yang termasuk famili Amaranthaceae dengan menggunakan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl) yang dimodifikasi menunjukkan adanya aktivitas antioksidan yang tinggi untuk semua tanaman yang 24 diteliti. Betasianin tipe gomphrenin (rata-rata = 3.7 µM) dan betaxanthin (ratarata = 4.2 µM) menunjukkan aktivitas antioksidan tertinggi, 3-4 kali lebih tinggi dari asam askorbat (13.9 µM) dan lebih tinggi dari rutin (6.1 ì M) dan catechin (7.2 µM). Penelitian ini juga mempelajari hubungan antara struktur kimia dengan aktivitas antioksidan betalain. Aktivitas antioksidan dari betalain biasanya meningkat dengan meningkatnya jumlah gugus hidroksil/imino dan juga tergantung dari posisi gugus hidroksil dan glikosilasi dari aglikon dalam molekulnya (Cai et al. 2003). Aktivitas radical scavenging beberapa senyawa terhadap DPPH memberikan hasil sebagai berikut aktivitas asam kafeat > asam sinapat > asam ferulat > ester asam ferulat > asam p-kumarat (Kwon et al. 2003). Aktivitas antioksidan biasanya meningkat dengan adanya peningkatan jumlah gugus hidroksil dan menurun dengan adanya glikosilasi (Fukumoto dan Mazza 2000). Penelitian yang dilakukan dengan membandingkan tiga metode yaitu metode DPPH, static headspace gas chromatography (HS-GC) dan beta-carotene bleaching test (BCBT) untuk menentukan aktivitas antioksidan menunjukkan bahwa metode DPPH paling cocok digunakan uintuk menentukan aktivitas antioksidan karena dapat dilakukan dengan cepat, mudah dan tidak tergantung pada kepolaran sampel (Koleva et al. 2002). Flavonoid bukan hanya dapat dianggap sebagai antioksidan, karena pada kondisi reaksi tertentu dapat pula menunjukkan aktivitas prooksidan. Sifat yang tidak diinginkan ini dapat dijadikan penjelasan terhadap toksisitas dari beberapa flavonoid secara in-vivo (Kessler et al. 2003). Penelitian Kang et al. (2003) terhadap ekstrak heksan, etilasetat, n-butanol dan air dari 10 herbal yang biasa digunakan sebagai obat di Korea menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak dengan pelarut yang bersifat lebih polar (n-butanol dan air) relatif lebih tinggi dari aktivitas antioksidan ekstrak dengan pelarut bersifat non-polar (heksan dan etil asetat). Penggunaan asam tanat sebagai standar untuk memenentukan total fenol menggunakan metode Folin-Ciocalteau berdasarkan reaksi reduksi asam fosfomolibdat oleh fenol dalam larutan alkali. Metode ini menentukan total gugus fenolik bebas dengan demikian juga menentukan total fenolik terlarut. Kelemahan metode ini adalah tidak dapat membedakan antara tanin dan fenolik 25 lain yang bukan tanin. Senyawa seperti asam askorbat, tirosin dan mungkin juga glukosa ikut terukur (Waterman dan Mole 1994). Keamanan Pangan Keamanan pangan adalah suatu kebijakan yang menentukan keamanan suatu bahan pangan untuk dapat dikonsumsi. Suatu bahan pangan diminimalkan resikonya yang dapat menyebabkan sesuatu yang mambahayakan bagi kesehatan, karena tidak ada bahan pangan yang 100% bebas dari kontaminan (Finley dan Robinson 1992). Untuk mengevaluasi resiko atau keamanan dari suatu bahan pangan atau bahan yang digunakan sebagai komposisi dalam bahan pangan yang baru, maka perlu dilakukan penentuan tipe bahaya potensial yang dapat ditimbulkan oleh bahan tersebut. Sebagai contoh, untuk suatu bahan yang merupakan komposisi dalam suatu bahan pangan harus ditentukan bahaya potensial baik yang bersifat kimiawi maupun biologis yang berhubungan dengan bahan tersebut. Bila ada bahaya yang dikandung suatu bahan, perlu ditentukan konsentrasi dimana bahan tersebut dapat bersifat toksik. Hal lain yang perlu juga diperhatikan adalah pengaruh bahan tersebut terhadap nilai nutrisi bahan pangan dan pengaruhnya terhadap penyerapan nutrien-nutrien lainnya (Finley dan Robinson 1992). Bahan pangan yang aman tidak dapat mengesampingkan adanya toksikan alami baik yang terkandung secara alami dalam bahan maupun yang diinduksi karena adanya bahan-bahan lainnya. Makrokomponen di dalam suatu bahan pangan terutama lemak dan protein serta komponen-komponen anti kanker dan penghambat kanker yang banyak terdapat dalam bahan pangan tampaknya berinteraksi dengan komponen-komponen bahan pangan lainnya yang dapat memodulasi resiko kanker. Komponen-komponen yang secara alami terkandung dalam bahan pangan pada konsentrasi tertentu mempunyai aktivitas anti kanker, tetapi pada konsentrasi yang lebih tinggi menjadi bersifat toksik dan seringkali batas antara konsentrasi yang menguntungkan dan yang toksik sangat kecil (Shank dan Carson 1992). Penentuan dosis merupakan suatu hal yang kritis untuk menguji senyawasenyawa yang bersifat immunomodulator. Dosis tinggi yang dapat menyebabkan 26 toksisitas atau menurunnya berat badan harus dicegah, sebaliknya dosis terlalu rendah yang menyebabkan stress dan malnutrisi sehingga memodulasi fungsi imun tertentu juga harus dicegah (Dean et al. 1989). Penelitian untuk mengetahui efek immunomodulator suatu komponen dapat dilakukan dengan menggunakan limfosit darah tepi manusia. Limfosit ini diisolasi kemudian diinkubasikan secara in vitro dalam kultur yang telah banyak digunakan untuk menguji fungsi immun. Komponen yang akan diuji efek immunomodulatornya kemudian ditambahkan ke dalam kultur ini (Dean et al. 1989). Hasil penelitian Duthil et al. (2003) menunjukkan bahwa beberapa polifenol dapat bersifat toksik dan mutagenik di dalam suatu sistem kultur sel tertentu. Limfosit dan Proliferasi Sel Limfosit Sistem yang berfungsi melindungi tubuh manusia dari unsur-unsur patogen disebut sistem imun. Sistem imun terdiri dari komponen genetik, molekuler dan seluler yang berinteraksi secara luas dalam merespon antigen endogenus dan eksogenus. Salah satu jenis sel yang berfungsi dalam merespon antigen adalah sel darah putih (Baratawidjaja 2000). Leukosit atau sel darah putih merupakan salah satu bagian dalam sistem imun yang ukurannya lebih besar dari eritrosit dan bebas bergerak (Roitt 1991). Menurut Baratawidjaja (2000) leukosit terdiri dari 75% sel granulosit dan 25% sel agranulosit yang terbentuk di dalam sumsum tulang. Granulosit terdiri dari sel limfosit dan monosit sedang agranulosit terdiri dari basofil, neutrofil dan eusinofil (Roitt 1991). Limfosit adalah kunci pengatur sistem imun dan merupakan 20% dari semua leukosit dalam sirkulasi darah orang dewasa. Sel limfosit dibentuk dalam kelenjar timus dan sumsum tulang, merupakan sel nongranulosit berukuran kecil, berbentuk bulat dengan diameter 7 – 15 µm. Sel limfosit selain dalam darah terdapat pula paada organ limfoid seperti limpa, kelenjar limfe dan timus (Baratawidjaja 2000). Sel limfosit terdiri atas sel T dan sel B. Sel T yang dibentuk di dalam sumsum tulang, tetapi berproliferasi dan berdiferensiasi di dalam kelenjar timus berperan dalam sistem imun spesifik seluler untuk pertahanan terhadap bakteri 27 yang hidup intraseluler, virus, jamur parasit dan kanker (Baratawidjaja 2000). Sel T merupakan 65-80% dari jumlah sel limfosit yang ada di dalam sirkulasi darah (Kresno 1991). Sel T terdiri dari tiga populasi utama yaitu sel Thelper (Th), sel Tsupressor (Ts) dan Tcytotoxic (Tc). Masing-masing populasi sel T mengekspresikan pertanda permukaan atau Cluster Determinant (CD) berupa molekul glikoprotein yang berbeda-beda. Subset Th ditandai oleh glikoprotein CD4, sel Tc oleh glikoprotein CD8, sedangkan semua subset sel T ditandai oleh molekul CD3. Sel Th membantu sel B dalam memproduksi antibodi, sel Ts menekan pembentukan antibodi dan sel Tc berfungsi menghancurkan sasaran (Roitt 1991). Sel T berproliferasi menjadi sel T memori dan berbagai sel efektor yang mensekresi berbagai limfokin. Limfokin ini dapat mengaktivasi sel B, sel Tc, sel NK (Natural Killer) dan sel lain yang terlibat dalam respon imun (Roitt 1991). Sel B yang berasal dari sel asal multipoten berperan dalam sistem imun spesifik humoral. Bila sel B dirangsang oleh benda asing, maka sel tesebut akan berproliferasi dan berkembang menjadi sel plasma yang dapat menghasilkan antibodi. Antibodi inilah yang mempunyai fungsi utama melawan infeksi ektraseluler virus dan bakteri serta menetralisir toksinnya (Baratawidjaja 2000). Sel B merupakan 5-15% dari limfosit dalam sirkulasi darah (Kresno 1991). Proliferasi sel limfosit dapat distimulasi oleh bahan-bahan alamiah yang disebut mitogen. Glikoprotein (lectin) asal tanaman yaitu concanavalin A (Con A) dan phytohemaglutinin (PHA) merupakan mitogen poten untuk sel T dan berguna untuk identifikasi dan mempelajari fungsi sel tersebut. Lipopolisakarida (LPS) yang diperoleh dari dinding sel bakteri gram-negatif mempunyai efek mitogen terhadap sel B sedangkan pokeweed merupakan mitogen baik untuk sel B maupun sel T (Baratawidjaja 2000). Macam-macam mitogen yang biasa digunakan untuk menentukan fungsi limfosit manusia dapat dilihat pada Tabel 1. Sebanyak 50-60% limfosit T mampu memberikan respon terhadap stimulasi dengan mitogen misalnya Phytohemaglutinin (PHA) dan concanavalin A (Con A). Respon terhadap mitogen dianggap menyerupai respon terhadap antigen, sehingga uji transformasi limfosit dengan rangsangan mitogen banyak dipakai 28 untuk menguji fungsi limfosit. Stimulasi limfosit dengan antigen atau mitogen menimbulkan berbagai reaksi biokimia di dalam sel, diantaranya fosforilasi nukleoprotein, pembentukan DNA dan RNA serta peningkatan metabolisme Tabel 1. Mitogen-mitogen ”nonspecific” yang mengaktivasi sel limfosit manusia Mitogen Singkatan Phytohemaglutinin Concanavalin A PHA Sumber biologis Phaseolus vulgaris Con A Canavalia ensiformis Antilympcyte globulin ALG Heterologous antisera Staphylococcus protein A SpA S aureus PWM Phytolacca americana Pokeweed mitogen Stites (1991) Spesifisitas relatif sel T sel T (subset yang berbeda dengan PHA) sel T dan sel B sel B sel T-independent sel B sel T-independent lemak dan lain-lain. Secara morfologik perubahan tersebut tampak menyerupai sel blast yaitu sel bersitoplasma biru dengan zone perinuklear yang terang, berinti besar dan beranak inti. Sel ini pada umumnya dapat dibedakan dengan limfosit yang tidak terangsang, namun kadang-kadang sulit membedakan sel yang terangsang dengan limfosit besar, sehingga penilaian morfologik kadang-kadang meragukan. Puncak respon limfosit normal terjadi pada hari ketiga setelah rangsangan. Limfosit B juga dapat memberi respon terhadap rangsangan mitogen, tetapi puncak respon limfosit B biasanya terjadi lebih lambat yaitu pada hari kelima atau keenam (Kresno 1991). Fungsi sel imun ditentukan oleh keseimbangan oksidan-antioksidan terutama untuk memelihara integritas dan fungsi lipida membran, protein selular dan asam-asam nukleat serta untuk pengaturan signal transduksi dan ekspresi gen di dalam sel-sel imun (Wu dan Meydani 1998). Tejasari (2000) melakukan pengujian efek komponen oleoresin jahe terhadap respon proliferatif limfosit (sel B dan T). Pada kondisi tanpa stress oksidatif penambahan senyawa oleoresin dengan konsentrasi 50 µg/ml meningkatkan proliferasi sel B tertingi sebesar 456%, sedangkan penambahan senyawa gingerol dengan konsentrasi 150 µg/ml secara nyata meningkatkan proliferasi sel T sebesar 39%. 29 Pengaruh aktivitas ekstrak tanaman cincau hijau terhadap proliferasi sel limfosit manusia menunjukkan adanya proliferasi sel limfosit yang ditunjukkan oleh nilai indeks stimulasi. Penambahan ekstrak air akar heksan daun kultur dengan konsentrasi 0.13655 mg/ml memberikan nilai indeks stimulasi sebesar 1.03, sedangkan penambahan ekstrak heksan akar dengan konsentrasi 0.08683 mg/ml dan sebesar 0.34732 mg/ml memberikan indeks stimulasi berturut-turut sebesar 1.31 dan 1.06 (Pandoyo 2000). Immunomodulator Immunonodulator adalah senyawa-senyawa yang secara langsung merubah fungsi imun spesifik atau memberikan efek baik positif maupun negatif terhadap aktivitas sistem imun (Jaffe dan Sherwin 1991). Menurut Baratawidjaja (2000) Immunomodulator bekerja menurut 3 cara, yaitu melalui immunostimulasi dan immunosupresi. immunorestorasi, Immunorestorasi dan immunostimulasi disebut immunopotensiasi atau up regulation, sedangkan immunosupresi disebut juga down regulation. Penggunaan immunomodulator yang memberikan efek positif (stimulasi) terhadap aktivitas sistem imun diantaranya adalah untuk mengobati defisiensi imun seperti pada pengobatan penderita AIDS, sedangkan yang memberikan efek negatif (menekan) terhadap fungsi imun yang normal atau berlebihan seperti pada pengobatan penyakit autoimun (Jaffe dan Sherwin 1991). Faktor-faktor yang mempengaruhi suatu komponen bersifat immunomodulator antara lain adalah dosis, cara dan waktu pemberian. Bentuk dan lokasi terjadinya mekanisme immunomodulasi juga berperan terhadap sifat immunomodulator suatu komponen (Tzianabos 2000). Pengujian ekstrak air dari Amaranthus sp. terhadap sel splenosit dari mencit BALB/c menunjukkan kemampuan ekstrak ini untuk menstimulasi proliferasi sel splenosit. Sel B yang diisolasi dapat distimulasi juga oleh ekstrak ini. Pemurnian ekstrak air dari Amaranthus sp menghasilkan protein (GF1) dengan berat molekul 313kDa. GF1 mempunyai aktivitas immunomodulator 309 kali ekstrak air yang belum dimurnikan. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak air Amaranthus sp. mempunyai aktivitas immunomodulator dengan secara langsung 30 menstimulasi aktivitas proliferasi sel B dan proliferasi subset sel T secara in vitro (Lin et al. 2005). Penelitian terhadap aktivitas immunomodulator dari suatu polisakarida tertentu menunjukkan adanya pengaruh terhadap respon imun selama proses penyembuhan penyakit infeksi. Polimer-polimer ini dapat mempengaruhi imunitas spesifik dan non spesifik melalui interaksinya dengan sel T, monosit, makrofag dan limfosit polimorfonuklear (Tzianabos 2000). Penelitian mengenai aktivitas immunomodulator dari ekstrak akar Echinacea spp. menunjukkan bahwa ekstrak Echinacea spp. dapat menstimulasi proliferasi sel mononuklear darah tepi manusia, tetapi aktivitas immunomodulator ini dapat berubah bila sebelumnya Echinacea spp. ini disimpan pada 40C selama 4 hari. (Senchina et al. 2005). Kultur Sel Kultur sel adalah suatu teknik untuk memelihara atau mengembangbiakkan sel di luar tubuh (in vitro). Tujuan dari pemeliharaan sel atau jaringan ini adalah untuk mempelajari sifat-sifat sel di luar tubuh. Kultur sel mempunyai beberapa keuntungan antara lain dapat dikontrolnya lingkungan tempat hidup sel, seperti pH, tekanan osmosis, tekanan CO2 dan O2 yang menjadikan kondisi fiologis kultur relatif konstan. Selain itu kultur sel juga mempunyai kelemahan, seperti hilanganya spesifisitas sel, karena sel di luar tubuh bekerja sendiri-sendiri sedang di dalam tubuh (in vivo) bekerja secara terintegrasi di dalam satu jaringan (Freshney, 1995). Kondisi kultur harus disesuaikan dengan kondisi di dalam tubuh untuk menunjang pertumbuhan sel yang optimal. Kultur sebaiknya berada pada pH sekitar 7.4 dan tidak di bawah 7.0, karena pH di bawah 6.8 akan menghambat pertumbuhan sel. Sistem buffer dalam kultur biasanya menggunakan sistem CO2bikarbonat yang analog dengan sistem dalam darah. Sistem ini masih berada di bawah kondisi optimum fisiologis sehingga masih diperlukan tambahan CO2 5% pada bagian headspace kultur untuk menjaga stabilitas pH. Stabilitas pH juga dapat dijaga dengan menggunakan buffer yang bersifat zwitterion seperti buffer bikarbonat dan HEPES (N-2-hidroksimetil-piperazin-N-2-etan-sulphonic acid) (Freshney 1995). 31 Medium standar yang biasa digunakan untuk kultur sel adalah Dulbecco’s modified Eagle’s (DME) dan RPMI 1640. Medium ini diperkaya dengan 10% Fetal Bovine Serum (FBS). FBS digunakan karena mengandung molekul IgG dengan konsentrasi yang sangat rendah. Suplemen pertumbuhan lainnya tidak diperlukan kecuali bila jumlah sel yang tumbuh sangat rendah (kira-kira di bawah 103 sel/ml). Antibiotik yang biasa ditambahkan ke dalam medium adalah penisilin dan streptomisin. Penisilin efektif untuk membunuh bakteri gram positif sedang streptomisin efektif membunuh bakteri gram negatif (Harlow dan Lane 1988). 32 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Pada penelitian ini, bahan-bahan yang digunakan adalah daun kumis kucing dari kebun di Kampus IPB Darmaga, bunga knop kebun Tanaman Obat Karyasari, Leuwiliang Bogor dan darah manusia dari responden terpilih. Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah K2SO4 (Kanto Chemical, Jepang), HgO (Merck, Jerman), H2SO4 pekat (Kanto Chemical, Jepang), batu didih, H3BO3 (Kanto Chemical, Jepang), metilen merah (Kanto Chemical, Jepang) metilen biru (Kanto Chemical, Jepang), NaOH-Na2S2O3, (Merck, Jerman), HCl (Merck, Jerman), dietil eter (Merck, Jerman), air bebas ion, buffer asetat (Merck, Jerman), akuades, air bebas pirogen, standar asam tanat (Merck, Jerman), Na2CO3 (Merck, Jerman), folin-ciocalteau 50% (Sigma, USA), etanol 95% (Merck, Jerman), metanol p.a. (Merck, Jerman), DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) (Sigma, USA), trolox® (Sigma, USA), tryphan blue (Wako, Jepang), larutan Ficoll-histopaque (Sigma, USA), phosphat buffer saline (PBS) (Sigma, USA), medium RPMI-1640 (Gibco, USA), NaHCO3 (Merck, Jerman), fetal bovine serum (FBS) (Sigma, USA), penicillin-streptomycin (Sigma, USA), concanavalin A (Sigma, USA), pokeweed (Sigma,USA), lipopolisakarida S. typhosa (Sigma, USA), MTT (3(4,5- dimethylthiazol-2-5-diphenyl-tetrazolium bromide)) (Sigma, USA) dan HClisopropanol (Merck, Jerman). Alat-alat yang digunakan adalah wadah seng, oven, timbangan, neraca analitik, hot plate, cawan alumunium, desikator, alat destilasi, labu kjeldahl, labu lemak, alat ekstraksi soxhlet, kondensor, cawan porselen, tanur, blender, vortek, pH-meter, alat-alat gelas, , saringan vakum, kertas saring Whatman no. 41, stopwatch, mortar, freeze drier, alumunium foil, sentrifuse, pipet mikro, tip, hemasitometer, mikroskop Zeiss Germany ID 03, spektrofotometer, vacutainer, filter 0.2 µm, pipet pasteur, micro plate, laminar flow, inkubator (5% CO2, RH 95%, suhu 37oC) dan microplate reader. 33 Metode Penelitian Pembuatan Bubuk Daun Kumis Kucing dan Bubuk Bunga Knop Metode Pengeringan Oven Daun kumis kucing segar dicuci bersih kemudian dikeringanginkan, sedangkan untuk bunga knop segar tidak perlu dicuci. Setelah itu dikeringkan dengan oven pada suhu 50oC sampai kadar airnya mencapai 7%. Produk yang telah dikeringkan kemudian diblender selama 2 menit untuk menghasilkan bubuk. Bubuk ini kemudian dianalisa proksimat. Metode Pengeringan Sinar Matahari Daun kumis kucing segar dicuci bersih kemudian dikeringanginkan, sedangkan untuk bunga knop segar tidak perlu dicuci. Setelah itu dikeringkan di bawah sinar matahari tetapi tidak secara langsung sampai kadar airnya mencapai 7%. Produk yang telah dikeringkan kemudian diblender selama 2 menit untuk menghasilkan bubuk. Bubuk ini kemudian di analisa proksimat. Pembuatan Ekstrak Air Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop Segar dan Bubuk Daun kumis kucing segar dan bunga knop segar dihaluskan dengan mortar kemudian diekstraksi dengan akuades mendidih dengan perbandingan berturutturut sebesar (1.1835 g : 220 ml) dan (3.6720 g : 80 ml) dan didiamkan selama 5 menit. Hasil ekstraksi diaduk kemudian disaring menggunakan saringan vakum dengan kertas saring Whatman no. 41. Dasar penggunaan perbandingan antara daun kumis kucing segar dengan akuades dapat dilihat pada Lampiran 1 dan untuk bunga knop segar pada Lampiran 2. Ekstrak air daun kumis kucing dan bunga knop dianalisa total fenol dan aktivitas antioksidannya. Bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop diekstraksi dengan menggunakan akuades mendidih dengan perbandingan sebesar (1 g : 257 ml) dan (0.8667 g : 80 ml) dan didiamkan selama 5 menit. Pembuatan ekstrak air ini dilakukan dengan perbandingan yang sama, baik untuk bubuk hasil pengeringan oven maupun bubuk hasil pengeringan sinar matahari. Hasil ekstraksi diaduk kemudian disaring menggunakan saringan vakum dengan kertas saring Whatman no. 41. Dasar penggunaan perbandingan antara bubuk daun kumis kucing 34 dengan akuades dapat dilihat pada Lampiran 1 dan untuk bubuk bunga knop pada Lampiran 2. Ekstrak air daun kumis kucing dan bunga knop dianalisa total fenol dan aktivitas antioksidannya. Analisa Total Fenol modifikasi metode Chandler dan Dodds (Shetty et al. 1995) Ekstrak air daun kumis kucing dan bunga knop baik segar maupun bubuk sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi 1 ml etanol 95%. Setelah itu 5 ml air bebas ion ditambahkan ke dalam 50%, divortek dan didiamkan selama 5 menit. Kemudian 1ml Na2CO3 5% ditambahkan ke dalam tabung reaksi tersebut, divortek dan disimpan delam ruang gelap selama 60 menit. Selanjutnya sampel divortek kembali dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 725 nm. Kurva standar dipersiapkan dengan menggunakan asam tanat standar yang dilarutkan dengan etanol 95%. Sebagian ektrak air sampel disimpan dalam ruang gelap pada suhu kamar untuk dianalisa lagi kandungan total fenol sampel setelah penyimpanan 24 jam. Analisa Aktivitas Antioksidan (Kubo et al. 2002) Buffer asetat 0.1M (pH 5.5) sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 1.87 ml etanol p.a. dan 0.15 ml senyawa radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 3mM dalam metanol. Campuran ini divortek. Sebanyak 0.03 ml ekstrak air daun kumis kucing dan bunga knop baik segar maupun bubuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi tersebut kemudian di vortek dan disimpan dalam ruang gelap pada suhu kamar (25oC) selama 20 menit. Setelah 20 menit absorbansi yang dihasilkan dibaca pada 517 nm. Untuk blanko digunakan akuades sebagai pengganti sampel, sedangkan untuk kontrol DPPH diganti dengan metanol dan sampel diganti akuades. Penurunan absorbansi menunjukkan adanya aktivitas scavenging atau aktivitas antioksidan. Untuk pembuatan kurva standar digunakan Trolox®, dengan satuan TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Sebagian ekstrak air sampel disimpan dalam ruang gelap pada suhu kamar untuk dianalisa lagi aktivitas antioksidan sampel setelah penyimpanan 24 jam. 35 Analisa Proksimat (Apriyantono et al. 1989) Analisa kadar air yang dilakukan dengan metode oven adalah sebagai berikut. Cawan aluminium dikeringkan dalam oven selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator selama 10 menit, kemudian ditimbang. Bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop ditimbang kurang lebih 5 gram dalam cawan. Selanjutnya cawan beserta isinya ditempatkan dalam oven selama 6 jam. Kemudian cawan dipindahkan ke desikator, lalu didinginkan. Setelah dingin ditimbang kembali dan proses pengeringan dalam oven diulang sampai diperoleh berat yang tetap. Perhitungan : Berat sampel (g) = W1 Berat sampel setelah dikeringkan (g) = W2 Kehilangan berat (g) = W3 Kadar air (basis kering) (%) = W3 x 100% W2 Kadar air (basis basah) (%) = W3 x 100% W1 Pengukuran Kadar Protein dilakukan dengan cara menimbang sejumlah bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop dan dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl lalu ditambahkan 2 g K2SO4, 50 mg HgO, 2 ml H2SO4 pekat dan batu didih. Sampel didekstruksi selama 1-1.5 jam hingga jernih, lalu didinginkan. Secara perlahan ditambahkan 2ml air dan didinginkan kembali. Cairan hasil dekstruksi (cairan X) dipindahkan ke dalam alat destilasi dan labu dibilas dengan air. Erlenmeyer berisi 5 ml H3BO3 dan 2 tetes indikator (metilen merah : metilen biru = 2:1) diletakkan di ujung kondensor alat destilasi. Cairan X ditambah dengan 10 ml NaOH-Na2S2O3 dan didestilasi sampai larutan dalam erlenmeyer ± 5 ml. Kemudian larutan dalam erlenmeyer dititrasi dengan HCl 0.02 N. Perhitungan : Volume HCl untuk titrasi sampel (ml) = Vs Volume HCl untuk titrasi blanko (ml) = Vb Konsentrasi HCl (N) Berat sampel (mg) =C =W 36 Kadar N (%) = (Vs-Vb)x N x 14.007 x 100% W Kadar protein (%) = % N x 6.25 Pengukuran Kadar Lemak dilakukan dengan cara sebagai berikut. Labu lemak yang telah bebas lemak dikeringkan di dalam oven. Setelah kering labu didinginkan kemudian ditimbang. Bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop dibungkus dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi soxhlet, kemudian kondensor dan labu lemak dipasang pada ujung-ujungnya. Pelarut dietil eter dimasukkan ke dalam alat lalu sampel direfluks selama 5 jam. Setelah itu pelarut didestilasi dan ditampung di dalam wadah lain. Lemak dan labu lemak dikeringkan di dalam oven pada suhu 105oC. Labu lemak kemudian dipindahkan ke desikator, lalu didinginkan. Setelah dingin labu lemak ditimbang kembali dan diulang proses pengeringan dalam oven sampai diperoleh berat yang tetap. Perhitungan : Berat sampel (g) = W1 Berat lemak (g) = W2 Kadar lemak (%) = W2 x 100% W1 Pengukuran Kadar Abu dilakukan dengan cara sebagai berikut. Cawan porselin dibakar dalam tanur selama 15 menit kemudian didinginkan di dalam desikator. Setelah dingin cawan ditimbang. Bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop sebanyak 5 g ditimbang di dalam cawan lalu diabukan di dalam tanur sampai didapatkan abu berwarna abu-abu dan beratnya tetap. Pengabuan dilakukan dalam 2 tahap, yaitu : tahap pertama suhu 400oC lalu dilanjutkan pada suhu 550oC. Cawan kemudian didinginkan di dalam desikator lalu ditimbang. Perhitungan : Berat sampel (g) = W1 Berat abu = W2 (g) Kadar abu (%) = W2 x 100% W1 37 Analisa Proliferasi Limfosit Persiapan Larutan Ekstrak Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop Serta Larutan Mitogen Persiapan ekstrak daun kumis kucing dan bunga knop dilakukan dengan cara terlebih dahulu membuat stock ekstrak Pembuatan stock ekstrak adalah dengan cara membuat ekstrak air bubuk hasil pengeringan terbaik yang dibuat sesuai dengan perbandingan pada Lampiran 1 untuk daun kumis kucing dan Lampiran 2 untuk bunga knop. Hasil ekstraksi disaring menggunakan saringan vakum dengan kertas saring Whatman no. 41. Setelah itu hasil ektraksi dikeringbekukan dengan freeze drier. Tabung freeze drier ditimbang (X1), setelah itu hasil ekstrak air dimasukkan ke dalam tabung dan dikeringbekukan menggunakan freeze drier selama 48 jam. Selama dikeringbekukan tabung freeze drier ditutup dengan alumunium foil untuk menghindari terjadinya oksidasi. Hasil freeze dry (X2) ditimbang untuk menentukan rendemen. Rendemen didapatkan dari perhitungan : Berat bubuk sampel awal (g) = W1 Berat hasil freeze dry (g) = X2 - X1 = W2 Rendemen sampel (basis basah) (%) = W2 x 100% W1 Rendemen yang didapat merupakan dasar untuk menghitung konsentrasi ekstrak yang akan dimasukkan ke dalam kultur sel. Perhitungan selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 3 untuk daun kumis kucing dan Lampiran 4 untuk bunga knop. Rendemen ini adalah stock ekstrak yang digunakan untuk membuat larutan stock ekstrak daun kumis kucing dan bunga knop Pembuatan Larutan Stock Ekstrak (Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop) dan Larutan Stock Mitogen (LPS, ConA dan pokeweed) dilakukan dengan cara : 1. Pembuatan larutan stock ekstrak (daun kumis kucing dan bunga knop) Sebanyak 0.2 g hasil freeze dry dilarutkan dengan sedikit medium RPMI-1640 takar (medium pencuci), kemudian dimasukkan ke dalam labu 5 ml. Medium RPMI-1640 (medium pencuci) ditambahkan sampai tanda tera, sehingga didapatkan larutan stock dengan konsentrasi 40 mg/ml. 38 2. Pembuatan larutan stock LPS dan Con A Sebanyak 1 mg bubuk mitogen dilarutkan dengan sedikit medium RPMI1640, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml. Medium RPMI-1640 ditambahkan sampai tanda tera, sehingga didapatkan larutan stock dengan konsentrasi 200 µg/ml. 3. Pembuatan larutan stock Pokeweed Sebanyak 0.005 g bubuk pokeweed dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan eppendorf 1 ml, dilarutkan dengan medium RPMI-1640 sampai volume sehingga didapatkan larutan stock dengan konsentrasi 5000 µg/ml. Larutan-larutan stock ini kemudian diencerkan sesuai dengan konsentrasi larutan ekstrak (daun kumis kucing dan bunga knop) serta larutan mitogen yang diinginkan. Pembuatan larutan ekstrak (daun kumis kucing dan bunga knop) yang akan diuji serta larutan mitogen (LPS, Con A dan Pokeweed) dari larutan Stock dilakukan dengan cara mengencerkan larutan stock dengan medium RPMI-1640 sesuai dengan konsentrasi ekstrak yang diujikan dan konsentrasi larutan mitogen yang diinginkan. Misal untuk membuat 5 ml (V2) ekstrak kumis kucing dengan konsentrasi 0.6015 mg/ml (M2), maka larutan stock dengan konsentrasi 40 mg/ml (M1) yang harus diambil (V1) adalah : V1 x M1 = V2 x M2 V1 x 40 mg/ml = 5 ml x 0.6015 mg/ml V1 = 0.075 ml = 75 µl Jadi sebanyak 75 µl larutan stock diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml dan ditambah dengan medium RPMI-1640 sampai tanda tera. Persiapan Medium Kultur Sel Limfosit (Koesitoresmi 2002), Isolasi Limfosit (Nurrahman 1999) dan Penghitungan Sel Medium yang digunakan untuk kultur dan pemeliharaan sel limfosit adalah 16.2 g RPMI-1640 bubuk yang telah mengandung L-glutamin dan 0.25 mM HEPES. Bubuk ini dilarutkan dengan air bebas pirogen sehingga diperoleh 1 liter larutan medium RPMI-1640. Kemudian ditambahkan 2 g NaHCO3 dan 1% 39 penicillin-streptomycin. Medium yang telah diperkaya ini kemudian disterilisasi kering dengan membran filter 0.2 µm dan digunakan sebagai medium pencuci. Untuk medium kultur sel limfosit digunakan medium RPMI-1640 di atas dengan penambahan fetal bovine serum (FBS) 10% steril. Pembuatan medium dan tahaptahap selanjutnya dalam isolasi limfosit dilakukan di dalam laminar flow yang steril dengan sistem pengaliran udara laminar. Sebelum digunakan, laminar flow ini disinari dahulu dengan sinar UV selama 15 menit. Gambar 3 Pengambilan darah secara aseptis Darah seorang wanita sehat berusia 22 tahun diambil secara aseptis sebanyak 50 ml dengan menggunakan needle dan vacutainer yang telah mengandung heparin. Darah dari dalam vacutainer dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse steril, kemudian di sentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Bagian tengah (lapisan buffycoat) yang berisi sel-sel limfosit diambil perlahan-lahan dengan pipet pasteur steril kemudian ditambah dengan 5 ml medium RPMI-1640. Larutan Ficoll-histopaque dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse, kemudian dimasukkan perlahan-lahan campuran lapisan buffycoat dan medium RPMI di atasnya dengan perbandingan 1: 1. Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit. Hasil sentrifuse didapatkan lapisan putih seperti cincin antara larutan ficoll-histopaque dan RPMI-1640. Lapisan putih tersebut diambil dengan pipet pasteur ke dalam tabung sentrifuse dan ditambah dengan 5 ml RPMI-1640 (medium pencuci), kemudian 40 disentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dan ditambahkan RPMI-1640 (medium pencuci), disentrifuse pada 2000 rpm selama 10 menit. Pencucian limfosit ini dilakukan 2 kali sehingga diperoleh kemurnian suspensi sel limfosit yang tinggi. Sebelum dilakukan kultur sel limfosit, terlebih dahulu dilakukan penghitungan sel limfosit dengan menggunakan pewarna tryphan blue. Sejumlah sel ditempatkan ke dalam sumur microplate dan ditambah dengan tryphan blue. Penghitungan sel limfosit dilakukan dengan menggunakan hemasitometer di bawah mikroskop cahaya Zeiss Germany ID 03 dengan perbesaran 10 kali. Untuk dapat dikultur, jumlah sel limfosit yang dapat dihitung harus lebih besar dari 95% berupa sel limfosit hidup yang berwarna terang. Limfosit yang diperoleh akan digunakan untuk pengujian proliferasi sel B dan sel T. Penghitungan sel limfosit dengan hemasitometer dapat dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut : N = A x FP x 104 sel/ml Keterangan : N = jumlah sel limfosit/ ml A = jumlah sel hidup rata-rata per bidang pandang FP = faktor pengenceran 104 = jumlah sel per luas bidang pandang (1.0 mm x 1.0 mm x 0.1 mm) Kultur Limfosit Jumlah sel limfosit dari responden ditepatkan menjadi 2 x 106 sel/ml dengan medium RPMI-1640. Untuk microplate 96 sumur, agar volume total masing- masing sumur menjadi 100 µl, maka bahan-bahan yang dipersiapkan untuk ditanam ke dalam kultur dapat dilihat pada pada Tabel 2. Setiap perlakuan dilakukan tiga kali ulangan. Penentuan konsentrasi mitogen dapat dilihat pada Lampiran 5. Kultur diinkubasi selama 72 jam dalam inkubator bersuhu 37oC dengan atmosfer yang mengandung 5% CO2 dan RH 95%. 41 Pengujian proliferasi sel limfosit dilakukan dengan menggunakan metode MTT. Enam jam sebelum masa inkubasi berakhir, ke dalam masing-masing sumur ditambahkan 10 ì l pewarna MT T 0.5% dan diinkubasi kembali pada Tabel 2. Bahan-bahan yang ditanam ke dalam kultur sel Perlakuan Kontrol limfosit Kontrol mitogen* Kontrol ekstrak** Ekstrak**+ mitogen* RPMI (µl) Suspensi limfosit dalam RPMI (µl) Mitogen* (µl) Ekstrak (µl) FBS (µl) 20 70 - - 10 - 70 20 - 10 - 70 - 20 10 - 70 10 10 10 *Mitogen : Lipopolisakarida (LPS), concanavalin A (conA) dan pokeweed (PK) ** Ekstrak : Ekstrak daun kumis kucing dan bunga knop dengan konsentrasi Sesuai dengan Lampiran 3 untuk daun kumis kucing dan Lampiran 4 untuk bunga knop kondisi yang sama selama 6 jam. Pada akhir masa inkubasi, ditambahkan 80 ì l HCl-isopropanol 0.04 N, setelah itu dilakukan pembacaan sel dengan alat microplate reader pada panjang gelombang 570 nm. - Nilai indeks stimulasi (IS) untuk semua perlakuan penambahan ekstrak daun kumis kucing, bunga knop maupun mitogen : IS = OD perlakuan OD kontrol Pengujian ekstrak kumis kucing dan bunga knop dalam kultur sel limfosit ini menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK). Hasil pengujian dianalisis dengan Analisis Sidik Ragam Satu Arah (ANOVA) dengan menggunakan program SPSS versi 12. 42 HASIL DAN PEMBAHASAN Daun Kumis Kucing Metode Pengeringan Daun kumis kucing setelah dikeringkan dengan dua macam metode pengeringan, maka didapatkan hasil yang terbaik. Hasil terbaik ini dinilai berdasarkan analisa total fenol dan analisa aktivitas antioksidan bubuk hasil pengeringan kedua metode. Bunga knop bila dilihat dari warna bubuk dan warna ekstrak airnya, kumis kucing, Bila dilihat dari warna bubuk dan warna ekstrak air daun hasil metode pengeringan dengan sinar matahari memberikan warna yang lebih baik dibandingkan hasil metode pengeringan dengan oven. Bubuk terlihat masih berwarna hijau, sedangkan warna ekstrak airnya coklat pekat. Pada metode pengeringan dengan sinar matahari, sebelum dikeringkan di bawah sinar matahari daun terlebih dahulu dikeringanginkan untuk memberi kesempatan daun menutup stomatanya. Menurut Mahendra dan Fauzi (2005) menutupnya stomata pada daun merupakan suatu sistem yang alami pada tumbuhan untuk mencegah penguapan zat-zat yang terkandung dalam daun. Selain itu, pada metode pengeringan dengan sinar matahari daun tidak langsung terkena matahari, sehingga lebih sedikit panas yang menyebabkan terdegradasinya klorofil. Warna hijau ini menunjukkan bahwa dengan pengeringan matahari sampai kadar air 7% zat-zat hijau daun yang terkandung dalam daun kumis kucing masih banyak (Jayaraman dan Das Gupta 1995). Senyawa fenol yang terkandung di dalam daun kumis kucing adalah orthosiphon glikosida, tanin, saponin, sapofonin, myoinositol dan sinensetin (Mahendra dan Fauzi 2005; Dalimartha 2000), polifenol yaitu polymethoxylated flavonoid dan turunan caffeic acid. (Olah et al. 2003). Identifikasi lebih lanjut menunjukkan adanya kandungan caffeic acid, cichoric acid, rosmarinic acid, sinensetin dan eupatorine. Selain itu menurut Loon et al. (2005) kumis kucing juga mengandung tiga jenis flavonoid yaitu sinensetin, eupatorin dan 3’ -hydroxy5,6,7,4’ tetramethoxyflavone. Warna ekstrak air bubuk daun kumis kucing yang berwarna coklat pekat kemungkinan karena adanya proses oksidasi selama 43 Sinar matahari Oven Gambar 4 Bubuk daun kumis kucing Sinar matahari (1 g bubuk : 257 ml air) Oven (1 g bubuk : 257 ml air) Gambar 5 Ekstrak air bubuk daun kumis kucing 44 pengeringan, seperti halnya pada teh hitam menurut Rijken et al (2002) perubahan oksidatif yang terjadi selama produksi teh hitam menyebabkan perubahan catechin monomerik yang tidak berwarna menjadi flavonoid oligomerik yang berwarna oranye kekuningan dan merah kecoklatan. Pada pengeringan dengan sinar matahari kemungkinan terjadi proses oksidasi yang lebih lama sehingga memberi warna ekstrak yang berwarna merah kecoklatan. Hasil yang didapat pada metode pengeringan dengan oven terlihat warna bubuk kecoklatan dan warna ekstrak airnya coklat terang. Warna bubuk yang kecoklatan kemungkinan karena terdegradasinya klorofil karena pengeringan dengan oven. Warna ekstrak air daun kumis kucing yang dihasilkan dengan pengeringan dengan oven warnanya coklat terang. Hal ini kemungkinan karena dengan pengeringan oven selain suhunya yang relatif stabil juga tinggi yaitu 50oC, sehingga daun kumis kucing lebih cepat mencapai kadar air 7%, sehingga proses oksidasi senyawasenyawa fenol yang terjadi lebih sedikit dibanding dengan daun yang dikeringkan dengan sinar matahari. Total Fenol dan Aktivitas Antioksidan Analisa total fenol dilakukan untuk mengukur kandungan fenol dalam ekstrak air daun kumis kucing. Penggunaan asam tanat sebagai standar untuk menentukan total fenol menggunakan metode Folin-Ciocalteau berdasarkan reaksi reduksi asam fosfomolibdat oleh fenol dalam larutan alkali. Metode ini menentukan total gugus fenolik bebas dengan demikian juga menentukan total fenolik terlarut (Waterman dan Mole 1994). Berdasarkan analisa kadar total fenol dan analisa aktivitas antioksidan dalam ekstrak air bubuk daun kumis kucing, terbukti bahwa kadar rataan total fenol dan aktivitas antioksidan ekstrak air bubuk daun kumis kucing yang dikeringkan dengan sinar matahari lebih tinggi yaitu 123.434 + 12.159 mg fenolik/g berat kering sampel dan TEAC sebesar 1354.756 + 1.515 mM/g berat kering sampel bila dibandingkan dengan yang dikeringkan dengan oven 16.918 + 0.123 mg fenolik/g berat kering sampel dan TEAC sebesar 470.441 + 61.699 mM/g berat kering sampel (Tabel 3 dan 4). 45 Bila dibandingkan dengan kadar rataan total fenol ekstrak air daun kumis kucing segar pada saat perlakuan 0 jam dan 24 (48.566 + 11.481 dan 42.514 + 12.901 mg fenolik/g berat kering sampel), maka kadar rataan total fenol pada ekstrak air bubuk daun kumis kucing yang dikeringkan dengan sinar matahari terlihat lebih tinggi yaitu 123.434 + 12.159 dan 87.624 + 6.785 mg fenolik/g berat kering sampel (secara statistik bermakna p 0.001 dan p 0.018), sedangkan ekstrak air bubuk hasil pengeringan oven terlihat lebih rendah yaitu sebesar 16.918 + 0.174 dan 14.086 + 0.250 mg fenolik/g berat kering sampel (tidak bermakna secara statistik p 0.085 dan p 0.125). Hal ini kemungkinan menurut Sokhansanj dan Jayas (1995), terjadi karena pengeringan dapat meningkatkan kualitas suatu produk pangan dan pakan di antaranya adalah perubahan metabolik yang meningkat. Pengeringan dengan sinar matahari dapat meningkatkan kualitas ekstrak air daun kumis kucing. Kadar total fenol yang tinggi pada ekstrak air bubuk daun kumis kucing yang dikeringkan dengan sinar matahari menunjukkan kandungan fenol yang tinggi. Senyawa fenolik adalah senyawa antioksidan. Kandungan senyawa ini di dalam daun kumis kucing tinggi, dengan demikian kandungan antioksidan di dalam daun kumis kucingpun tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak air bubuk kumis kucing merupakan sumber potensial antioksidan alami. ` Tabel 3. Perbandingan total fenol pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air daun kumis kucing segar Perlakuan KKS1 KKS2 KKM1 KKM2 KKO1 KKO2 Total fenol Mean p SD 0 jam 24 jam 0 jam 24 Jam 0 jam 24 jam 0 jam 24 jam 56.685 40.448 132.031 114.836 17.041 16.796 51.636 33.391 92.422 82.826 14.262 13.909 48.566 42.514 11.481 12.901 123.434 87.624 12.159 6.785 0.001* 0.018* 16.918 14.086 0.123 0.250 0.085 0.125 Penelitian lainnya terhadap aktivitas antioksidan beberpa jenis buah-buahan dan sayuran memberikan hasil sebagai berikut. Buah berry TEAC 3700, sayursayuran TEAC 450-1400 serta buah-buahan TEAC 600-1700 (Miller et al. 2000). 46 Bila dibandingkan dengan nilai TEAC terutama untuk sayuran, maka nilai TEAC ekstrak air bubuk daun kumis kucing cukup tinggi, terutama yang pengeringannya dilakukan dengan sinar matahari (1354 .756 + 1.515). *p 0.01 130.000 120.000 Lama Penyimpanan 0 Jam 24 Jam 110.000 Total Fenol (mg fenolik/g berat kering sampel) 100.000 *p 0.018 90.000 80.000 70.000 KKS : Kumis Kucing segar KKM : Pengeringan dengan sinar matahari KKO : Pengeringan dengan oven 60.000 50.000 40.000 30.000 20.000 10.000 0.00 KKS KKM KKO Gambar 6 Perbandingan total fenol ekstrak air masing-masing Perlakuan pada daun kumis kucing. Penyimpanan ekstrak air daun kumis kucing selama 24 jam mempengaruhi kadar total fenol. Setelah 24 jam, kadar rataan total fenol ekstrak air daun segar mengalami penurunan dari 48.566 + 11.481 mg fenolik/g berat kering sampel menjadi 42.514 + 12.9 mg fenolik/g berat kering sampel. Kadar rataan total fenol untuk ekstrak air bubuk kumis kucing hasil pengeringan matahari mengalami penurunan yaitu dari 123.434 + 12.159 mg fenolik/g berat kering sampel menjadi 87.624 + 6.785 mg fenolik/g berat kering sampel, sedangkan ekstrak air bubuk kumis kucing hasil pengeringan oven juga mengalami penurunan kadar rataan total fenol yaitu dari 16.918 + 0.174 mg fenolik/g berat kering sampel menjadi 14.086 + 0.250 mg fenolik/g berat kering sampel, seperti terlihat pada Tabel 3 dan Gambar 6. Penurunan ini disebabkan oleh adanya reaksi oksidasi selama penyimpanan dan kemungkinan juga terjadi perubahan pH 47 ekstrak air. Hal ini sesuai dengan pendapat Jayaraman dan Das Gupta (1995) yang menyatakan bahwa degradasi klorofil tergantung pada pH, waktu, kerja enzim, oksigen dan cahaya. Tabel 4. Perbandingan aktivitas antioksidan pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air daun kumis kucing segar Perlakuan KKS1 KKS2 KKM1 KKM2 KKO1 KKO2 mM trolox Mean p SD 0 Jam 24 jam 0 jam 24 Jam 0 jam 24 jam 2474.837 1922.311 1353.685 1355.827 514.069 426.813 2491.622 2188.022 1348 1344 429.715 375.275 2198.574 2339.822 390.695 214.678 1354.756 1346 1.515 470.441 402.495 61.699 2500.000 0 jam 24 jam 2.828 0.027* 0.012* 38.495 0.001* 0.000* Lama Penyimpanan 2400.000 0 Jam 2300.000 24 Jam 2200.000 2000.000 1900.000 KKS : Kumis Kucing segar KKM : Pengeringan dengan sinar matahari KKO : Pengeringan dengan oven 1800.000 1700.000 *p 0.027 *p 0.012 1600.000 1500.000 1400.000 1300.000 1200.000 1100.000 1000.000 900.000 *p 0.001 800.000 *p 0.000 mM/g berat kering sampel (TEAC) 2100.000 700.000 600.000 500.000 400.000 300.000 KKS KKM KKO Gambar 7 Perbandingan analisa aktivitas antioksidan masingmasing perlakuan pada daun kumis kucing. 48 Pada Tabel 4 dan Gambar 7 terlihat kadar rataan aktivitas antioksidan pada perlakuan 0 dan 24 jam dalam ekstrak air daun kumis kucing segar yaitu TEAC sebesar 2198.574 + 390.695 dan 2339.822 + 214.678 mM/g berat kering sampel lebih tinggi dari pada kadar rataan aktivitas antioksidan dalam ekstrak air bubuk hasil pengeringan sinar matahari (1354.756 + 1.515 dan 1346 + 2.828 mM/g berat kering sampel) maupun ekstrak air bubuk hasil pengeringan oven (470.441 + 61.699 dan 402.495 + 38.495 mM/g berat kering sampel), dengan uji statistik perbedaan rataan aktivitas antioksidan yang diperlihatkan oleh ekstrak air daun kumis kucing segar dengan rataan aktivitas antioksidan ekstrak air bubuk hasil pengeringan sinar matahari maupun seduhan bubuk hasil pengeringan oven menunjukkan hasil yang bermakna (p < 0.05). Hal ini kemungkinan karena fenol yang terkandung dalam daun segar walaupun lebih sedikit tetapi mempunyai sifat antioksidan yang lebih baik dibandingkan dengan kandungan fenol yang terdapat dalam bubuk hasil kedua metode pengeringan. Penyimpanan ekstrak air daun kumis kucing selama 24 jam mempengaruhi aktivitas antioksidan. Setelah 24 jam, aktivitas rataan antioksidan ekstrak air bubuk kumis kucing hasil pengeringan matahari mengalami penurunan yaitu dari TEAC sebesar 1354.756 + 1.515 mM/g berat kering sampel menjadi TEAC sebesar 1346 + 2.828 mM/g berat kering sampel, sedangkan ekstrak air bubuk kumis kucing hasil pengeringan oven juga mengalami penurunan aktivitas rataan antioksidan yaitu dari TEAC sebesar 470.441+ 61.699 mM/g berat kering sampel menjadi TEAC sebesar 402.495 + 38.495 mM/g berat kering sampel. Penurunan ini disebabkan adanya degradasi klorofil, reaksi oksidasi selama penyimpanan dan kemungkinan juga terjadi perubahan pH seduhan. Hal ini sesuai dengan pendapat Jayaraman dan Das Gupta (1995) yang menyatakan bahwa degradasi klorofil tergantung pada pH, waktu, kerja enzim, oksigen dan cahaya. antioksidan ekstrak air Aktivitas rataan daun segar setelah penyimpanan selama 24 jam mengalami kenaikan dari TEAC sebesar 2198.574 + 390.695 mM/g berat kering sampel menjadi TEAC sebesar 2339.822 + 214.678 mM/g berat kering sampel. Hal ini seseuai dengan penelitian Kwon et al. (2003) yang menunjukkan bahwa ekstrak batang dan akar Hibiscus syriacus yang dipanaskan pada 100oC 49 selama 24 jam lebih efektif mereduksi senyawa radikal bebas DPPH dibandingkan yang tidak diberi perlakuan pemanasan, dengan demikian menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih baik. Analisa Proksimat Bubuk Daun Kumis Kucing Hasil Pengeringan Dengan Sinar Matahari Hasil analisa proksimat bubuk daun kumis kucing hasil pengeringan dengan sinar matahari dapat dilihat pada Tabel 5. Hal ini dilakukan karena kadar air daun kumis kucing segar cukup tinggi yaitu sebesar 81.42%, sehingga agar dapat disimpan dalam jangka waktu yang relatif lama diperlukan pengurangan kadar air sampai 7%. Penentuan ini berdasarkan SNI produksi teh dalam kemasan yang kadar airnya maksimum 8% (SNI 01-3836-2000). Tabel 5. Hasil analisa proksimat bubuk daun kumis kucing hasil pengeringan dengan sinar matahari Analisa Hasil (%) Kadar air 7.00 Kadar abu 7.89 Kadar lemak 5.09 Kadar protein 17.41 Pengujian Ekstrak Daun Kumis Kucing Terhadap Proliferasi Sel Limfosit Dengan Metode MTT Pengujian ekstrak daun kumis kucing terhadap proliferasi sel limfosit memberikan hasil seperti terlihat pada Gambar 8. Pengujian proliferasi sel ini dilakukan dengan metode pewarnaan MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5diphenyl-tetrazolium), dimana MTT dirubah oleh aktivitas enzim suksinat dehidrogenase mitokondrial dalam sel hidup menjadi formazan, yang kemudian diukur absorbansinya dengan Spectrophotometer Microplate Reader. Kandungan suksinat dehidrogenase ini relatif konstan di antara berbagai sel dengan tipe spesifik, sehingga menurut Wilson (1995) jumlah formazan yang terbentuk proporsional terhadap jumlah sel hidup. Pemberian ekstrak daun kumis kucing 50 dengan konsentrasi 1.203 mg/ml meningkatkan proliferasi sel limfosit 1.518 + 0.124. Untuk kumis kucing, semakin tinggi konsentrasi ekstrak (sampai 4.812 mg/ml) yang ditambahkan, semakin meningkat pula proliferasi sel limfosit berturut-turut sebesar 1.819 + 0.031 (2.406 mg/ml) dan 2.389 + 0.148 (4.812 mg/ml). Pemberian mitogen saja menunjukkan IS yang lebih kecil dari pada penambahan ekstrak saja maupun dibandingkan dengan perlakuan kombinasi antara penambahan ekstrak dengan mitogen. Hal ini kemungkinan karena pada waktu dilakukan pengambilan darah responden, keadaan sistem imun dalam tubuh responden sedang menurun. Tabel 6. Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak daun kumis kucing dengan mitogen (Con A, LPS dan PK ) dengan yang ditambah ekstrak daun kumis kucing saja pada konsentrasi C2 (1.203 mg/ml), C4 (2.406 mg/ml), C8 (4.812 mg/ml) Perlakuan C2 C2+ConA C2+LPS C2+PK C4 C4+ConA C4+LPS C4+PK C8 C8+ConA C8+LPS C8+PK Indeks stimulasi 1 2 3 1.540 1.438 1.789 1.340 1.853 1.811 2.242 1.977 2.457 2.702 2.174 2.574 1.385 1.675 1.770 1.328 1.792 1.955 1.872 1.977 2.491 2.523 1.808 2.377 1.630 1.396 1.796 1.585 1.811 1.815 1.596 2.075 2.219 2.253 2.913 2.853 Mean SD 1.518 1.503 1.785 1.418 1.819 1.860 1.903 2.001 2.389 2.493 2.298 2.601 0.124 0.150 0.013 0.145 0.031 0.082 0.324 0.057 0.148 0.226 0.563 0.239 Mean Diff p 0.015 0.267 0.101 1 0.944 1 0.042 0.085 0.191 1 1 0.995 0.104 0.091 0.212 1 1 0.989 Bila dibandingkan dengan penelitian-penelitian sebelumnya, nilai % IS sel limfosit ekstrak air kayu secang (Caesalpina sappan Linn) sebesar sampai 150% (Puspaningrum 2003). Nilai % IS sel limfosit mencit sampel teh daun cincau (Cyclea) sebesar 141% dan bubuk gel cincau (Cyclea) sebesar 122% (Setiawati 2003). Nilai % IS filtrat bebas sel yang dipanaskan selama 20 menit 60oC dan diinkubasikan pada substrat kitosan DD 85% selama 1 jam sebesar 288.06% (Wahyuni et al 2004; Wahyuni et al 2005) dan nilai IS kitinase 0.1 IU/mg kitin yang direaksikan selama 3 jam untuk pembuatan oligomer kitosan dengan konsentrasi 85 ì g/ml sampel sebesar 1.35 (Agustine 2005), makanilai I S tertinggi 51 2.389 (238.9%) untuk penambahan ekstrak daun kumis kucing dengan konsentrasi 4.812 mg/ml menunjukkan bahwa ektrak daun kumis kucing tidak bersifat toksik, bahkan mampu menstimulasi proliferasi sel limfosit. Dengan demikian peningkatan konsentrasi ekstrak daun kumis kucing dapat menstimulasi proliferasi sel limfosit, dengan kata lain mempunyai fungsi sebagai immunomodulator. Mekanisme yang mungkin terjadi adalah karena adanya efek immunomodulator dari antioksidan yang cukup besar yang terkandung dalam ekstrak daun kumis kucing terutama dari senyawa-senyawa fenol yang dikandungnya. Menurut Wu dan Meydani (1998) antioksidan dapat mempengaruhi produksi molekul-molekul seperti IL-2 yang berpengaruh terhadap pertumbuhan sel limfosit dan sangat penting untuk mengaktivasi sel limfosit. Senyawa-senyawa fenol spesifik yang terkandung di dalam ekstrak daun kumis kucing yang dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit belum diketahui. Pada Gambar 8 dapat dilihat Indeks Stimulasi (IS) untuk perlakuan kombinasi antara penambahan ekstrak daun kumis kucing dan mitogen lipopolisakarida (LPS), concanavalin A (con A) dan pokeweed (PK) dibandingkan dengan penambahan ekstrak saja. Ekstrak daun kumis kucing yang ditambah dengan mitogen rata-rata meningkatkan proliferasi sel limfosit baik limfosit B maupun limfosit T walaupun tidak bermakna peningkatannya (p>0.05). Peningkatan IS ini menurut Paraskevas and Foerster (1999) karena mitogen merupakan substansi yang dapat menginduksi proliferasi sel limfosit. Pada perlakuan penambahan ekstrak daun kumis kucing konsentrasi 1.203 mg/ml ditambah con A (1.503 + 0.150) dan pokeweed (1.418 + 0.145) memang terlihat rataan IS lebih kecil dari pada rataan IS untuk penambahan ekstrak daun kumis kucing saja dengan konsentrasi yang sama (1.518 + 0.124), tetapi tampaknya juga tidak nyata perbedaannya (Tabel 6). Hal ini kemungkinan terjadi karena kondisi sistem imun dalam tubuh responden yang sedang kurang baik, sehingga mempengaruhi pula terhadap proliferasi limfositnya, selain itu setiap mitogenpun mempunyai pengaruh yang berbeda terhadap proliferasi sel limfosit. Menurut Paraskevas dan Foerster (1999) aktivasi oleh mitogen memerlukan reseptor yang cocok, yang merupakan tahap awal dari aktivasi limfosit. Untuk 52 3.000 2.800 2.600 2.400 2.000 1.800 1.600 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 Ekstrak + PK PK Ekstrak + LPS LPS Ekstrak + Con A Con A 0.00 Ekstrak Indeks Stimulasi 2.200 Gambar 8 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak daun kumis kucing saja dengan yang ditambah mitogen (con A, LPS dan PK ) saja dan dengan ekstrak daun kumis kucing ditambah mitogen Konsentrasi ekstrak Kumis Kucing 1.203 mg/ml 2.406 mg/ml 4.812 mg/ml konsentrasi ekstrak daun kumis kucing 4.812 mg/ml ditambah LPS nilai rataan IS 2.298 + 0.563 yang lebih kecil dibanding rataan IS penambahan ekstrak daun kumis kucing saja (2.389 + 0.418), tetapi tidak bermakna perbedaannya (p>0.05) (Tabel 6). Hal ini kemungkinan karena pada konsentrasi ini ekstrak daun kumis kucing bila ditambah dengan LPS dapat menyebabkan reaksi yang menurunkan proliferasi sel limfosit seperti penurunan kepekaan reseptor membran sel terhadap mitogen atau tidak meningkatkan aktivitas/reaksi biokimiawi dalam proses 53 proliferasi, misalnya aktivitas enzim protein kinase C yang berperan dalam transduksi sinyal faktor pertumbuhan. Pada masing-masing perlakuan dengan penambahan mitogen baik lipopolisakarida (LPS), concanavalin A (Con A) maupun pokeweed (PK) bila dilakukan penambahan ekstrak kumis kucing, peningkatan konsentrasi dari 1.203 mg/ml ke 2.406 mg/ml sampai 4.812 mg/ml meningkatkan pula rataan IS (Tabel 6 dan Gambar 8). Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak daun kumis kucing dan mitogen bersifat sinergis untuk meningkatkan proliferasi sel limfosit. Jika dilihat dari penambahan mitogen yang berbeda terhadap konsentrasi ekstrak kumis kucing yang sama, pada konsentrasi ekstrak 1.203 mg/ml penambahan LPS memiliki rataan IS tertinggi (1.785 + 0.013) Pada konsentrasi 2.406 mg/ml dan 4.812 mg/ml penambahan Pokeweed memiliki rataan IS tertinggi berturut-turut sebesar 2.001 + 0.05 dan 2.601 + 0.239 walaupun perbandingan nilainya juga tidak bermakna (p>0.05). Hal ini menunjukkan bahwa pada konsentrasi ekstrak daun kumis kucing yang rendah hanya sel B yang distimulasi proliferasinya, sedang pada konsentrasi ekstrak daun kumis kucing yang lebih tinggi dapat menstimulasi proliferasi baik sel T maupun sel B. Bunga Knop Metode Pengeringan Bunga knop setelah dikeringkan dengan dua macam metode pengeringan, maka didapatkan hasil yang terbaik. Hasil terbaik ini dinilai berdasarkan analisa total fenol dan analisa aktivitas antioksidan bubuk hasil pengeringan kedua metode. Bunga knop bila dilihat dari warna bubuk dan warna ekstrak airnya, hasil metode pengeringan oven memberikan warna yang lebih baik dibandingkan hasil metode pengeringan dengan sinar matahari. Bubuk terlihat lebih terang, sedangkan warna ekstrak airnya merah terang. Pada pengeringan dengan sinar matahari terlihat warna bubuk lebih kusam dan warna ekstrak airnya merah kusam. Metode pengeringan terbaik untuk mempertahankan kadar senyawasenyawa yang terkandung di dalam bunga knop adalah pengeringan dengan oven. 54 Sinar matahari Oven Gambar 9 Bubuk bunga knop Sinar matahari (0,8667 g bubuk : 80 ml air) Oven (0,8667 g bubuk : 80 ml air) Gambar 10 Ekstrak air bubuk bunga knop 55 Bunga knop tampaknya tahan terhadap panas oven 50oC karena bentuknya yang mempunyai bonggol di bagian tengah. Menurut Jayaraman dan Das Gupta (1999), salah satu faktor yang mempengaruhi pemilihan metode pengeringan adalah bentuk dari bahan mentah dan sifat-sifatnya. Pada metode pengeringan dengan oven bunga knop lebih cepat mencapai kadar air 7% dibandingkan dengan metode pengeringan dengan sinar matahari. Kecepatan pengeringan juga berpengaruh terhadap degradasi zat-zat yang terkandung dalam suatu bahan hasil pertanian (Jayaraman dan Das Gupta 1995). Pada pengeringan dengan sinar matahari karena bentuknya yang mempunyai bonggol, bunga knop memerlukan waktu yang lebih lama untuk mencapai kadar air 7%. Hal ini menyebabkan semakin lama waktu yang diperlukan pada pengeringan dengan sinar matahari, padahal menurut Jayaraman dan Das Gupta (1995) kemungkinan dapat terjadi pembusukan baik secara kimiawi, enzimatis atau mikrobiologis karena waktu pengeringan yang lama. Selain itu dapat terjadi penurunan mutu selama penyimpanan karena terjadi ketidakseragaman pengeringan (Imre 1995). Total Fenol dan Aktivitas Antioksidan Berdasarkan analisa kadar total fenol dan aktivitas antioksidan dalam ekstrak air bubuk bunga knop, terlihat bahwa kadar total fenol dan aktivitas antioksidan dalam ekstrak air bubuk bunga knop yaitu 3.069 + 0.168 mg fenolik/g berat kering sampel dan TEAC 108.345 + 14.166 mM/g berat kering sampel yang dikeringkan dengan oven lebih tinggi dibandingkan dengan yang dikeringkan dengan sinar matahari 2.239 + 0.055 mg fenolik/g berat kering sampel dan TEAC 56.070 + 7.085 mM/g berat kering sampel (Tabel 7 dan 8, Gambar 11 dan 12). Kandungan senyawa fenolik dalam bunga knop belum banyak diteliti tetapi senyawa yang utama adalah gomphrenin I, II, III, V dan VI, amaranthin, minyak atsiri, saponin dan flavon (Mahendra dan Fauzi 2005; Dalimartha 2000). Menurut Cai et al. (2001), bunga knop banyak mengandung komponen pigmen alami yaitu dari kelompok betasianin sebesar 1.3 mg/g sampel segar. Selain itu menurut Stintzing et al (2004) famili bunga knop (Amaranthus spinosus L.) mengandung senyawa hidroksisinamat, quersetin dan kaempferol glikosida dan senyawa Aurone I (E) -3’ -O –ß –D –glucopyranosyl -4,5,6,4’ -tetrahydroxy -7,2’ - 56 dimethoxyaurone dan dua senyawa lain yaitu aurantiamide acetate dan tiliroside yang diisolasi dari ekstrak Gomphrena agretis (Ferreira et al. 2004). Besarnya kadar total fenol ekstrak air juga dipengaruhi oleh proses pengeringan sebelumnya. Kadar total fenol ekstrak air bubuk hasil pengeringan dengan oven lebih tinggi daripada ekstrak air bubuk hasil pengeringan matahari kemungkinan karena pada pengeringan dengan oven, bunga knop lebih cepat Tabel 7. Perbandingan total fenol pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak bunga knop segar BKS1 BKS2 BKM1 BKM2 BKO1 BKO2 Mean 0 jam 24 jam 0 jam 24 jam 0 jam 24 jam 3.446 3.536 2.277 2.200 2.950 3.187 1.874 2.117 2.035 1.781 2.735 3.088 3.491 1.996 0.064 0.172 2.239 1.908 0.055 3.069 2.911 0.168 3.600 3.400 *p 0.002 3.200 Total Fenol (mg fenolik/g berat kering sample) p SD 3.000 2.800 2.600 2.400 *p 0.010 Perlakuan Total fenol 0 jam 24 jam 0.179 0.002* 0.992 0.250 0.231 0.010* Lama Penyimpanan 2.000 1.800 1.600 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 BKM 24 Jam BKS : Bunga knop segar BKM : Pengeringan dengan sinar matahari BKO : Pengeringan dengan oven 2.200 BKS 0 Jam BKO Gambar 11 Perbandingan total fenol masing-masing perlakuan pada bunga knop. 57 mencapai kadar air 7%, sehingga hanya sedikit zat-zat yang terkandung dalam bunga knop yang terdegradasi. Kadar total fenol bunga knop segar paling tinggi (3.491 + 0.064 mg fenolik/g berat sampel kering) dibandingkan dengan ekstrak air bubuk hasil pengeringan baik dengan oven maupun matahari, hal ini mungkin karena bunga knop segar tidak mengalami pengeringan sehingga senyawasenyawa yang terkandung di dalamnya tidak terdegradasi. Walaupun kadar total fenol ekstrak air bunga knop segar paling tinggi, tetapi tidak dipilih untuk penelitian selanjutnya karena salah satu tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan bubuk hasil pengeringan bunga knop. Tabel 8. Perbandingan aktivitas antioksidan pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak bunga knop segar Perlakuan BKS1 BKS2 BKM1 BKM2 BKO1 BKO2 mM trolox Mean p SD 0 jam 24 jam 0 jam 24 jam 0 jam 24 jam 0 jam 24 jam 19.803 28.664 61.080 51.060 118.363 98.329 39.836 40.990 39.750 46.450 88.036 89.575 24.234 40.413 6.266 0.816 56.070 43.100 7.085 4.738 0.032* 0.999 108.345 88.806 14.166 1.088 0.000* 0.004* Setelah penyimpanan ekstrak air selama 24 jam terjadi penurunan rataan kadar total fenol. Pada seduhan bubuk hasil pengeringan sinar matahari terlihat penurunan rataan kadar total fenol dari 2.239 + 0.055 mg fenolik/g berat kering sampel menjadi 1.908 + 0.179 mg fenolik/g berat kering sampel. Penurunan ini lebih besar dibandingkan dengan penurunan kadar total fenol ekstrak air bubuk hasil pengeringan oven dari 3.069 + 0.168 mg fenolik/g berat kering sampel menjadi 2.911 + 0.250 mg fenolik/g berat kering sampel (Gambar 11). Hal ini kemungkinan terjadi karena pengeringan bunga knop dengan sinar matahari memerlukan waktu yang lama untuk mencapai kadar air 7%, sehingga menurut Jayaraman dan Das Gupta (1995) terjadi pembusukan baik secara kimiawi, enzimatis atau mikrobiologis karena waktu pengeringan yang lama. Selain itu dapat terjadi penurunan mutu selama penyimpanan karena terjadi ketidakseragaman pengeringan (Imre 1995). Ekstrak air bunga knop segar juga 58 mengalami penurunan total fenol setelah penyimpanan yaitu dari 3.491 + 0.064 mg fenolik/g berat kering sampel menjadi 1.996 + 0.172 mg fenolik/g berat kering sampel. Aktivitas antioksidan dalam ekstrak air bunga knop segar rataannya lebih rendah dari pada rataan aktivitas antioksidan dalam ekstrak air bubuk hasil pengeringan sinar matahari maupun ektrak air bubuk hasil pengeringan oven, yaitu TEAC sebesar 24.234 + 6.266 mM/g berat kering sampel (Tabel 8). Hal ini kemungkinan terjadi karena ada senyawa-senyawa fenol tertentu yang mempunyai sifat antioksidan lebih baik yang terbentuk karena adanya proses pemanasan. Penelitian lainnya terhadap aktivitas antioksidan beberapa jenis buah-buahan dan sayuran memberikan hasil sebagai berikut. Buah berry TEAC 3700, sayursayuran TEAC 450-1400 serta buah-buahan TEAC 600-1700 (Miller et al. 2000). Bila dibandingkan dengan nilai TEAC terutama untuk sayuran, maka nilai TEAC ekstrak air bubuk daun kumis kucing cukup tinggi, terutama yang pengeringannya *p 0.000 dilakukan dengan sinar matahari (1354 .756 + 1.515). 120.000 115.000 *p 0.004 110.000 105.000 100.000 90.000 85.000 80.000 *p 0.032 mM/g berat kering sampel (TEAC) 95.000 75.000 70.000 65.000 60.000 Lama Penyimpanan 0 Jam 24 Jam BKS : Bunga knop segar BKM : Pengeringan dengan sinar matahari BKO : Pengeringan dengan oven 55.000 50.000 45.000 40.000 35.000 30.000 25.000 20.000 15.000 10.000 5.000 0.000 BKS BKM BKO Gambar 12 Perbandingan analisa aktivitas antioksidan masing-masing perlakuan pada bunga knop 59 Penyimpanan ekstrak air selama 24 jam mempengaruhi aktivitas antioksidan. Setelah 24 jam, rataan aktivitas antioksidan untuk ekstrak air bubuk bunga knop hasil pengeringan matahari mengalami penurunan yaitu dari TEAC sebesar 56.070 + 7.085 mM/g berat kering sampel menjadi TEAC sebesar 43.100 + 4.738 mM/g berat kering sampel, sedangkan ekstrak air bubuk bunga knop hasil pengeringan oven juga mengalami penurunan rataan aktivitas antioksidan yaitu dari TEAC sebesar 108.345 + 14.166 mM/g berat kering sampel menjadi TEAC sebesar 88.806 + 1.088 mM/g berat kering sampel. Penurunan ini disebabkan adanya reaksi oksidasi selama penyimpanan dan kemungkinan juga terjadi perubahan pH seduhan. Rataan aktivitas antioksidan seduhan daun segar setelah penyimpanan selama 24 jam mengalami kenaikan dari TEAC sebesar 24.234 + 6.266 mM/g berat kering sampel menjadi TEAC sebesar 40.413 + 0.816 mM/g berat kering sampel, tetapi kenaikannya tidak bermakna (p>0.05). Analisa Proksimat Bubuk Bunga Knop Hasil Pengeringan Dengan Oven Hasil analisa proksimat bubuk bunga knop hasil pengeringan dengan oven dapat dilihat pada Tabel 9. Dari hasil analisa bunga knop segar didapatkan kadar air yang cukup tinggi yaitu sebesar 73.13%, sehingga agar dapat disimpan dalam jangka waktu yang relatif lama diperlukan pengurangan kadar air sampai 7%. Penentuan ini berdasarkan SNI produksi teh dalam kemasan yang kadar airnya maksimum 8% (SNI 01-3836-2000). Tabel 9. Hasil analisa proksimat bubuk bunga knop hasil pengeringan dengan oven Analisa Hasil (%) Kadar air 7.00 Kadar abu 7.18 Kadar lemak 0.83 Kadar protein 7.16 60 Pengujian Ekstrak Bunga Knop Terhadap Proliferasi Sel Limfosit dengan Metode MTT Pengujian ekstrak bunga knop terhadap proliferasi sel limfosit memberikan hasil seperti terlihat pada Tabel 10 dan Gambar 13. Pemberian ekstrak bunga knop dengan konsentrasi 0.4115 mg/ml menaikkan rataan IS sel limfosit sebesar 1.011 + 0.082. Untuk bunga knop sampai 0.8230 mg/ml proliferasi sel limfosit masih meningkat 1.071 + 0.122 setelah itu peningkatan konsentrasi ekstrak bunga knop 1.646 mg/ml dan 3.292 mg/ml menghambat proliferasi sel limfosit berturutturut sebesar 0.938 + 0.041 dan 0.789 + 0.142. Tabel 10. Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak bunga knop dengan mitogen (Con A, LPS dan PK ) dengan ekstrak bunga knop saja pada konsentrasi C1 (0.412 mg/ml), C2 (0.823 g/ml), C4 (1.646 mg/ml) dan C8 (3.292 g/ml) Perlakuan C1 C1+ConA C1+LPS C1+PK C2 C2+ConA C2+LPS C2+PK C4 C4+ConA C4+LPS C4+PK C8 C8+ConA C8+LPS C8+PK Indeks stimulasi 1 2 3 1.095 0.781 0.945 0.976 1.201 0.718 0.992 0.842 0.974 0.728 0.900 0.868 0.940 0.562 0.813 0.749 1.008 0.757 0.974 0.976 1.053 0.794 0.995 0.931 0.894 0.654 0.884 0.934 0.670 0.562 0.847 0.778 0.931 0.760 0.815 1.016 0.958 0.691 1.005 0.905 0.945 0.702 0.873 0.887 0.731 0.633 0.760 0.620 Mean SD 1.011 0.766 0.911 0.989 1.071 0.734 0.997 0.893 0.938 0.695 0.886 0.896 0.780 0.586 0.807 0.716 0.082 0.013 0.085 0.023 0.122 0.053 0.007 0.046 0.041 0.038 0.014 0.034 0.142 0.041 0.044 0.084 Mean Diff p 0.245 0.1 0.022 0.006* 0.877 1 0.336 0.073 0.178 0.000* 0.989 0.123 0.243 0.052 0.041 0.007* 1 1 0.195 0.026 0.065 0.063 1 0.997 Bila dibandingkan dengan penelitian-penelitian sebelumnya, nilai % IS sel limfosit ekstrak air kayu secang (Caesalpina sappan Linn) sebesar sampai 150% (Puspaningrum 2003). Nilai % IS sel limfosit mencit sampel teh daun cincau (Cyclea) sebesar 141% dan bubuk gel cincau (Cyclea) sebesar 122% (Setiawati 2003). Nilai % IS filtrat bebas sel yang dipanaskan selama 20 menit 60oC dan diinkubasikan pada substrat kitosan DD 85% selama 1 jam sebesar 288.06% (Wahyuni et al 2004; Wahyuni et al 2005) dan nilai IS kitinase 0.1 IU/mg kitin 61 yang direaksikan selama 3 jam untuk pembuatan oligomer kitosan dengan konsentrasi 85 ì g/ml sampel sebesar 1.35 (Agustine 2005), maka nilai rataan I S tertinggi 1.071 + 0.122 (107.1% + 0.122) untuk penambahan ekstrak bunga knop dengan konsentrasi 0.8230 mg/ml menunjukkan bahwa ektrak bunga knop walaupun nilai rataan IS nya lebih kecil dari pada hasil-hasil penelitian lainnya tetapi mempunyai kemampuan menstimulasi proliferasi sel limfosit. 1.200 1.100 *p 0.006 *p 0.000 *p 0.007 1.000 0.900 0.700 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 Ekstrak + ConA Ekstrak + LPS PK Ekstrak LPS 0.00 Con A Indeks Stimulasi 0.800 Gambar 13 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah Ekstrak bunga knop saja dengan penambahan mitogen (Con A, LPS dan PK ) saja dan dengan ekstrak bunga knop ditambah mitogen Konsentrasi Ekstrak Bunga Knop 0.412 mg/ml 1.646 mg/ml 0.823 mg/ml 3.292 mg/ml Pengujian ekstrak air dari Amaranthus sp. (famili bunga knop) terhadap sel splenosit dari mencit BALB/c menunjukkan kemampuan ekstrak ini untuk menstimulasi proliferasi sel splenosit. Sel B yang diisolasi dapat distimulasi juga oleh ekstrak ini. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak air Amaranthus sp. mempunyai aktivitas immunomodulator dengan secara langsung menstimulasi Ekstrak + PK 62 aktivitas proliferasi sel B dan proliferasi subset sel T secara in vitro (Lin et al 2005). Dengan demikian peningkatan konsentrasi ekstrak bunga knop sampai 0.8230 mg/ml dapat menstimulasi proliferasi sel limfosit, dengan kata lain mempunyai fungsi sebagai immunomodulator. Mekanisme yang mungkin terjadi adalah karena adanya efek immunomodulator dari antioksidan yang terkandung dalam ekstrak bunga knop terutama dari senyawa-senyawa fenol yang dikandungnya. Menurut Wu dan Meydani (1998) antioksidan dapat mempengaruhi produksi molekul-molekul seperti IL-2 yang berpengaruh terhadap pertumbuhan sel limfosit dan sangat penting untuk mengaktivasi sel limfosit. Senyawa-senyawa fenol spesifik yang dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit belum diketahui. Peningkatan konsentrasi ekstrak bunga knop lebih besar dari 0.8230 mg/ml menurunkan proliferasi sel limfosit atau bersifat toksik terhadap sel limfosit. Hal ini kemungkinan terjadi karena pada konsentrasi tersebut senyawa-senyawa fenol dalam bunga knop menunjukkan aktivitas prooksidan. Sifat yang tidak diinginkan ini menurut Kessler et al. (2003) dapat dijadikan penjelasan terhadap toksisitas dari beberapa flavonoid secara in-vivo. Senyawa-senyawa fenol spesifik yang menyebabkan terjadinya toksisitas ekstrak bunga knop terhadap limfosit belum diketahui. Salem et al. (2004) melakukan penelitian terhadap daun bunga knop yang diinokulasi dengan virus Prunus Necrotic Ringspot Virus (PNRSV). Hasil inokulasi ini menunjukkan ketahanan daun bunga knop terhadap virus tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa daun bunga knop mengandung anti virus atau bersifat toksik terhadap virus. Senyawa ini kemungkinan terdapat juga dalam bunganya yang kemungkinan dengan konsentrasi tertentu dapat menghambat proliferasi sel limfosit. Pada Gambar 13 dapat dilihat rataan IS untuk perlakuan kombinasi antara penambahan ekstrak bunga knop dan mitogen lipopolisakarida (LPS), concanavalin A (Con A) dan pokeweed (PK). Ekstrak bunga knop yang ditambah dengan mitogen semua menghambat proliferasi sel limfosit bila dibandingkan dengan perlakuan penambahan ekstrak bunga knop saja, tetapi yang berbeda bermakna menghambat proliferasi hanya penambahan concanavalin A (p<0.05) Hal ini kemungkinan terjadi karena kondisi sistem imun dalam tubuh responden 63 yang sedang kurang baik, sehingga mempengaruhi pula terhadap proliferasi limfositnya, selain itu kemungkinan karena adanya reaksi yang menyebabkan ketidakcocokan mitogen untuk berpasangan dengan reseptor, karena menurut Paraskevas dan Foerster (1999) aktivasi oleh mitogen memerlukan reseptor yang cocok, yang merupakan tahap awal dari aktivasi limfosit. Penambahan LPS saja mempunyai indeks stimulasi yang lebih tinggi dari pada untuk penambahan concanavalin A (Con A), dan pokeweed (PK) saja (Gambar 13). Pada penambahan LPS peningkatan konsentrasi ekstrak bunga knop dari 0.4115 mg/ml ke 0.8230 mg/ml meningkatkan IS. Hal ini menunjukkan bahwa dalam kultur tersebut ekstrak bunga knop yang berperan meningkatkan IS. Setelah itu peningkatan konsentrasi ekstrak bunga knop dengan penambahan LPS, Con A maupun pokeweed dengan konsentrasi yang sama menurunkan IS. Hal ini menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi penambahan bunga knop bersifat menghambat proliferasi sel limfosit dan bersama-sama dengan LPS, Con A dan pokeweed sinergis menghambat proliferasi sel limfosit. Selain itu, Con A sendiri menurut Stites (1991) dapat mengaktifkan sel Ts yang dengan demikian dapat menghambat proliferasi sel limfosit di dalam kultur tertentu. 64 Tabel 11. Perbandingan hasil penelitian ekstrak daun kumis kucing dengan bunga knop Daun Kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) Metode pengeringan Terbaik Bunga knop (Gomphrena globosa L.) sinar matahari Senyawa kimia yang orthosiphon glikosida(1), tanin(2) dikandung minyak atsiri(3) ,minyak lemak(4) , saponin(5), sapofonin(6), garam kalium (0.6-3.5%)(7), myoinositol(8), sinensetin(9). Eupatorin(10), Polymethoxylated flavonoid (11) turunan caffeic acid(12), hydroxy-5,6,7,4’ tetramethoxyflavone.(13), Flavonoid aglikon(14) oven Gomphrenin I,II,III,V,VI(15), amaranthin(16), saponin(17) minyak atsiri(18), flavon(19) Aktivitas biologis mencegah dan mengobati asam urat(20) mencegah batu yang mengandung asam urat(21) pelarut batu ginjal dan batu kandung kemih(22) efek diuretikum(23), anti bakteri(24) anti bakteri(25) anti inflamasi(26), obatbatuk(27), obat sesak(28), penurun panas(29), disentri(30) Kadar total fenol Tertinggi (mg fenolik/g bk) 123.220 3.068 Aktivitas antioksidan tertinggi (mM/gr bk (TEAC)) 2339.822 108.343 Konsentrasi ekstrak yang diuji mg/ml 1.203, 2.406 dan 4.812 Konsentrasi ekstrak (mg/ml) dengan Indeks Stimulasi (IS) tertinggi 4.812 2.4 0.412, 0.823, 1.646 dan 3.292 0.823 1.071 (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (15), (16), (17), (18) dan (19) Mahendra dan Fauzi (2005) (10), (11), (12) Olah et al. (2003) (13), (14) Loon et al. (2005) (25) Ferreira et al. (2004) (26) Stalinska et al. 2005) (27),(28), (29) dan (30) Anonim (2005) 65 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Berdasarkan hasil yang diperoleh dapat disimpulkan : 1. Metode pengeringan terbaik untuk daun kumis kucing adalah pengeringan dengan sinar matahari sedang untuk bunga knop adalah pengeringan dengan oven 2. Peningkatan konsentrasi ekstrak daun kumis kucing yang ditambahkan berturut-turut dari 1.203 mg/ml, 2.406 sampai 4.812 mg/ml meningkatkan IS. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak daun kumis kucing sampai konsentrasi setara 4.812 mg/ml masih aman untuk dikonsumsi karena masih bersifat meningkatkan proliferasi sel limfosit. 3. Peningkatan konsentrasi bunga knop yang ditambahkan berturut turut dari 0.4115 mg/ml sampai 0.8230 mg/ml meningkatkan konsentrasi selanjutnya sebesar 1.646 IS. Peningkatan mg/ml sampai 3.292 mg/ml menghambat proliferasi sel limfosit. Konsentrasi ekstrak bunga knop yang aman untuk dikonsumsi adalah sampai konsentrasi 0.8230 mg/ml, karena masih bersifat meningkatkan proliferasi sel limfosit. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui peningkatan sel NK, CD4 (penanda permukaan untuk Th) dan Tc. Peningkatan ketiganya menunjukkan adanya peningkatan proliferasi sel limfosit yang menunjukkan pula keamanan terhadap sel limfosit, baik sel B maupun sel T dalam sistem imun dengan adanya penambahan ekstrak daun kumis kucing. Mekanisme imunomodulator dengan adanya penambahan ekstrak daun kumis kucing ke dalam kultur sel juga perlu diteliti lebih lanjut. Untuk bunga knop, terjadi penghambatan proliferasi sel limfosit dengan adanya penambahan ekstrak bunga knop ke dalam kultur sel. Hal ini menunjukkan adanya sifat sitotoksik dari ekstrak bunga knop tersebut. Untuk mengetahui mekanisme penghambatan proliferasi sel limfosit atau adanya aktivitas anti inflamasi dengan penambahan ekstrak bunga knop ke dalam kultur sel perlu dilakukan penelitian lebih lanjut. 66 DAFTAR PUSTAKA Anonim. Materi Pelatihan Profesional Tanaman Obat (Kelas Profesional Tanaman Obat 2). 2005. Edisi Baru. Jakarta : Yayasan Pengembangan Tanaman Obat Karyasari Mengabdi Bagi Pengembangan Tanaman Obat Indonesia. Anonim. 2000. GomphrenaglobosaL. http://kambing.ui.edu/bebas/v12/artikel/ttg_tanaman_obat/depkes/buku3/3041.pdf#search=’bunga%20knop’ [8 Februari 2005]. Agustine H. 2005. Pengujian aktivitas immunoenhancing oligomer kitin yang diproduksi secara enzimatik [skripsi]. Bogor : Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Apriyantono A, Fardiaz D, Puspitasari NL, Yasni S, Budiyanto S. 1989. Analisis Pangan. Bogor : PT Penerbit IPB (IPB Press). Baratawidjaja KG. 2000. Imunologi Dasar. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta : Balai Penerbit Beaux D, Fleurentin J, Mortier F. 1999. Effects of extract of Orthosiphon stamineus Benth, Hieracium pilosella L. Sambucus nigra L. and Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng in rats. Phytother Res 13(3):222-5. Cai Y, Sun M, Schliemann W, Corke H. 2001. Chemical stability and colorant properties of betaxanthin pigments from Celosia argentea. J Agric Food Chem 49(9):4429-35. Cai Y, Sun M, Corke H. 2001. Identification and distribution of simple and acylated betacyanins in the Amaranthaceae. J Agric Food Chem 49(4):1971-8. Cai Y, Sun M, Corke H. 2003. Antioxidant activity of betalains from plants of the Amaranthaceae. J Agric Food Chem 51(8):2288-94. . Cai Y, Luo Q, Sun M, Corke H. 2004. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plant associated with anticancer. Life Sci 74(17):2157-84. Casadebaig-Lafon J, Jacob M, Cassanas G, Marion C, Puech A. 1989. Adsorbed plant extract, use of extracts of dried seeds of Orthosiphon stamineus Benth. Pharm Acta Helv 64(8):2204. Dalimartha S. 2000. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia. Jilid ke-2. Jakarta: Trubus Agriwidya. 67 Dean JH, Cornacoff JB, Rosenthal GJ, Luster MI. 1989. Immune system : evaluation of injury. Di dalam : Hayes AW, editor. Principles and Methods of Toxicology. New York : Raven Press Ltd. Hlm 741-760. De Padua LS,Bunyaprahatsara N, Lemmens RHMJ, editor. 1999. Medicinal and poisonous plants 1. plant Resources of South-East Asia 12(1):368-371. Duthil GG, Gardner PT, Kyle JA. 2003. Plant polyphenols : are they the new magic bullet ?. Proc Nutr Soc 62: 599-603. Ferreira EO, Salvador MJ, P ral EM, Alfieri SC, Ito IY, Dias DA. 2004. A new heptasubstituted (E) - aurone glucoside and other aromatic compounds of Gomphrena agrestis with biological activity. Z Naturforsch [C] 59(7-8):499-505. Finley JW, Robinson SF. 1992. Food safety assessment : introduction. Di dalam Finley JW, Robinson SF, Amstrong DJ, editor. Food Safety Assessment. Washington DC : Library of Congress Cataloging –in -Publication Data. Hlm 2-7. Frehsney RI . 1995. Introduction to basic principles. Di dalam : Freshney RI, editor. Animal Cell Culture : A Practical Approach. Ed ke-2. Oxford : Oxford University Press. hlm 1-14. Fukumoto LR, Mazza G. 2000. Assessing antioxidant and prooxidant activities of phenolic compounds. J Agric Food Chem 48(8):3597-604. Garnadi Y. 1998. Perbandingan potensi diuretic antara infusa daun dan batang tumbuhan kumis kucing (Orthosiphon aristatus BI. Mig.) pada kelinci secara oral [skripsi]. Bandung : Fakultas Kedokteran, Universitas Padjadjaran. Halliwell B. 2002. Food –derived antioxidant : how to evaluate their importance In food and in vivo. Di dalam : Cadenas E, editor. Handbook of Antioxidants. New York : Marcel Dekker Inc. hlm 1-33. Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor : Cold Spring Harbor Laboratory. Imre L. 1995. Solar drying. Di dalam : Mujundar AS, editor. Handbook of Industrial Drying. Volume ke-1. Ed ke-2. New York: Marcel Dekker, Inc. hlm 373-451. Isparyanto W. 1999. Pengaruh infusa daun kumis kucing (Orthosiphon Aristatus BI. Mig.) terhadap asam urat darah tikus putih [skripsi]. Yogyakarta : Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada. 68 Jaffe HS, Sherwin SA. 1991. Immunomodulators. Di dalam : Stites DP, Terr AI, editor. Basic and Clinical Immunology. Edisi ke-7. New Jersey : Prentice-Hall International Inc. hlm 780-785. Jayaraman KS, Das Gupta DK. 1999. Drying of fruits and vegetables. Di dalam: Mujundar AS, editor. Handbook of Industrial Drying. Volume ke-1. Ed ke-2. New York: Marcel Dekker, Inc. hlm 643-690. Kang DG, Yun C, Lee HS. 2003. Screening and comparison of antioxidant activity of Solvent extracts of herbal medicines used in Korea. J Ethnopharmacol 87(2) : 231-6. Kapiszewska M, Soltys E, Visioli F, Cierniak A, Zajac G. 2005. The protective ability of the Mediterranean plant extracts against the oxidative DNA damage. The role of the radical oxygen species and the polyphenol content. J Physiol Pharmacol 56 Suppl 1:183-97. Kessler M, Ubeaud G, Jung L. 2003. Anti- and pro- oxidant activity of rutin and quercetin derivatives. J Pharm Pharmacol 55(1):131-42. Koesitoresmi A. 2002. Kapasitas antioksidan ekstrak batang dan daun cincau hijau (Cyclea barbata L. Miers) pada sel limfosit manusia secara in vitro [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Koleva II, van Beek TA, Linssen JP, de Groot A, Evstatieva LN. 2002. Screening of Plant extracts for antioxidant activity : a comparative study on three testing methods. Phytochem Anal 13(1):8-17. Kresno SB. 1991. Imunologi. Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Jakarta : Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Kubo IN, Masuoka P, Haraguchi H. 2002. Antioxidant activity of dodecyl gallate. J Agric Food Chem 50:3533-3539. Lin BF, Chiang BL, Lin JY. 2005. Amaranthus spinosus water extract Directly stimulates proliferation of B lymphocytes in vitro. Int Immunopharmacol 5(4):711-22. Loon YH, Wong JW, Yap SP, Yuen KH. 2005. Determination of flavonoids from Orthosiphon stamineus in plasma using a simple HPLC method with ultraviolet detection. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 816 (1-2):161-6. Mahendra B, Fauzi RH. 2005. Kumis Kucing, Pembudidayaan dan Pemanfaatan Untuk Penghancur Batu Ginjal. Jakarta: Penebar Swadaya. 69 Miller HE, Rigelhorf F, Marquat L, Prakash A, Kanter M. 2000. Antioxidant Content of whole grain breakfast cereal, fruits and vegetables. J Am Coll Nut 90003(19):3128-3198. Nirdnoy M, Muangman V. 1991. Effects of Folia orthosipohonis on urinary stone promoters and inhibitors. J Med Assoc Thai 74(6):318-21. Nurrahman. 1998. Pengaruh konsumsi sari jahe terhadap perlindungan limfosit dari stres oksidatif pada mahasiswa pondok pesantren Ulil Albaab di Bogor [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Olah NK, Radu L, Mogosan C, Hanganu, D, Gocan S. 2003. Phytochemical and pharmacological studies on Orthosiphon stamineus Benth. (Lamiaceae) hydroalcoholic extracts. J Pharm Biomed Anal 33(1):117-23. Pandoyo AS. 2000. Pengaruh aktivitas ekstrak tanaman cincau hijau (Cyclea barbata L. Miers) terhadap proliferasi sel limfosit darah tepi manusia secara in vitro [skripsi]. Bogor : Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Paraskevas F, Foerster J. 1999. The lymphatic system. Di dalam : Lee GR, Foerster J, Lukens J, Paraskevas F, Greer JP, Rodgers GM, editor. Wintrobe’s Clinical Hematology. Ed ke - 10. Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins. hlm 430-465. Pomilio AB, Buschi CA, Tomes CN, Viale AA. 1992. Antimicrobial constituents of Gomphrena martiana and Gomphrena boliviana. J Ethnopharmacol 36(2):155-61. Pranoto BA. 2003. Aktivitas antitumor dan immunomodulator dari produk cincau hijau Cyclea barbata L. Miers dan Premna oblongifolia Merr. terhadap pertumbuhan tumor kelenjar susu mencit C3H [tesis]. Bogor : Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Puspaningrum R. 2003. Pengaruh ekstrak kayu secang (Caesalpinia sappan Linn) terhadap proliferasi sel limfosit limpa tikus dan sel kanker K562 (Chronic Myelogenous Leukimia) secara in vitro [skripsi]. Bogor : Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Roitt IM. 1991. Essential Immunology. Edisi ke - 7. Scientific Publication. Oxford : Blackwell Sari PW. 1985. Efek penyuntikan campuran infus daun Meniran (Phyllanthus niruri Linn) dan daun Kumis Kucing (Orthosiphon aristatus BI. Mig.) terhadap jumlah tetes urine kelinci terbius. Laporan penelitian. Yogyakarta : Lembaga Penelitian Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada. 70 Senchina DS, McCann DA, Asp JM, Johnson JA, Cunnick JE, Kaiser MS, Khut ML. 2005. Changes in immunomodulatory properties of Echinacea spp. root infusions and tintures stored at 4 degrees C for four days. Clin Chiom Acta 355(1-2):67-82. Setiawati R. 2003. Pengaruh produk daun cincau hijau Cyclea barbata L.Miers dan Premna oblongifolia Merr, terhadap kapasitas antioksidan limfosit mencit C3H bertumor kelenjar susu [skripsi]. Bogor : Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Shank FR, Carson KL. 1992. What is safe food?. Di dalam : Finley JW, Robinson SF, Amstrong DJ, editor. Food Safety Assessment. Washington DC : Library of Congress Cataloging –in -Publication Data. hlm 26-34. Shetty K, Curtis OR, Levin RE, Witkowsky R, Ang W. 1995. Prevention of vitrication associated with in vitro shoot culture of oregano (Origanum vulgare) by Pseudomonas spp. J Plant Physiol 147: 447-451. SNI 01- 3836- 2000. Teh kering dalam kemasan. Jakarta : Badan Standardisasi Nasional. Sofiani YS. 2003. Isolasi, pemurnian dan uji aktivitas antibakteri senyawa Sinensetin dari daun kumis kucing (Orthosiphon aristatus BI. Mig.) [skripsi]. Bogor : Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Sokhansaj S, Jayas DS. 1995. Drying of foodstuffs. Di dalam : Mujundar AS, editor. Handbook of Industrial Drying. Volume ke -1. Edisi ke -2. New York : Marcel Dekker, Inc. hlm 589-625. Stalinska K, Guzdek A, Rokicki M, Koj A. 2005. Transcription factors as targets of the anti-inflammatory treatment. A cell culture study with extracts from some Mediterranean diet plants. Physiol Pharmacol 56 Suppl 1:157-69. Stintzing FC, Kammerer D, Schieber A, Adama H, Nacoulma OG, Carle R. 2004. Betacyanins and phenolic compounds from Amaranthus spinosus L. and Boerhavia erecta L. Z Naturforsch [C] 59(1-2):1-8. Stites DP. 1987. Clinical laboratory methods for detection of cellular immunity. Di dalam : Stites DP dan Terr AI, editor. Basic and Clinical Immunology. Edisi ke-7. New Jersey : Prentice-Hall International Inc. hlm 263-283 Strack D,Vogt T, Schliemann W. 2003. Recent advances in betalain research. Phytochemistry 62(3):247-69. 71 Tejasari. 2000. Efek proteksi komponen bioaktif oleoresin rimpang jahe (Zingiber officinale Roscoe) terhadap fungsi limfosit secara in vitro. [disertasi]. Bogor : Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Tejasari, Zakaria FR, Sayuthi D. 2002. Aktivitas stimulasi komponen rimpang Jahe (Zingiber officinale Roscoe) pada sel limfosit B manusia secara in vitro. J Teknologi dan Industri Pangan 13(1):47-53. Tzianabos AO. 2000. Polysaccharides immunomodulators as therapeutic agents : structural aspects and biological function. Clin Microb Rev. 13(4):523-33. Wahyuni S, Zakaria FR, Witarto AB, Syah D, Suhartono MT. 2004. Aktivitas oligomer kitosan sebagai immunoenhancer. Seminar Nasional PATPI. Jakarta, Desember 2004. Wahyuni S, Zakaria FR, Witarto AB, Syah D, Suhartono MT. 2005. Aplikasi oligomer kitosan sebagai anti kanker. Seminar Nasional PERSADA (Persatuan Alumni Jepang). Agustus 2005. Waterman PG, Mole S. 1994. Analysis of phenolic plant metabolites. Oxford : Blackwell Scientific Publications. Wilson AP. 1995. Cytotoxicity and viability assays. Di dalam : Freshney RI, editor. Animal Cell Culture : A Practical Approach. Ed ke-2. Oxford : Oxford University Press. hlm 263-304. Zakaria FR, Meilasanti MA, Sanjaya, Pramudya SM, Richards AL. 1997. Aktivitas proliferasi limfosit darah tepi konsumen makanan jajanan di Bogor, Jawa Barat. Bul. Teknologi dan Industri Pangan. 8(2):57-65. Zakaria FR, Prangdimurti E. 2001. Kajian aktivitas biologis dari pengkayaan gel cincau hijau (Cyclea barbata L. Miers). Laporan Penelitian. Bogor: Proyek QUE FTSP. 72 Lampiran 1 Dosis dasar jumlah penggunaan daun segar dan bubuk daun kumis kucing untuk membuat ekstrak air * Untuk ekstrak air daun segar : Dosis yang digunakan berdasarkan Anonim (2005) yaitu dosis daun segar yang digunakan untuk mengobati infeksi kandung kemih dan batu dalam kandung kemih. 5-10 helai daun kumis kucing segar diekstraksi dengan ½ gelas air mendidih (110ml) Dikonversikan untuk dosis pencegahan 5 helai daun dalam 220 ml air (berat 5 helai daun = 1.1835 gr) Jadi perbandingan yang didapatkan untuk pembuatanekstrak air adalah : 1.1835 gr daun segar : 220 ml air * Untuk ekstrak air bubuk : Dosis yang digunakan berdasarkan Anonim (2005) yaitu dosis bubuk daun kumis kucing untuk pencegahan infeksi kandung kemih, kencing batu, dan infeksi saluran kemih, yaitu : 1-3 sendok takar (3-10 gr) per hari diekstraksi dengan 3.5 gelas air mendidih (770 ml) Diambil takaran 3 gr dalam 770 ml air, karena terlalu pekat maka diencerkan dengan mengurangi takaran menjadi 1 gr dalam 257 ml air. Jadi perbandingan yang didapatkan untuk pembuatan ekstrak air adalah 1 gr bubuk : 275 ml air 73 Lampiran 2 Dosis dasar jumlah penggunaan bunga segar dan bubuk bunga knop untuk membuat ekstrak air * Untuk ekstrak air bunga segar : Dosis yang digunakan berdasarkan Anonim (2005) yaitu dosis bunga segar yang digunakan untuk menambah nafsu makan, yaitu : 20 gr bunga segar (33 kuntum) diekstraksi dengan 3 gelas air mendidih direbus Sampai tersisa 2 gelas (440 ml). Karena terlalu pekat, maka diambil dosis untuk pengobatan asthma broncial sebanyak 10 kuntum Dikonversikan untuk dosis pencegahan 5 kuntum bunga dalam 80 ml air (berat 5 helai daun = 3.6720 gr) Jadi perbandingan yang didapatkan untuk pembuatan ekstrak air adalah : 3.6720 gr bunga segar : 80 ml air * Untuksekstrak air bubuk : Dosis yang digunakan berdasarkan Anoni m (2005) yaitu dosis bunga segar yang digunakan untuk menambah nafsu makan (sama dengan untuk ektrak air bunga segar). Berdasarkan ektrak air b unga segar (kadar air bunga segar 73.13%), maka didapatkan bubuk (kadar air 7%) sebesar : N x 93 = 3 gr x 26.87 N = 0.8667 gr bubuk Jadi perbandingan yang didapatkan untuk pembuatan ektrak air adalah : 0.8667 gr bubuk : 80 ml air 74 Lampiran 3 Contoh Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Daun Kumis Kucing Contoh : Konsentrasi ekstrak bubuk daun kumis kucing yang dikonsumsi seharihari - Asumsi konsumsi seduhan bubuk daun kumis kucing per hari = 770 ml - Dari 0.6226 gr bubuk daun kumis kucing yang diekstraksi dengan 80 ml air mendidih didapatkan 0.15 gr hasil freeze dry. - Untuk konsumsi sehari-hari bubuk yang digunakan untuk pembuatan ekstrak air adalah : 0.6225 gr x 770 ml 80 ml - Rendemen = 24% (berat basah) = 5.9925 gr - Sehingga jumlah ekstrak daun kumis kucing yang setara dengan 5.9925 gr bubuk adalah : 5.9925 gr x 24% = 1.4436 gr - Volume darah manusia dalam tubuh = 6 liter = 6000 ml - Konsentrasri teoritis ekstrak di dalam darah bila semua ektrak bubuk diserap adalah 1.4436 gr = 2.406x 10-4 gr/ml = 0.2406 mg/ml 6000 ml darah - Bila volume ekstrak dalam kultur (0.1 ml) adalah 20 µl maka konsentrasi ekstrak yang harus dipersiapkan adalah : V1 x M 1 = V2 x M2 0.1 ml x 0.2406 mg/ml = 0.02 ml x M2 M2 = 1.203 mg/ml (2 x dosis awal) di C1 (dosis awal) adalah = 0.6015 mg/ml - C1 adalah konsentrasi ekstrak untuk dosis referensi yang dikonsumsi seharihari Penentuan dosis ekstrak daun kumis kucing pada taraf yang lainnya adalah dengan menmgalikan C1 dengan kelipatan yang diinginkan. Pada penelitian ini digunakan C2, C4 dan C8. C2 = 1.203 mg/ml C4 = 2.406 mg/ml C8 = 4.812 mg/ml 75 Lampiran 4 Contoh Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Bunga Knop Contoh : Konsentrasi ekstrak bubuk bunga knop yang dikonsumsi sehari-hari - Asumsi konsumsi seduhan bubuk bunga knop per hari = 440 ml - Dari 2.3834 gr bubuk bunga knop yang diektraksi dengan 110 ml air mendidih didapatkan 0.247 gr hasil freeze dry. - Untuk konsumsi sehari-hari bubuk yang digunakan untuk pembuatan ekstrak air adalah 2.3834 gr x 440 ml 110 ml - Rendemen = 10.36% (berat basah) = 9.5336 gr - Sehingga jumlah ekstrak bunga knop yang setara dengan 5.9925 gr bubuk adalah : 9.5336 gr x 24% = 0.9876 gr - Volume darah manusia dalam tubuh = 6 liter = 6000 ml - Konsentrasri teoritis ekstrak di dalam darah bila semua ekstrak bubuk diserap adalah 0.9876 gr = 1.646 x 10-4 gr/ml = 0.1646 mg/ml 6000 ml darah - Bila volume ekstrak dalam kultur (0.1 ml) adalah 20 µl maka konsentrasi ekstrak yang harus dipersiapkan adalah : V1 x M1 = V2 x M2 0.1 ml x 0.1646 mg/ml = 0.02 ml x M2 M2 = 0.8230 mg/ml (2 x dosis awal) di C1 (dosis awal) adalah = 0.4115 mg/ml - C1 adalah konsentrasi ekstrak untuk dosis referensi yang dikonsumsi seharihari Penentuan dosis ekstrak bunga knop pada taraf yang lainnya adalah dengan menmgalikan C1 dengan kelipatan yang diinginkan. Pada penelitian ini digunakan C1, C2, C4 dan C8. C1 = 0.4115 mg/ml C2 = 0.823 mg/ml C4 = 1.646 mg/ml C8 = 3.292 mg/ml 76 Lampiran 5 Penentuan konsentrasi larutan mitogen (LPS, Con A dan Pokeweed) 1. Bila mitogen yang ditanam ke dalam kultur sebanyak 10 µl Dalam sumur dengan volume 100µl (V1) untuk mendapatkan konsentrasi mitogen (M1) sebesar 10 µg/ml, maka konsentrasi mitogen sebanyak 10 µl (V2) yang ditanam ke dalam kultur adalah : V1 x M1 = V2 x M2 100 µl x 10 µg/ml = 10 µl x M2 M2 = 100 µg/ml 2. Bila mitogen yang ditanam ke dalam kultur sebanyak 20 µl Dalam sumur dengan volume 100µl (V1) untuk mendapatkan konsentrasi mitogen (M1) sebesar 10 µg/ml, maka konsentrasi mitogen sebanyak 20 µl (V2) yang ditanam ke dalam kultur adalah : V1 x M1 = V2 x M2 100 µl x 10 µg/ml = 20 µl x M2 M2 = 50 µg/ml 77 Lampiran 6 Master tabel data penelitian Tabel 12. Hasil analisa total fenol dan aktivitas antioksidan PERLAKUAN KKS KKM KKO BKS BKM BKO TOTAL FENOL mg fenolik/g berat kering sampel 0 JAM 24 JAM 47.202 41.319 123.220 87.620 16.918 14.319 3.491 1.995 2.238 1.907 3.068 2.911 ANALISA ANTIOKSIDAN mM/g berat kering sampel 0 JAM 24 JAM 2198.533 2339.822 1354.763 1346.528 470.448 406.350 24.231 40.413 56.072 43.204 108.343 88.825 Tabel 13. Hasil analisa MTT ekstrak bunga knop OD PERLAKUAN C1 C1+LPS C1+Con A C1+PK C2 C2+LPS C2+Con A C2+PK C4 C4+LPS C4+Con A C4+PK C8 C8+LPS C8+Con A C8+PK KONTROL LPS Con A PK I 0.415 0.358 0.296 0.370 0.455 0.376 0.272 0.319 0.369 0.341 0.276 0.329 0.356 0.308 0.213 0.284 0.400 0.372 0.272 0.363 II 0.382 0.369 0.287 0.370 0.399 0.377 0.301 0.353 0.339 0.335 0.248 0.354 0.254 0.321 0.213 0.295 0.362 0.356 0.270 0.361 III 0.353 0.309 0.288 0.385 0.363 0.381 0.262 0.343 0.358 0.331 0.266 0.336 0.277 0.288 0.240 0.235 0.375 0.373 0.269 0.376 x 0.383 0.345 0.290 0.375 0.406 0.378 0.278 0.338 0.355 0.336 0.263 0.340 0.296 0.306 0.222 0.271 0.379 0.367 0.270 0.367 IS 1.011 0.910 0.765 0.989 1.071 0.997 0.734 0.892 0.937 0.887 0.694 0.897 0.781 0.807 0.586 0.715 0.968 0.712 0.968 78 Tabel 14. Hasil analisa MTT ekstrak daun kumis kucing OD PERLAKUAN C2 C2+LPS C2+Con A C2+PK C4 C4+LPS C4+Con A C4+PK C8 C8+LPS C8+Con A C8+PK KONTROL LPS Con A PK I 0.408 0.474 0.381 0.355 0.491 0.594 0.480 0.524 0.651 0.576 0.716 0.682 0.266 0.245 0.267 0.284 II 0.367 0.469 0.444 0.352 0.475 0.496 0.518 0.524 0.669 0.479 0.669 0.630 0.265 0.267 0.273 0.265 III 0.432 0.476 0.370 0.420 0.480 0.423 0.481 0.550 0.588 0.772 0.597 0.756 0.266 0.282 0.269 0.280 x 0.402 0.473 0.398 0.376 0.482 0.504 0.493 0.533 0.636 0.609 0.661 0.689 0.265 0.265 0.270 0.276 IS 1.517 1.785 1.502 1.419 1.819 1.902 1.860 2.011 2.400 2.298 2.494 2.600 1.000 1.019 1.042 79 Lampiran 7 Tabel absorbansi dan kurva standar trolox Tabel 15. Absorbansi untuk Trolox (mM) No Trolox (mM) Absorbansi 1 2 0.0 1.25 0.0000 0.0315 3 4 2.5 5.0 0.2025 0.4575 0.5000 Y= 0.097 X – 0.038 R2 = 0.968 absorbansi 0.4000 0.3000 0.2000 0.1000 0.0000 0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 trolox Gambar 14 Kurva standar Trolox 5.0000 80 Lampiran 8 Tabel absorbansi dan kurva standar asam tanat Tabel 16. Absorbansi untuk Asam Tanat No Asam Tanat (ug/ml) Absorbansi 1 2 5 10 0.0580 0.0745 3 4 25 50 0.1775 0.4185 5 6 100 150 0.9430 1.4445 7 200 1.7785 2.0000 Y= 0.009 X – 0.015 R2 = 0.996 absorbansi 1.5000 1.0000 0.5000 0.0000 0.0000 50.0000 100.0000 150.0000 200.0000 AsamTanat Gambar 15 Kurva standar Asam Tanat 81 Lampiran 9 Daftar singkatan DPPH = 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl TEAC = Trolox Equivalent Antioxidant Capacity GAE = Gallic Acid Equivalent HEPES = N-2-hidroksimetil-piperazin-N-2-etan-sulphonic acid FBS = Fetal Bovine Serum MTT = (3-[4,5-dimethythiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) Con A = Concanavalin A LPS = Lipopolisakarida PK = Pokeweed 82 Lampiran 10 Hasil uji statistik (ANOVA) kadar total fenol ekstrak air daun kumis kucing. Descriptives N Mean Std. Deviation 95% Confidence Interval for Mean Std. Error Minimum Maximum 1 2 48.56640 11.481151 8.118400 Lower Bound -54.58765 2 2 123.43380 12.158560 8.597400 14.19348 3 2 16.91840 .173665 .122800 15.35808 18.47872 16.796 17.041 12 2 42.51355 12.900951 9.122350 -73.39690 158.42400 33.391 51.636 22 32 2 2 87.62410 14.08585 6.784972 .249679 4.797700 .176550 26.66354 11.84257 148.58466 16.32913 82.826 13.909 92.422 14.262 12 55.52368 41.150401 11.879097 29.37797 81.66940 13.909 132.031 Total Upper Bound 151.72045 40.448 56.685 232.67412 114.836 132.031 Multiple Comparisons Tukey HSD (I) perlakuan (J) perlakuan 1 2 3 2 3 12 22 32 Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval -74.867400(*) 31.648000 9.057320 9.057320 .001 .085 Lower Bound -110.91415 -4.39875 Upper Bound -38.82065 67.69475 12 6.052850 9.057320 .979 -29.99390 42.09960 22 -39.057700(*) 9.057320 .035 -75.10445 -3.01095 32 34.480550 9.057320 .060 -1.56620 70.52730 1 74.867400(*) 9.057320 .001 38.82065 110.91415 3 12 22 106.515400(*) 80.920250(*) 35.809700 9.057320 9.057320 9.057320 .000 .001 .051 70.46865 44.87350 -.23705 142.56215 116.96700 71.85645 32 109.347950(*) 9.057320 .000 73.30120 145.39470 1 -31.648000 9.057320 .085 -67.69475 4.39875 2 -106.515400(*) 9.057320 .000 -142.56215 -70.46865 12 -25.595150 9.057320 .178 -61.64190 10.45160 22 32 1 -70.705700(*) 2.832550 -6.052850 9.057320 9.057320 9.057320 .002 .999 .979 -106.75245 -33.21420 -42.09960 -34.65895 38.87930 29.99390 2 3 -80.920250(*) 25.595150 9.057320 9.057320 .001 .178 -116.96700 -10.45160 -44.87350 61.64190 22 -45.110550(*) 9.057320 .018 -81.15730 -9.06380 32 28.427700 9.057320 .125 -7.61905 64.47445 1 2 3 39.057700(*) -35.809700 70.705700(*) 9.057320 9.057320 9.057320 .035 .051 .002 3.01095 -71.85645 34.65895 75.10445 .23705 106.75245 12 45.110550(*) 9.057320 .018 9.06380 81.15730 32 73.538250(*) 9.057320 .001 37.49150 109.58500 1 -34.480550 9.057320 .060 -70.52730 1.56620 2 -109.347950(*) 9.057320 .000 -145.39470 -73.30120 3 12 22 -2.832550 -28.427700 -73.538250(*) 9.057320 9.057320 9.057320 .999 .125 .001 -38.87930 -64.47445 -109.58500 33.21420 7.61905 -37.49150 83 * The mean difference is significant at the .05 level. Keterangan : 1 2 3 12 22 32 Kumis kucing segar 0 jam Kumis kucing matahari 0 jam Kumis kucing oven 0 jam Kumis kucing segar 24 jam Kumis kucing matahari 24 jam Kumis kucing oven 24 jam 84 Lampiran 11 Hasil uji statistik (ANOVA) aktivitas antioksidan ekstrak air daun kumis kucing. Descriptives N Std. Deviation Mean Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Minimum Maximum Upper Bound 1 2 2198.57400 390.694881 276.263000 -1311.68024 5708.82824 1922.311 2474.837 2 2 1354.75600 1.514623 1.071000 1341.14765 1368.36435 1353.685 1355.827 3 2 470.44100 61.699309 43.628000 -83.90530 1024.78730 426.813 514.069 12 2 2339.82200 214.677619 151.800000 411.02012 4268.62388 2188.022 2491.622 22 2 1346.00000 2.828427 2.000000 1320.58759 1371.41241 1344.000 1348.000 32 2 402.49500 38.494893 27.220000 56.63211 748.35789 375.275 429.715 12 1352.01467 794.668989 229.401177 847.10608 1856.92325 375.275 2491.622 Total Multiple Comparisons Tukey HSD (I) perlakuan (J) perlakuan 1 2 3 12 2 12 22 32 Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound 109.92029 994.23529 -875.14571 Upper Bound 1577.71571 2462.03071 592.64971 .026 118.67629 1586.47171 .001 1062.18129 2529.97671 184.403510 .027 -1577.71571 -109.92029 184.403510 184.403510 184.403510 .022 .013 1.000 150.41729 -1718.96371 -725.14171 1618.21271 -251.16829 742.65371 843.818000(*) 1728.133000(*) -141.248000 184.403510 184.403510 184.403510 .027 .001 .964 22 852.574000(*) 184.403510 32 1796.079000(*) 184.403510 1 -843.818000(*) 3 12 22 884.315000(*) -985.066000(*) 8.756000 32 3 Mean Difference (I-J) 952.261000(*) 184.403510 .015 218.36329 1686.15871 1 -1728.133000(*) 184.403510 .001 -2462.03071 -994.23529 2 12 -884.315000(*) -1869.381000(*) 184.403510 184.403510 .022 .000 -1618.21271 -2603.27871 -150.41729 -1135.48329 22 32 1 -875.559000(*) 67.946000 141.248000 184.403510 184.403510 184.403510 .023 .999 .964 -1609.45671 -665.95171 -592.64971 -141.66129 801.84371 875.14571 2 985.066000(*) 184.403510 .013 251.16829 1718.96371 3 22 1869.381000(*) 993.822000(*) 184.403510 184.403510 .000 .012 1135.48329 259.92429 2603.27871 1727.71971 32 1937.327000(*) 184.403510 .000 1203.42929 2671.22471 1 2 3 -852.574000(*) -8.756000 875.559000(*) 184.403510 184.403510 184.403510 .026 1.000 .023 -1586.47171 -742.65371 141.66129 -118.67629 725.14171 1609.45671 12 -993.822000(*) 184.403510 .012 -1727.71971 -259.92429 32 943.505000(*) 184.403510 .016 209.60729 1677.40271 1 -1796.079000(*) 184.403510 .001 -2529.97671 -1062.18129 2 -952.261000(*) 184.403510 .015 -1686.15871 -218.36329 3 12 22 -67.946000 -1937.327000(*) -943.505000(*) 184.403510 184.403510 184.403510 .999 .000 .016 -801.84371 -2671.22471 -1677.40271 665.95171 -1203.42929 -209.60729 85 * The mean difference is significant at the .05 level. Keterangan : 4 5 6 13 22 32 Kumis kucing segar 0 jam Kumis kucing matahari 0 jam Kumis kucing oven 0 jam Kumis kucing segar 24 jam Kumis kucing matahari 24 jam Kumis kucing oven 24 jam 86 Lampiran 12 Hasil uji statistik (ANOVA) indeks stimulasi ekstrak daun kumis kucing. Descriptives N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Upper Bound 1.21048 1.82619 Minimum Maximum C2 3 1.51833 .123929 .071550 1.385 1.630 C4 3 1.81867 .031214 .018022 1.74113 1.89621 1.792 1.853 C8 3 2.38900 .148203 .085565 2.02084 2.75716 2.219 2.491 C2+ConA 3 1.50300 .150429 .086850 1.12931 1.87669 1.396 1.675 C4+ConA 3 1.86033 .082008 .047347 1.65661 2.06405 1.811 1.955 C8+ConA 3 2.49267 .226032 .130499 1.93117 3.05416 2.253 2.702 C2+LPS 3 1.78500 .013454 .007767 1.75158 1.81842 1.770 1.796 C4+LPS C8+LPS 3 3 1.90333 2.29833 .324138 .562895 .187141 .324987 1.09813 .90003 2.70854 3.69664 1.596 1.808 2.242 2.913 C2+PK 3 1.41767 .145039 .083738 1.05737 1.77796 1.328 1.585 C4+PK 3 2.00967 .056580 .032667 1.86911 2.15022 1.977 2.075 3 2.60133 .239174 .138087 2.00719 3.19548 2.377 2.853 36 1.96644 .431492 .071915 1.82045 2.11244 1.328 2.913 C8+PK Total Multiple Comparisons Tukey HSD (I) perlakuan (J) perlakuan 11 12 13 21 12 Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound -.300333 -.870667(*) .015333 .185933 .185933 .185933 .887 .004 1.000 -.97074 -1.54107 -.65507 .37007 -.20026 .68574 22 -.342000 .185933 .782 -1.01241 .32841 23 -.974333(*) .185933 .001 -1.64474 -.30393 31 32 -.266667 -.385000 .185933 .185933 .944 .646 -.93707 -1.05541 .40374 .28541 33 -.780000(*) .185933 .013 -1.45041 -.10959 41 .100667 .185933 1.000 -.56974 .77107 42 -.491333 .185933 .311 -1.16174 .17907 43 -1.083000(*) .185933 .000 -1.75341 -.41259 11 .300333 .185933 .887 -.37007 .97074 13 21 22 -.570333 .315667 -.041667 .185933 .185933 .185933 .149 .853 1.000 -1.24074 -.35474 -.71207 .10007 .98607 .62874 23 -.674000(*) .185933 .048 -1.34441 -.00359 31 .033667 .185933 1.000 -.63674 .70407 32 -.084667 .185933 1.000 -.75507 .58574 33 -.479667 .185933 .342 -1.15007 .19074 41 42 .401000 -.191000 .185933 .185933 .592 .995 -.26941 -.86141 1.07141 .47941 43 -.782667(*) .185933 .013 -1.45307 -.11226 87 13 21 22 23 31 11 .870667(*) .185933 .004 .20026 1.54107 12 .570333 .185933 .149 -.10007 1.24074 21 .886000(*) .185933 .003 .21559 1.55641 22 23 31 .528667 -.103667 .604000 .185933 .185933 .185933 .223 1.000 .105 -.14174 -.77407 -.06641 1.19907 .56674 1.27441 32 .485667 .185933 .326 -.18474 1.15607 33 41 .090667 .971333(*) .185933 .185933 1.000 .001 -.57974 .30093 .76107 1.64174 42 .379333 .185933 .665 -.29107 1.04974 43 -.212333 .185933 .989 -.88274 .45807 11 -.015333 .185933 1.000 -.68574 .65507 12 -.315667 .185933 .853 -.98607 .35474 13 -.886000(*) .185933 .003 -1.55641 -.21559 22 -.357333 .185933 .736 -1.02774 .31307 23 31 32 33 -.989667(*) -.282000 -.400333 -.795333(*) .185933 .185933 .185933 .185933 .001 .921 .594 .011 -1.66007 -.95241 -1.07074 -1.46574 -.31926 .38841 .27007 -.12493 41 .085333 .185933 1.000 -.58507 .75574 42 -.506667 .185933 .273 -1.17707 .16374 43 11 -1.098333(*) .342000 .185933 .185933 .000 .782 -1.76874 -.32841 -.42793 1.01241 12 .041667 .185933 1.000 -.62874 .71207 13 -.528667 .185933 .223 -1.19907 .14174 21 .357333 .185933 .736 -.31307 1.02774 23 -.632333 .185933 .077 -1.30274 .03807 31 .075333 .185933 1.000 -.59507 .74574 32 -.043000 .185933 1.000 -.71341 .62741 33 41 42 43 -.438000 .442667 -.149333 -.741000(*) .185933 .185933 .185933 .185933 .468 .453 .999 .022 -1.10841 -.22774 -.81974 -1.41141 .23241 1.11307 .52107 -.07059 11 .974333(*) .185933 .001 .30393 1.64474 12 .674000(*) .185933 .048 .00359 1.34441 13 .103667 .185933 1.000 -.56674 .77407 21 .989667(*) .185933 .001 .31926 1.66007 22 .632333 .185933 .077 -.03807 1.30274 31 .707667(*) .185933 .032 .03726 1.37807 32 33 .589333 .194333 .185933 .185933 .123 .995 -.08107 -.47607 1.25974 .86474 41 1.075000(*) .185933 .000 .40459 1.74541 42 43 11 .483000 -.108667 .266667 .185933 .185933 .185933 .333 1.000 .944 -.18741 -.77907 -.40374 1.15341 .56174 .93707 12 13 -.033667 -.604000 .185933 .185933 1.000 .105 -.70407 -1.27441 .63674 .06641 21 .282000 .185933 .921 -.38841 .95241 22 -.075333 .185933 1.000 -.74574 .59507 23 -.707667(*) .185933 .032 -1.37807 -.03726 88 32 33 41 42 43 32 -.118333 .185933 1.000 -.78874 33 -.513333 .185933 .257 -1.18374 .55207 .15707 41 .367333 .185933 .704 -.30307 1.03774 42 -.224667 .185933 .983 -.89507 .44574 43 -.816333(*) .185933 .008 -1.48674 -.14593 11 12 13 21 .385000 .084667 -.485667 .400333 .185933 .185933 .185933 .185933 .646 1.000 .326 .594 -.28541 -.58574 -1.15607 -.27007 1.05541 .75507 .18474 1.07074 22 .043000 .185933 1.000 -.62741 .71341 23 -.589333 .185933 .123 -1.25974 .08107 31 .118333 .185933 1.000 -.55207 .78874 33 -.395000 .185933 .612 -1.06541 .27541 41 .485667 .185933 .326 -.18474 1.15607 42 -.106333 .185933 1.000 -.77674 .56407 43 11 -.698000(*) .780000(*) .185933 .185933 .036 .013 -1.36841 .10959 -.02759 1.45041 12 .479667 .185933 .342 -.19074 1.15007 13 21 22 -.090667 .795333(*) .438000 .185933 .185933 .185933 1.000 .011 .468 -.76107 .12493 -.23241 .57974 1.46574 1.10841 23 31 -.194333 .513333 .185933 .185933 .995 .257 -.86474 -.15707 .47607 1.18374 32 .395000 .185933 .612 -.27541 1.06541 41 .880667(*) .185933 .004 .21026 1.55107 42 .288667 .185933 .910 -.38174 .95907 43 -.303000 .185933 .881 -.97341 .36741 11 -.100667 .185933 1.000 -.77107 .56974 12 -.401000 .185933 .592 -1.07141 .26941 13 21 -.971333(*) -.085333 .185933 .185933 .001 1.000 -1.64174 -.75574 -.30093 .58507 22 23 31 -.442667 -1.075000(*) -.367333 .185933 .185933 .185933 .453 .000 .704 -1.11307 -1.74541 -1.03774 .22774 -.40459 .30307 32 -.485667 .185933 .326 -1.15607 .18474 33 -.880667(*) .185933 .004 -1.55107 -.21026 42 -.592000 .185933 .119 -1.26241 .07841 43 -1.183667(*) .185933 .000 -1.85407 -.51326 11 .491333 .185933 .311 -.17907 1.16174 12 13 .191000 -.379333 .185933 .185933 .995 .665 -.47941 -1.04974 .86141 .29107 21 .506667 .185933 .273 -.16374 1.17707 22 .149333 .185933 .999 -.52107 .81974 23 -.483000 .185933 .333 -1.15341 .18741 31 32 33 .224667 .106333 -.288667 .185933 .185933 .185933 .983 1.000 .910 -.44574 -.56407 -.95907 .89507 .77674 .38174 41 .592000 .185933 .119 -.07841 1.26241 43 -.591667 .185933 .120 -1.26207 .07874 11 1.083000(*) .185933 .000 .41259 1.75341 89 12 .782667(*) .185933 .013 .11226 13 .212333 .185933 .989 -.45807 .88274 21 1.098333(*) .185933 .000 .42793 1.76874 22 .741000(*) .185933 .022 .07059 1.41141 23 .108667 .185933 1.000 -.56174 .77907 31 32 .816333(*) .698000(*) .185933 .185933 .008 .036 .14593 .02759 1.48674 1.36841 33 41 42 .303000 1.183667(*) .591667 .185933 .185933 .185933 .881 .000 .120 -.36741 .51326 -.07874 .97341 1.85407 1.26207 Keterangan : 11 12 13 21 22 23 31 32 33 41 42 43 C2 C4 C8 C2+ConA C4+ConA C8+ConA C2+LPS C4+LPS C8+LPS C2+PK C4+PK C8+PK 1.45307 90 Lampiran 13 Hasil uji statistik (ANOVA) kadar total fenol ekstrak air bunga knop Descriptives N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Minimum Maximum Upper Bound 1 2 3.49095 .063710 .045050 2.91854 4.06336 3.446 3.536 2 2 2.23870 .054589 .038600 1.74824 2.72916 2.200 2.277 3 12 2 2 3.06855 1.99550 .167655 .171968 .118550 .121600 1.56223 .45043 4.57487 3.54057 2.950 1.874 3.187 2.117 22 2 1.90785 .179393 .126850 .29607 3.51963 1.781 2.035 32 2 2.91135 .249538 .176450 .66934 5.15336 2.735 3.088 12 2.60215 .627384 .181110 2.20353 3.00077 1.781 3.536 Total Multiple Comparisons (I) perlakuan (J) perlakuan Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Tukey HSD 1 2 3 12 22 32 Upper Bound 2 3 1.252250(*) .422400 .162876 .162876 .002 .231 .60403 -.22582 1.90047 1.07062 12 1.495450(*) .162876 .001 .84723 2.14367 22 32 1.583100(*) .579600 .162876 .162876 .001 .079 .93488 -.06862 2.23132 1.22782 1 -1.252250(*) .162876 .002 -1.90047 -.60403 3 12 22 -.829850(*) .243200 .330850 .162876 .162876 .162876 .016 .681 .421 -1.47807 -.40502 -.31737 -.18163 .89142 .97907 32 1 -.672650(*) -.422400 .162876 .162876 .043 .231 -1.32087 -1.07062 -.02443 .22582 2 .829850(*) .162876 .016 .18163 1.47807 12 1.073050(*) .162876 .005 .42483 1.72127 22 32 1 1.160700(*) .157200 -1.495450(*) .162876 .162876 .162876 .003 .914 .001 .51248 -.49102 -2.14367 1.80892 .80542 -.84723 2 -.243200 .162876 .681 -.89142 .40502 3 -1.073050(*) .162876 .005 -1.72127 -.42483 22 .087650 .162876 .992 -.56057 .73587 32 1 2 3 -.915850(*) -1.583100(*) -.330850 -1.160700(*) .162876 .162876 .162876 .162876 .010 .001 .421 .003 -1.56407 -2.23132 -.97907 -1.80892 -.26763 -.93488 .31737 -.51248 12 -.087650 .162876 .992 -.73587 .56057 32 -1.003500(*) .162876 .006 -1.65172 -.35528 -.579600 .672650(*) .162876 .162876 .079 .043 -1.22782 .02443 .06862 1.32087 1 2 91 3 -.157200 12 .915850(*) 22 1.003500(*) * The mean difference is significant at the .05 level. Keterangan : 7 8 9 14 22 32 Bunga knop segar 0 jam Bunga knop matahari 0 jam Bunga knop oven 0 jam Bunga knop segar 24 jam Bunga knop matahari 24 jam Bunga knop oven 24 jam .162876 .162876 .162876 .914 .010 .006 -.80542 .26763 .35528 .49102 1.56407 1.65172 92 Lampiran 14 Hasil uji statistik (ANOVA) aktivitas antioksidan ekstrak air bunga knop. Descriptives N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound 1 2 2 2 56.07000 7.085210 3 2 108.34600 14.166177 12 22 2 2 40.41300 43.10000 .816001 4.737615 32 2 88.80550 12 60.16133 Total 24.23350 6.265673 4.430500 Minimum Maximum Upper Bound -32.06134 80.52834 19.803 28.664 5.010000 -7.58809 119.72809 51.060 61.080 10.017000 -18.93205 235.62405 98.329 118.363 .577000 3.350000 33.08152 .53421 47.74448 85.66579 39.836 39.750 40.990 46.450 1.088237 .769500 79.02808 98.58292 88.036 89.575 31.007629 8.951131 40.46003 79.86264 19.803 118.363 Multiple Comparisons (I) perlakuan (J) perlakuan 1 2 3 Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Tukey HSD 2 3 12 22 32 Upper Bound -31.836500(*) -84.112500(*) 7.239182 7.239182 .032 .000 -60.64734 -112.92334 -3.02566 -55.30166 12 -16.179500 7.239182 .341 -44.99034 12.63134 22 32 -18.866500 -64.572000(*) 7.239182 7.239182 .228 .001 -47.67734 -93.38284 9.94434 -35.76116 1 31.836500(*) 7.239182 .032 3.02566 60.64734 3 12 22 -52.276000(*) 15.657000 12.970000 7.239182 7.239182 7.239182 .003 .368 .530 -81.08684 -13.15384 -15.84084 -23.46516 44.46784 41.78084 32 1 -32.735500(*) 84.112500(*) 7.239182 7.239182 .029 .000 -61.54634 55.30166 -3.92466 112.92334 2 52.276000(*) 7.239182 .003 23.46516 81.08684 12 67.933000(*) 7.239182 .001 39.12216 96.74384 22 32 1 65.246000(*) 19.540500 16.179500 7.239182 7.239182 7.239182 .001 .205 .341 36.43516 -9.27034 -12.63134 94.05684 48.35134 44.99034 2 -15.657000 7.239182 .368 -44.46784 13.15384 3 -67.933000(*) 7.239182 .001 -96.74384 -39.12216 22 -2.687000 7.239182 .999 -31.49784 26.12384 32 1 2 3 -48.392500(*) 18.866500 -12.970000 -65.246000(*) 7.239182 7.239182 7.239182 7.239182 .004 .228 .530 .001 -77.20334 -9.94434 -41.78084 -94.05684 -19.58166 47.67734 15.84084 -36.43516 12 2.687000 7.239182 .999 -26.12384 31.49784 32 -45.705500(*) 7.239182 .006 -74.51634 -16.89466 1 2 64.572000(*) 32.735500(*) 7.239182 7.239182 .001 .029 35.76116 3.92466 93.38284 61.54634 3 -19.540500 7.239182 .205 -48.35134 9.27034 93 12 48.392500(*) 22 45.705500(*) * The mean difference is significant at the .05 level. Keterangan : 10 11 12 15 22 32 Bunga knop segar 0 jam Bunga knop matahari 0 jam Bunga knop oven 0 jam Bunga knop segar 24 jam Bunga knop matahari 24 jam Bunga knop oven 24 jam 7.239182 7.239182 .004 .006 19.58166 16.89466 77.20334 74.51634 94 Lampiran 15 Hasil uji statistik (ANOVA) indeks stimulasi ekstrak bunga knop. Descriptives N Mean Std. Deviation Std. Error Minimum 95% Confidence Interval for Mean Maximum C1 3 1.01133 .082051 .047372 Lower Bound .80751 C2 3 1.07067 .122460 .070702 .76646 1.37487 .958 1.201 C4 3 .93767 .040501 .023383 .83706 1.03828 .894 .974 C8 3 .78033 .141599 .081752 .42858 1.13209 .670 .940 C1ConA 3 .76600 .013077 .007550 .73352 .79848 .757 .781 C2ConA 3 .73433 .053407 .030835 .60166 .86700 .691 .794 C4ConA 3 .69467 .037541 .021674 .60141 .78792 .654 .728 C8ConA 3 .58567 .040992 .023667 .48384 .68750 .562 .633 C1LPS 3 .91133 .084678 .048889 .70098 1.12168 .815 .974 C2LPS 3 .99733 .006807 .003930 .98042 1.01424 .992 1.005 C4LPS 3 .88567 .013577 .007839 .85194 .91939 .873 .900 C8LPS 3 .80667 .043844 .025314 .69775 .91558 .760 .847 C1PK 3 .98933 .023094 .013333 .93196 1.04670 .976 1.016 C2PK 3 .89267 .045764 .026422 .77898 1.00635 .842 .931 C4PK 3 .89633 .033975 .019616 .81193 .98073 .868 .934 C8PK 3 4 8 .71567 .084109 .048560 .50673 .92461 .620 .778 .85473 .142439 .020559 .81337 .89609 .562 1.201 Total Upper Bound 1.21516 .931 1.095 Multiple Comparisons Tukey HSD (I) perlakuan (J) perlakuan 11 12 13 -.059333 .073667 .053895 .053895 .999 .989 -.25918 -.12618 .14051 .27351 14 .231000(*) .053895 .012 .03115 .43085 21 .245333(*) .053895 .006 .04549 .44518 22 .277000(*) .053895 .001 .07715 .47685 23 .316667(*) .053895 .000 .11682 .51651 24 31 .425667(*) .100000 .053895 .053895 .000 .877 .22582 -.09985 .62551 .29985 32 .014000 .053895 1.000 -.18585 .21385 33 .125667 .053895 .605 -.07418 .32551 34 41 .204667(*) .022000 .053895 .053895 .040 1.000 .00482 -.17785 .40451 .22185 42 .118667 .053895 .690 -.08118 .31851 43 .115000 .053895 .732 -.08485 .31485 44 11 .295667(*) .059333 .053895 .053895 .000 .999 .09582 -.14051 .49551 .25918 13 14 21 .133000 .290333(*) .304667(*) .053895 .053895 .053895 .516 .001 .000 -.06685 .09049 .10482 .33285 .49018 .50451 22 .336333(*) .053895 .000 .13649 .53618 12 Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound 95 13 14 21 23 .376000(*) .053895 .000 .17615 .57585 24 .485000(*) .053895 .000 .28515 .68485 31 .159333 .053895 .243 -.04051 .35918 32 .073333 .053895 .989 -.12651 .27318 33 .185000 .053895 .094 -.01485 .38485 34 41 .264000(*) .081333 .053895 .053895 .002 .973 .06415 -.11851 .46385 .28118 42 .178000 .053895 .123 -.02185 .37785 43 .174333 .053895 .142 -.02551 .37418 44 .355000(*) .053895 .000 .15515 .55485 11 -.073667 .053895 .989 -.27351 .12618 12 -.133000 .053895 .516 -.33285 .06685 14 .157333 .053895 .259 -.04251 .35718 21 22 23 24 .171667 .203333(*) .243000(*) .352000(*) .053895 .053895 .053895 .053895 .157 .043 .007 .000 -.02818 .00349 .04315 .15215 .37151 .40318 .44285 .55185 31 .026333 .053895 1.000 -.17351 .22618 32 -.059667 .053895 .999 -.25951 .14018 33 .052000 .053895 1.000 -.14785 .25185 34 .131000 .053895 .540 -.06885 .33085 41 -.051667 .053895 1.000 -.25151 .14818 42 .045000 .053895 1.000 -.15485 .24485 43 44 .041333 .222000(*) .053895 .053895 1.000 .018 -.15851 .02215 .24118 .42185 11 -.231000(*) .053895 .012 -.43085 -.03115 12 -.290333(*) .053895 .001 -.49018 -.09049 13 -.157333 .053895 .259 -.35718 .04251 21 .014333 .053895 1.000 -.18551 .21418 22 .046000 .053895 1.000 -.15385 .24585 23 24 31 .085667 .194667 -.131000 .053895 .053895 .053895 .959 .063 .540 -.11418 -.00518 -.33085 .28551 .39451 .06885 32 33 -.217000(*) -.105333 .053895 .053895 .023 .832 -.41685 -.30518 -.01715 .09451 34 -.026333 .053895 1.000 -.22618 .17351 41 -.209000(*) .053895 .033 -.40885 -.00915 42 43 -.112333 -.116000 .053895 .053895 .761 .721 -.31218 -.31585 .08751 .08385 44 .064667 .053895 .997 -.13518 .26451 11 -.245333(*) .053895 .006 -.44518 -.04549 12 13 -.304667(*) -.171667 .053895 .053895 .000 .157 -.50451 -.37151 -.10482 .02818 14 -.014333 .053895 1.000 -.21418 .18551 22 .031667 .053895 1.000 -.16818 .23151 23 .071333 .053895 .992 -.12851 .27118 24 .180333 .053895 .113 -.01951 .38018 31 32 -.145333 -.231333(*) .053895 .053895 .375 .012 -.34518 -.43118 .05451 -.03149 96 22 23 24 33 -.119667 .053895 .678 -.31951 34 -.040667 .053895 1.000 -.24051 .08018 .15918 41 -.223333(*) .053895 .017 -.42318 -.02349 42 -.126667 .053895 .593 -.32651 .07318 43 -.130333 .053895 .548 -.33018 .06951 44 11 .050333 -.277000(*) .053895 .053895 1.000 .001 -.14951 -.47685 .25018 -.07715 12 -.336333(*) .053895 .000 -.53618 -.13649 13 -.203333(*) .053895 .043 -.40318 -.00349 14 -.046000 .053895 1.000 -.24585 .15385 21 -.031667 .053895 1.000 -.23151 .16818 23 .039667 .053895 1.000 -.16018 .23951 24 .148667 .053895 .340 -.05118 .34851 31 32 -.177000 -.263000(*) .053895 .053895 .128 .002 -.37685 -.46285 .02285 -.06315 33 34 41 -.151333 -.072333 -.255000(*) .053895 .053895 .053895 .314 .991 .004 -.35118 -.27218 -.45485 .04851 .12751 -.05515 42 -.158333 .053895 .251 -.35818 .04151 43 -.162000 .053895 .222 -.36185 .03785 44 .018667 .053895 1.000 -.18118 .21851 11 -.316667(*) .053895 .000 -.51651 -.11682 12 -.376000(*) .053895 .000 -.57585 -.17615 13 14 -.243000(*) -.085667 .053895 .053895 .007 .959 -.44285 -.28551 -.04315 .11418 21 -.071333 .053895 .992 -.27118 .12851 22 -.039667 .053895 1.000 -.23951 .16018 24 .109000 .053895 .796 -.09085 .30885 31 -.216667(*) .053895 .023 -.41651 -.01682 32 -.302667(*) .053895 .000 -.50251 -.10282 33 -.191000 .053895 .073 -.39085 .00885 34 41 42 43 -.112000 -.294667(*) -.198000 -.201667(*) .053895 .053895 .053895 .053895 .765 .000 .054 .046 -.31185 -.49451 -.39785 -.40151 .08785 -.09482 .00185 -.00182 44 -.021000 .053895 1.000 -.22085 .17885 11 -.425667(*) .053895 .000 -.62551 -.22582 12 13 -.485000(*) -.352000(*) .053895 .053895 .000 .000 -.68485 -.55185 -.28515 -.15215 14 -.194667 .053895 .063 -.39451 .00518 21 -.180333 .053895 .113 -.38018 .01951 22 23 -.148667 -.109000 .053895 .053895 .340 .796 -.34851 -.30885 .05118 .09085 31 -.325667(*) .053895 .000 -.52551 -.12582 32 -.411667(*) .053895 .000 -.61151 -.21182 33 -.300000(*) .053895 .000 -.49985 -.10015 34 -.221000(*) .053895 .019 -.42085 -.02115 41 -.403667(*) .053895 .000 -.60351 -.20382 42 -.307000(*) .053895 .000 -.50685 -.10715 97 31 32 33 34 43 44 11 -.310667(*) -.130000 -.100000 .053895 .053895 .053895 .000 .552 .877 -.51051 -.32985 -.29985 -.11082 .06985 .09985 12 13 -.159333 -.026333 .053895 .053895 .243 1.000 -.35918 -.22618 .04051 .17351 14 .131000 .053895 .540 -.06885 .33085 21 .145333 .053895 .375 -.05451 .34518 22 23 .177000 .216667(*) .053895 .053895 .128 .023 -.02285 .01682 .37685 .41651 24 .325667(*) .053895 .000 .12582 .52551 32 -.086000 .053895 .958 -.28585 .11385 33 .025667 .053895 1.000 -.17418 .22551 34 .104667 .053895 .838 -.09518 .30451 41 -.078000 .053895 .981 -.27785 .12185 42 .018667 .053895 1.000 -.18118 .21851 43 44 .015000 .195667 .053895 .053895 1.000 .060 -.18485 -.00418 .21485 .39551 11 12 13 -.014000 -.073333 .059667 .053895 .053895 .053895 1.000 .989 .999 -.21385 -.27318 -.14018 .18585 .12651 .25951 14 .217000(*) .053895 .023 .01715 .41685 21 22 .231333(*) .263000(*) .053895 .053895 .012 .002 .03149 .06315 .43118 .46285 23 .302667(*) .053895 .000 .10282 .50251 24 .411667(*) .053895 .000 .21182 .61151 31 .086000 .053895 .958 -.11385 .28585 33 .111667 .053895 .768 -.08818 .31151 34 .190667 .053895 .074 -.00918 .39051 41 .008000 .053895 1.000 -.19185 .20785 42 43 .104667 .101000 .053895 .053895 .838 .869 -.09518 -.09885 .30451 .30085 44 .281667(*) .053895 .001 .08182 .48151 11 -.125667 .053895 .605 -.32551 .07418 12 13 14 21 -.185000 -.052000 .105333 .119667 .053895 .053895 .053895 .053895 .094 1.000 .832 .678 -.38485 -.25185 -.09451 -.08018 .01485 .14785 .30518 .31951 22 .151333 .053895 .314 -.04851 .35118 23 .191000 .053895 .073 -.00885 .39085 24 31 .300000(*) -.025667 .053895 .053895 .000 1.000 .10015 -.22551 .49985 .17418 32 -.111667 .053895 .768 -.31151 .08818 34 .079000 .053895 .979 -.12085 .27885 41 -.103667 .053895 .847 -.30351 .09618 42 -.007000 .053895 1.000 -.20685 .19285 43 -.010667 .053895 1.000 -.21051 .18918 44 .170000 .053895 .167 -.02985 .36985 11 12 -.204667(*) -.264000(*) .053895 .053895 .040 .002 -.40451 -.46385 -.00482 -.06415 98 41 42 43 13 -.131000 .053895 .540 -.33085 .06885 14 .026333 .053895 1.000 -.17351 .22618 21 22 23 .040667 .072333 .112000 .053895 .053895 .053895 1.000 .991 .765 -.15918 -.12751 -.08785 .24051 .27218 .31185 24 .221000(*) .053895 .019 .02115 .42085 31 -.104667 .053895 .838 -.30451 .09518 32 33 -.190667 -.079000 .053895 .053895 .074 .979 -.39051 -.27885 .00918 .12085 41 -.182667 .053895 .103 -.38251 .01718 42 -.086000 .053895 .958 -.28585 .11385 43 -.089667 .053895 .942 -.28951 .11018 44 .091000 .053895 .935 -.10885 .29085 11 -.022000 .053895 1.000 -.22185 .17785 12 -.081333 .053895 .973 -.28118 .11851 13 14 .051667 .209000(*) .053895 .053895 1.000 .033 -.14818 .00915 .25151 .40885 21 .223333(*) .053895 .017 .02349 .42318 22 .255000(*) .053895 .004 .05515 .45485 23 24 31 32 .294667(*) .403667(*) .078000 -.008000 .053895 .053895 .053895 .053895 .000 .000 .981 1.000 .09482 .20382 -.12185 -.20785 .49451 .60351 .27785 .19185 33 .103667 .053895 .847 -.09618 .30351 34 .182667 .053895 .103 -.01718 .38251 42 .096667 .053895 .901 -.10318 .29651 43 .093000 .053895 .924 -.10685 .29285 44 .273667(*) .053895 .001 .07382 .47351 11 -.118667 .053895 .690 -.31851 .08118 12 13 -.178000 -.045000 .053895 .053895 .123 1.000 -.37785 -.24485 .02185 .15485 14 .112333 .053895 .761 -.08751 .31218 21 .126667 .053895 .593 -.07318 .32651 22 23 .158333 .198000 .053895 .053895 .251 .054 -.04151 -.00185 .35818 .39785 24 .307000(*) .053895 .000 .10715 .50685 31 32 33 -.018667 -.104667 .007000 .053895 .053895 .053895 1.000 .838 1.000 -.21851 -.30451 -.19285 .18118 .09518 .20685 34 41 .086000 -.096667 .053895 .053895 .958 .901 -.11385 -.29651 .28585 .10318 43 -.003667 .053895 1.000 -.20351 .19618 44 .177000 .053895 .128 -.02285 .37685 11 -.115000 .053895 .732 -.31485 .08485 12 -.174333 .053895 .142 -.37418 .02551 13 -.041333 .053895 1.000 -.24118 .15851 14 .116000 .053895 .721 -.08385 .31585 21 22 .130333 .162000 .053895 .053895 .548 .222 -.06951 -.03785 .33018 .36185 99 23 .201667(*) .053895 .046 .00182 .40151 24 .310667(*) .053895 .000 .11082 .51051 31 -.015000 .053895 1.000 -.21485 .18485 32 -.101000 .053895 .869 -.30085 .09885 33 34 41 .010667 .089667 -.093000 .053895 .053895 .053895 1.000 .942 .924 -.18918 -.11018 -.29285 .21051 .28951 .10685 42 44 .003667 .180667 .053895 .053895 1.000 .111 -.19618 -.01918 .20351 .38051 11 -.295667(*) .053895 .000 -.49551 -.09582 12 -.355000(*) .053895 .000 -.55485 -.15515 13 -.222000(*) .053895 .018 -.42185 -.02215 14 -.064667 .053895 .997 -.26451 .13518 21 -.050333 .053895 1.000 -.25018 .14951 22 -.018667 .053895 1.000 -.21851 .18118 23 24 .021000 .130000 .053895 .053895 1.000 .552 -.17885 -.06985 .22085 .32985 31 -.195667 .053895 .060 -.39551 .00418 32 -.281667(*) .053895 .001 -.48151 -.08182 33 -.170000 .053895 .167 -.36985 .02985 34 -.091000 .053895 .935 -.29085 .10885 41 -.273667(*) 42 -.177000 43 -.180667 * The mean difference is significant at the .05 level. .053895 .053895 .053895 .001 .128 .111 -.47351 -.37685 -.38051 -.07382 .02285 .01918 44 Keterangan : 11 12 13 21 22 23 31 32 33 41 42 43 C2 C4 C8 C2+ConA C4+ConA C8+ConA C2+LPS C4+LPS C8+LPS C2+PK C4+PK C8+PK
