BAB V. KESIMPULAN, SARAN DAN RINGKASAN V.1
advertisement
BAB V. KESIMPULAN, SARAN DAN RINGKASAN V.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian, dapat diambil kesimpulan bahwa : 1. Tingkat ekspresi miR-21 pada plasma darah pasien kanker payudara ditinjau dari stadium lanjut lebih tinggi daripada stadium awal dengan nilai fold change 1,32 kali lipat, dan mRNA PTEN pada plasma darah pasien kanker payudara ditinjau dari stadium lanjut lebih rendah daripada stadium awal dengan nilai fold change 1,33 kali lipat. 2. Terdapat perbedaan tingkat ekspresi miR-21 dan mRNA PTEN pada plasma darah pasien kanker payudara ditinjau dari status reseptor ER negatif dengan ER positif namun demikian secara statistik tidak ada perbedaan signifikan. 3. Terdapat perbedaan tingkat ekspresi miR-21 dan mRNA PTEN pada plasma darah pasien kanker payudara ditinjau dari status reseptor PR negatif dengan PR positif namun demikian secara statistik tidak ada perbedaan signifikan. 4. Terdapat perbedaan tingkat ekspresi miR-21 dan mRNA PTEN pada plasma darah pasien kanker payudara ditinjau dari status reseptor HER2 positif dengan HER2 negatif namun demikian secara statistik tidak ada perbedaan signifikan. 5. Terdapat perbedaan tingkat ekspresi miR-21 dan mRNA PTEN pada plasma darah pasien kanker payudara ditinjau dari status subtipe kanker payudara namun demikian secara statistik tidak ada perbedaan signifikan. 69 70 V.2 Saran Saran untuk penelitian selanjutnya : 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan jumlah sampel yang lebih besar. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut yang berhubungan dengan mekanisme interaksi antara miR-21 dan mRNA PTEN pada plasma pasien kanker payudara ditinjau dari status klinikopatologi dan molekuler. V.3 Ringkasan V.3.1 Latar Belakang Kanker payudara merupakan penyakit kompleks yang ditandai dengan adanya heterogenitas pada perubahan genetik. Kanker payudara menjadi penyebab utama kematian di dunia. Di Yogyakarta, kanker payudara masih merupakan penyakit kanker kedua terbanyak, namun khusus di RSUP Dr. Sardjito Yogyakarta, penyakit kanker payudara menduduki tempat pertama keganasan pada wanita (Aryandono, 2006). MikroRNA berperan sebagai modulator ekspresi gen sehingga dapat dijadikan sebagai kandidat diagnostik dan indikator prognostik serta target terapi yang potensial (Heneghan et al., 2010). Oleh karena itu, miRNA menjadi salah satu alternatif biomarker kanker yang sangat menjanjikan dimasa mendatang (Mo et al., 2012) . 71 MiR-21 merupakan satu-satunya miRNA yang mengalami peningkatan ekspresi dalam semua kanker manusia termasuk kanker payudara (Negrini & Calin, 2008). Pada patogenesis tumor, miR-21 menunjukkan keterlibatannya dalam proses tumorigenesis, progresi, dan metastasis. PTEN (Phosphatase Tensin and Homolog) merupakan gen tumor supresor yang mengalami delesi atau mutasi dalam berbagai kanker manusia. Ekspresi PTEN menurun pada sebagian besar tumor padat termasuk kanker payudara. PTEN diketahui menjadi salah satu mRNA target dari miR-21. Dalam salah satu studinya, Schwarzenbach et al. (2012) menyatakan bahwa aktivasi PTEN dapat menghambat perkembangan proliferasi dan pertumbuhan sel kanker payudara melalui jalur apoptosis yaitu jalur PI3K/Akt. V.3.2 Tinjauan Pustaka Kanker payudara merupakan keadaan malignansi yang berasal dari selsel yang terdapat pada payudara. Payudara wanita terdiri dari lobulus-lobulus, duktus-duktus, lemak dan jaringan konektif, pembuluh darah dan limfe. Pada umumnya karsinoma berasal dari sel-sel yang terdapat di duktus, beberapa diantaranya berasal dari lobulus dan jaringan lainnya (Zhang et al., 2014). Pembagian subtipe kanker payudara berdasarkan status ER, PR, dan HER2 (Li et al., 2013) : 1. Luminal A : ER(+) dan atau PR(+), dan HER2/Neu(-) 2. Luminal B : ER(+) dan atau PR(+), dan HER/Neu(+) 3. Her2 overexpression : ER(-), PR(-), HER2/Neu(+) 72 4. Triple negative : ER(-), PR(-), HER2/Neu(-) Penentuan stadium yang paling banyak dipakai saat ini adalah sistem TNM yang direkomendasikan oleh AJCC (The American Joint Committee on Cancer). Tiga indikator utamanya adalah “T” (tumor size atau ukuran tumor). “N” (node atau kelenjar getah bening regional) dan “M” (metastasis atau penyebaran jauh). Berdasarkan penilaian sebelum dan sesudah operasi serta melalui pemeriksaan histopatologi (PA) dapat diklasifikasikan sebagai berikut (Singletary & Connolly, 2006; AJCC, 2010; Aebi et al., 2011) Tabel. Stadium Klinis Kanker Payudara Stadium 0 I IIA IIB IIIA IIIB IIIC IV T Tis T1 T0 T1 T2 T2 T3 T0 T1 T2 T3 T3 T4 T4 T4 Setiap T Setiap T N N0 N0 N1 N1 N0 N1 N0 N2 N2 N2 N1 N2 N0 N1 N2 N3 Setiap N M M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M1 MikroRNA (miRNA) merupakan molekul RNA berukuran kecil yang tidak membawa sandi genetik, berukuran antara 18-24 nukleotida. MikroRNA (miRNA) secara normal berada dalam tubuh dan mengenali mRNA target. Melekatnya miRNA pada mRNA target akan menghambat translasi mRNA, baik 73 dengan memacu degradasi maupun dengan memblok translasi mRNA (Asaga et al., 2011). Reduksi atau delesi miRNA yang berfungsi sebagai tumor supressor dapat mempengaruhi pembentukan tumor. Reduksi atau eliminasi pada miRNA mature dapat menyebabkan kerusakan pada tingkatan biogenesis miRNA dan menyebabkan ekspresi yang tidak tepat pada target miRNA sehingga menghasilkan peningkatan proliferasi, invasi atau angiogenesis dan penurunan apoptosis pada target miRNA. Sedangkan amplifikasi atau overekspresi miRNA yang berperan sebagai onkogen menyebabkan peningkatan jumlah miRNA yang diproduksi pada waktu dan jaringan yang tidak tepat sehingga akan mengeliminasi ekspresi target miRNA (Huang et al., 2013). MiRNA sirkulasi memiliki beberapa karakteristik penting sebagai suatu biomarker. Pertama, stabil dalam sirkulasi dan tahan disimpan pada suhu -80°C. Serum miRNA tahan terhadap digesti RNase dan kondisi yang ekstrim seperti pH, boiling, penyimpanan jangka panjang, dan kondisi freeze-thaw. Kedua, sebagian besar sekuens miRNA terlindungi diseluruh spesies. Ketiga, dalam beberapa kasus, perubahan level miRNA dalam sirkulasi dihubungkan dengan penyakit yang berbeda serta tahapan biologis atau patologis tertentu. Sehingga miRNA dapat dengan mudah ditentukan dengan berbagai metode (Yu et al., 2011; Mo et al., 2012). Beberapa penelitian telah difokuskan pada fungsi biologi miR-21 dan menunjukan bahwa secara signifikan mengalami peningkatan regulasi di berbagai kanker manusia, termasuk kanker payudara (Yan et al., 2008; Qian et al., 2009). 74 Berdasarkan data eksperimental, mengindikasikan bahwa miR-21 berperan penting dalam proliferasi sel tumor, apoptosis, dan invasi. Penghambatan miR-21 dapat menyebabkan gangguan pada siklus sel, peningkatan apoptosis, dan peningkatan pada kemosensitivitas agen anti kanker. Hal ini memberikan bukti bahwa miR-21 berfungsi sebagai onkogen di kanker manusia (Chan et al., 2005; Li et al., 2009; Ren et al., 2010). Fungsi utama dari PTEN adalah memblokir jalur PI3K dengan dephosphorylasi phosphatidylinositol phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3,4,5-triphosphate (PIP2), sehingga (PIP3) berperan menjadi dalam menangkal fungsi PI3K. (Salmena et al., 2008; Molinari & Frattini, 2013). Inaktivasi PTEN menyebabkan hilangnya aktivitas lipid phosphatase dan akumulasi PIP3, sehingga terjadi phosphorylasi Akt. Akibatnya, inaktivasi PTEN merangsang perkembangan siklus sel, proliferasi, pertumbuhan sel, dan sintesis protein yang dilakukan oleh Akt. Selain itu, disisi lain inaktivasi PTEN mencegah sel-sel kanker dari apoptosis dengan menghambat jalur apoptosis (Li et al., 2012). Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik biologi molekuler untuk mengamplifikasi sekuen DNA spesifik menjadi ribuan sampai jutaan copy sekuen DNA. Teknik ini menggunakan metode enzimatis yang diperantarai primer. Prinsip dasar PCR adalah sekuen DNA spesifik diamplifikasi menjadi dua copy selanjutnya menjadi empat copy dan seterusnya. Pelipatgandaan ini membutuhkan enzim spesifik yang dikenal polimerase. Polimerase adalah enzim yang mampu menggabungkan DNA cetakan tunggal, membentuk untaian molekul DNA yang panjang. Enzim membutuhkan primer serta DNA cetakan seperti 75 nukleotida yang terdiri dari empat basa, yaitu: Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C), dan Guanine (G) (Gibbs, 1990). Metode PCR dibedakan menjadi dua, yaitu: PCR konvesional dan Real Time qPCR. Analisis hasil amplifikasi fragmen DNA pada PCR konvensional dilakukan dengan visualisasi di agar elektroforesis sedangkan dengan Real Time qPCR, jumlah DNA yang diamplifikasi dapat dideteksi dan diukur di setiap siklus proses PCR (Fraga et al., 2008). V.3.3 Landasan Teori Kanker payudara dapat terjadi disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain: (1) faktor genetik, (2) hormon, (3) lingkungan. Kanker payudara merupakan penyakit heterogen yang memiliki entitas patologis dan heterogenitas yang tercermin pada perbedaan komposisi jenis sel dan proporsi; perbedaan kemampuan proliferasi antara sel-sel kelenjar dan mioepitel; proliferasi sel progenitor; respon terapi dan hasil klinis pasien (Mcpherson et al., 2000; Zhang et al., 2014) Diketahui bahwa miR-21 berfungsi sebagai onkogen melalui mekanisme represi regulasi terhadap target gen tumor supresor. Dan hal ini menjelaskan adanya hubungan antara ekspresi berlebih mir-21 dan prognosis yang buruk pada pasien kanker payudara (Chan et al., 2005; Li et al., 2009; Ren et al., 2010). Sejauh ini, ada beberapa gen yang telah diidentifikasi sebagai target miR21 pada berbagai jenis kanker termasuk kanker payudara. Salah satu gen target itu adalah PTEN yang menjadi target langsung dari miR-21. Ekspresi berlebih PTEN 76 dapat menginduksi apoptosis sehingga dapat menekan perkembangan sel kanker (Meng et al., 2007; Zhang et al., 2012). Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik biologi molekuler untuk mengamplifikasi sekuen DNA spesifik menjadi ribuan sampai jutaan copy sekuen DNA. Teknik ini menggunakan metode enzimatis yang diperantarai primer. Metode PCR dibedakan menjadi dua, yaitu: PCR konvesional dan Real Time qPCR. Analisis hasil amplifikasi fragmen DNA pada PCR konvensional dilakukan dengan visualisasi di agar elektroforesis sedangkan dengan Real Time qPCR, jumlah DNA yang diamplifikasi dapat dideteksi dan diukur di setiap siklus proses PCR (Fraga et al., 2008). Pada saat proses analisis RNA, perlu dilakukan suatu tindakan untuk meminimalisir variasi yang mungkin terjadi dengan cara normalisasi. Normalisasi dapat dilakukan dengan cara menyeragamkan jumlah sel yang akan diekstraksi, Penyeragaman jumlah total RNA yang akan digunakan dalam proses Real Time qPCR, Standarisasi RNA dengan menggunakan housekeeping genes sebagai indikator. V.3.4 Cara Penelitian Penelitian dilakukan dengan beberapa tahapan, yaitu: isolasi total RNA, sintesis cDNA, analisis ekspresi miR-21 dan mRNA PTEN menggunakan Real Time qPCR. Analisis Real Time qPCR untuk miR-21 menggunakan metode two step Real Time qPCR sedangkan mRNA PTEN menggunakan metode one step Real Time qPCR. 77 V.3.5 Hasil Penelitian dan Pembahasan V.3.5.1 Interaksi Antara miR-21 dan mRNA PTEN Berdasarkan database microRNA (http://www.mirbase.org) maka diperoleh sekuens miR-21, sedangkan sekuens mRNA PTEN diperoleh dari gene bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Metode analisis bioinformatika dilakukan untuk menunjukkan bahwa miR-21 mempunyai target penempelan pada sekuens mRNA PTEN yang memiliki panjang 5.572 nukleotida melalui prediksi miRanda/mirtarbase (www.mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw). Penempelan tersebut terutama pada sekuens 3’UTR (untranslated region) sepanjang 3.332 nukleotida yang berada pada posisi 2.240 – 5.572 nukleotida mRNA PTEN. Berdasarkan analisis bioinformatika diketahui bahwa situs penempelan miR-21 terjadi pada posisi nukleotida ke 423 – 440 dari seluruh sekuens 3’UTR yang berjumlah 3.332 nukleotida atau berada pada posisi 2.663 – 2.680 dari seluruh sekuens mRNA PTEN yang berjumlah 5.572 nukleotida. V.3.5.2 Amplifikasi miR-21 dan mRNA PTEN 78 Kurva amplifikasi miR-21 dan mRNA PTEN ditunjukan pada gambar berikut: miR-16 miR-21 β-actin mRNA PTEN Gambar. Kurva amplifikasi ekspresi miR-21 dan mRNA PTEN dengan Real Time qPCR Rata-rata siklus amplifikasi pada miR-16 dan miR-21 adalah 26,88 dan 27,04 sedangkan pada β-actin dan mRNA PTEN sebesar 31,00 dan 32,75. Nilai melting temperature yang optimum untuk miR-21 adalah 67,50°C – 68,50°C dan 69,50°C – 70,00°C untuk miR-16 (reference gene), sedangkan melting temperature optimum pada mRNA PTEN adalah 80,00°C – 81,50°C dan untuk β-actin (reference gene) adalah 78,50°C – 80,00°C. Spesifisitas dan deteksi kontaminasi pada reaksi real time PCR dapat diidentifikasi melalui kurva melt peak yang spesifik pada kisaran suhu tertentu.. V.3.5.4 Ekspresi miR-21 dan mRNA PTEN Pada Plasma Kanker Payudara 79 Berdasarkan perhitungan dengan menggunakan metode CT comparatif menunjukkan bahwa miR-21 mengalami peningkatan ekspresi (upregulated) pada stadium lanjut dibandingkan dengan stadium awal. Pada stadium lanjut miR-21 mengalami peningkatan ekspresi (up-regulated) sebesar 1,32 kali lipat dibandingkan stadium awal dan untuk mRNA PTEN menunjukkan bahwa terjadi penurunan ekspresi (downregulated) mRNA PTEN pada stadium lanjut dibandingkan stadium awal sebesar 1,33 kali lipat. Namun demikian, berdasarkan perhitungan statistik, tingkat ekspresi miR-21 dan mRNA PTEN antara stadium awal dan stadium lanjut terlihat tidak ada perbedaan yang substansial dengan P value miR-21 dan mRNA PTEN > 0,05. V.3.5.5 Ekspresi miR-21 Ditinjau Berdasarkan Karakteristik Molekuler Tingkat ekspresi miR-21 dapat dianalisis melalui 2 metode, yaitu dengan metode CT komparatif dan metode statistik. Berdasarkan analisa menggunakan metode CT komparatif diperoleh nilai fold change untuk setiap variabel. Pada reseptor estrogen ER(-), ekspresi miR-21 menurun (downregulated)1,14 dibandingkan ER(+) dan hal yang sama juga terjadi pada reseptor progesteron PR(-) dengan nilai ekspresi miR-21 menurun (downregulated) 1,63 kali lipat dibandingkan PR(+). Ekspresi miR-21 pada Her2(+) meningkat (up-regulated) 1,38 kali lipat dibandingkan Her2(-), sedangkan ekspresi miR-21 ditinjau dari subtipe menunjukkan ada perbedaan ekspresi melalui perhitungan metode CT komparatif akan tetapi berdasarkan perhitungan statistik terlihat bahwa ekspresi 80 miR-21 ditinjau dari status molekuler tidak ada perbedaan signifikan dengan P value > 0,05. V.3.5.6 Ekspresi mRNA PTEN Ditinjau Dari Karakteristik Molekuler Pada reseptor estrogen ER(-), ekspresi mRNA PTEN meningkat (upregulated) 1,96 kali lipat dibandingkan ER(+) dan hal yang sama juga terjadi pada reseptor progesteron PR(-) dengan nilai ekspresi mRNA PTEN meningkat (upregulated) 2,02 kali lipat dibandingkan PR(+). Ekspresi mRNA PTEN pada Her2(+) meningkat (up-regulated) 1,60 kali lipat dibandingkan Her2(-) sedangkan ekspresi miR-21 ditinjau dari subtipe menunjukkan ada perbedaan ekspresi melalui perhitungan metode CT komparatif akan tetapi berdasarkan perhitungan statistik terlihat bahwa ekspresi miR-21 ditinjau dari status molekuler tidak ada perbedaan signifikan dengan P value > 0,05. V.3.6 Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian, dapat diambil kesimpulan bahwa : 1. Tingkat ekspresi miR-21 pada plasma darah pasien kanker payudara ditinjau dari stadium lanjut lebih tinggi daripada stadium awal dengan nilai fold change 1,32 kali lipat, dan mRNA PTEN pada plasma darah pasien kanker payudara ditinjau dari stadium lanjut lebih rendah daripada stadium awal dengan nilai fold change 1,33 kali lipat. 81 2. Terdapat perbedaan tingkat ekspresi miR-21 dan mRNA PTEN pada plasma darah pasien kanker payudara ditinjau dari status reseptor ER negatif dengan ER positiff namun demikian secara statistik tidak ada perbedaan signifikan. 3. Terdapat perbedaan tingkat ekspresi miR-21 dan mRNA PTEN pada plasma darah pasien kanker payudara ditinjau dari status reseptor PR negatif dengan PR positif namun demikian secara statistik tidak ada perbedaan signifikan. 4. Terdapat perbedaan tingkat ekspresi miR-21 dan mRNA PTEN pada plasma darah pasien kanker payudara ditinjau dari status reseptor HER2 positif dengan HER2 negatif namun demikian secara statistik tidak ada perbedaan signifikan. 5. Terdapat perbedaan tingkat ekspresi miR-21 dan mRNA PTEN pada plasma darah pasien kanker payudara ditinjau dari status subtipe kanker payudara namun demikian secara statistik tidak ada perbedaan signifikan. V.3.7 Saran Saran untuk penelitian selanjutnya : 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan jumlah sampel yang lebih besar. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut yang berhubungan dengan mekanisme interaksi antara miR-21 dan mRNA PTEN pada plasma pasien kanker payudara ditinjau dari status klinikopatologi dan molekuler.
