UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI (+) - KATEKIN DAN GAMBIR (Uncaria
advertisement
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI (+) - KATEKIN DAN GAMBIR (Uncaria gambier Roxb.) TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI GRAM NEGATIF DAN MEKANISMENYA Skripsi Diajukan sebagai salah satu syarat untuk Memperoleh gelar Sarjan Farmasi (S, Far) OLEH : MUSTIKANING AYU HAPSARI PUTRI NIM : 106102003416 PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2010 M/ 1431 H Skripsi dengan judul UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI (+)- KATEKIN DAN GAMBIR (Uncaria gambier Roxb.) TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI GRAM NEGATIF DAN MEKANISMENYA Telah disetujui, diperiksa dan dipertahakan dihadapan tim penguji oleh Mustikaning Ayu Hapsari Putri NIM: 106102003416 Menyetujui, Pembimbing: 1. Pembimbing I Dr. Andria Agusta ........................ 2. Pembimbing II Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ........................ Penguji: 1. Ketua Penguji Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt. ........................ 2. Anggota Penguji I Azrifitria, M.Si, Apt. ........................ 3. Anggota Penguji II Zilhadia, M.Si, Apt. ........................ 4. Anggota Peguji III Sabrina, M.Si, Apt. ........................ Mengetahui, Dekan Fakultas Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Prof. DR. (hc). dr. M.K. Tadjudin, Sp. And Tanggal lulus : 24 Agustus 2010 ii LEMBAR PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul : UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI (+)- KATEKIN DAN GAMBIR (Uncaria gambier Roxb.) TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI GRAM NEGATIF DAN MEKANISMENYA Adalah karya saya sendiri dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi atau lembaga pendidikan manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka. Jakarta, Agustus 2010 Mustikaning Ayu Hapsari Putri iii KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi dengan judul “Uji Aktivitas antibakteri (+)- katekin dan gambir (Uncaria gambier Roxb.) terhadap beberapa jenis bakteri gram negatif dan mekanismenya”. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk menyelesaikan program pendidikan tingkat sarjana Strata 1 (S1) pada program studi Farmasi, Fakultas kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan rasa terima kasih yang mendalam kepada : 1. Bapak Dr. Andria Agusta dan Bapak Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt selaku dosen pembimbing yang telah memberikan arahan, bimbingan, motivasi, nasehat dan perhatian selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. 2. Bapak Prof. Dr (hc). Dr, M. K Tadjudin, Sp. And, selaku dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk melakukan penelitian. 3. Bapak Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt sebagai Ketua program Studi Farmasi serta staf karyawan prodi Farmasi UIN yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi ini. 4. Dosen-dosen UIN yang telah sabar mendidik dan membantu penulis sejak awal sampai penulisan skripsi ini. 5. Bapak Dr. Eko Baroto Walujo, APU sebagai kepala bidang botani, LIPI Cibinong yang telah membantu memberikan izin untuk melakukan penelitian di Laboratorium Fitokimia, Puslit Biologi, LIPI Cibinong. 6. Dr. Praptiwi, M,Agr. dari Laboratorium Fitokimia bidang Botani, Puslit Biologi LIPI, yang telah memberikan bantuan, kesabaran, arahan selama penelitian. iv 7. Kakak Ahmad Fathoni dan Kakak Andi Saptaji Kamal dari Laboratorium Fitokimia, Bidang Botani, LIPI Cibinong yang telah membantu penulis dalam mengarahkan serta menuntun untuk melakukan penelitian. 8. Ayahanda, Teguh Sugiarto, SE dan Ibunda, Indriani widyastuti yang selalu memberikan doa, semangat, dukungan, perhatian dan kasih sayang selama penulis menyelesaikan skripsi ini. 9. Sahabat tersayang Ayu Nuki Wahyuni, teman seperjuangan Fika Fauziah dan Nuryatni, Nurul gustiari, Erni, Febriyati, Nurul Farihah, Ulfah Sadiah dan Lidya Pratiwi yang telah membantu dan menemani di Laboratorium untuk menyelesaikan penelitian. 10. Teman-teman Farmasi UIN angkatan 2006, terutama Indira Irma Anggraeni, Silma Awalia, Via Rifkia dan Nadya Kristina yang telah memberikan semangat kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan skripsi ini. Untuk menyempurnakan skripsi ini, penulis menerima segala saran dan kritik yang membangun. Semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi ilmu pengetahuan dan kesehatan masyarakat. Jakarta, Agustus 2010 Penulis v ABSTRAK UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI (+)- KATEKIN DAN GAMBIR (Uncaria gambier Roxb.) TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI GRAM NEGATIF DAN MEKANISMENYA (+)- Katekin dan ekstrak air gambir (Uncaria gambier Roxb.) dilaporkan mempunyai aktivitas antibakteri. Penelitian ini ditunjukkan untuk mengetahui lebih lanjut uji aktivitas antibakteri (+)- katekin dan ekstrak air gambir terhadap Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa, Eschericia coli, Proteus vulgaris dan Proteus mirabilis.. Pengujian yang dilakukan meliputi pengujian sensitivitas terhadap bakteri uji gram negatif untuk memastikan aktivitas antibakteri (+)katekin dan ekstrak air gambir, penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan analisis mekanisme penghambatannya terhadap bakteri uji gram negatif. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa (+)- katekin memiliki nilai KHM terhadap bakteri Shigella flexneri sebesar 7,5 mg/ml. dan mekanisme kerja (+)- katekin adalah dengan merusak membran sel, sehingga terjadi kebocoran komponen sel. Hal ini ditunjukkan oleh terdeteksinya ion Ca2+ dan ion K+ serta protein dan asam nukleat pada media sel bakteri. Sedangkan ekstrak air gambir tidak memperlihatkan aktivitas penghambatan sampai konsentrasi 25 mg/ml pada metode makrodilusi. Kata kunci : Uncaria gambier Roxb. , Bakteri gram negatif, Mekanisme penghambatan, Perubahan morfologi sel vi ABSTRACT TESTING (+)- CATECHIN AND GAMBIR (Uncaria gambier Roxb.) ANTIBACTERIA ACTIVITIES TO SOME NEGATIVE BACTERIA AND THEIR MECHANISM OF INHIBITION. (+)- Catechin and gambir water extract (Uncaria gambier Roxb.) have been reported to have antibacterial activity. The aim of this research is to evaluate antibacterial activity of (+)- catechin and gambir water extract againts some Gram negative bacteria. The experiments composed of sensitivity testing of (+)catechin and gambir extract to Gram negative bacteria, Minimum Inhibitor Concentration (MIC), and the analysis of inhibition mechanism to Gram negative bacteria tested. The result of this research showed that MIC value of (+)- catechin against S. flexneri was 7,5 mg/ml and its inhibition mechanism was by destruction of cell membrane. It was indicated by increasing K+ ion, Ca2+ ion, protein and nucleic acid content in the medium compared to negative control treatment. While gambir water extract didn’t have inhibition activity up to 25 mg/ml of extract concentratation by macrodillution method. Keywords : Uncaria gambier Roxb., bacteria, inhibition mechanism, cell morphology. vii viii DAFTAR ISI Lembar Persetujuan Skripsi............................................................................................i Lembar Pernyataan........................................................................................................ii Lembar Pengesahan......................................................................................................iii Kata Pengantar.............................................................................................................iv Abstrak.........................................................................................................................vi Abstract.......................................................................................................................vii Daftar Isi....................................................................................................................viii Daftar Gambar.............................................................................................................xi Daftar Lampiran..........................................................................................................xii Daftar Tabel...............................................................................................................xiii BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ......................................................................................1 1.2 Perumusan Masalah ..............................................................................4 1.3 Hipotesis ...............................................................................................5 1.4 Tujuan Penelitian...................................................................................5 1.5 Manfaat Penelitian ................................................................................5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tanaman Gambir ..................................................................................6 2.1.1 Taksonomi.................................................................................7 2.1.2 Morfologi .................................................................................8 2.1.3 Asal dan Tempat Tumbuh.........................................................8 2.1.4 Kandungan................................................................................9 2.1.4.1 (+)- Katekin...................................................................9 2.1.5 2.2 Khasiat dan Kegunaan............................................................11 Ekstraksi..............................................................................................12 viii 2.3 Bakteri................................................................................................13 2.4 Antimikroba.......................................................................................13 2.4.1 Definisi...................................................................................13 2.4.2 Mekanisme Kerja……….......................................................14 2.4.3 Uji Antimikroba.....................................................................17 2.5 Bakteri Uji..........................................................................................20 2.6 Metode Ekstraksi...............................................................................22 BAB III KERANGKA KONSEP............................................................................25 BAB IV METODOLOGI PENELITIAN 4.1 Waktu dan Tempat Penelitian ..........................................................26 4.2 Prinsip Penelitian...............................................................................26 4.3 Bahan.................................................................................................27 4.4 Mikroba Uji........................................................................................27 4.5 Metode Penelitian..............................................................................28 4.5.1 Penyiapan Bahan, Media dan Alat........................................28 4.5.2 Penentuan Diameter Hambat.................................................33 4.5.3 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum............................33 4.5.4 Pengujian Kebocoran Metabolit Seluler................................34 4.5.5 Pengujian Kebocoran Ion-ion Logam....................................35 4.5.6 Pengujian Morfologi Sel dengan SEM..................................35 BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1 Hasil Penelitian..................................................................................37 5.2 Pembahasan ......................................................................................41 ix BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN 6.1 Kesimpulan ......................................................................................48 6.2 Saran ................................................................................................48 DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................49 LAMPIRAN ...........................................................................................................53 x DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Diagram alir tahapan penelitian 25 Gambar 2. Ekstrak gambir kering 37 Gambar 3. Foto KLT Fraksi Kromatografi Kolom 37 Gambar 4. Foto KLT Fraksi Gabungan Kromatografi Kolom 38 Gambar 5. Grafik pengukuran senyawa metabolit seluler 40 Gambar 6. Grafik ion-ion logam terhadap bakteri S. Flexneri 40 Gambar 7. Morfologi sel S. flexneri dengan mikroskop elektron 41 xi DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Skema pembuatan ekstrak gambir 52 Lampiran 2. Skema isolasi katekin dari gambir 53 Lampiran 3. Skema pembuatan suspensi bakteri. 54 Lampiran 4. Skema penentuan diameter hambat bakteri. 55 Lampiran 5. Skema penentuan KHM 56 Lampiran 6. Skema analisis kebocoran dinding/membran sel bakteri. 57 Lampiran 7. Skema pengamatan morfologi sel bakteri. 58 Lampiran 8. Perhitungan Konsentrasi Hambat Minimum. 59 Lampiran 9. Diameter hambat ekstrak gambir dan (+)- katekin terhadap 61 S. flexneri pada konsentrasi 7 mg/ml. Lampiran 10. Pertumbuhan bakteri S. flexneri dengan metode 63 makrodilusi. Lampiran 11. Data Hasil AAS (Ca2+ dan K+) 68 Lampiran 12. Alat-alat yang digunakan 70 xii DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Pengukuran diameter hambat ekstrak terhadap 38 5 bakteri gram negatif pada konsentrasi 7 mg/ml Tabel 2. Penentuan nilai konsentrasi KHM ekstrak terhadap 5 bakteri gram negatif. xiii 39 BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Tumbuhan merupakan gudang berbagai jenis senyawa kimia, mulai dari struktur dan sifat yang sederhana sampai yang rumit dan unik. Beragam jenis dan senyawa kimia yang terkandung dalam tumbuhan akan berkorelasi positif dengan khasiat dan manfaat yang dimilikinya. Upaya pencarian tumbuhan obat telah lama dilakukan, baik untuk mencari senyawa baru ataupun menambah keanekaragaman senyawa yang telah ada (Djauhariya dan Hernani, 2004). Beberapa tahun belakangan ini telah banyak dilakukan penelitian untuk menemukan antioksidan dan antibakteri alami yang bersumber dari tanaman, khususnya tanaman asli Indonesia. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan pada sejumlah ekstrak tanaman yang biasa digunakan sebagai bumbu dan obat tradisional, beberapa diantaranya berpotensi sebagai sumber antioksidan. Salah satu tanaman yang diteliti adalah tumbuhan gambir (Uncaria gambier Roxb.) yang memang sejak lama digunakan masyarakat tradisional sebagai antiseptik dan obat sakit perut. Serta sebagai salah satu campuran makan sirih. Sampai saat ini belum banyak penelitian yang mengupas tentang aktivitas antibakteri yang dimiliki oleh daun gambir (Kresnawaty et al.,2009) Di Indonesia obat-obat tradisional dari tumbuhan berupa simplisia dan jamu-jamu. Saat ini Indonesia merupakan salah satu negara penghasil tanaman obat yang potensial dengan keanekaragaman hayati yang dimilikinya. Keanekaragaman hayati Indonesia menempati urutan ketiga terbesar di dunia 1 setelah Brazil dan Zaire. Di hutan tropika Indonesia tumbuh sekitar 30.000 spesies tumbuhan berbunga dan diperkirakan sekitar 3.689 spesies diantaranya merupakan tumbuhan obat. Dari sejumlah tanaman obat tersebut baru sebanyak 283 spesies tumbuhan obat yang sudah digunakan dalam industri obat tradisional (Djauhariya dan Hernani, 2004). Kebutuhan bahan baku obat tradisional terutama yang berasal dari tumbuhan, sebagian besar masih diambil dari alam, sehingga beberapa jenis mulai langka. Sebagian besar tumbuhan bermanfaat untuk pengobatan berbagai jenis penyakit, diantaranya penyakit alergi, penyakit metabolik, dan penyakit degeneratif yang berkaitan dengan penuaan (Djauhariya dan Hernani, 2004). Spesies Uncaria gambier Roxb. merupakan salah satu tanaman tahunan penghasil getah penting yang banyak digunakan untuk keperluan industri maupun farmasi. Peranan spesies ini dari waktu ke waktu dirasakan semakin penting, namun upaya-upaya perbaikan potensi genetik tanaman tersebut sejauh ini belum mendapat perhatian yang serius (Jamsari et al.,2007). Gambir berkhasiat sebagai astringen. Dan gambir juga bermanfaat untuk mengobati disentri, luka bakar (obat luar), luka (obat luar), sariawan mulut (obat kumur), dan suara parau (obat kumur) (Utami et al., 2008). Kegunaan gambir secara tradisional adalah sebagai pelengkap makan sirih dan obat-obatan, seperti di Malaysia gambir digunakan untuk obat luka bakar, di samping rebusan daun muda dan tunasnya digunakan sebagai obat diare dan disentri serta obat kumur-kumur pada sakit kerongkongan. Secara modern gambir banyak digunakan sebagai bahan baku industri farmasi dan makanan, di antaranya bahan baku obat penyakit hati dengan paten “catergen”, bahan baku permen yang 2 melegakan kerongkongan bagi perokok di Jepang karena gambir mampu menetralisir nikotin. Sedangkan di Singapura gambir digunakan sebagai bahan baku obat sakit perut dan sakit gigi (Dhalimi, 2006). Daun dan ranting merupakan bagian tanaman gambir yang memiliki nilai ekonomi. Senyawa-senyawa yang terkandung pada ekstrak atau getah daun dan ranting tanaman gambir memiliki potensi pemanfaatan yang beragam. Ekstrak atau getah daun dan ranting yang telah dikeringkan merupakan produk yang dikenal sebagai gambir, sedangkan dalam perdagangan dunia dikenal sebagai gambier, cutch, catechu atau pale catechu. Senyawa utama yang terkandung di dalam gambir adalah pseudotanin katekin dan phlobatanin asam katekutanat dengan persentase masing-masing senyawa adalah 7-30% dan 22-55%. Adanya perbedaan kadar katekin pada gambir dipengaruhi oleh kondisi daun yang diekstrak (Utami et al., 2008). Gambir merupakan komoditas utama provinsi Sumatera Barat. Gambir telah sejak lama digunakan sebagai pelengkap sirih yang dikunyah dan dipercaya dapat menguatkan gigi. Ekstrak gambir mengandung (+)- katekin sebagai komponen utama, suatu senyawa polifenol, yang berpotensi sebagai antioksidan dan antibakteri melaporkan bahwa ekstrak gambir memiliki daya hambat terhadap bakteri Streptococcus mutans yang menyebabkan terjadinya plak gigi. Terjadinya plak gigi dapat menyebabkan karies pada gigi dan berlanjut dengan gingivitis. (+)katekin bersifat asam lemah (pKa1 = 7,72 dan pKa2 = 10,22), sukar larut dalam air, dan tidak stabil di udara terbuka. Bersifat mudah teroksidasi pada pH yang mendekati netral (pH 6,9) dan lebih stabil pada pH yang lebih rendah (2,8 dan 4,9). Sifat fitokimianya menjadi tantangan sendiri dalam formulasi katekin 3 menjadi sediaan obat. Pemanfaatan katekin untuk mencegah terjadinya plak gigi dengan cara pemberian obat kumur yang bisa diminum untuk memperoleh aktivitas antioksidan katekin (Lucida et al., 2007). Gambir merupakan produk dari tanaman gambir (Uncaria gambier Roxb.) yang mengandung senyawa fungsional yang termasuk dalam golongan senyawa polifenol. Gambir komersial diperoleh dengan pengolahan daun gambir dengan metoda perebusan, pengepresan dan pengeringan padatan. Dalam perdagangan salah satu komponen mutu gambir ditentukan berdasarkan pada kandungan katekinnya. Ekstraksi suatu bahan pada prinsipnya dipengaruhi oleh suhu. Makin tinggi suhu yang digunakan, makin tinggi ekstrak yang diperoleh. Namun demikian, bahan hasil ekstrak dengan berbagai tingkat suhu belum tentu memberikan pengaruh yang berbeda terhadap sifat antibakterinya (Pembayun et al., 2007). 1.2 Perumusan Masalah Pada penelitian ini yang menjadi perumusan masalah adalah : 1. Apakah (+)- katekin dan ekstrak air gambir (Uncaria gambier Roxb.) memiliki aktivitas antibakteri terhadap beberapa jenis bakteri gram negatif ? 2. Bagaimana mekanisme penghambatan pertumbuhan beberapa jenis bakteri gram negatif oleh (+)- katekin dan ekstrak air gambir ? 4 1.3 Tujuan Penelitian 1. Mengetahui aktivitas antibakteri (+)- katekin dan ekstrak air gambir terhadap beberapa jenis bakteri gram negatif. 2. Mengetahui mekanisme penghambatan pertumbuhan beberapa jenis bakteri gram negatif terhadap (+)- katekin dan ekstrak air gambir. 1.4. Hipotesis 1. (+)- katekin dan ekstrak air gambir mempunyai aktivitas antibakteri terhadap bakteri gram negatif. 2. Mekanisme penghambatan bakteri gram negatif terhadap (+)- katekin dan ekstrak air gambir melalui perusakan membran sel. 1.5. Manfaat Penelitian 1. Untuk mendapatkan gambaran mengenai aktivitas antibakteri (+)- katekin dalam pengembangan dan pemanfaatan obat tradisional. 2. Untuk mengetahui dan membuktikan penggunaan antibiotik alami berikut mekanisme kerjanya. 5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tanaman Gambir (Uncaria gambier Roxb.) Uncaria gambier Roxb. termasuk dalam familia Rubiaceae. Ciri-ciri umum dari familia Rubiaceae adalah sebagai berikut : merupakan tanaman perdu dengan tinggi 1-3 cm. Umumnya tumbuh memanjat pada pohon atau semak yang ada di sekitarnya dengan bantuan alat pengait. Batang tegak, berkayu, bulat, percabangan simplodial dan berwarna cokelat pucat. Daun tunggal berbentuk lonjong. Letak berhadapan, tepi bergerigi, pangkal bulat, ujung meruncing, panjang 8-13 cm, lebar 4-7 cm, dan berwarna hijau. Bunga majemuk berbentuk lonceng, muncul di ketiak daun, panjang 5 cm. Mahkota bunga berjumlah 5 helai, berbentuk lonjong dan berwarna ungu. Buah berbentuk bulat telur, panjang sekitar 1,5 cm dan berwarna hitam (Utami et al., 2008). Sedangkan tangkai dari daun tidak berambut, panjang 0,5-0,8 cm, pertulangan primer pada permukaan daun sebelah bawah menonjol. Lobus dari mahkota krem keputihan, daun pelindung tidak berambut, langset. Buah kapsul, sempit dan panjang, terbagi menjadi 2 belahan. Biji banyak, kecil, halus, berbentuk jarum dan bersayap, panjang 0,4 cm, dan berwarna kuning (BPOM RI, 2007). Simplisianya umumnya berbentuk kubus tidak beraturan atau agak silindrik pendek, kadang-kadang bercampur dengan bagian yang remuk, tebal 2 cm sampai 3 cm, ringan, mudah patah dan berliang renik-renik. Warna permukaan luar cokelat muda sampai cokelat tua kemerahan atau kehitaman, warna 6 permukaan yang baru dipatahkan cokelat muda sampai cokelat kekuningan, kadang-kadang terihat garis-garis yang lebih gelap (BPOM RI, 2007). Nama Simplisianya adalah Terra Japonica, Gele catechu, Gambir (Dalimarta., 2003) 2.1.1 Taksonomi Taksonomi dari gambir (Uncaria gambier Roxb.) menurut (Haryanto., 2009). a. Klasifikasi Kerajaan/Kingdom : Plantarum Divisio : Spermatophyta Sub diviso : Angiospermae Kelas/Class : Dicotyledonae Bangsa/Ordo : Rubiales Suku/Family : Rubiaceae Marga/Genus : Uncaria Jenis/Species : Uncaria gambier Roxb. Sinonim : Ourouparia gambir Roxb Nauclea gambir b. Nama daerah Sumatera : gambe, gani, kacu, sontang, gambee, gambie, gambu, gimber, pengilom, sepelet. Jawa : santun, ghambhir. Kalimantan : kelare, abi, gamer, kambim, sori. Nusa Tenggara : tagambe, gambele, gamelo, gambi, gambe, 7 gambiri, gata, gaber. Maluku : kampir, kambir, ngambir, gaamer, gabi, tagabere, gagabere, gabere, gambe (Sirait et al., 1989). 2.1.2 Morfologi Berasal dari Sumatera dan Kalimantan. Merupakan tanaman perdu dengan tinggi 1-3 cm. umumnya tumbuh memanjat pada pohon atau semak yang ada di sekitarnya dengan bantuan alat pengait. Batang tegak, berkayu, bulat, percabangan simplodial dan berwarna cokelat pucat. Daun tunggal berbentuk lonjong, letak berhadapan, tepi bergerigi, pangkal bulat, ujung meruncing, panjang 8-13 cm, lebar 4-7 cm, dan berwarna hijau. Bunga majemuk berbentuk lonceng, muncul di ketiak daun, panjang 5 cm. Mahkota bunga berjumlah 5 helai, berbentuk lonjong dan berwarna ungu. Buah berbentuk bulat telur, panjang sekitar 1,5 cm dan berwarna hitam (Utami et al., 2008). 2.1.3 Asal dan Tempat Tumbuh Tanaman gambir ini merupakan tanaman perdu yang berasal dari daerah Sumatera dan Kalimantan. Tumbuhan ini tumbuh liar di hutan dan di tempattempat lain yang tingginya 200-900 m dari permukaan laut, tanahnya agak miring dan cukup mendapat sinar matahari. Di daerah Sumatera dan Kalimantan, tanaman gambir ini umunya ditanam orang di kebun-kebun (Mardisiswodjo et al., 1968). Gambir tumbuh pada area terbuka di dalam hutan, kawasan hutan yang lembab, area terbuka bekas perladangan atau pinggir hutan (BPOM RI, 2007). 8 2.1.4 Kandungan Kandungan Kimia Kandungan kimia dari gambir (Uncaria gambir Roxb.) adalah katekin, kuersetin, tannin, lendir, lemak, dan malam. Gambir memiliki sifat khas pahit dan kelat (Utami et al., 2008). Kandungan katekin ini digunakan sebagai salah satu parameter mutu gambir. Selain katekin terdapat juga proantosianidin yaitu : gambiriin A1, gambiriin A2, gambiriin A3, gambiriin B1, gambiriin B2, gambiriin B3, dan gambiriin C. kandungan lainnya adalah epikatekin, epigallo-katekin, asam tanat dan alkaloida. Adanya alkaloida ini dapat membedakan produk gambir ‘pale catechu’ dari Uncaria gambier dengan ‘black catechu’ yang diproduksi Acacia catechu. Beberapa alkaloida dari gambir yang dikenal sebagai ‘gambir fluoresen’ diantaranya adalah dihidrogambirtanin, gambirdin, gambirtanin, gambirin, isogambirin, auroparin, dan oksogambirtanin. Namun kandungan utama gambir adalah katekin. (BPOM RI, 2007). 2.1.4.1 (+)- Katekin Katekin termasuk senyawa polifenol dari kelompok flavonoid. Flavonoid biasanya banyak ditemukan pada buah-buahan, daun teh, sayuran dan juga pada Uncaria gambier Roxb. Kualitas gambir dalam aspek ekonominya tergantung 9 kepada kandungan katekinnya. Katekin adalah bagian dari flavan-3-ol yang termasuk (+)- katekin (1), (-)- katekin (2). OH HO O OH (1) (+)- katekin OH HO OH Y O X OH : X=OH, Y=H (2) (-)- katekin OH Y X : X=H, Y=O Katekin juga memiliki banyak aktivitas biologi yang penting, seperti aktivitas antitumor dan antioksidan. Flavan-3-ol, seperti epikatekin dan katekin menunjukkan klas utama dari metabolit sekunder polifenol pada tanaman. Telah ditentukan bahwa konfigurasi dan struktur dari (+)- katekin adalah (2R,3S)3′,4′,5,7-tetrahydroksiflavan-3-ol (Wilhelm, 2008). Uji Organoleptik gambir • Penampakan Fisik : cairan kental (viscous liquid) • Rasa : mula-mula pahit dan sangat kelat, lalu agak manis. • Aroma : lemah Makroskopik Umumnya berbentuk kubus tidak beraturan atau agak silindris pendek, kadang bercampur dengan bagian-bagian yang remuk, tebal 2-3 cm, ringan, 10 mudah patah dan berliang renik-renik, warna permukaan luar cokelat muda sampai cokelat kekuningan, kadang-kadang terlihat garis-garis yang lebih gelap (Sirait et al., 1989). Mula-mula terasa pahit, namun lama-kelamaan terasa manis dan tidak berbau (Evans, 2002). Mikroskopik Dilihat dalam kloralhidrat terlihat adanya pollen, sel batu besar, dinding agak tipis, lumen besar, atau kadang-kadang kecil memanjang, lumen sempit. Sel parenkim besar, dinding tipis. Hablur kalsium oksalat bentuk jarum dan bentuk prisma. Rambut penutup terdiri dari satu sel ujung runcing (Sirait et al., 1989). Efek farmakologi Ekstrak gambir mampu mengatasi diare karena sifat astringen dari tanin yang merupakan kandungan utama dari gambir. Selain itu gambir juga efektif dalam menghambat pertumbuhan bakteri dan alga (BPOM RI, 2007). 2.1.5 Khasiat dan Kegunaan Gambir berkhasiat sebagai astringen. Dan gambir juga bermanfaat untuk mengobati disentri, luka bakar (obat luar), luka (obat luar), sariawan mulut (obat kumur), dan suara parau (obat kumur) (Utami et al., 2008). Uncaria gambier Roxb. merupakan salah satu tanaman penghasil getah (alkaloid) yang mengandung senyawa kimia berupa katekin, tannin, flouresin, kuersetin, lendir, lemak dan lilin. Sampai saat ini produk gambir hanya dimanfaatkan secara terbatas untuk menyirih, bahan campuran cat, pencelup tekstil, obat-obatan, kosmetika dan bahan antiseptik. Senyawa (+)- katekin, tanin, dan kuersetin 11 bersifat antimikroba dan antioksidan. Di samping itu, (+)- katekin, tanin dan kuersetin juga bersifat toksik terhadap serangga, selain itu senyawa kuersetin dan tanin juga mampu berperan sebagai nematisidal (Idris., 2007). 2.2 Ekstraksi Ekstrak bahan alam adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang ditetapkan. Sebagian besar ekstrak dibuat dengan mengekstraksi bahan baku secara perkolasi. Seluruh perkolat dipekatkan dengan mengguakan destilasi dengan pengurangan tekanan, agar kandungan utama obat sesedikit mungkin terkena panas. Ekstrak cair adalah sediaan cair simplisia nabati, yang mengandung ethanol sebagai pelarut dan pengawet (Soesilo., 1995). Penyarian adalah proses penarikan zat pokok yang diinginkan dari bahan alam dengan menggunakan pelarut yang dipilih di mana zat yang diinginkan larut. Pemilihan pelarut yang akan digunakan dalam bahan alam tertentu berdasarkan pada daya larut zat aktif dan zat tidak aktif serta zat yang tidak diinginkan tergantung pada preparat yang diperlukan. Proses penyarian dapat dipisahkan menjadi : 1. Pembuatan serbuk. Umumnya penyarian akan bertambah baik bila permukaan serbuk simplisia semakin luas demikian penyarian akan lebih baik. 2. Pembasahan. 12 Pembasahan serbuk sebelum dilakukan penyarian dimaksudkan untuk memberikan kesempatan pada cairan penyarian untuk memasuki pori-pori dalam simplisia sehingga mempermudah penyarian selanjutnya. 3. Penyarian. Cara penyarian dapat dibedakan menjadi infundasi, maserasi, perkolasi, dan destilasi uap. Dari keempat cara tersebut sering dilakukan modifikasi untuk memperoleh hasil yang lebih baik. 4. Pemekatan. Pemekatan dilakukan dengan maksud untuk menghilangkan pelarut atau membuat ekstrak kering. 2.3 Bakteri Bakteri termasuk termasuk kedalam golongan prokariota, yang strukturnya lebih sederhana dari eukariota, kecuali bahwa struktur dinding sel prokariota lebih komplek dari eukariota. Morfologi bakteri dibagi dalam 3 bentuk utama, yaitu kokus, batang/basil dan spiral. Bakteri dibagi atas bakteri yang positif Gram dan negatif Gram tergantung pada responnya bila diwarnai dengan pewarnaan menurut GRAM. Sel bakteri mula-mula diwarnai dengan zat warna kristal ungu dan iodium, lalu dicuci dengan alkohol atau aseton. Bakteri negatif Gram akan kehilangan zat warna ungunya setah dicuci dengan alkohol, sedangkan bakteri positif Gram tetap mempertahankan warna ungu meskipun telah dicuci dengan alkohol (Assani., 1993). 13 2.4 Antimikroba 2.4.1 Definisi Antimikroba adalah suatu jenis obat yang digunakan untuk membasmi mikroba, khususnya untuk jenis mikroba yang merugikan manusia (patogen). Pada penelitian ini, mikroba yang digunakan terbatas pada beberapa spesies bakteri. Zat yang berfungsi sebagai antimikroba dapat berasal dari senyawa alami, sintetis, atau semisintetis yan pada dasarnya digunakan untuk mematikan mikroba secara langsung atau dengan menghambat pertumbuhannya (Setiabudy et al., 1995) Berdasarkan sifat toksisitas selektif, aktivitas zat antibakteri dapat dikategorikan menjadi : a. Bakteriostatik, yaitu antibakteri yang mempunyai kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri sehingga jumlah sel bakteri yang hidup praktis tetap. Tetapi pertumbuhan bakteri akan berlangsung kembali bila kontak dengan obat dihentikan. b. Bakterisidal, yaitu antibakteri yang mempunyai kemampuan untuk membunuh bakteri dikarenakan hancurnya dinding bakteri karena lisi. Akibatnya bakteri tidak dapat bereproduksi kembali meskipun kontak dengan obat dihentikan. 2.4.2 Mekanisme Kerja Antimikroba Setiabudy, R dan Vincent H.S. Gan, bahwa antimikroba mengganggu bagian-bagian yang peka dalam sel. a. Antimikroba yang menghambat sintesis dinding sel mikroba 14 Obat yang termasuk kedalam kelompok ini adalah penisilin, sefalosporin, basitrasin, vankomisin, dan sikloserin. Dinding sel bakteri terdiri atas polipeptidoglikan yaitu suatu kompleks polimer mukopeptida (glikopeptida). Perbedaan struktur sel antara bakteri dan eukariot menguntungkan bagi penggunaan bahan antimikroba. Salah satu contoh klasik yang memiliki mekanisme antimikroba seperti ini adalah penisilin. Antibiotik ini menyebabkan penghambatan pada pembentukan ikatan sebrang silang. Pada konsentrasi rendah, penisilin menghambat pembentukan ikatan glikosida, sehingga pembentukan dinding sel baru akan terganggu dapat dilihat dari bakteri dengan bentuk sel yang panjang tanpa dinding sekat. Pada konsentrasi tinggi, ikatan sebrang silang terganggu dan pembentukan dinding sel terhenti. Kepekaan bakteri terhadap penisilin tergantung pada kemampuan mikroorganisme menghasilkan enzim beta-laktamase enzim ini dapat merusak daya kerjanya b. Antimikroba yang mengganggu/merusak membran sel Membran sel bakteri dan fungi dapat dirusak oleh beberpa zat tertentu tanpa merusak sel inang. Akibat dari daya kerja zat ini akan terjadi perusakan membrane sehingga isi sel akan keluar. Antibakteri ini berdaya kerja terhadap sel baik yang sedang tumbuh maupun yang tidak tumbuh. Misalnya Polymixin dan polyene dan antiseptik golongan surface active agent. Antimikroba golongan ini dapat merubah tegangan permukaan sehingga akan merusak permeabilitas selektif dari membran sel mikroba. Kerusakan membran sel akan menimbulkan kebocoran yang mengakibatkan keluarnya berbagai komponen sel yang esensial sehingga bakteri mengalami kematian 15 c. Antimikroba yang menghambat sintesis protein Dalam kelangsungan hidup sel mikroba perlu mensintesis berbagai protein. Di ribosom sentesis protein berlangsung, dengan bantuan mRNA dan tRNA. Pada bakteri terdapat dua sub unit ribosom, yang berdasarkan konstanta seddimentasi dinyatakan sebgai ribosom 30S dan 50S. kedua komponen ini akan bersatu pada pangkal rantai mRNA menjadi ribosom 70S, sehingga dapat berfungsi pada sintesis protein. Penghambatan sintesis protein dapat terjadi dengan berbagai cara. Salah satu contoh, yaitu Streptomisin berikatan dengan komponen ribosom 30S dan menyebabkan kode pada mRNA salah dibaca oleh tRNA pada waktu sintesis protein. Akibatnya, akan terbentuk protein yang abnormal dan nonfungsional bagi sel mikroba d. Antimikroba yang menghambat sintesis asam nukleat Antimikroba yang termasuk kedalam golongan ini adalah rifampisin dan golongan kuinolon. Rifampisin merupakan antimikroba yang dapat bekerja dengan cara menghambat sintesis mRNA pada proses transkripsi atau menghambat replikasi DNA pada proses pembelahan sel. e. Antimikroba yang menghambat metabolisme sel mikroba Sulfonamida merupakan salah satu jenis antimikroba yang memiliki kemampuan menggangu metabolisme sel mikroba. Sulfonamida merupakan analog dari asam para amino benzoat (PABA) yang merupakan zat penting dalam sintesa asam folat pada bakteri (mikroba). Kedua senyawa ini memiliki kemiripan struktur sehingga terjadi suatu kompetisi keduanya dalam sintesis asam folat. Apabila sulfonamida menang bersaing dengan PABA, maka akan terbentuk analog asam folat yang non fungsional yang mengakibatkan sintesis asam folat terhambat 16 sehingga pembentukan basa purin dan pirimidin pun juga akan terhambat. Karena hal tersebut, proses pertumbuhan bakteri akan terhenti dan menyebabkan kematian bakteri. Dari mekanisme kerja ini diperoleh efek bakteriostatik. 2.4.3 Uji Antimikroba Pada uji ini diukur respons pertumbuhan populasi mikroorganisme terhadap agen antimukroba. Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang efektif dan efisien (Pratiwi., 2008). Penentuan kepekaan kuman terhadap suatu obat adalah penentuan kadar obat terkecil yang dapat menghambat pertumbuhan kuman in vitro. Beberapa cara penentuan kepekaan kuman terhadap obat-obatan yang lazim digunakan diuraikan menjadi (Bonang, G. & E.S. Koeswondo., 1982) : a. Metode Difusi Pada metode ini, penentuan aktivitas didasarkan pada kemampuan difusi dari zat antimikroba dalam lempeng agar yang telah diinokulasi dengan mikroba uji. Pengamatan yang akan diperoleh adalah ada atau tidaknya zona hambatan (daerah bening yang tidak memperlihatkan adanya pertumbuhan bakteri) yang akan terbentuk di sekeliling zat antimikroba pada waktu tertentu masa inkubasi). Pada metode ini dapat dilakukan dengan 3 cara, yaitu : 1) Cara Cakram (disc) Cara ini adalah cara yang paling banyak digunakan untuk menentukan kepekaan kuman terhadap berbagai macam obat-obatan. Pada cara ini, digunakan suatu cakram kertas saring (paper disc) yang berfungsi sebagai tempat menampung zat antimikroba. Kertas saring yang mengandung zat antimikroba tersebut diletakkan 17 pada lempeng agar yang telah diinokulasi dengan mikroba uji, kemudian diinkubasi pada waktu tertentu dan suhu tertentu, sesuai dengan kondisi optimum dari mikroba uji. Biasanya, hasil dibaca setelah inkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37o C. Hasil pengamatan yang akan diperoleh adalah ada atau tidaknya daerah bening yang terbentuk di sekeliling kertas cakram yang menunjukkan zona hambatan pertumbuhan bakteri. Hambatan akan terlihat sebagai daerah yang tidak memperlihatkan adanya pertumbuhan kuman di sekitar cakram. Semakin besar zona hambatan yang ditunjukkan, semakin besar pula kemampuan aktivitas zat antimikroba, dan lebar daerah hambatan ini juga tergantung kepada daya resap obat kedalam agar. 2) Cara Parit (ditch) Suatu lempeng agar yang telah dinokulasi dengan bakteri uji dibuat sebidang parit. Parit tersebuut diisi dengan zat antimikroba, kemudian diinkubasi pada waktu dan suhu optimum yang sesuai untuk mikroba uji. Hasil pengamatan yang diperoleh adalah ada atau tidaknya zona hambatan yang terbentuk di sekitar parit. Analog dengan cara cakram, besarnya zona hambatan dari zat antimikroba yang diujikan. 3) Cara Lubang (hole/cup) Pada lempeng agar yang telah diinokulasi dengan bakteri uji dibuat suatu lubang yang selanjutnya diisi dengan zat antimikroba uji. Cara ini dapat diganti dengan meletakkan cawan porselin kecil yang biasa disebut fish spines di atas medium agar. Kemudian cawan-cawan tersebut diisi dengan zat uji. Setelah diinkubasi pada suhu dan waktu optimum yang sesuai untuk mikroba uji, dilakukan 18 pengamatan dengan melihat ada atau tidaknya zona hambatan di sekeliling lubang atau cawan. b. Metode Dilusi Metode ini dilakukan dengan mencampurkan zat antimikroba dan media agar, yang kemudian diinokulasi dengan mikroba uji. Hasil pengamatan yang akan diperoleh adalah tumbuh atau tidaknya mikroba di dalam media. Aktivitas zat antimikroba ditentukan dengan melihat konsentrasi hambat minimum (KHM), yang merupakan konsentrasi terkecil dari zat antimikroba uji yang masih memberikan efek penghambatan terhadap pertumbuhan mikroba uji. Pada metode ini dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu : 1) Cara penipisan lempeng agar. Dengan cara ini, zat antimikroba yang akan diuji aktivitasnya diencerkan sehingga diperoleh suatu larutan stock yang mengandung 100 µg/ml zat uji. Kemudian dari larutan stock tersebut dibuat suatu larutan seri uji dengan metode pengenceran kelipatan dua dalam media agar yang masih cair (suhu 450C - 500C), kemudian dituangkan ke dalam cawan petri. Bakteri uji diinokulasikan setelah campuran media agar dan zat uji membeku dan kering, dan diinkubasi pada kondisi optimum (waktu dan suhu) dari bakteri uji. Aktivitas zat uji ditentukan sebagai konsentrasi hambatan minimum (KHM), yaitu konsentrasi terkecil dari zat antimikroba uji yang masih dapat memberikan efek penghambatan terhadap pertumbuhan mikroba uji. 2) Cara pengenceran tabung. Prinsip dari cara ini adalah penghambatan pertumbuhan mikroba dalam pembenihan cair oleh suatu zat antimikroba yang dicampur ke dalam pembenihan. 19 Dibuat suatu seri larutan zat uji dengan konsentrasi tertentu dengan cara pengenceran kelipatan dua dalam media cair, kemudian diinokulasi dengan mikroba uji dan diinkubasikan (waktu dan suhu) sesuai kondisi optimum dari mikroba uji. Aktivitas zat antimikroba ditentukan sebagai konsentrasi hambatan minimum (KHM), yang merupakan pengenceran tertinggi dari seri zat antimikroba uji yang tidak menunjukkan adanya pertumbuhan mikroba. 2.5 Bakteri Uji Pada penelitian ini digunakan 5 spesies bakteri gram negatif bersifat patogen bagi manusia, yaitu Escherichia coli, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris dan Proteus mirabilis. Escherecia coli Karsinah, Lucky H.M et al., 1993, bahwa klasifikasi dari bakteri ini adalah sebagai berikut : Dunia : Procaryotae Divisio : Bacteria Kelas : Schizomycetes Ordo : Eubacteriales Famili : Enterobacteriaceae Genus : Escherichia Species : Escherichia coli Bakteri ini adalah bakteri yang banyak ditemukan di dalam usus besar manusia sebagai flora normal. Sifatnya unik karena dapat menyebabkan infeksi primer pada usus misalnya diare pada anak. Secara morfologis, bakteri ini berbentuk batang pendek (kokobasil), selnya berukuran antara 0,4-0,7 µm x 1,4 µm, dan termasuk golongan bakteri Gram negatif. Escherichia coli tidak membentuk spora, tidak tahan asam. Bakteri ini 20 dapat tumbuh secara anaerob fakultatif. Nilai pH optimum untuk pertumbuhannya adalah 7,0 – 7,5 serta kisaran suhu pertumbuhannya 100C – 400C dengan suhu optimum 370C. Escherichia coli sangat tidak sensitif terhadap panas. Pada manusia, Escherichia coli O157:H7, bisa juga menyebabkan radang usus besar. Pada proses pencernaan sedikitnya 10 organisme yang cukup dapat menyebabkan infeksi/peradangan (Campbel, G.R. et al., 2001). Shigella flexneri Kuman ini berbentuk batang, ukuran 0,5 – 0,7 µm x 2 – 3 µm. Fisiologi bakteri ini adalah sifat pertumbuhannya aerob dan fakultatif anaerob, pH pertumbuhannya 6,4 – 7,8 suhu pertumbuhan optimum 37o C. Sifat koloni kuman ini adalah halus, kecil, tidak berwarna. Daya tahan kuman ini adalah 2 bulan dalam es. Toleran terhadap suhu rendah dan kelembaban cukup. Kuman akan mati pada suhu 55o C. Pseudomonas aeruginosa Kuman ini dapat menyebabkan infeksi pada saluran pernapasan bagian bawah, saluran kemih, mata dan lain – lainnya. Morfologi dari kuman ini adalah batang negatif Gram 0,5 – 1,0 x 3,0 – 4,0 µm. Kuman ini menyenangi hidup di tempat yang lembab seperti pada peralatan pernapasan, air dingin, lantai, kamar mandi, tempat air dan lain – lainnya. Suhu pertumbuhan optimumnya adalah 35o C, tetapi juga dapat tumbuh pada suhu 42o C. Proteus vulgaris 21 Familia : Enterobacteriaceae Genus : Proteus Merupakan bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek, anaerobik fakulatif dengan panjang 2-3 µm. Bakteri ini ditemukan pada feses, limbah dan tanah. Proteus mirabilis Familia : Enterobacteriaceae Genus : Proteus Proteus mirabilis merupakan bakteri gram negatif yang yang dapat hidup secara anaerobik fakultatif dan dapat menyebabkan infeksi pada saluran kemih (Himps et al., 2008). 2.6 Metode Ekstraksi Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein dan lain-lain. Senyawa aktif yang terdapat pada berbagai simplisia dapat digolongkan kedalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid dan lain-lain (Depkes RI, 2000). 22 Ada beberapa metode yang umum digunakan untuk ekstraksi yaitu (Sampurno., 2000) : a. Ekstraksi Dengan Menggunakan Pelarut 1). Cara Dingin Maserasi Yaitu proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (kamar). Cara ini dapat menarik zat-zat berkhasiat yang tahan pemanasan maupun yang tidak tahan pemanasan. Perkolasi Adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna (exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan. Ekstraksi ini membutuhkan pelarut yang lebih banyak. 2). Cara Panas Refluks Adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama, yaitu 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna. Soxhlet Adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendinginan balik. 23 Digesti Adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinyu) pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50ºC. Infus Adalah sediaan cair yang dibuat dengan mengekstraksi simplisia nabati dengan air pada suhu 90ºC selama 15-20 menit. Dekok Adalah infus pada waktu yang lebih lama dan temperatur sampai titik didih air. b. Destilasi Uap Destilasi uap adalah ekstraksi senyawa kandungan menguap (minyak atsiri) dari bahan (segar atau simplisia) dengan uap air berdasarkan peristiwa tekanan parsial senyawa kandungan menguap dengan fase uap air dari ketel secara kontinu sampai sempurna dan diakhiri dengan kondensasi fase uap campuran (senyawa kandungan menguap ikut terdestilasi) menjadi destilat air bersama senyawa kandungan yang memisah sempurna atau memisah sebagian. Pada destilasi uap, simplisia benar-benar tidak tercelup ke air yang mendidih, namun dilewati uap air sehingga senyawa kandungan menguap ikut terdestilasi. 24 BAB III KERANGKA KONSEP Bahan Uji : Ekstrak air gambir kering (Uncaria gambier Roxb.) Pembuatan serbuk gambir H2O Etil asetat Fraksi etil asetat Fraksi air Isolasi (+)- katekin secara kromatogafi kolom Freeze dryer Uji aktivitas antibakteri Menentukan diameter hambat katekin dengan ekstrak air pada bakteri Analisis kebocoran logam AAS Menguji kebocoran membran sel bakteri Analisis kebocoran protein UV-Vis Menentukan KHM Menganalisis morfologi bakteri Menggunakan SEM Gambar 1. Diagram Alir Tahapan Penelitian 25 BAB IV METODOLOGI PENELITIAN 4.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini mulai dilakukan dari bulan Mei sampai dengan Agustus 2010 di Laboratorium Fitokimia, Bidang Botani, Puslit Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong. 4.2 Prinsip Penelitian Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstrak air gambir kering, hasil ekstraksi dari daun dan tanaman gambir (Uncaria gambier Roxb). Ekstrak air gambir yang akan diteliti ini berasal dari Payakumbuh, Sumatera barat. (+)- Katekin diisolasi dari gambir dan kemudian diuji aktivitas antibakterinya. Begitu juga dengan ekstrak air gambir yang akan dievaluasi aktivitas antibakterinya melawan bakteri gram negatif. a) Alat Alat yang digunakan adalah : Kolom d = 5 cm, blender (National), Spektrofotometer UV-Vis, hot plate, rotavapor, batang pengaduk, AAS (Atomic Absorption Spectrometer), Gelas ukur, SEM (Scanning Electron Microscope), jarum ose, autoklaf (Hirayama), pinset, inkubator (Heareus), vortex, Laminar Air Flow (Envair), spatel logam, lemari pendingin (Kelvinator), lampu spiritus, 26 pipet volume 1 mL, 2 mL, 5 mL, 25 mL, kertas saring, timbangan analitik (Sartorius), kapas, cawan petri diameter 6 cm dan 9 cm, alumunium foil, erlenmeyer 50 mL, 250 mL, 500 mL, tabung reaksi 10 mL dan 20 mL, shaker inkubator, freezedrier, cover slip, sentrifuge, paper disc. 4.3 Bahan Bahan yang digunakan meliputi : Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain gambir, katekin gambir, aquadest, medium NA, Silica gel 60 for cc, 63-200m, Silica gel 60 F254, 25 TLC, plates 20x20 cm, alkohol 70%, 80%, 96% , NaSO4, glutaraldehide, Agar Mueller-Hinton (MHA), Mueller-Hinton Broth (MHB), buffer fospat pH 7, buffer caccodilate 0.2 M pH 7,2, butanol, osmium tetraoksida, tannin acid 1 %, terbutanol, emas. 4.4 Mikroba uji Biakan bakteri Escherichia coli LIPI MC 0136, Pseudomonas aeruginosa LIPI MC 0103, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis dan Shigella flexneri (clinical isolat yang diperoleh dari microbiology UI). 27 4.5 Metode Penelitian 4.5.1 Persiapan Bahan, Media dan Alat a. Persiapan bahan uji 1. Sampel gambir Dalam penelitian ini, sampel yang digunakan adalah ekstrak getah dari tanaman gambir (Uncaria gambier Roxb.) yang sudah dicetak. Diperoleh dari kebun Payakumbuh, Sumatera Barat. 2. Persiapan Serbuk Bongkahan gambir dihaluskan menjadi bentuk serbuk. 3. Fraksinasi Ekstrak Air Gambir Bongkahan gambir ditumbuk halus hingga menjadi serbuk. 500 gr serbuk gambir dilarutkan dengan air panas sebanyak 1 lt. Setelah didilarutkan, hasil rendaman yang diperoleh dipisahkan (filtrasi) dengan kertas saring sehingga menghasilkan filtrate. 250 ml fraksi air yang diperoleh di freeze drying yang kemudian akan diujikan aktivitas antibakterinya dan 250 ml lainnya akan di fraksi dengan etil asetat. Fraksinasi dengan etil asetat dilakukan berulang hingga diperoleh filtrat yang bening. Setelah diperoleh fraksi etil asetat, filtrat dipekatkan dengan rotary vacuum evaporator, ekstrak tersebut yang kemudian diisolasi dengan kromatografi kolom hingga diperoleh (+)katekin, untuk kemudian diujikan aktivitas antibakterinya. 28 4. Isolasi (+)- Katekin dengan Kromatografi Kolom Fraksi etil asetat ditimbang sebanyak 1,5 gr dan silika gel ditimbang sebanyak 150 gr. Sebelum digunakan, silika gel dikeringkan dalam oven pada suhu 100o C selama 30 menit untuk menghilangkan kadar airnya. Kloroform : metanol (4:1) dalam 2 lt (1600:400) ml disiapkan. Kemudian, silika gel disuspensikan dengan kloroform : metanol (4:1), lalu dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mampat, eluen dibiarkan mengalir hingga batas adsorben, lalu kran ditutup dan ekstrak kental gambir dimasukkan dimana sebelumnya telah dilarutkan dalam eluen hingga diperoleh kelarutan yang spesifik. Sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit, lalu kran dibuka dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi. Fraksi-fraksi yang didapat kemudian diuji menggunakan KLT untuk analisis (+)- katekin. Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak yang sekecil dan sesempit mungkin. Setelah penotolan, lalu plat KLT dimasukkan kedalam chamber yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan uap kloroform : metanol (3:1), tepi bagian bawah lempeng lapis 29 tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan ke dalam fase gerak kurang dari 0,5-1 cm. Setelah itu akan terjadi bercak pemisahan yang kemudian spot yang terbentuk dibandingkan dengan (+)katekin standar. Bercak pemisahan pada kromatografi lapis tipis umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Sehingga, perlu disemprotkan dengan vanilin 10% dalam H2SO4 pekat agar spot menjadi lebih jelas. b. Sterilisasi Alat dan Bahan Seluruh alat yang akan digunakan dicuci bersih, dikeringkan dan disterilkan terlebih dahulu. Tabung reaksi, gelas ukur dan erlenmeyer ditutup mulutnya dengan kapas. Cawan petri dibungkus dengan kertas. Kemudian semuanya dimasukkan dalam plastik tahan panas dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121ºC, selama 30 menit. Jarum ose disterilkan dengan cara flambir pada nyala bunsen. Laminar Air Flow disterilkan dengan lampu UV dan disemprotkan dengan alkohol 70%. Sterilisasi Laminar ini dilakukan sebelum dan sesudah bekerja didalamnya. c. Pembuatan Medium 1. Nutrien Agar (NA) Agar 15,0 gm Gelatin peptone 5,0 gm 30 Beef extract 3,0 gm Pada pembiakan bakteri media yang digunakan Nutient agar (NA). Serbuk NA sebanyak 24 gram dilarutkan dalam 1 liter aquades dan dipanaskan sampai mendidih sehingga semuanya larut. Lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit. Setelah agak dingin dapat disimpan dalam lemari pendingin dan dapat digunakan jika diperlukan dengan memanaskannya kembali dalam water bath. 2. Mueller Hinton Agar (MHA) Beef extract powder 2,0 gm Acid digest of casein 17,5 gm Starch 1,5 gm Agar 1,7 gm Medium Mueller Hinton Agar digunakan untuk penentuan diameter zona hambat dengan cara difusi. Serbuk sebanyak 38 gram dilarutkan dalam aquadest sebanyak 1 liter dan dipanaskan sampai mendidih sehingga larut. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit. Setelah agak dingin larutan MHA dapat disimpan dalam lemari pendingin dan bila akan digunakan dapat dipanaskan kembali. 31 3. Mueller Hinton Broth (MHB) Casein acid hydrolysate 17,5 gm Beef extract 2,0 gm Starch 1,5 gm Pembuatan suspensi yang dilakukan digunakan Mueller Hinton Broth (MHB). Dibuat dengan cara mencampurkan 0.1 gram serbuk MHB dengan 5 ml aquadest dan dihomogenkan hingga seluruh serbuk larut dalam aquadest. Larutan MHB yang telah larut disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121ºC selama 30 menit. Setelah dingin dapat disimpan dalam lemari pendingin (Refrigerator) untuk digunakan kembali jika dibutuhkan. d. Pembuatan Kultur Kerja Stok bakteri gram negatif dalam agar miring nutrien diremajakan kembali pada MHA miring dengan menggunakan ose yang telah disterilkan dengan cara memijarkan pada api bunsen, kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. e. Pembuatan Suspensi Bakteri Kultur inokulum bakteri gram negatif yang telah diremajakan dengan umur 24 jam diambil satu ose yang telah dipijarkan lalu dimasukkan dalam tabung reaksi yang berisi 5 32 ml medium MHB dan kemudian divortex dan dikocok dalam shaker inkubator pada suhu 37ºC selama 18-24 jam. 4.5.2 Penentuan Diameter Hambat Penentuan diameter hambat dilakukan dengan cara : siapkan larutan uji ekstrak gambir dsn katekin masing – masing 7 mg/ml, larutan kontrol dan teteskan masing-masing konsentrasi sebanyak 10 μl pada kertas cakram steril. Kertas cakram steril diteteskan dengan larutan uji, kemudian diletakkan pada media tersebut dan diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Pengujian dilakukan dengan tiga kali ulangan (Peoloengan et al., 2006) dan diamati diameter hambat yang terbentuk. 4.5.3 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Penentuan KHM/MIC antibakteri dengan cara : sediakan larutan uji ekstrak (5 mg/ml – 25 mg/ml) dengan interval 2,5. Disiapkan petri dengan media agar (MHA). Lalu, dibuat 5 ml larutan yang berisi (MHA + aquades + ekstrak dengan konsentrasi masing - masing) untuk lapisan atasnya. Setelah agar mengeras, lapisan atas dituang ke media agar yang telah mengeras. Lalu, diteteskan ± 1 tetes 5 jenis suspensi bakteri uji. Lalu, diinkubasi dan diamati ada tidaknya pertumbuhan bakteri. 33 Dari prosedur tersebut dapat diketahui nilai KHM (+)katekin dan ekstrak air gambir. Nilai KHM dinyatakan dengan konsentrasi terkecil yang masih memberikan penghambatan pertumbuhan bakteri 100% dan ditandai dengan tidak adanya bakteri uji yang tumbuh. Hasil nilai konsentrasi KHM yang diperoleh kemudian digunakan sebagai konsentrasi untuk analisis senyawa protein, asam nukleat dan ion-ion logam pada kebocoran membran/dinding sel bakteri serta analisis morfologi membran/dinding sel bakteri. 4.5.4 Pengujian Kebocoran metabolit seluler (Chia et al 2000) Analisis kebocoran sel dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer dan pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 260 nm (untuk kandungan nitrogen dari asam nukleat) dan panjang gelombang 280 nm (untuk menentukan kandungan nitrogen dari protein). Suspensi bakteri uji umur 24 jam sebanyak 10 ml disentrifuse dengan kecepatan 3500 rpm selama 15-20 menit sehingga diperoleh endapan sel bakteri. Endapan sel bakteri tersebut selanjutnya dicuci dengan buffer phospat pH 7.0 dan diulang pencuciannya sebanyak 2 kali. Endapan sel tersebut kemudian disuspensikan kedalam 10 ml larutan buffer phospat pH 7.4, dikontakkan dengan ekstrak katekin pada konsentrasi 1 dan 2 KHM (b/v), diinkubasikan kembali dalam inkubator bergoyang 34 (150 rpm) selama 24 jam. Setelah inkubasi, suspensi bakteri tersebut disentrifuse dengan kecepatan 3500 rpm selam 15-20 menit sehingga diperoleh filtrat dan filtrat ini selanjutnya diukur absorbansinya dengan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. 4.5.5 Pengujian kebocoran ion-ion logam (Cox et al. 2000; Carson et al., 2002) Untuk analisa kebocoran ion-ion diukur dalam bentuk ion Ca2+ dan K+ yang keluar dari membran sel bakteri akibat perlakuan dengan ekstrak. Analisis kebocoran ion dilakukan pada pelet bakteri yang dipersiapkan seperti pada pengukuran kebocoran protein dan asam nukleat. Kebocoran dinyatakan dengan terukurnya ion-ion logam yang terdapat pada bakteri uji setelah dikontakkan dengan minyak atsiri pada konsentrasi 1 KHM dan 2 KHM. Kebocoran ion Ca2+ dan K+ dideteksi dengan menggunakan AAS (Atomic Absorption Spectrometre) Thermo Elemental tipe Solar MS. Larutan sel hasil kontak dengan ekstrak diambil untuk diukur kandungan ion-ionnya. 4.5.6 Pengamatan Morfologi Sel dengan SEM (Noor, 2001; Jeol, 1995) Suspensi bakteri uji (umur 24 jam) dikontakkan dengan ekstrak pada konsentrasi 1 KHM dan 2 KHM selama 24 jam. 35 Selanjutnya suspensi bakteri tersebut disentrifuse dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit, cairan dibuang untuk mendapatkan masa sel bakteri (pelet), kemudian pelet dicuci dengan buffer phospat sebanyak 2 kali. Pellet direndam dalam dengan glutaraldehid dan buffer caccodhilate selama 4 jam. Selanjutnya di sentrifuse dan sufernatan dibuang pellet direndam kembali dengan tannin acid 1% dalam buffer caccodhilate selama 12 jam selanjutnya disentrifuse supernatan dibuang dan pelet direndam dalam 2% larutan osmium tetraoksida selama 2-4 jam. Cuci dengan buffer cocodilate lalu disentrifuse dan pellet dicuci dengan ethanol 50% dingin biarkan 10 menit dan sentrifuse lagi 5 menit kemudian buang supernatan. Cuci lagi dengan etanol 50% 70% 80% 95% masing-masing selama 10 menit. Cuci dengan etanol absolute dan disentrifuse 5 menit sebanyak 2 kali dan cuci kembali dengan terbutanol 2 kali. Tambahkan sedikit terbutanol pada endapan sel. Oleskan apusan sel pada slip glas. Slip glas yang digunakan dicuci terlebih dahulu dengan etanol absolute. Slip glas yang telah diolesi dengan sel, dicoating dengan emas selama 1 jam dalam kondisi vakum. Amati dengan menggunakan Scanning Electron Microscope (seri JSM5310LV) 36 BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1. Hasil Bahan yang digunakan pada penelitian ini merupakan ekstrak gambir kering. Gambar 2. Ekstrak gambir kering Isolasi senyawa (+)- katekin dari hasil fraksinasi etil asetat dengan eluen kloroform : metanol (4:1) menghasilkan ekstrak kering sebanyak 70,44 gram. Dan identifikasi senyawa (+)- katekin dengan KLT menghasilkan 1 spot dengan nilai Rf sama seperti (+)- katekin standar. Gambar 3. Foto KLT Fraksi Kromatografi Kolom Hasil tampungan kromatografi kolom yang digabungkan yaitu : 910, 11-28, 29-40, 41-75. Setelah setiap fraksi digabungkan dan kemudian 37 dihilangkan pelarutnya kemudian dilakukan KLT lagi untuk memastikan, yang didapatkan hasil bahwa dari fraksi 9-40 merupakan senyawa (+)katekin. Dan menghasilkan 1,2079 gram dari jumlah cuplikan 1,5 gram. Dan persentase kadar (+)- katekin sebesar 22,54 %. Gambar 4. Foto KLT Fraksi Gabungan Kromatografi Kolom Dari hasil penelitian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa penentuan uji aktivitas gambir dan (+)- katekin pada konsentrasi 7 mg/ml menghasilkan diameter hambat terhadap bakteri uji, seperti yang terlihat pada table dibawah ini : Bakteri Gambir Shigella flexneri Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Proteus vulgaris Proteus mirabilis Tabel 1. 7 4 Diameter Daerah Hambat (mm) Kontrol – (+)(DMSO 10%) katekin 5 2 4 7 1 - 3 6 3 Kontrol – (Aseton) - Diameter hambat ekstrak air gambir dan (+)- katekin terhadap S. flexneri, P. aeruginosa LIPI MC 0103, E. coli LIPI MC 0136, P. vulgaris, P. mirabilis pada konsentrasi 7 mg/ml 38 Penentuan nilai KHM dari (+)- katekin dan gambir dilakukan pada konsentrasi 5 mg/ml – 25 mg/ml (b/v) dengan interval konsentrasi 2,5 mg/ml. Konsentrasi S.flexneri P.aeruginosa E.coli P.vulgaris P.mirabilis K G K Ekstrak (b/v) K G K G G K G 5 mg/ml √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ 7,5 mg/ml - √ √ √ √ √ √ √ √ √ 10 mg/ml - √ √ √ √ √ √ √ √ √ 12,5 mg/ml - √ √ √ √ √ √ √ √ √ 15 mg/ml - √ √ √ √ √ √ √ √ √ 17,5 mg/ml - √ √ √ √ √ √ √ √ √ 20 mg/ml - √ √ √ √ √ √ √ √ √ 22,5 mg/ml - √ √ √ - √ √ √ √ √ 25 mg/ml - √ √ √ - √ - √ - √ Keterangan : √ : Ada pertumbuhana bakteri : Tidak ada pertumbuhan bakteri K : (+)- katekin G : Ekstrak air gambir Tabel 2. Nilai KHM ekstrak air gambir dan (+)- katekin gambir terhadap bakteri Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis setelah dilakukan dengan metode makro dilusi Penentuan kebocoran dinding/membran sel bakteri dianalisis dengan cara mengukur absorbansi pada panjang gelombang 260 nm (asam nukleat) dan 280 nm (protein) serta mengukur kadar ion-ion logam (Ca2+dan 39 K+) pada larutan uji setelah dikontakkan dengan konsentrasi larutan uji 1 KHM dan 2 KHM. Hasil pengukurannya dapat kita lihat pada gambar 4 dibawah ini : Gambar 5. Grafik pengukuran senyawa metabolit seluler terhadap bakteri Shigella flexneri Gambar 6. Grafik kandungan ion-ion logam pada media kultur bakteri S. flexneri yang diperlakukan dengan 1 KHM dan 2 KHM (+)katekin 40 Pengamatan morfologi dinding/membran sel bakteri dilakukan dengan bantuan scanning electron microscope (SEM). Terlihat adanya perubahan pada dinding/membran bakteri setelah perlakuan pada konsentrasi 1 KHM dan 2 KHM. Hasilnya adalah sebagai berikut : Kontrol 1 KHM 2 KHM Gambar 7. Fotograf SEM sel S. flexneri yang diperlakukan dengan (+)- katekin. Perbesaran 15.000 x 5.2 Pembahasan Gambir (Uncaria gambier Roxb.) telah sejak lama digunakan sebagai campuran menyirih yang dipercaya dapat menguatkan gigi. Ekstrak gambir mengandung (+)- katekin sebagai komponen utama, yang berpotensi sebagai antibakteri (Lucida et al., 2007). Potensi dan aktivitas antibakteri gambir dan (+)- katekin dapat diketahui dengan melihat diameter hambat dan nilai KHM yang dihasilkan pada berbagai konsentrasi. 41 Dalam ekstrak produk gambir senyawa fenol total merupakan komponen terpenting terkait dengan sifat antibakterinya, sejauh ini (+)katekin telah dilaporkan sebagai salah satu senyawa fenolik utama pada ekstrak gambir (Pembayun et al., 2007). Isolasi (+)- katekin dilakukan dengan kromatografi kolom menggunakan pelarut kloroform : metanol (4:1) sebagai eluen. Fraksi – fraksi hasil kromatografi kolom kemudian di KLT kembali untuk memastikan bahwa fraksi yang diperoleh adalah benar (+)- katekin dengan cara membandingkan dengan (+)- katekin standar. Selanjutnya, fraksi dengan spot yang sama digabung dan diuapkan pelarutnya. Rendemen katekin yang diperoleh sebanyak 22,54 %. Hasil katekin yang diperoleh kemudian diujikan terhadap bakteri gram negatif. Uji sensitivitas antibakteri menggunakan Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa, Eschericia coli, Proteus vulgaris dan Proteus mirabilis dengan konsentrasi 7 mg/ml (Taguri et al., 2006), sedangkan untuk uji aktivitas antibakteri menggunakan konsentrasi 5 mg/ml – 25 mg/ml. Pada tabel 1, terlihat bahwa bakteri S. flexneri dan P. vulgaris merupakan bakteri yang sensitif terhadap gambir dan katekin. Berdasarkan uji sensitifitas terhadap kelima jenis bakteri uji dengan metode difusi cakram, diketahui bahwa diameter hambat yang dihasilkan S. flexneri dan P. vulgaris pada gambir adalah 7 mm, sedangkan pada katekin adalah 5 mm dan 6 mm. Diameter daerah hambat ini lebih besar dibandingkan dengan P. aeruginosa, E. coli, P. mirabilis. Terbukti pada penelitian yang dilakukan Voravunthikunchai et al (2004) bahwa ekstrak dari Uncaria 42 gambier menghasilkan zona hambat terhadap semua strain dari Escherichia coli O157:H7. Dan perbedaan besarnya daerah hambat ini menunjukkan bahwa setiap bakteri memiliki sensitivitas yang berbeda, semakin sensitif bakteri uji maka semakin besar diameter hambat yang dihasilkan. Ukuran zona hambat dipengaruhi oleh sensitivitas organisme, kultur media, kondisi inkubasi, konsentrasi zat antimikroba pada kertas cakram (Lorian, 1980). Zat yang menghasilkan zona hambat lebih besar tidak pasti lebih aktif dari zat yang menghasilkan zona yang lebih kecil (Brock, 1973). Pemberian (+)- katekin dan ekstrak air gambir dengan konsentrasi 5 mg/ml; 7,5 mg/ml; 10 mg/ml; 12,5 mg/ml; 15 mg/ml; 17,5 mg/ml; 20 mg/ml; 22,5 mg/ml dan 25 mg/ml sangat mempengaruhi aktivitas pertumbuhan bakteri uji yang dapat dilihat pada tabel 2. Hasil pada tabel 2 menunjukkan bahwa gambir pada konsentrasi 5 mg/ml – 25 mg/ml belum dapat menghambat pertumbuhan bakteri, sedangkan (+)- katekin pada konsentrasi 7,5 mg/ml dapat menghambat pertumbuhan Shigella flexneri. Untuk Eschericia coli mulai terhambat pertumbuhannya pada konsentrasi 22,5 mg/ml, Proteus vulgaris dan Proteus mirabilis pada konsentrasi 25 mg/ml, sedangkan Pseudomonas aeruginosa masih terjadi pertumbuhan. Golongan fenol dapat menghambat antibakteri karena adanya gugus OH (Cowan, 1999). Golongan fenol yang terdapat dalam gambir adalah katekin dan tanin. Dan dari hasil penelitian yang dilakukan oleh Taguri et al (2006), aktivitas antibakteri terhadap katekin pada Shigella flexneri memiliki nilai KHM untuk (+)- katekin sebesar 1333 µg/ml, Pseudomonas 43 aeruginosa adalah 1333 µg/ml, Eschericia coli 2667 µg/ml, Proteus vulgaris 667 µg/ml dan Proteus mirabilis adalah 1333 µg/ml, hal ini diduga bahwa bakteri yang diisolasi dari sumber dan daerah yang berbeda memiliki sensitivitas dan aktivitas yang berbeda pula, dan metode pengujian yang juga berbeda. Pada konsentrasi 5 mg/ml semua bakteri baik pada gambir maupun katekin masih dapat tumbuh, sehingga metode mikro dilusi diganti pada metode makro dilusi, selain ekstrak yang dihasilkan berwarna merah sehingga tidak dapat diidentifikasi dengan penambahan INT (Iodonitro Tetrazolium). Pada metode makro dilusi, aktivitas antibakteri dapat dilihat dari jenis bakteri yang tumbuh ataupun tidak tumbuh. Bakteri yang memiliki nilai konsentrasi hambat terendah pada ekstrak inilah yang digunakan untuk penelitian tahap selanjutnya. Kebocoran membran/dinding sel bakteri dapat diketahui dengan menganalisis keberadaan protein dan asam nukleat serta ion-ion logam seperti Ca2+ dan K+. Terjadinya kebocoran metabolit seluler dari bakteri karena penambahan (+)- katekin ini diukur dengan spektrofotometer UVVis dan ditandai dengan adanya peningkatan nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm untuk asam nukleat dan peningkatan nilai absorbansi pada panjang gelombang 280 nm untuk protein (Miksusanti et al, 2008). Sedangkan untuk mengetahui terjadinya kebocoran ion logam dapat diukur dengan AAS. Pada gambar 5, terlihat bahwa dinding/membran sel bakteri mengalami kebocoran dengan adanya asam nukleat dan protein pada larutan media kultur bakteri uji yang dideteksi dengan UV-Vis pada 44 panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Dari gambar 5, dapat diketahui bahwa pemberian (+)- katekin pada konsentrasi 1 KHM menyebabkan terjadinya kebocoran sel yang menyebabkan terjadinya peningkatan absorbansi untuk asam nukleat (260 nm). Pada konsentrasi 1 KHM absorbansinya mengalami peningkatan dari 0.283 menjadi 0.742 dan pada konsentrasi 2 KHM terjadi peningkatan absorbansi sekitar 3 kali lipat menjadi 0.761 bila dibandingkan dengan kontrol. Peningkatan absorbansi pada panjang gelombang 260 nm sejalan dengan peningkatan absorbansi untuk protein yaitu pada panjang gelombang 280 nm (gambar 5). Bila dibandingkan dengan peningkatan absorbansi untuk asam nukleat maka peningkatan untuk protein (280 nm) lebih tinggi. Pada panjang gelombang 280 nm, absorbansi konsentrasi 1 KHM mengalami peningkatan dari 0.260 menjadi 1.651 dan pada konsentrasi 2 KHM terjadi peningkatan sekitar 8 kali lipat menjadi 2.087 bila dibandingkan dengan kontrol. Menurut Davidson dan Branen (1999), senyawa fenol akan bereaksi dengan membran sitoplasma dan dapat meningkatkan permeabilitas membran. Penghambatan pertumbuhan bakteri diduga berhubungan dengan struktur sel bakteri (Ultee et al., 2002). Dan adanya kerusakan membran akan mengakibatkan keluarnya komponen-komponen intraseluler seperti asam-asam amino dan bahan-bahan lain yang terserap pada panjang gelombang 260 nm, seperti asam nukleat serta protein (Maillard., 2002). Asam nukleat dapat mengabsorpsi sinar UV pada panjang gelombang 260 nm karena adanya basa nitrogen yang bersifat 45 aromatik, sedangkan fosfat dan gula tidak memberikan kontribusi dalam absorpsi UV (Stansfield et al., 2006). Tidak jauh berbeda dengan pengukuran metabolit seluler yaitu asam nukleat dan protein, pengukuran ion-ion logam (Ca2+ dan K+) yang ditunjukkan pada (gambar 6) juga menunjukkan peningkatan seiring dengan meningkatnya konsentrasi KHM larutan uji/ekstrak. Pada gambar 6, terjadi peningkatan kadar ion Ca2+ dari 4.21 ppm – 5.89 ppm dan kadar ion K+ dari 52.3 ppm – 100.6 ppm. Meningkatnya ion-ion Ca2+ dan K+ yang dikeluarkan oleh sel-sel bakteri uji menunjukkan bahwa telah terjadi kerusakan pada bagian dinding sel dan membran sitoplasma. Untuk mempertahankan diri, pada umumnya membran sel mempunyai lapisan lipid. Dari hasil penelitian yang dilakukan oleh Seok et al (1999), bakteri Lactobacillus sp pada kondisi lingkungan yang sangat asam akan menyebabkan komponen utama dari membran sel bakteri tersebut mengalami kerusakan dan akibatnya komponen-komponen intraseluler seperti Ca2+, Mg2+, K+ dan lipid akan dikeluarkan. Indikasi adanya kerusakan membran sitoplasma adalah terjadinya kebocoran kandungan sitoplasma K+ dan peningkatan kandungan K+ yang dilepaskan merupakan tanda kerusakan permeabilitas membran (Cox et al., 2001). Ca2+ dan Mg2+ berfungsi untuk menjaga kestabilan membran bakteri dan dengan adanya kebocoran ion-ion tersebut maka kestabilan membran akan terganggu yang selanjutnya akan mengakibatkan kematian bakteri. Seperti yang terjadi pada kebocoran sel , makin tinggi konsentrasi KHM ekstrak yang digunakan maka morfologi sel bakteri uji juga semakin 46 mengalami perubahan dibandingkan sel normal. Kerusakan morfologi sel bakteri diamati dengan SEM dengan perbesaran 15.000 kali. Dengan perlakuan ekstrak 1 KHM permukaan sel bakteri menjadi kasar dan tidak rata serta agak memanjang dan dengan perlakuan 2 KHM permukaan sel menjadi semakin kasar dan bagian pinggir dinding sel menjadi bergerigi (gambar 7). S. flexneri dalam keadaan normal berbentuk batang, Koloni kuman ini adalah halus, kecil, permukaan yang licin dan rata. 47 BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN 6.1. Kesimpulan Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil beberapa kesimpulan sebagai berikut : a. Kandungan (+)- katekin pada gambir 22,54 % b. (+)- Katekin memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Shigella flexneri, dimana nilai konsentrasi hambat minimum (KHM) adalah 7,5 mg/ml (b/v). c. (+)- Katekin memiliki mekanisme penghambatan antibakteri dengan merusak dinding/membran sel bakteri Shigella flexneri. d. Ekstrak air gambir tidak memiliki aktivitas dan mekanisme penghambatan antibakteri terhadap Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa, Eschericia coli, Proteus vulgaris dan Proteus mirabilis. 6.2. Saran Dari hasil penelitian yang telah diperoleh menunjukkan bahwa (+)katekin dan ekstrak air gambir tidak berpotensi sebagai antibakteri. Antibiotik yang boleh digunakan adalah pada konsentrasi < 8 µg dan bersifat resisten pada konsentrasi > 64 µg. Maka disarankan untuk melakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan bakteri jenis lain yang berpotensi dapat 48 menimbulkan penyakit pada manusia dan diharapkan bahan uji berpotensi sebagai antibakteri terhadap bakteri jenis lain tersebut. DAFTAR PUSTAKA Assani, S. 1993. Ultrastruktur, Morfologi dan Pewarnaan Kuman dalam buku Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Jakarta : Binarupa Aksara Bonang, S dan E.S, Koeswandono. 1982. Mikrobiologi Kedokteran Untuk Laboratorium dan Klinik. Jakarta : Gramedia BPOM RI. 2007. Acuan Sediaan Herbal Volume ketiga Edisi Pertama. Jakarta : Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan. Brock, T. D. 1973. Basic Microbiology With Applications. London: Prentice-Hall International, Inc: 72-73, 89-92. Campbel, G.R., J. Prosser., A. Glover., and K. Killham. 2001. Detection of Escherichia coli in Soil and Water using Multiplex PCR. Journal of Applied Microbiology. 91, 1004-1010 Carson C.F., Brian J.M and Riley T.V. 2002. Mechanism of Action of Tea Tree Oil on Staphylococcus aureus Determined by Time Kill, Lyses, Leakage, and Salt Tolerance Assays and Electron Microscopy. Antimicrobial Agent and Chemotherapy 6 : 1914-1920 Chatim, A dan Suharto. 1993. Sterilisasi dan Disinfeksi dalam buku Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Jakarta : Binarupa Aksara Chia M. L., J. K. Preston dan C. I. Wei. 2000. Antibacterial Mechanism of Allyl Isothiocyanate. J. of Food Protection 63 (6): 727- 734. Cox S.D., Mann C.M., Markham J.L., Bell H.C., Gustafson J.E., Warmington J.R and Wyllie S.G. 2000. The Mode of Antibacterial Action of The Essential Oil of Melaleuca Alternifolia (Tea Tree Oil). Journal of Apply Microbiology 88 : 170-175 49 Cox S. D, Cindy M. Mann, Julie L. Markham, John E. Gustafson, John R. Warmington and S. Grant Wyllie. 2001. Determining the Antimicrobial action of Tea Tree Oil. Molecules (6) : 87-91. Cowan M. Murphy. 1999. Plants Product as Antimicrobial Agents. Journal Microbiology Review. 12 (4) : 564-582 Dalimarta, S. 2003. Atlas Tanaman Obat Indonesia Jilid 3. Jakarta : Puspaswara, Anggota Ikapi. Davidson. P. M. dan A. L. Branen. 1993. Antimicrobial In Food (2nd). Marcel Dekker, Inc. New York. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta:13-21. Dhalimi, A. 2006. Permasalahan Gambir (Uncaria gambir L.) di Sumatera Barat dan Alternatif Pemecahannya. Perspektif Volume 5 Nomor 1. Juni : 46-59 Djauhariya dan Hernani. 2004. Gulma Berkhasiat Obat. Jakarta : Penebar Swadaya Evans, W.C. 2002. Trease and Evans Pharmacognosy 15th Edition. Nottingham, U.K : W.B. Saunders Haryanto, S. 2009. Ensiklopedia Tanaman Obat Indonesia. Yogya : Palmall Himpsl, S. D., C. Virginia.L., J. Richard. H., David. E. J., dan Harry L.T.M. 2008. Identification of Virulence Determinants in Uropathogenic Proteus mirabilis Using Signatur-Tagged Mutagenesis. Journal of Medical Microbiology 57(2008), 1068-1078. Idris, H. 2007. Pemakaian Fungisida Gambir Terhadap Penyakit Bercak Fusarium sp pada Daun Serai Wangi. Jurnal Ilmu-ilmu Pertanian Indonesia Edisi Khusus No 3 Hal 379-385 Jamsari., Yaswendri dan M. Kasim. 2007. Fenologi Perkembangan Bunga dan Buah Spesies Uncaria gambir. Biodiversitas Volume 8 No 2, Hal 141-146 50 Jeol. 1995. Specimen Preparation Method for Scanning Electron Microscope. JEOL Application Note. Tokyo. Karsinah, L.H.M., Suharto dan Mardiastuti H.W. 1993. Batang Negatif Gram dalam buku Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Jakarta : Binarupa Aksara Kresnawaty, I dan A. Zainuddin. 2009. Aktivitas Antioksidan dan Bakteri dari Derivat Metil Ekstrak Etanol Daun Gambir (Uncaria Gambir). Jurnal Litri 15(4) Hal.145-151 Lorian, V. 1980. Antibiotics Laboratory Medicine. Baltimore : The Williams & Wilkins Company: 17, 121-122. Lucida, H., A. Bakhtiar dan Wina A.P. 2007. Formulasi Sediaan Antiseptik Mulut dari Katekin Gambir. Jurnal Sains Teknologi Farmasi 12(1) Maillard J. J. 2002. Bacterial Target sites for Biocide Action. J. of Applied Microbiology Symposium Supplement (92): 16 S- 27 S. Mardisiswojo, S dan H. Rajakmangunsudarso. 1968. Cabe Puyang Warisan Nenek Moyang Cetakan ke 2. Jakarta : Depkes RI Miksusanti., Betty, S. L. J., Bambang, P., dan Gatot, T. 2008. Kerusakan Dinding Sel Escherichia coli K1.1 Oleh Minyak Atsiri Temu Kunci (Kaempferia pandurata). Berita Biologi 9 (1). Misra, M. 2009. The key to medicinal plants research revolves around the detection, isolation, and characterisation of antioxidants as therapeutic agents. Journal of Medicinal Plants Research Vol. 3(10). Noor R. R. 2001. Scanning Electron Microscope. Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak. Fakultas Peternakan IPB, Bogor. Peoloengan, M., Chairul., I. Komala., S. Salmah dan Susan. 2006. Aktivitas Antimikroba dan Fitokimia dari Beberapa Tanaman Obat. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner Pembayun, R., Murdijati. G., Slamet. S dan Kapti R. K. 2007. Kandungan Fenol dan Sifat Antibakteri dari Berbagai Jenis Ekstrak Produk Gambir (Uncaria gambir). Majalah Farmasi Indonesia 18(3) Hal 141-146. 51 Pratiwi, S. T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga. Sampurno. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta : Departemen Kesehatan RI Setiabudy, R dan Vincent H.S. Gen. 1995. Pengantar Antimikroba dalam buku Farmakologi dan Terapi Edisi 4. Jakarta : Bagian Farmakologi FKUI Sirait, M., E. Loho., R. B. Sutrisno., S. Prawirosujanto., M. B. Lesmono., B. Poerwodhiredjo., B. Dzulkarnain., B. Wahyudi., Abisono dan A. Hidir. 1989. Materia Medika Indonesia. Jakarta : Dirjen POM. Soesilo, S., Andajaningsih., Richard. P., Tjartim. H dan Lucky. S. S. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta : Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan. Stansfield W. D., Colome J. S. Cano R. J. 2006. Biologi Molekuler dan Sel, Moleculer and Cell Biology. Alih Bahasa: Varian Fahmi. Jakarta: Erlangga:23 Taguri, T., Takashi. T., dan Isao.k., 2006. Antibacterial Spectrum of Plant Polyphenols and Extracts Depending upon Hydroxyphenil Structure., Biol. Pharm. Bull. 29 (11) 2226-2235 Ultee A., M. H. J. Bennik dan R. Moezelaar. 2002. The Phenolic Hydroxyl Group of Carvacrol is Essential for Action against the Food-Borne Pathogen Bacillus cereus. J. Applied and Environmental Microbiology 68 (4) : 15611568. Utami, P., Novi. W., Nina. W., Dewi. D., Agung. S., Tinton D. P., Hadi. I., Lukito. A.M., Ug’t dan Iwan’S. 2008. Buku Pintar Tanaman Obat 431 Jenis Tanaman Penggempur Aneka Penyakit. Jakarta : PT. Agromedia Pustaka Voravuthikunchai, S., Amornrat. L., Wanpen. J., Trechada. S., Souwalak. P and Thanomjit. S. 2004. Effective Medicinal Plants Againts Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Journal of Ethnopharmacology 94 Hal 49-54 Wilhelm, A. 2008. Photochemistry of (+)- Catechin and (-)- Epicatechin. Bloemfontein : Department of Chemistry. 52 Lampiran 1. Skema pembuatan ekstrak gambir (Uncaria gambier Roxb.). Gambir Diserbuk Diekstraksi dengan cara maserasi Filtrat dipekatkan dengan vakum Filtrat disaring evaporator Dibekukan dan dimasukkan dalam freeze drying selama 1-2 hari Didapat ekstrak air gambir Dibuat berbagai konsentrasi 53 Lampiran 2. Skema isolasi katekin dari gambir dengan kromatografi kolom Gambir Serbuk gambir Ekstraksi dengan etil asetat Sebagian ekstrak di KLT, untuk mengetahui perbandingan pelarut, lalu diisolasi dengan kolom Hasil fraksinasi ditampung dan dievaporasi Hasil evap di KLT kembali dan dibandingkan dengn standar katekin Didapat (+)- katekin Dibuat berbagai konsentrasi 54 Lampiran 3. Skema pembuatan suspensi bakteri Bakteri uji yang telah diremajakan 24 jam Bakteri diambil satu ose, dengan ose yang telah disterilkan Dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 5 ml MHB steril Diinkubasi shaker selama 24 jam Suhu 37º C Suspensi bakteri digunakan untuk uji difusi cakram Suspensi bakteri diencerkan hingga diperoleh 105 sel bakteri/ml Jumlah bakteri dihitung dengan metode cawan hitung Suspensi bakteri digunakan untuk penentuan KHM 55 Lampiran 4. Skema kerja penentuan diameter hambat dengan metode difusi cakram Media Mueller Hinton Agar Dituang ke cawan petri dan dibiarkan membeku Diinokulasi dengan 1 ml suspensi bakteri Didiamkan sesaat Diletakkan kertas cakram yang telah dijenuhkan lar uji dan kontrol negatif Diinkubasi pada suhu 370 C, 24 jam Diukur diameter hambat yang terbentuk 56 Lampiran 5. Skema kerja penentuan KHM/MIC Media MHA, dituang ke masing – masing petri (petri telah dibagi 5 bagian untuk suspensi bakteri). Setelah mengeras lalu dituang larutan yang berisi sampel di atasnya Setiap erlenmeyer berisi larutan 5ml (MHA + aquades + ekstrak) yang dituang keatas media MHA Setelah mengeras, diteteskan ± 1 tetes suspensi bakteri S. flexneri, P. aeruginosa, E.coli, P. vulgaris dan P. mirabilis dimasing-masing bagian pada petri. Diinkubasi selama 24 jam, pada suhu 37o C Diamati pertumbuhan bakterinya Jika tidak terdapat koloni bakteri, diperoleh KHM 57 Lampiran 6. Skema analisis kebocoran dinding/membran sel bakteri 10 ml suspensi bakteri Disentrifuse 15 menit, 3500 rpm Pellet dicuci dengan buffer fosfat, 2 kali Disuspensikan dalam 9 ml buffer fosfat Ditambahkan 1 ml larutan uji 1 KHM & 2 KHM Diinkubasi shaker 24 jam Suhu 37 ºC Disentrifuse selama 15 menit, 3500 rpm Disaring dan cairan supernatan diambil Diukur kadar ion K+ dan Ca2+ dengan AAS 58 Diukur absorban λ 260 nm dan 280 nm dengan spektro UV Lampiran 7. Skema pengamatan morfologi sel bakteri Pellet direndam dengan glutaraldehid dan buffer cocodhilate selama 4 jam. Selanjutnya di sentrifuse dan sufernatan dibuang. Pellet direndam kembali dengan tannin acid 1 % dalam buffer caccodhilate selama 12 jam Disentrifuse & supernatan dibuang dan pelet direndam dalam 2 % larutan osmium tetraoksida selama 2-4 jam. Dicuci dengan buffer caccodhilate lalu disentrifuse dan pellet dicuci dengan ethanol 50% dingin Dibiarkan 10 menit dan sentrifuse lagi 5 menit lalu supernatan dibuang. Dicuci lagi dengan etanol 50%,70%, 80%, 95% masing-masing selama 10 menit. Dicuci dengan ethanol absolute dan disentrifuse 5 menit sebanyak 2 kali & dicuci kembali dengan terbutanol 2 kali. 59 Ditambahkan sedikit terbutanol pada endapan sel. Dioleskan apusan sel pada slip glas Dicoating dengan emasmetode selama makro 1 jam dilusi Lampiran 8. Perhitungan konsentrasi dengan dalam kondisi vakum. Diamati dengan menggunakan mikroskop electron JSM-5310LV) Konsentrasi gambir maupun katekin(seri adalah 5 mg/ml; 7,5 mg/ml; 10 mg/ml; 12,5 mg/ml; 15 mg/ml; 17,5 mg/ml; 20 mg/ml; 22,5 mg/ml; 25 mg/ml Larutan Induk : 25 mg/ml x 5 = 125 mg/ml = 125 µg/µl = 0,125 mg/µl Perhitungan masing-masing konsentrasi : 1. 25 x 5 = 1000 µl = 1 ml 0,125 Maka, x MHA + (5000 – 1000) = 1000 µl ekstrak = 4000 µl aquades 2. 22,5 x 5 = 900 µl 0,125 Maka, x MHA + (5000 – 900) = 900 µl ekstrak = 4100 µl aquades 3. 25 x 5 = 800 µl 0,125 Maka, x MHA + (5000 – 800) = 800 µl ekstrak 60 = 4200 µl aquades 4. 17,5 x 5 = 700 µl 0,125 Maka, x MHA + (5000 – 700) = 700 µl ekstrak = 4300 µl aquades 5. 15 x 5 = 600 µl 0,125 Maka, x MHA + (5000 – 600) = 600 µl ekstrak = 4400 µl aquades 6. 12,5 x 5 = 500 µl 0,125 Maka, x MHA + (5000 – 500) = 500 µl ekstrak = 4500 µl aquades 7. 10 x 5 = 400 µl 0,125 Maka, x MHA + (5000 – 400) = 400 µl ekstrak = 4600 µl aquades 8. 7,5 x 5 = 300 µl 0,125 Maka, x MHA + (5000 – 300) = 300 µl ekstrak = 4700 µl aquades 9. 5x5 = 200 µl 0,125 61 Maka, x MHA + (5000 – 200) = 200 µl ekstrak = 4800 µl aquades Lampiran 9. Diameter hambat (+)- katekin dan ekstrak air gambir terhadap Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa, Eschericia coli, Proteus vulgaris dan Proteus mirabilis 7 mg/ml. Bakteri Shigella flexneri Pseudomonas aeruginosa Eschericia coli 62 Proteus vulgaris Proteus mirabilis Keterangan K : (+)- Katekin G Gambir 63 : Lampiran 10. Pertumbuhan bakteri Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa, Eschericia coli, Proteus vulgaris dan Proteus mirabilis terhadap (+)- katekin dan ekstrak air gambir dengan metode makrodilusi. Konsentrasi Sampel 5 mg/ml Gambir Bakteri (+)- katekin Konsentrasi Sampel 7,5 mg/ml Gambir Bakteri (+)- katekin 64 Konsentrasi Sampel 10 mg/ml Gambir Bakteri (+)- katekin Konsentrasi Sampel 12,5 mg/ml Gambir Bakteri (+)- katekin 65 Konsentrasi Sampel 15 mg/ml Gambir Bakteri (+)- katekin Konsentrasi Sampel 17,5 mg/ml Gambir Bakteri (+)- katekin 66 Konsentrasi Sampel 20 mg/ml Gambir Bakteri (+)- katekin Konsentrasi Sampel 22,5 mg/ml Gambir Bakteri (+)- katekin 67 Konsentrasi Sampel 25 mg/ml Gambir Bakteri (+)- katekin Keterangan : Ec : E. coli Sf : S. flexneri Pa : P. aeruginosa Pv : P. vulgaris Pm : P. mirabilis 68 Lampiran 11. Data Hasil AAS (Ca2+ dan K+) 69 70 Lampiran 12. Alat-alat yang digunakan (a) (b) (d) (c) (e) (g) (f) (h) Keterangan : (a). Autoklaf (b). Inkubator (c). Shaker inkubator (d). Freeze drying (e). UV-Vis (f). Sentrifuse (g). Atomic absorption spectrometer (h). Scanning electron microscope 71
