bio.unsoed.ac.id - Universitas Jenderal Soedirman

III.
METODE PENELITIAN
A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian
1.
Materi Penelitian
1.1. Peralatan Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol sampel,
beaker glass, cool box, labu Erlenmayer, tabung reaksi, gelas ukur,
sarung tangan karet, masker, alumunium foil, tabung mikrosentrifuge 1,5
ml, tabung disposable 50 ml, hot plate dan stirrer, vorteks, kertas
parafilm, timbangan analitik, autoklaf, mikropipet 100-1000 µl,
mikropipet 20-200 µl, mikropipet 0,5-10 µl, tip biru, tip kuning, tip putih,
pH indicator strip, waterbath, nanospektrofotometri, alat elektroforesis,
UV transiluminator, PCR tube 0,2 ml, perangkat PCR dan perangkat
elektroforesis DGGE.
1.2. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuades steril,
sampel sedimen dari lahan mangrove, buffer Tris-HCl, asam asetat
glasial, ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), FeCl3, sodium dodecyl
sulphate (SDS), kloroform, isoamyl alcohol, alkohol absolut, alkohol
70%, NaCl, agarosa, Marka DNA 100 bp, DNA fluorosafe, ethidium
bromide (EtBr), PCR primer universal 16S rRNA 27F (AGA GTT TGA
TCM TGG CTC AG) dan 1540R (AAG GAG GTG ATC CAG CCG
CA) (Gurtner et al., 2000), PCR pimer universal 16S rRNA 968F-GC
(5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG
GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3’) dan 1406R (5’ACG GGC
GGT GTG TAC 3’) (Nakatsu et al., 2000), akuabides, Kappa PCR
Master
bio.unsoed.ac.id
Mix,
akrilamid,
bis-akrilamid,
UREA,
formamide,
tetramethylethylenediamine (TEMED), ammonium persulfat, Biorad Dye
Solution dan loading dye.
2.
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan dengan pengambilan sampel sedimen tanah di lahan
mangrove
Tritih
Kulon
Cilacap.
6
Ekstraksi
DNA
dilaksanakan
di
Laboratorium Biologi Molekuler Universitas Jenderal Soedirman, amplifikasi
DNA dilaksanakan di Laboratorium Riset Terpadu Universitas Jenderal
Soedirman Purwokerto, dan elektroforesis DGGE dilakukan di Laboratorium
Biosains Universitas Brawijaya Malang selama bulan Februari – November
2014.
B. Metode Penelitian
1.
Metode Percobaan
Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif dengan
tahapan ektraksi DNA bakteri sedimen mangrove, amplifikasi DNA dengan
PCR, dan analisis DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis).
2.
Bagan Alir Penelitian
Sampel Sedimen Mangrove
Isolasi DNA dari Sedimen Mangrove
Verifikasi Elektroforesis
Gel Agarosa 1,5%
Spektrofotometri
Rasio A260/280
Rasio A260/230
Amplifikasi Gen Penyandi
16S rRNA Menggunakan
Primer 27F dan 1540R
Elektroforesis Gel
Agarosa 1,5%
Amplifikasi Gen Penyandi
16S rRNA Menggunakan
Primer 968F-GC dan 1406R
Elektroforesis Gel
Agarosa 1,5%
bio.unsoed.ac.id
Analisis Denaturing Gradient
Gel Electrophoresis (DGGE)
Data Diversitas Bakteri Sedimen
Mangrove Tritih Kulon
7
3.
Cara Kerja
3.1.
Preparasi Sampel Tanah
Sampel sedimen tanah diambil dari lahan mangrove Tritih
Kulon Cilacap. Sampel sedimen tanah diambil dengan teknik random
sampling. Sebelum pengambilan, pH sedimen tanah diukur terlebih
dahulu dengan menggunakan pH meter. Pengambilan sampel sedimen
tanah dilakukan dari permukaan sampai kedalaman 15 cm dari
permukaan sedimen. Sampling dilakukan pada 3 titik yang berbeda,
kemudian sampel dari 3 titik tersebut dikompositkan. Setelah itu
sampel dimasukan ke dalam plastik dan disimpan dalam cool box.
3.2. Ektraksi DNA dari Sampel Sedimen Tanah (More, 2011 dengan
modifikasi)
Sampel sedimen mangrove sebanyak 1 gram dimasukkan ke
dalam tabung reaksi. Sampel ditambahkan dengan 400 µl FeCl3 200
mM dan divorteks selama 10 detik. Pasir steril 1 gram dan 1,5 ml SDS
20% ditambahkan ke dalam campuran kemudian divorteks selama 10
menit dengan kecepatan 3000 rpm. Campuran diinkubasi selama 45
menit pada suhu 75oC. Campuran yang telah diinkubasi dipindahkan
ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml diikuti dengan proses sentrifugasi
15700 g selama 12 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung
eppendorf baru kemudian NaCl 2 M ditambahkan sebanyak setengah
volume supernatan. Campuran disentrifugasi 15700 g selama 12
menit. Natan yang diperoleh ditambahkan dengan TE 1X 700 µl.
Larutan kloroform : isoamil alkohol (24:1) ditambahkan dengan
volume yang sama kemudian disentrifugasi 15700 g selama 12 menit
bio.unsoed.ac.id
pada suhu 4 oC. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendorf baru dan
ditambahkan etanol absolut dengan volume yang sama diikuti dengan
proses sentrifugasi 15700 g selama 12 menit pada suhu 4oC. Natan
yang diperoleh dicuci dengan etanol 70% dingin sebanyak 1 ml dan
disentrifugasi kembali dengan 9300 g selama 5 menit pada suhu 4oC.
Supernatan dibuang dan dikering anginkan selama 10 menit,
kemudian dipreservasi dengan TE 1X 100 µl. Keberhasilan isolasi
8
DNA diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1,5% pada voltase
100 V, 400 mA selama 50 menit. Kemudian divisualisasi dengan UV
transiluminator.
Kemurnian
DNA
diukur
menggunakan
spektrofotometri untuk memperoleh nilai rasio A260/280 dan
A260/230.
3.3. Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA
Amplifikasi 16S rRNA dilakukan dengan teknik Polymerase
Chain Reaction (PCR). Proses amplifikasi dilakukan sebanyak 2
tahapan. Tahap pertama menggunakan primer 27F dan 1540R dimulai
dengan membuat campuran 8 µL ddH2O, 10 µl Kappa PCR Master
Mix, 0,5 µl forward primer 10 µM, 0,5 µl reverse primer 10 µM, dan
1 µl template berupa DNA hasil isolasi. PCR tahap pertama dilakukan
dengan tahapan pre-denaturasi 950C selama 5 menit, denaturasi 940C
selama 1 menit, annealing 500C selama 1 menit dan ekstensi 720C
selama 2 menit. Running PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dan final
extention 720C selama 10 menit. Kemudian suhu diturunkan 40C
selama 20 menit. Tahapan kedua menggunakan primer 968F-GC dan
1406R dilakukan dengan mencampurkan 8 µl ddH2O, 10 µl Kappa
PCR Master Mix, 0,5 µl forward primer 10 µM, 0,5 µl reverse primer
10 µM, dan 1 µl template berupa hasil PCR tahap pertama. PCR tahap
kedua dilakukan dengan tahapan pre-denaturasi 950C selama 5 menit,
denaturasi 940C selama 1 menit, annealing 560C selama 1 menit dan
ekstensi 720C selama 2 menit. Running PCR dilakukan sebanyak 30
siklus dan final extention 720C selama 10 menit. Kemudian suhu
diturunkan 40C selama 20 menit. Keberhasilan amplifikasi diverifikasi
dengan elektroforesis gel agarosa 1,5% pada voltase 100 V, 400 mA
bio.unsoed.ac.id
selama 50 menit. Kemudian divisualisasi dengan UV transiluminator.
3.4. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
Produk PCR tahap kedua sebanyak 15 µl dicampurkan dengan 5
µl loading dye. Campuran dimasukkan ke dalam sumuran gel
poliakrilamid 8% yang direndam dalam larutan TAE 1X. Denaturing
9
gradient yang digunakan adalah 25% sampai 60% (pembuatan
denaturant 100% mengandung urea 4 M dan 40% formamide).
Elektroforesis dilakukan pada voltase 130 V pada suhu 60oC selama
5,5 jam. Setelah elektroforesis, gel diinkubasi selama 15 menit pada
etidium bromida 0,1%. Kemudian dibilas dengan TAE 1X selama 20
menit dan divisualisasi dengan UV transiluminator.
C. Metode Analisis
Pengamatan diversitas bakteri asal sedimen mangrove Tritih Kulon
dilakukan dengan menganalisis profil Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
(DGGE).
bio.unsoed.ac.id
10