penuntun praktikum mikrobiologi

PENUNTUN PRAKTIKUM
PENUNTUN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI
MIKROBIOLOGI UMUM
Hafsan, S.Si., M.Pd.
Eka Sukmawaty, S.Si., M.Si.
Dr. Mashuri Masri, S.Si., M,kes
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
JURUSAN BIOLOGI
N
PURWOKERTO
2008
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN MAKASSAR
2016
i
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, kami panjatkan rasa syukur kepada Allah SWT karena
hanya dengan taufiq dan hidayahNya sehingga penyusunan Penuntun Praktikum
Mikrobiologi ini telah terselesaikan dan kini dapat dipergunakan. Kami sangat
menyadari bahwa penuntun ini masih sangat jauh dari kesempurnaan, sehingga
kepada para pengguna/pembaca yang arif, sangat diharapkan saran-saran yang
konstruktif demi kesempurnaan tulisan berikutnya.
Penyelesaian penuntun ini tak lepas dari peran serta berbagai pihak.
Kepada pihak yang telah membantu proses penyusunan penuntun ini yang
kesemuanya tidak dapat disebutkan satu persatu, kami mengucapkan banyak
terimakasih. Semoga segenap aktivitas kita bernilai ibadah di sisiNya. Amin
Samata, September 2016
Tim Penyusun
i
TATA TERTIB PRAKTIKUM
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Praktikan harus telah mengenakan jas lab saat memasuki laboratorium dan
bekerja dengan peralatan di laboratorium untuk menghindari kontaminasi
dan terkena khemikalia
Dilarang keras makan, merokok dan minum di laboratorium
Sebelum dan sesudah bekerja, meja praktikum dibersihkan dengan
desinfektan
Dilarang membuang biakan sisa atau habis pakai dan pewarna sisa
disembarang tempat. Bahan tersebut harus dibuang di tempat yang telah
disediakan oleh asisten.
Laporkan segera jika terjadi kecelakaan seperti kebakaran, biakan tumpah
ada yang menelan bahan kimia, atau biakan kepada asisten
Jika menggunakan jarum inokulum, ujung jarum dibakar sampai memijar
sesudah dan sebelum bekerja menggunakan alat ini
Sebelum meninggalkan laboratorium disarankan untuk mencuci tangan
dengan seksama.
ii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ............................................................................................. i
TATA TERTIB PRAKTIKUM .............................................................................. ii
DAFTAR ISI……………………………..………………………………………iii
PENGENALAN ALAT .......................................................................................... 1
MEDIA PERTUMBUHAN .................................................................................. 13
STERILISASI ....................................................................................................... 19
ISOLASI MIKROBA ........................................................................................... 30
MORFOLOGI MIKROBA ................................................................................... 37
FAKTOR LINGKUNGAN YANG BERPENGARUH........................................ 54
TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME .................................... 54
ANALISA COLIFORM BERDASARKAN NILAI MPN ................................... 58
ANALISA Staphylococcus aureus PADA BAHAN PANGAN .......................... 63
UJI BIOKIMIA (UJI IMVIC) ............................................................................... 66
DAYA KERJA ANTIMIKROBA DAN OLIGODINAMIK ............................... 71
AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME ............................................. 75
PENGUKURAN KADAR PROTEIN MIKROBA .............................................. 82
ISOLASI BAKTERIOFAGE................................................................................ 83
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 84
LAMPIRAN .......................................................................................................... 85
iii
PENGENALAN ALAT
A. Kompetensi : mahasiswa mengenal dan mengetahui fungsi dari tiap-tiap alat
Berikut daftar alat-alat mikrobiologi yang perlu dikenal:
Alat-alat elektrik
 Mikroskop cahaya
 Mikroskop stereo
 Autoklaf elektrik
 Incubator
 Hot plate & stirrer
 Colony counter
 Biological Safety Cabinet (BSC)
 Mikropipet
Alat-alat gelas dan keramik
 Cawan Petri
 Pipet ukur
 Pipet tetes
 Tabung reaksi
 Labu Erlenmeyer
 Glass beads
 Mortar & pestle
 Beaker glass
 Buncen burner
 Gelas ukur
 Batang L / Drugalsky
 Tabung durham
Alat-alat non gelas
 Jarum inokulum / ose
 Pinset
 Rubber bulb
 pH meter universal
1
B. Dasar Teori
Mikroskop Cahaya (Brightfield Microscope)
Salah satu alat untuk melihat sel mikroorganisme adalah mikroskop
cahaya. Dengan mikroskop kita dapat mengamati sel bakteri yang tidak dapat
dilihat dengan mata telanjang. Pada umumnya mata tidak mampu membedakan
benda dengan diameter lebih kecil dari 0,1 mm. berikut merupakan uraian
tentang cara penggunaan bagian-bagiandan spesifikasi mikroskop cahaya merk
Olympus CH20 yang dimiliki Laboratorium Mikrobiologi.
Bagian-bagian Mikroskop:
1.
Eyepiece / oculars (lensa okuler)
Untuk memperbesar bayangan yang
dibentuk lensa objektif
2.
Revolving nosepiece (pemutar lensa objektif)
Untuk
memutar objektif
sehingga
mengubah perbesaran
3.
Observation tube (tabung pengamatan
/ tabung okuler)
4.
Stage (meja benda)
Spesimen diletakkan di sini
5.
Condenser (condenser)
Untuk mengumpulkan cahaya supaya
tertuju ke lensa objektif
6.
Objective lense (lensa objektif) Memperbesar
spesimen
7.
Brightness adjustment knob (pengatur kekuatan lampu)
Untuk memperbesar dan memperkecil cahaya lampu
8.
Main switch (tombol on-off)
9.
Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter)
Untuk menyamakan focus antara mata kanan dan kiri
10. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak interpupillar)
11. Specimen holder (penjepit spesimen)
12. Illuminator (sumber cahaya)
13. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal)
Untuk menaikkan atau menurunkan objectglass
14. Horizontal feed knob (sekrup pengatur horizontal) Untuk menggeser ke
kanan / kiri objek glas
15. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar)
Menaik turunkan meja benda (untuk mencari fokus) secara kasar dan cepat
2
16.
17.
18.
Fine focus knob (sekrup fokus halus)
Menaik turunkan meja benda secara halus dan lambat
Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung okuler)
Condenser adjustment knob (sekrup pengatur kondenser)
Untuk menaik-turunkan kondenser
Prosedur Operasi
1. Menyalakan lampu
a. tekan tombol on (8)
b. atur kekuatan lampu dengan memutar bagian (7)
2. Menempatkan spesimen pada meja benda
a. Letakan objek glas diatas meja benda (4) kemudian jepit dengan (11). Jika
meja benda belum turun, diturunkan dengan sekrup kasar (15)
b. Cari bagian dari objek glas yang terdapat preparat ulas (dicari dan
diperkirakan memiliki gambar yang jelas) dengan memutar sekrup
vertikal dan horizontal (13) dan (14)
3. Memfokuskan
a. Putar Revolving nosepiece (2) pada perbesaran objektif 4x
lalu putar sekrup kasar (15) sehingga meja benda bergerak
ke atas untuk mencari fokus
b. Setelah fokus perbesaran 4 x 10 didapatkan, maka putar (2)
pada perbesaran selanjutnya yaitu perbesaran objektif 10x.
kemudian putar sekrup halus (16) untuk mendapatkan
fokusnya
c. Lakukan hal yang sama jika menggunakan perbesaran yang lebih tinggi
Berikut adalah tabel yang menunjukan jarak antara spesimen dengan lensa
objektif jika okus telah didapatkan
Perbesaran objektif
4x
Jarak
29
A (mm)
10x
6,3
40x
60x
0,53
0,29
Catatan: Setelah mendapatkkan fokus pada perbesaran tetentu, misal 40x, dan
ingin memutar objektif ke perbesaran 100x, maka meja benda tidak perlu
diturunkan dan tidak perlu khawatir bahwa lensa objektif akan menggesek
cover glass karena terdapat sisa jarak A yang lebih kecil antara cover glass
dengan lensa objektif (lihat tabel diatas).
Tambahan
a.
Jika perlu interpupillar distance adjustment knob (10) dapat digeser, hal ini
akan mengubah dua bayangan yang akan diterima oleh 2 mata menjadi
gambar yang tunggal sehingga sangat membantu dalam mengatasi kelelahan
mata
3
b.
c.
Jika perlu diopter adjustment knob (9) dapat diatur untuk memperoleh
bayangan focus yang seimbang antara mata kanan dan kiri
Pengaturan condenser (5) akan memperjelas bayangan yang tampak dengan
mensetting pada posisi tertinggi (cahaya penuh)
Perbesaran total
Ukuran specimen yang diamati dapat diperoleh dengan mengalikan
perbesaran lensa okuler dengan lensa objektif. Misal = Okuler (10x) x Objektif
(40x) = 400x
Penggunaan minyak imersi
Semakin kecil nilai daya pisah, akan semakin kuat kemampuan lensa
untuk memisahkan dua titikyang berdekatan pada preparat sehingga struktur
benda terlihat lebih jelas. Daya pisah dapat diperkuat dengan memperbesarkan
indeks bias atau menggunakan cahaya yang memiliki panjang gelombang (λ)
pendek. Biasanya dapat digunakan minyak imersi untuk meningkatkan indeks
bias pada perbesaran 10 x 100
a. Jika fokus pada perbesaran 10 x 40 telah didapatkan maka putar ke
perbesaran objektif 100x
b. tetesi minyak imersi 1 – 2 tetes dari sisi lensa
c. Jika telah selesai menggunakan mikroskop, bersihkan lensa objektif 100x
dengan kertas lensa yang dibasahi xilol
1
2
1
2
Mikroskop stereo (Zoom Stereo Microscope)
Mikroskop ini berfungsi untuk melihat objek
yang membutuhkan perbesaran tidak terlalu besar. Di
Laboratorium Mikrobiologi, mikroskop stereo biasanya
digunakan untuk mengamati secara detail bentuk
koloni dan jamur. Berikut merupakan uraian tentang
mikroskop stereo yang dimiliki Laboratorium
Mikrobiologi yaitu Zoom Stereo Microscope, Olimpus
SZ3060.
1. Ocularseyepiece (lensa okuler)
2. Diopter adjustment ring (cincin pengatur
diopter)
3. Zoom control
knob (sekrup
pengatur pembesaran)
4
4. Focusing knob (sekrup pengatur fokus)
5. Stage plate (pelat tempat specimen diletakkan)
6. Stage clip (penjepit spesimen / preparat)
Prosedur operasi
1. Letakkan spesimen / preparat di stage plate (5), jepit jika perlu
2. Atur perbesaran pada perbesaran terkecil dengan memutar Zoom Control
Knob (3) kemudian dicari fokusnya dengan memutar Focusing Knob (4)
3. Jika ingin mendapatkan bayangan yang lebih besar, putar Zoom Control Knob
(3) ke perbesaran yang lebih tinggi kemudian dicari fokusnyaMikroskop
ini memiliki pilihan perbesaran:
Okuler
Objektif
total
0,67 x
6,7 x
0,9 x
9x
1x
10 x
2x
20 x
4x
40 x
10 x
Autoklaf (Autoclave)
Diagram autoklaf vertical
1.
Tombol
pengaturwaktu
mundur (timer)
2.
Katup pengeluaran uap
3.
pengukur tekanan
4.
kelep pengaman
5.
Tombol on-off
6.
Termometer
7.
Lempeng sumber panas
8.
Aquades (dH2O)
9.
Sekrup pengaman
10.
batas penambahan air
Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan
yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan.
Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan
suhu 121oC (250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda
adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi
yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC.
Cara Penggunaan :
5
1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf.
Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air
sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari
terbentuknya kerak dan karat.
2. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir,
maka tutup harus dikendorkan.
3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak
ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan
dikencangkan terlebih dahulu.
4. Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu
121oC.
5. Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen
autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep
pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai.
Penghitungan waktu 15’ dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm.
6. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam
kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan
(jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep
pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hatihati.
Inkubator (Incubator)
Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau
memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. Alat ini
dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu. Kisaran
suhu untuk inkubator produksi Heraeus B5042 misalnya adalah
10-70oC..
Hot plate stirrer dan Stirre bar
Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer)
berfungsi untuk menghomogenkan suatu larutan dengan
pengadukan. Pelat (plate) yang terdapat dalam alat ini dapat
dipanaskan sehingga mampu mempercepat proses homogenisasi.
Pengadukan dengan bantuan batang magnet Hot plate dan
magnetic stirrer seri SBS-100 dari SBS® misalnya mampu
menghomogenkan sampai 10 L, dengan kecepatan sangat lambat
sampai 1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai 425oC.
Colony counter
Alat ini berguna untuk mempermudah perhitungan koloni
yang tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawankarena adanya
kaca pembesar. Selain itu alat tersebut dilengkapi dengan skala/
kuadran yang sangat bergunauntuk
pengamatan
pertumbuhan koloni sangat banyak. Jumlah koloni pada cawan Petri dapat
ditandai dan dihitung otomatis yang dapat di-reset.
Biological Safety Cabinet
6
Biological Safety Cabinet (BSC) atau
dapat juga disebut Laminar Air Flow (LAF)
adalah alat yang berguna untuk bekerja
secara aseptis karena BSC mempunyai pola
pengaturan dan penyaring aliran udara
sehingga menjadi steril dan aplikasisinar UV
beberapa jam sebelum digunakan. Prosedur
penggunaan BSC seri 36212, Purifier™
Biological Safety Cabinet dari LABCONCO
yang dimiliki laboratorium mikrobiologi
adalah sebagai berikut:
1. Hidupkan lampu UV selama 2
jam, selanjutnya matikan segera
sebelum mulai bekerja
2. Pastikan kaca penutup terkunci
dan pada posisi terendah
3. Nyalakan lampu neon dan
blower
4. Biarkan selama 5 menit
5. Cuci tangan dan lengan dengan sabun gemisidal / alkohol 70 %
6. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % atau desinfektan
yang cocok dan biarkan menguap
7. masukkan alat dan bahan yang akan dikerjakan, jangan terlalu penuh
(overload) karena memperbesar resiko kontaminan
8. Atur alat dan bahan yang telah dimasukan ke BSC sedemikian rupa
sehingga efektif dalam bekerja dan tercipta areal yang benar-benar
steril
9. Jangan menggunakan pembakar Bunsen dengan bahan bakar alkohol
tapi gunakan yang berbahan bakar gas.
10. Kerja secara aseptis dan jangan sampai pola aliran udara terganggu
oleh aktivitas kerja
11. setelah selesai bekerja, biarkan 2-3 menit supaya kontaminan tidak
keluar dari BSC
12. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % dan biarkan
menguap lalu tangan dibasuh dengan desinfektan
13. Matikan lampu neon dan blower
Mikropipet (Micropippete) dan Tip
Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup
kecil, biasanya kurang dari 1000 µl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet,
misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable
volume pipette) antara 1µl sampai 20 µl, atau mikropipet yang tidak bisa diatur
volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya
mikropipet 5 µl. Dalam penggunaannya mikropipet memerlukan tip.
7
Mikropipet
tip
Cara Penggunaan :
1. Sebelum digunakan Thumb Knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk
memastikan lancarnya mikropipet.
2. Masukkan Tip bersih ke dalam Nozzle / ujung mikropipet.
3. Tekan Thumb Knob sampai hambatan pertama / first stop, jangan ditekan
lebih ke dalam lagi.
4. Masukkan tip ke dalam cairan sedalam 3-4 mm.
5. Tahan pipet dalam posisi vertikal kemudian lepaskan tekanan dari Thumb
Knob maka cairan akan masuk ke tip.
6. Pindahkan ujung tip ke tempat penampung yang diinginkan.
7. Tekan Thumb Knob sampai hambatan kedua / second stop atau tekan
semaksimal mungkin maka semua cairan akan keluar dari ujung tip.
8. Jika ingin melepas tip putar Thumb Knob searah jarum jam dan ditekan
maka tip akan terdorong keluar dengan sendirinya, atau menggunakan alat
tambahan yang berfungsi mendorong tip keluar.
Cawan Petri (Petri Dish)
Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi)
mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian
bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri
tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter cawan
yang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media
sebanyak 15-20 ml, sedangkan cawan berdiameter 9 cm
kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml.
8
Pipet Ukur (Measuring Pippete)
Pipet ukur merupakan
alat
untuk
memindahkan larutan dengan volume yang diketahui.
Tersedia berbagai macam ukuran kapasitas pipet ukur,
diantaranya pipet berukuran 1 ml, 5 ml dan 10 ml. Cara
penggunaanya adalah cairan disedot dengan pipet ukur
dengan bantuan filler sampai dengan volume yang
diingini. Volume yang dipindahkan dikeluarkan menikuti
skala yang tersedia (dilihat bahwa skala harus tepat sejajar
dengan mensikus cekung cairan) dengan cara
menyamakan tekanan filler dengan udara sekitar.
Pipet tetes (Pasteur Pippete)
Fungsinya sama dengan pipet ukur, namun volume
yang dipindahkan tidak diketahui. Salah satu
penerapannya adalah dalam menambahkan HCl / NaOH
saat mengatur pH media, penambahan reagen ada uji
biokimia, dll.
Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube)
Di dalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan untuk
uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan mikroba.Tabung reaksi
dapat diisi media padat maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat
berupa kapas, tutup metal, tutup plastik atau aluminium foil.
Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur
menjadi 2 bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak
(deep tube agar) dan agar miring (slants agar). Untuk membuat
agar miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu
luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit
atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat
dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi.
Untuk alas an efisiensi, media yang ditambahkan berkisar 10-12 ml tiap tabung.
Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask)
Berfungsi untuk menampung larutan, bahan atau cairan yang.
Labu Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan
menghomogenkan bahan-bahan komposisi media, menampung
akuades, kultivasi mikroba dalam kultur cair, dll. Terdapat beberapa
pilihan berdasarkan volume cairan yang dapat ditampungnya yaitu 25
ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 300 ml, 500 ml, 1000 ml, dsb.
Gelas ukur (GraduatedCylinder)
Berguna untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu erlenmeyer,
gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya. Pada saat
mengukur volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan
meniskus cekung larutan.
9
)
Batang L (L rod)
Batang L bermanfaat untuk menyebarkan cairan di permukaan agar supaya
bakteri yang tersuspensi dalam cairan tersebut tersebar merata. Alat ini juga
disebut spreader.
Mortar dan Pestle
Mortar dan penumbuk (pastle) digunakan untuk
menumbuk atau menghancurkan materi cuplikan,
misal daging, roti atau tanah sebelum diproses lebih
lanjut.
Beaker Glass
Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak
fungsi. Di dalam mikrobiologi, dapat digunakan untuk preparasi
media media, menampung akuades dll..
Pembakar Bunsen (Bunsen Burner)
Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi
yang steril adalah pembakar bunsen. Api yang menyala dapat
membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan
diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara
tersebut. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang lain, bagian api
yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang
10
berwarna biru (paling panas). Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar
gas atau metanol
.
Glass Beads
GlassBeads adalah manik-manik gelas kecil yang digunakan untuk
meratakan suspensi biakan dengan menyebarkan beberapa butir di atas permukaan
agar dan digoyang merata. Glass beads digunakan pada teknik spread plate yang
fungsinya sama dengan batang L atau Spreader.
Tabung Durham
Tabung durham berbentuk mirip dengan tabung reaksi namun ukurannya
lebih kecil dan berfungsi untuk menampung/menjebak gas yang terbentuk akibat
metabolisme pada bakteri yang diujikan. Penempatannya terbalik dalam tabung
reaksi dan harus terendam sempurna dalam media (jangan sampai ada sisa udara).
Jarum Inokulum
Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan
untuk ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum
biasanya terbuat dari kawat nichrome atau platinum sehingga
dapat berpijar jika terkena panas. Bentuk ujung jarum dapat
berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating
loop/transfer loop, dan yang berbentuk lurus disebut inoculating
needle/Transfer needle. Inoculating loop cocok untuk melakukan
streak di permukaan agar, sedangkan inoculating needle cocok
digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab
inoculating). Jarum inokulum ini akan sangat bermanfaat saat
membelah agar untuk preprasi Heinrich’s Slide Culture.
Pinset
Pinset memiliki banyak fungsi diantaranya adalah untuk mengambil benda
dengan menjepit misalnya saat memindahkan cakram antibiotik.
pH Indikator Universal
Berguna untuk mengukur/mengetahui pH suatu larutan. Hal ini
sangat penting dalam pembuatan media karena pH pada media
berpengaruh terhadap petumbuhan mikroba. Kertas pH indikator
dicelupkan sampai tidak ada perubahan warna kemudian strip warna
dicocokkan dengan skala warna acuan.
Pipet Filler / Rubber Bulb
Filler adalah alat untuk menyedot larutan yang dapat dipasang pada
pangkal pipet ukur. Karet sebagai bahan filler merupakan karet yang resisten
bahan kimia. Filler memiliki 3 saluran yang masing-masing saluran memiliki
katup. Katup yang bersimbol A (aspirate) berguna untuk mengeluarkan udara dari
gelembung. S (suction) merupakan katup yang jika ditekan maka cairan dari
11
ujung pipet akan tersedot ke atas.
Kemudian katup E (exhaust) berfungsi
untuk mengeluarkan cairan dari pipet ukur.
12
MEDIA PERTUMBUHAN
A. Kompetensi : Mahasiswa dapat membuat media pertumbuhan Nutrient Agar
dan Potato Dextrose Agar
Media pertumbuhan :
a. Pengertian dan fungsi
b. Bahan-bahan media pertumbuhan
b.1 Bahan dasar
b.2 Nutrisi atau zat makanan
b.3 Bahan tambahan
b.4 Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media
c. Macam-macam media pertumbuhan
c.1 Berdasarkan sifat fisik
c.2 Berdasarkan komposisi
c.3 Berdasarkan tujuan
d. Pembuatan NutrientAgar dan NutrientBroth
e. Pembuatan PotatoDextroseAgar
Dasar Teori
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari
campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk
pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekulmolekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media
pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan
juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.
Bahan-bahan media pertumbuhan
1.
Bahan dasar
 air (H2O) sebagai pelarut

agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar
sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada
suhu 45 °C.
 gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah
polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya
adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya
dibanding agar.
 Silicagel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga
sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan
media bagi mikroorganisme autotrof obligat.
2.
Nutrisi atau zat makanan
13
Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme
sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe,
Mg dan unsur pelikan/trace element.
 Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik
atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof
memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak,
protein dan asam organik.
 Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen
lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti
urea.
 Vitamin-vitamin.
3.
Bahan tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan
tujuan tertentu, misalnya phenolred (indikator asam basa) ditambahkan
untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil
metabolisme. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan
mikroba nontarget/kontaminan.
4.
Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media
 Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk
dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai
pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther
Hesse untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak
akan larut. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan
pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan
kekuatan agar, terutama pada pH yang asam
 Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati
seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai.
Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara
memperolehnya.
 Meatextract. Meatextract mengandung basa organik terbuat dari otak,
limpa, plasenta dan daging sapi.
 Yeastextract. Yeastextract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat
alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin
(B complex).
 Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan
asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya
digunkan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol,
dll.
Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.
Macam-Macam Media Pertumbuhan
1.
Medium berdasarkan sifat fisik
 Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah
dingin media menjadi padat..
14
 Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4%
sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media
semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat
menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran
sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB
(NitrogenfreeBromthymolBlue) semisolid akan membentuk cincin hijau
kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini
dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk
mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media NitrateBroth,
kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat
tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
 Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah
NB (NutrientBroth), LB (LactoseBroth).
2.
Medium berdasarkan komposisi
 Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis
dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
 Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui
secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung
agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita
tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa
penyusunnya.
 Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang
tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari
bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar,
Pancreatic Extract..
3.
Medium berdasarkan tujuan
 Media untuk isolasi
Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan
mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
 Media selektif/penghambat
Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu
sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan
merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria
Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten
antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth
yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang
toleran terhadap garam.
 Media diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk
pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah,
serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba
tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya
membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi
15
membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile
Agar, Serum Agar, dll.
 Media untuk peremajaan kultur
Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur
Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme
suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citratemedium, yang
digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai
sumber karbon.
 Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu
mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan
adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth,
Arginine Agar.
 Media diferensial
Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya
berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial,
misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih
Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan
warna media di sekeliling koloni..
Prosedur Kerja:
Pembuatan Nutrient Agar dan Nutrient Broth
 Pembuatan Nutrient Agar
Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan
analitis untuk volume
yang diinginkan
sesuai dengan
komposisi berikut:
 Beefextract
3g
 Peptone
5g
 Agar
15 g
 Akuades
s.d 1000 ml
• Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua satu bagian untuk
melarutkan Beefextract dan peptone dan sebagian lagi untuk
melarutkan agar. Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih
banyak
• Larutkan agar pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara
konstan dan diberi panas. Dapat menggunakan kompor gas atau
hot plate stirrer (jangan sampai overheat, karena akan terbentuk
busa dan memuai sehingga tumpah).
• Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan
peptone dan beef extract, cukup dengan pengadukan.
• Setelah keduanya larut, larutan dituangkan ke larutan agar dan
diaduk sampai homogen. Kemudian
pH
media diukur
16
•
•
dengan mencelupkan kertas pH indikator. Jika pH tidak netral
maka dapat ditambahkan HCl/NaOH.
Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan
disterilisasi dengan autoklaf.
Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis. Jika
diinginkan media tegak atau miring
pada point ke 5, media langsung
dituang ke tabung kemudian
disterilisasi.
•
Pembuatan Nutrient Broth
Komposisi untuk media NB samadengan
NA tetapi tidak memakai agar sebagai
pemadat. Proses pembuatannyapun lebih
sederhana, tinggal melarutkan peptone dan
beef extract kemudian ditampung dalam
labu Erlenmeyer atau tabung reaksi dan
siap disterilisasi. Proses pembuatan ini
tidak memerlukan panas, peptone dan beef
extract akan mudah larut sempurna pada
air suhu kamar jika diaduk
Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)
 Timbang komponen media dengan menggunakan timbangan analitis untuk
volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:
 Potato/kentang
3g
 Peptone
5g
 Agar
15 g
 Akuades
s.d 1000 ml
 (sebelum ditimbang, sebaiknya kentang dikupas dan diiris kecil-kecil)
 Rebus kentang dalam sebagian akuades tadi selama 1-3 jam sampai lunak,
kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring dan memerasnya
menggunakan kertas saring lalu ditampung di Beakerglass baru.
 Agar dilarutkan dengan Hot Plate Stirrer dalam 50 ml
akuades lalu
setelah ditambahkan dekstrosa dan dihomogenkan lagi.
17
•
•
Setelah
semua larut, ekstrak kentang
dan
agardekstrosa dicampur dan dihomogenkan. Atur pH media menjadi
5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH.
Media
dituang
ke
dalam Erlenmeyer atau ke
tabung reaksi kemudian siap untuk disterilisasi.
18
STERILISASI
Kompetensi : mahasiswa mengetahui sterilisasi dengan autoklaf, filtrasi,
tyndalisasi mahasiswa dapat melakukan kerja aseptis
Sterilisasi :
1. Pengertian sterilisasi
2. Macam-macam sterilisasi
a. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi)
b. Sterilisasi secara fisik
• Pemanasan
- Dengan api langsung
- Panas kering
- Uap air panas
- Uap air panas bertekanan
• Penyinaran UV
c. Sterilisasi secara kimia dengan larutan disinfektan
3. Prosedur/Teknik aseptis
a. Mensterilkan meja kerja
b. Memindahkan biakan (streak)
c. Menuang media
d. Pipetting
4. Prinsip cara kerja autoklaf
5. Sterilisasi dengan cara penyaringan
6. Tyndalisasi
7. Sterilisasi dengan udara panas
8. Prinsip kerja Biological Safety Cabinet
Dasar Teori
Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau
benda dari semua bentuk kehidupan.
Macam-macam sterilisasi
Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara
mekanik, fisik dan kimiawi.
1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang
berpori sangat kecil (0.22mikron atau 0.45 mikrob) sehingga mikroba
tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan
yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotik.
2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.
• Pemanasan
19
a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api
secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang
L, dll.
b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C.
Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari
kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll.
c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan
yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini
supaya tidak terjadi dehidrasi.
d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf
• Penyinaran dengan UV
Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi,
misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada
permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV
3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa
desinfektan antara lain alkohol.
20
Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan
teknik aseptis
Desinfeksi meja kerja
21
22
23
24
Saran-saran kerja aseptis :
1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam
tabung/cawan/erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang
memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih
dahulu.
2. Pinset, batang L, dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu lalu
dibakar.
3. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin
dahulu atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk
mempercepat transfer panas yang terjadi.
4. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke
bagian api.
5. Jika kerja di SafetyCabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen tetapi
jika di luar Safety Cabinet maka semakin banyak sumber api maka
semakin terjamin kondisi aseptisnya
Prinsip cara kerja autoklaf
Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab pengenalan alat, autoklaf
adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang
menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 1210C. Untuk cara kerja
penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan. Suhu dan tekanan tinggi yang
diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang
lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk
mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa)
selama 15 menit. Alasan digunakan suhu 1210C atau 249,8 0F adalah karena air
mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi
pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 1000C,
sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan
tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat kejadian ini
hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian
tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf
diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20
psi supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan
akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi selama 15 menit.
Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan
akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi
autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup
uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai
tekanan dan suhu yang sesuai., maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai
menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas
dimatikan dan tekanan dibiarkan turun
perlahan hingga mencapai 0 psi.
Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum
tekanan mencapai 0 psi.
Untuk
mendeteksi
bahwa
autoklaf bekerja dengan sempurna
dapat digunakan mikroba pengguji
yang bersifat termofilik dan memiliki
25
endospora yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia
secara komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan
dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada
media. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan
baik.
Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah :
 Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim
 Paelarut organik, seperti fenol
 Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS
Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media menjadi
coklat) dan hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb :
 Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa
fosfat
 Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau
senyawa garam mineral lain.
 Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar
 Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf Jangan
mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0
Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total volumenya,
sisa ruang dibirkan kosong. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada
erlenmeyer 2L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit.
Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi)
Sterilisasi
dengan
penyaringan
dilakukan
untuk
mensterilisasi cairan yagn mudah rusak jika terkena panas atu
mudah menguap (volatile). Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke
suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa
vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk
menyaring bakteri. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini.
Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan dengan
berbagai cara :
•
Non-disposable filtration apparatus
Disedot dengan pompa vakum
- Volume 20-1000 ml
• Disposable filter cup unit
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 15-1000 ml
• Disposable filtration unit dengan botol penyimpan
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 15-1000 ml
• Syringe filters
- Ditekan seperti jarum suntik
- Volume 1-20 ml
26
•
Spin filters
- Ditekan dengan gaya setrifugasi
- Volume kurang dari 1 ml
-
Cara kerja menggunakan nondisposable filtration apparatus




Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan Bekerfeld, Chamberland
Zeitz), membran penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer penampung.
Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis (sesuai gambar), lalu isi
corong dengan larutan yang akan disterilkan.
Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum kemudian hidupkan
pompa.
setelah
semua larutan
melewati
membran
filter
dantertampung dierlenmeyer, maka larutan dapat dipindahkan
kedalam gelas penampung lain yang sudah steril dan tutup dengan kapas
atau aluminium foil yang steril.
Tyndalisasi
Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. Bahan yang
mengandung air dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan
dengan metode ini. Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan
mengalami koagulasi dan bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan
pada kondisi pH asam akan terhidrolisis.
27





Cara kerja :
Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat
dengan sumbat atau aluminium foil.
Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar
menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang).
Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu
1000C kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang
terbentuk akan mematikan mikroba).
Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan.
Setelah 24 jam, bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama,
sedang waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel
vegetatif yang belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh.
Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization)
Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas
seperti cawan petri, pipet ukur dan labu erlenmyer. Alat gelas yang disterilisasi
dengan udara panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air
(embun) didalam alat gelas.
 Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil
 Atur pengatur suhu oven menjadi 1800C dan alat disterilkan selama 2-3
jam.
Prinsip kerja Biological Saferty Cabinet
Biological Safety Cabinet merupakan kabinet kerja yang sterilkan untuk
kerja mikrobiologi. BSC memiliki suatu pengatur aliran udara yang menciptakan
aliran udara kotor (dimungkinkan ada kontaminan) untuk disaring dan
diresirkulasi melalui filter.
BSC juga disebut biosafety hood, dan juga dikenal dengan Laminar
flowhood atau Class II vertical flow cabinet yang menyediakan alat filtrasi dan
aliran udara yang bersirkulasi didalam ruang kerja. Aliran udara diatur untuk
menghambat udara luar masuk dan udara di dalam keluar, untuk mencegah
kontaminasi dari luar dan pencemaran bakteri dari ruang BSC. Udara yang keluar
disaring melewati penyaring sehingga sel-sel yang berbahaya tidak lepas keluar
ke ruangan lain. Berbagai kelas Biological Safety Cabinet.
28
BSC yang dimiliki Lab mikrobiologi merupakan BSC
kelas II yang memiliki konfigurasi udara seperti gambar
disamping ini. Udara yang berasal dari luar kabinet akan
langsung terserap masuk kesaluran bawah yang bergabung
dengan udara dari meja kerja yang dimungkinkan mengandung
bakteri yang digunakan untuk kerja. Udara dari meja kerja
disedot dari depan meja kerja. Kemudian udara kotor ini
disaring oleh penyaring HEPA dan disirkulasikan keluar
kabinet atau kembali lagi ke meja kerja sebagai udara bersih.
29
ISOLASI MIKROBA
Kompetensi: mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari campurannya sehingga
didapat kultur murni.
Isolasi Mikroorganisme:
a. Pengertian
b. Teknik Pengambilan sample
c. Isolasi dengan cara pengenceran
1) Teknik preparasi suspensi
• Swab
• Rinse
• Maserasi
2) Teknik pengenceran bertingkat
3) Teknik penanaman
• Dari suspensi (spread dan pour plate)
• Dengan goresan (streak dan quadrant streak inoculation)
d. Prosedur isolasi bakteri dari sampel
e. Prosedur isolasi jamur dari sampel
A. Dasar Teori
Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi
terdiri dari campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri
inidapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat
dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.
B. Alat dan Bahan











Tabung reaksi
Cawan Petri
Oven
Inkubator
Vortex
Tanah gembur
Air sungai/Air danau/Air kanal
Media NA
Media PDA
Aqauades
Streptomicyn/penicillin/kloramfenikol
30
C. Cara Kerja
Teknik Pengambilan Sampel
Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan
sampel.
Berikut merupakan prosedur pengambilan sampel.
1.
Sampel tanah
Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam
tanah, maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan.
Misal jika yang diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari
sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran..
2.
Sampel air
Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika
beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir
botol melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang,
botol dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air keran
maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar.
Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)
1. Teknik Preparasi Suspensi
Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades
steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau
melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah
penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel
:
a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel
yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan
atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang
kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga
seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan
sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih
dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water.
b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang
menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran
kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan
31
mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v).
Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas
dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beakerglass.
c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk
dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di
dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya
antar alain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan
pengenceran pertama adalah
: 9 (w/v). Unutk sampel dari tanah tak perlu dimaserasi
2. Teknik Pengenceran Bertingkat
Tujuan dari pengencera bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi
Jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau
banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba
dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran
pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel
mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.
Cara Kerja :
 Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung
pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi
suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama
adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse
dan swab sudah termasuk pengencer 10-1. Setelah sampel masuk lalu
dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat
pada gambar disamping)
 Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke
tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan
tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan
hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang
32
perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti,
artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang
berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika
memindahkan cairan dari sumber yang sama.
3. Teknik Penanaman
a.
Teknik penanaman dari suspensi
Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat.
Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya
untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung
pengenceran terakhir.
a.1. Spread Plate (agar tabur ulas)
Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi
bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang
dapat dilakukan adalah sebagai berikut :
 Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian
teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. Batang L atau batang
drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen
beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.
 Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar
supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan
ikut diputar.
 Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat
menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.
(
)
a.2 Pour Plate (agar tuang)
Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang
bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan
dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada
permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga
terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di
dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun
prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut :
 Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media
padat yang masih cair (>45oC)
 Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong
33

Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawanuntuk
menghomogenkan suspense bakteri dan medium, kemudian diinkubasi
Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0.1 ml untuk spread plate dan 1 ml
untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan
dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas
untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.
b.
Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau
meremajakan kultur ke dalam medium baru.
b.1 Goresan Sinambung
Cara kerja :
 Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai
setengah permukaan agar.
 Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai
habis.
Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni
tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
b.2 Goresan T
Cara kerja :
•
Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker
•
Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag
•
Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan
streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar
untuk memperoleh goresan yang sempurna
34
•
Lakukan hal yang sama pada daerah 3
•
B.3 Goresan kuadran
)
Quadrant Streak)
Cara kerja :
Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda
yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih
mengandung banyak sel mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau
disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya
terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.





Cara Kerja Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah :
Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara
aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8
Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread
plate pada medium NA, setelah selesai, diinkubasi pada 37oC selama 1x24
jam
Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni
yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali
Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru
dengan teknik streak kuadran Inkubasi 1x24 jam.
35
 Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah :
 Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80oC selama
30 menit dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan
 Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam
tabung pengenceran bertingkat
 Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke
media PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin. Kemudian
diinkubnasi pada suhu ruang 5-7 hari
 Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA
baru,
Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari.
36
ISOLASI BAKTERI DARI MAKRO ALGAE
1. Preparasi Sampel
Sampel alga yang telah dikumpulkan kemudian dibersihkan dari kotoran yang
menempel dan disimpan dalam cool box. Selanjutnya sampel disegarkan
dalam media Nutrient Broth.
a. Bagian permukaan alga
Sebanyak 15 gram sampel alga dibilas dengan 30 mL NaCl fisiologis.
Selanjutnya air bilasan dimasukkan ke dalam 30 mL media nutrient
broth lalu dikocok menggunakan shaker pada suhu kamar selama 24-48
jam.
b. Bagian dalam alga
Sebanyak 15 gram sampel alga dibilas dengan 30 mL NaCl fisiologis.
Selanjutnya, alga yang telah dibilas dihaluskan dengan menggunakan
blender dan ditambahkan NaCl fisiologis. Suspensi kemudian
dimasukkan ke dalam 30 mL media nutrient broth lalu dikocok
menggunakan shaker pada suhu kamar selama 24-48 jam.
Masing-masing sampel pada bagian permukaan dan bagian dalam
alga diambil sebanyak 1 mL dan dilakukan pengenceran bertingkat untuk
memperoleh pengenceran yang sesuai. Selanjutnya sebanyak 0,1 mL dari
pengenceran tersebut disebarkan ke dalam medium agar dan ditumbuhkan
selama 24 jam. Pemurnian bakteri dilakukan dengan menumbuhkan koloni
bakteri yang berbeda-beda dari kultur sebelumnya ke dalam cawan petri yang
mengandung media selektif M-9 produksi L – Aspraginase yang telah
dimodifikasi dengan komposisi KH2PO4 0,75 g/L, L – Asparagin 10 g/L,
NaCl 0,5 /L, MgSO4.7H2O 1,0 g/L, CaCl2.2H2O 1,0 g/L, gukosa 3 g/L, agar
20 g/L, dan indikator fenol merah 0,05 g/L. (Moorthy, 2010, dan Ghasemi,
2008). Larutan stok fenol merah dibuat 2,5 % dalam etanol pH 7 lalu
ditambahkan ke dalam medium. Medium disterilkan dalam autoclave selama
15 menit pada suhu 1210C tekanan 1 atm. Diinkubasi selama 24 jam pada
suhu 37 oC. Pada medium ini L – Asparagin digunakan sebagai sumber
nitrogen. Produksi L – Asparaginase oleh bakteri akan melepaskan amoniak
sehingga meningkatkan pH medium pembiakan. Perubahan pH membentuk
warna pink disekitar koloni yang memproduksi L – Asparaginase (Gashemi,
dkk., 2008).
37
MORFOLOGI MIKROBA
Kompetensi : mahasiswa dapat mengenali bentuk dan morfologi sel dan koloni
mikroorganisme
a. Bakteri
a.1 mengamati morfologi koloni bakteri
a.1.1 pada media cawan
a.1.2 pada agar miring
a.1.3 pada agar tegak
a.1.4 pada media cair
a.2 mengamati morfologi sel bakteri
a.2.1 dengan pewarnaan sederhana
a.2.2 dengan pewarnaan negatif
a.2.3 dengan pewarnaan gram
a.2.4 dengan pewarnaan endospora
a.3 mengamati motilitas bakteri
a.3.1 pengamatan langsung
a.3.2 pengamatan tidak langsung
b. Yeast
b.1 mengamati morfologi koloni yeast (pada agar cawan)
b.2 mengamati morfologi sel yeast (dengan pewarnaan sederhana)
c. Kapang
c.1 mengamati morfologi koloni kapang (pada agar cawan)
c.2 mengamati morfologi sel kapang (dengan metode slideculture)
A. Dasar Teori
Pengamatan Morfologi mikroba merupakan tindakan pertama kali jika
ingin mempelajari suatu jenis bakteri lebih lanjut, khususnya untuk tujuan
identifikasi. Setelah mendapatkan kultur murni maka biakan yang diinginkan
ditumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk dikenali ciri koloninya. Ciri koloni
yang diamati berupa ukuran, pigmentasi, bentuk tepi, elevasi dan pertumbuhan
pada media cair.
B. Alat dan Bahan
Isolat Bakteri
Media Nutrient Agar miring dan tegak
Media Nutrient Broth
Reagen Pewarnaan Gram
Malachite Green
Mikroskop
Jarum Inokulas
Kaca Preparat
Pipet Tetes
38
C. Prosedur Kerja
1. Pengamatan Morfologi koloni Bakteri
Cara Kerja :
 Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran
 Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang
tegak lurus
 Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stabinoculation
 Tumbuhkan biakan pada media NB
 Amati ciri-ciri pertumbuhan koloni yang tumbuh.
 Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :
 Pertumbuhan pada Cawan Petri
•
Ukuran:
pinpoint/punctiform (titik)
Small (kecil)
Moderate (sedang)
Large (besar)
•
Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen
intraseluler, beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang
dapat terlarut dalam media
• Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati
koloni.
Opaque (tidak dapat ditembus cahaya), Translucent (dapat ditembus cahaya
sebagian), Transparant (bening)
Bentuk :
Elevasi
Circular
:
Flat
Irregular
Raised
Spindle
Convex
Filamentous
Umbonate
Rhizoid
39
Permukaan :
Halus mengkilap
Kasar
Berkerut
Kering seperti bubuk
Margin
 Pertumbuhan pada Agar Miring
Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus
Ciri koloni berdasarkan bentuk:
Ciri-ciri koloni berdasar bentuk :
koloni berdasar
O2
 Ciri
Pertumbuhan
padakebutuhan
Agar Tegak
dengan
needle
Cara penanaman adalah
menusukkan jarum inokulum
ke dalam media agar tegak.
40

Pertumbuhan pada Media Cair
Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2
2. Mengamati Morfologi Sel Bakteri
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan
perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa
41
pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel
bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna
dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan
sekelilingnya ditingkatkan.
Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa,
bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan
mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang
berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih
banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada
permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue,
Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara
lain Eosin, Congo Red dll.
Pewarnaan
 Pewarnaan sederhana
 pewarnaan positif
 pewarnaan negatif
 Pewarnaan diferensial
 Pewarnaa Gram
 pewarnaan acid fast dll.
 Pewarnaan khusus
 pewarnaan endospora
 pewarnaan flagella dll.
 Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif)
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass
yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu
padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat
mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri
dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.
Cara Kerja :
 Bersihkan object glass dengan kapas
 Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass
 Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan
pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. Jangan
lupa biakan dikocok terlebih dahulu. Jika digunakan biakan padat, maka
biakan dipindahkan dengan jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian
diberi akuades dan disebarkan supaya sel merata.
 Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen
(lewatkan di atas api 2-3 kali)

Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan
pewarna (dapat digunakan Methylen blue, Safranin, CrystalViolet) dan
tunggu kurang lebih 30 detik.
42

Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue Periksa
dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10).

Pewarnaan Negatif
Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat
dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan
mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar
belakang hitam.
Cara Kerja:
 Ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan
salah satu object glass
 Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi,
lalu dicampurkan
 Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri
 Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di
atas api.
43
1
2
3
4
Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri.
Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri
Bentuk
Contoh jenis
Coccus (sphere)
Neisseria, Veillonella, Enterococcus
Coccobacilli
Moraxella, Acinetobacter
Bacilli, (rod), rounded ends
Escherichia, Lactobacilus, clostridium
Vibrio (curved)
Vibrio, Bdellovibrio, Ancylobacter dll
Bacilli (Rod), blunt end
Bacillus
Helical (spirillum)
Spirochaeta, Spirillum, campylobacter
Diplococcus
Neisseria, Moraxela
Streptococcus
Streptococcus
Streptobacillus
Bacillus, Mycobacterium
Staphylococcus
Staphylococcus
Tetrad (Gaffkya)
Deinococci, pediococcus, micrococcus
Sarcina (cuboidpackets)
Sarcina
44
 Pewarnaan Gram
Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau
tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak
pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi
menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki
dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif
mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.Berikut
merupakan prosedur pewarnaan Gram:
Cara Kerja :
Dampak/Hasil
1.Buat preparat ulas (smear) yang telah Sel bakteri tertempel pada permukaan kaca
difiksasi dari bakteri gram positif (object glas)
misal Bacillus subtilis dan gram
negatif misal Escherichia coli
2.Teteskan kristal violet sebagai Kristal ungu akan mewarnai seluruh permukaan
pewarna utama pada kedua preparat , sel bakteri gram positif dan negatif
usahakan semua ulasan terwarnai dan
tunggu selama ± 1 menit
3.Cuci dengan akuades mengalir
4.Teteskan mordant (lugol,s iodine) Adanya lugol’s iodine menyebabkan adanya
ikatan CV dengan iodine yang akan
lalu tunggu ± 1 menit
meningkatkan afinitas pengikatan zat warna
oleh bakteri. Pada gram
positif dapat terbentuk CV iodinribonukleat
pada dinding sel
5.Cuci dengan akuades mengalir
45
6.Beri larutan pemucat (ethanol 96%/
aseton) setetes demi setetes hingga
etanol yang jatuh berwarna jernih.
Jangan sampai terlalu banyak
(overdecolorize)
Penetesan
etanol
absolut
menyebabkan
terbentuknya pori-pori pada gram negatif yang
memiliki banyak lapisn lemak (lipid larut dalam
etanol), sehingga komplek CV-iodine akan lepas
dari permukaan sel gram negatif, sedangkan
pada gram positif CV-iodine tetap menempel di
dinding sel, sel gram negatif menjadi bening
7.Cuci dengan akuades mengalir
8.Teteskan counterstain (safranin) dan Safranin akan mewarnai sel gram negatif
tunggu selama ± 45 detik
menjadi berwarna merah, sedangkan gram
positif tidak terpengaruh. Counterstain hanya
berfungsi sebagai pengontras saja
9.Cuci dengan akuades mengalir
10.Keringkan preparat dengan kertas
tissue yang ditempelkan di sisi ulasan
(jangan sampai merusak ulasan) lalu
biarkan mengering di udara.
•
46
•
•
Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi
yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan
sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga
sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai
terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak
akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif
seperti gram positif.
Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda
yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada
kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram
positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel,
sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur.
Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel
seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.

Pewarnaan Endospora
Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah
bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora
merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat
inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering,
dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora
adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya
tampak jelas.
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa
pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun
jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan
inklusi (keduaduanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan
teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan prosedur pewarnaan endospora
dengan metode Schaeffer-Fulton.
47
Cara Kerja :
Dampak/Hasil
1.Buat preparat ulas dari Bacillus subtilis Sel bakteri menempel pada permukaan
lalu tutup dengan kertas merang
objectglass
2.Tetesi ulasan pada object glass dengan
Malachite green di atas kertas merang.
Letakan di atas air yang mendidih.
Biarkan 5 menit. Dijaga jangan sampai
kering. Jika bagian pinggir mulai
mengering, tambahkan lagi Malachite
Green.
Malachite green akan mewarnai sel
vegetatif bakteri. Endospora sukar
menyerap zat warna, sekali diberi zat
warna, warna tersebut sulit dilunturkan.
Untuk mewarnainya dilakukan pemanasan
untuk mempermudah penetrasi Malachite
green ke dinding endospora.
3.Setelah dingin, bilas object glass dengan Air digunakan sebagai agen dekolorasi sel.
akuades mengalir
Setelah perlakuan di atas Malachite green
tidak melekat kuat dengan sel vegetatif.
Pembilasan dengan akuades akan
melunturkan Malachite green pada sel
vegetatif
4.Tetesi dengan safranin sebagai
counter stain, diamkan selama + 45
detik
Safranin akan mewarnai sel vegetatif
menjadi merah, warna ini tidak
mempengaruhi warna hijau endospora.
5.Cuci kering anginkan
48
Pemberian Malachite green
Pelunturan dengan air mengalir
Penambahan safranin
Cuci dan keringkan
49
Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya :
Yeast / Khamir
A. Dasar Teori
Yeast merupakan fungi mikroskopik uniseluler, tidak membentuk hifa
(beberapa spesies dapat membentuk pseudohifa). Bentuk selnya bervariasi dapat
berbentuk bulat, bulat telur, bulat memanjang dengan ukuran 1-9x20 µm.
Beberapa spesies yeast memiliki sifat dimorfisme yaitu bentuk sel tunggal dan
bentuk hifa atau pseudohifa. Pseudohifa adalah hifa yeast yang terbentuk dari
rangkaian sel hasil pembelahan aseksual secara budding, tetapi tidak melepaskan
diri dari induk. Morfologi internal sel mudah dilihat dan terdiri dari inti dan
organel seperti mitkondria, grannula lemak dan glikogen.

Mengamati morfologi koloni yeast
 Tanam biakan yeast (dapat berupa Sacharomyces
cereviceae atau Candida albicans) pada PDA dengan
cara streakquadrant.
 Inkubasi selama 2x24 jam.
 Setelah didapatkan koloni tunggal, pengamatan ciriciri morfologi koloni hampir sama dengan ciri
morfologi bakteri.
50

Mengamati Morfologi Sel Yeast
1. Melihat bentuk sel east
Cara Kerja :
• Tumbuhkan Sacharomyces cereviceae pada glukosa cair selama 24 jam.
• Ulaskan suspensi biakan pada object glass lalu teteskan Methilene Blue
hingga rata (jangan difiksasi).
• Tutup preparat dengan cover glass.
• Amati dengan perbesaran 40x10 atau 100x10.
2. Melihat bentuk spora sel Yeast
Cara kerja :
• Buat preparat ulas dari biakan yeast pada Goodkowa Agar yang berumur
10 hari.
• Fiksasi dengan api bunsen.
• Warnai dengan cara Shager dan Fulgen yaitu:
Tetesi preparat dengan MalachiteGreen dan biarkan 30-60 detik. Panasi
preparat dengan api bunsen selama + 30 detik (sampai timbul uap). Cuci
preparat dengan air mengalir. Keringkan dengan tissue kemudian biarkan
pada udara terbuka. Amati di bawah mikroskop. Perhatikan spora yang
berwarna
Kapang / Jamur
Jamur merupakan mikroba dengan struktur talus berupa benang-benang
(hifa) yang terjalin seperti jala (myselium). Hifa dapat berekat (septat) dengan
inti tunggal/ lebih dan hifa tidak bersekat (aseptat). Penampakan morfologi
koloni pada umumnya seperti benang (filamentous) yang pertumbuhannya
membentuk lingkaran. Morfologi koloninya dapat dengan mudah dibedakan
dengan bakteri walaupun ada beberapa jenis bakteri yang koloninya mirip
jamur, seperti dari kelompok Actinomycetes atau Bacillus mycoides. Koloni
kapang memiliki keragaman warna yang muncul dari sporanya.
51
 Mengamati morfologi koloni kapang
Cara kerja :
 Tanam/pindahkan biakan kapang dengan jarum inokulum needle
yang diletakan di tenganh-tengah cawan petri. Inkubasi selam
beberapa hari.
 Amati pertumbuhan koloni (miselium) yang menyebar.
A. Mengamati sel morfologi kapang dengan metode SlideCulture
(Microculture)
Teknik ini bertujuan untuk mengamati sel kapang dengan menumbuhkan
spora pada object glass yang ditetesi media pertumbuhan. Pengamatan struktur
spora dan miselium dapat juga dilakukan dengan preparat ulas seperti yang telah
diuraikan di depan. Namun seringkali miselium atau susunan spora menjadi pecah
atau terputus sehingga penampakan di mikroskop dapat membingungkan. Dengan
teknik ini, spora dan miselium tumbuh langsung pada slide sehingga dapat
mengatasi masalah tersebut.
B.1 Metode Heinrich’s
cara kerja :
• Siapkan object glass, cover glass, tissue basah yang dimasukkan dalam
cawan dan sterilkan dengan autoclave.
• Setelah selesai sterilisasi berikan lilin (parafin-petrolatum) steril pada
sebelah kiri dan kanan tempat yang akan ditutup cover glass (aseptis).
• Tutup dengan cover glass.
• Teteskan suspensi spora jamur dalam media cair pada media cover glass
yang tidak diberi lilin. Berikan sampai setengah luasan cover glass. Tekan
cover galss secara media merata.
• Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam.
• Ambil preparat dan amati di bawah mikroskop.
52
B. 2 Metode Riddel
cara kerja :
• Persiapan sama seperti di atas
• Setelah semua steril, potong media Saboraud Dextrose Agar steril
berbentuk kubus dan letakkan di atas object glass.
• Inokulasikan spora jamur pada bagian atau potongan agar.
• Tutup potongan agar dengan cover glass.
• Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam.
Ambil preparat dan diamati di bawah mikroskop.
B.3 Prosedur yang lebih sederhana
carakerja :
• Sterilkan cawan petri yang berisi kapas yang di atasnya terdapat object
glass dan cover glass.
• Siapkan media PDA dan dijaga supaya tetap cair.
• Teteskan media PDA pada object glass secara aseptis lalu tunggu
memadat (teteskan jangan terlalu banyak).
• Belah media yang memadat dengan jarum inokulum yang berujung L.
• Ulaskan spora jamur yang akan diamati pada belahan tersebut.
• Tutup dengan cover glass tepat di atas media dan tekan hingga merata.
• Inkubasi selama 2x24 jam.
• Amati pertumbuhan miselium dan spora pada object glass dengan
perbesaran sedang
53
54
FAKTOR LINGKUNGAN YANG BERPENGARUH
TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME
Kompetensi: mahasiswa mengetahui pengaruh suhu, tekanan sinar UV dan pH
terhadap pertumbuhuan Mikroorganisme
a.
b.
c.
d.
Faktor lingkungan :
pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme
pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme
pengaruh sinar ultraviolet tehadap pertumbuhan mikroorganisme
pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorganisme
Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme
A. Dasar teori
Berdasarkan suhu optimum untuk pertumbuhan maka dapat
dikelompokan menjadi 3 yaitu : 1. psikrofilik(0-200C), 2. mesofilik Mesofilik
(20-300C), 3. termofilik (50-1000C). Suhu merupakan faktor lingkungan yang
sangat menentukan kehidupan mikroorganisme, pengaruh suhu berhubungan
dengan aktivitas enzim. Suhu rendah menyebabkan aktiivtas enzim menurun dan
jika suhu terlalu tinggi dapat mendenaturasi protein enzim.
B. Alat dan Bahan
Isolat bakteri E.coli dan Bacillus sp
Media Nutrient Broth
Tabung reaksi
Inkubator
C. Cara Kerja :
 8x2 tabung yang berisi Nutrient Broth untuk suhu inkubasi 50C, 250C,
370C, dan 500C dan mikroorganisma yang berbeda (E.coli dan Bacillus
sp.) diberi label . Setelah diinokulasi dengan bekteri yang berbeda,
diinkubasi sesuai suhu yang tertera
 setelah ditumbuhkan selama 48 jam, bandingkan derajat kekeruhannya.
55
Pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme
A. Dasar Teori
Keberadaan mikroorganisma dilingkungan dapat dipengaruhi kepekatan
suspensi/cairan di lingkungan. Bila kepekatan suspensi di lingkungan tinggi
maka isi sel akan ke luar. Sebaliknya kepekatan suspensi dilingkungan rendah
maka akan terjadi pergerakan massa cair ke dalam sel
B.
Alat dan Bahan
Isolat bakteri E.coli dan Bacillus sp
Media Nutrient Agar
NaCl
Tabung reaksi
Inkubator
C.Cara Kerja:
 Buat 4 buah cawan NutrientAgar
yang mengandung NaCl 0,5%, 3%,
5% dan 15%.
 Setiap konsentrasi, cawan dibagi
menjadi 2 dengan spidol kemudian
labeli dengan bakteri E.coli dan
Bacillus sp.
 Inokulasikan E.coli dan Bacillus sp.
dengan streak kontinyu
 Gunakan kontrol untuk masingmasing biakan dengan media yang
tidak ditambahi NaCl.
 Inkubasi selama 48 jam dan amati
pertumbuhannya
Pengaruh sinar ultraviolet terhadap pertumbuhan mikroorganisme
A. Dasar Teori
Sinar UV panjang gelombang 210-300 nm dapat
membunuh
mikroorganisme
jika di paparkan. Komponen seluler yang dapat
menyerap sinar UV adalah asam nukleat sehingga dapat rusak dan
menyebabkan kematian.
B. Alat dan Bahan
Isolat bakteri E.coli dan Bacillus sp
Aspergillus sp
Media Nutrient Agar
NaCl
Lampu UV
Inkubator
56
C. Cara Kerja:
 Inokulasikan Aspergillus sp., E.coli dan Bacillus sp. pada 3 cawan NA.
 Dedahkan ketiga cawan tersebut pada sinar UV dengan panjang 254 nm
selama 1 menit, 5 menit, dan 15 menit (ingat tutup cawan dibuka dan
diusahakan lingkungan sekitar steril). Jarak antar UV dan cawan sekitar 12
inchi
 Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan tidak memaparkan
pada sinar UV
 Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhan koloninya
Pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorgansime
A. Dasar Teori
pH berpengaruh terhadap sel dengan mempengaruhi metabolisme, pada
umumnya bakteri tumbuh dengan baik pada pH netral (7,0). Berdasarkan nilai
pH yang dibutuhkan untuk kehidupannya dikenal 3 kelompok mikroorganisme
yaitu : Acidofilik, 2 Mesofilik/Neutrofilik dan 3. Basofilik
B. Alat dan Bahan
Isolat bakteri E.coli dan Bacillus sp
Aspergillus sp
Lampu UV
Media Nutrient Agar
Inkubator
NaCl
C. Cara Kerja :
 Buatlah tabung reaksi berisi NB dan atur pH-nya (pH 3, 7 dan 9) masingmasing 2 tabung untuk tiap nilai pH
 Labeli dengan
nama bakteri
yang akan diinokulasikan
 Inokulasi tiap tabung dengan Bacillus sp dan E.coli lalu diinkubasi pada
suhu 370C selama 48 jam
 Amati perbedaan kekeruhan pada tiap nilai pH
57
58
ANALISA COLIFORM BERDASARKAN NILAI MPN
Kompetensi: Mengetahui kualitas sampel yang diuji berdasarkan nilai MPN coliform
A. Dasar teori
MPN (Most Probable Number) atau angka perkiraan terdekat merupakan suatu cara
untuk menganalisa bakteri golongan coli yang memiliki kemampuan memfermentasi
laktosa dan menghasilkan gas, yang merupakan parameter pencemaran suatu sampel air.
Analisisi MPN coliform berlangsung dalam tiga tahap utama, yaitu uji penduga
(Presumtive Test), uji penguat (Corfirmed Test) dan uji kepastian atau pelengkap
(Complete Test).
Uji penduga dilakukan untuk mendeteksi bakteri koliform yang teramat kecil
porsinya dalam air terutama untuk air minum kemasan maupun bahan pangan lainnya.
Nilai MPN yang ditunjukkan berdasarkan kombinasi tabung positif dan negatif tersebut
tidak menunjukkan konsentrasi yang sebenarnya, namun berlaku sebagai penunjuk angka
bakteri koliform dengan derajat kepercayaan (level of significant) dalam arti statistik
sebesar 95%.
Uji penguat atau penegas dilakukan agar uji positif pada uji penduga dapat lebih
tegas menunjukkan bahwa bakteri yang mengkontaminasi sampel air merupakan bakteri
coli fekal atau bakteri coli yang berasal dari tinja. Penentuan nilai MPN juga ditunjukkan
berdasarkan kombinasi tabung positif dan negatif yang dicocokkan dengan tabel MPN.
Tabung positif pada uji penguat, kemudian dilanjutkan dengan uji pelengkap atau
kepastian yaitu dengan menggunakan medium Mic Concey Agar (MCA). Uji ini bertujuan
untuk memastikan bahwa bakteri yang tumbuh merupakan Escherichia coli. Dapat pula
langsung dilakukan dengan pengamatan bentuk sel, pengecatan spora pengecatan gram
pada bakteri yang tersebut.
Analisa MPN koliform berlangsung dalam 3 tahap utama yaitu:
1. Uji Penduga (Presumtive Test)
a. Alat dan bahan :
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
Sampel air (air minum kantin, air isi ulang dan air mineral)
9 tabung berisi LB @ 10 ml + tabung durham
BTB (Bromtimol Blue) 10%.
Spoit 10 ml
Bunsen
Rak tabung
Kapas
Inkubator
59
b. Cara kerja :
1) Siapkan medium LB steril + BTB di dalam 9 tabung reaksi yang masing-masing telah
dimasukkan tabung durham.
2) Buat pengenceran 10-1, 10-2, dan 10-3 dari sampel.
3) Masukkan masing-masing 1 ml dari setiap seri pengenceran ke dalam medium LB
(sudah ditetesi larutan indikator BTB).
4) Kocok dengan hati-hati hingga sampel homogen dan tutup mulut tabung reaksi dengan
kapas.
5) Inkubasi semua tabung pada suhu 37oC.
6) Pada 1 x 24 pertama, amati perubahan yang terjadi yaitu reaksi positif bila warna
medium berubah dari hijau menjadi kuning dan ada gas dalam tabung durham. Jika
belum terjadi perubahan inkubasi dilanjutkan sampai maksimal 2 x 24 jam.
7) Berdasarkan pengamatan tersebut, tentukan kombinasi MPN yang dihasilkan,
selanjutnya hitung MPN koliform sampel dengan mencocokkan kombinasi MPN
tersebut pada tabel .
Misal :
didapatkan kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform
adalah 150 sel/100 ml = 1,5 x 102 sel/ml
60
2. Uji Penguat (Confirmed Test)
a. Alat dan bahan :
1) Tabung dari uji penduga yang positif
2) Medium EMBA atau ENDO Agar
3) Jarum inokulasi (ose)
4) Cawan petri
5) Bunsen
6) Inkubator
61
b. Cara kerja :
1) Siapkan medium EMBA atau ENDO Agar lempeng pada cawan petri (kondisi
steril).
2) Dari tabung yang memberi reaksi positif pada uji penduga di inokulasikan atau
digores dengan cara goresan kuadran pada medium EMBA atau ENDO Agar yang
telah disiapkan di atas.
3) Inkubasi pada suhu 37oC selama 1 x 24 jam.
4) Uji positif bila terdapat koloni hijau metalik dengan titik hitam ditengah koloni
pada medium EMBA atau koloni merah hitam metalik pada medium ENDO Agar.
5) Koloni bakteri pada medium lempeng tersebut kemudian dimurnikan dan disimpan
di medium agar miring.
3. Uji Pelengkap (Complete Test)
a. Alat dan bahan :
1) Biakan bakteri dari uji penguat
2) Larutan gram A, B, C dan D
3) Aquades steril
4) Alkohol 70%
5) Jarum inokulasi (ose)
6) Gelas obyek
7) Mikroskop
b. Cara kerja :
1) Koloni yang berwarna hijau metalik dengan titik hitam ditengah koloni pada
medium EMBA atau koloni merah hitam metalik pada medium ENDO Agar di
inokulasikan dan disuspensikan dengan cara menginokulasikan 3 ose ke dalam 10
ml aquades steril kemudian dihomogenkan dengan dikocok perlahan.
2) Bersihkan gelas objek dengn alkohol 70 % agar bebas lemak.
3) Ambil secara aseptis 1 ose suspensi bakteri dan ratakan diatas gelas objek seluas +
1 cm2.
4) Biarkan mengering di udara, lalu fiksasi di atas api spritus.
5) Teteskan larutan Gram A sebanyak 2 tetes dan biarakan selama 2 menit.
6) Cuci dengan air mengalir, keringkan dengan kertas isap secara hati-hati.
62
7) Teteskan larutan Gram B, biarkan selama 1 – 2 menit.
8) Cuci dengan air mengalir, keringkan.
9) Teteskan larutan Gram C, biarkan selama 30 detik.
10) Cuci dengan air mengalir dan biarkan mengering.
11) Teteskan larutan Gram D sebanyak 2 – 3 tetes, biarkan selama 1 menit, lalu cuci
dengan air mengalir. Biarkan mengering.
12) Tentukan hasil pewarnaan gram bakteri tersebut, jika gram negatif berarti positif
E.coli.
13) Amati bentuk sel bakteri tersebut, jika berbentuk batang berarti positif E.coli.
63
ANALISA Staphylococcus aureus PADA BAHAN PANGAN
Isolasi Staphylococcus aureus dengan metode cawan hitung (plate count) agar
sebar
Kompetensi: Mengetahui kualitas sampel yang diuji berdasarkan jumlah total bakteri
Alat:
1. Autoclave
7. Gelas Ukur
2. Colony Counter
8. Gelas Preparat
3. Neraca analitik
9. Inkubator
4. Botol pengencer
10. Pipet
5. Batang Gelas Bengkok
11.Water Bath
6. Cawan Petri
Bahan:
1. Ikan segar, nugget dan ayam
goreng krispi
2. Baird Parker Agar
3. Buffer Posfat
4. Brain Heart Infusion Broth
5. Parafin oil steril
6. Pereaksi katalase
7. Pereaksi pewarnaan Gram
8. Purple
Carbohydrate
(masing-masing
Broth
mengandung
glucose dan manitol 0.5%)
9. Trypticase Soy Agar
64
A. Isolasi Staphylococcus aureus
1. Timbang 1 gr sampel dan homogenkan dalam 10 ml buffer posfat sebagai pengeceran
10-1.
2. Secara aseptis pindahkan 1 ml sampel untuk membuat pengenceran 10-2, 10-3, dst.
3. Masukkan dalam sebanyak 0,1 ml ke dalam 3 cawan yang berisi media Baird Parker
Agar.
4. Ratakan inokulum dengan menggunakan batang gelas bengkok dan biarkan inokulum
teresap ke dalam media kira-kira 10 menit dalam media Baird Parker Agar kering.
Bila belum terserap, letakkan cawan dalam inkubator Dalam posisi menghadap ke atas
sekitar 1 jam. Balik cawan petri dan inkubasi 45-48 jam.
5. Koloni Staphylococcus aureus pada Baird Parker Agar mempunyai ciri-ciri koloni
bundar, licin/halus, cembung, diameter 2-3 mm, warna abu-abu hingga kehitaman,
sekeliling tepi koloni bening (terbentuk halo). Koloni-koloni mempunyai konsistensi
berlemak dan lengket bila diambil dengan jarum inokulasi.
6. Hitung jumlah koloni pada cawan yang mempunyai jumlah koloni 30-300 koloni.
7. Cara perhitungan SPC terdapat pada lampiran
8. Ambil 2 atau lebih koloni terduga untuk uji koagulase dan uji tambahan
B. Uji Koagulase
1. Inokulasi koloni terduga Staphylococcus aureus ke dalam 2 ml BHI broth dan
inkubasi selama 18-24 jam.
2. Pindahkan 0,2 ml – 0,3 ml inokulum tersebut ke dalam tabung steril dan tambahkan
0,5 ml koagulasi plasma kemudian aduk. inkubasi dan amati setiap jam untuk 4 jam
pertama dan lanjutkan hingga 24 jam untuk melihat terbentuknya koagulan.
3. Koagulan yang terbentuk secara padat/solid an tidak jatuh apabila tabung dibalik
dinyatkan positif (reaksi 4+) Staphylococcus aureus. Koagulan yang menunjukkan
reaksi 2+ dan 3+ harus dilakukan uji tambahan.
65
C. Uji tambahan
a. Uji Katalase
1.
ambil 1 ose inokulum dari BHi broth goreskan ke dalam media TSA miring dan
inkubasi selama 18 jam – 24 jam.
2.
Stelah diinkubasi ambil 1 ose inokulum dan letakkan di atas gelas preparat, tetesi
dengan H2O2 untuk melihat pembentukan gelembung-gelembung gas.
b. Fermentasi glukosa secara anaerob
1. Ambil 1 ose inokulum dari BHI broth. Inokulasikan ke tabung reaksi yang berisi
media karbohidrat mengandung 0,5% glukosa, tutup lapisan atas dengan paraffin oil
steril setebal 25 mm.
2. Inkubasi selama 5 hari. Kondisi asam dihasilkan secara anaerob jika terjadi perunahan
warna ungu media menjadi kuning, ini menunjukkan adanya Staphylococcus aureus.
c.
Fermentasi manitol secara anaerob
Lakukan langkah seperti pada ferementasi glukosa dengan manitol sebagai
karbohidrat dalam media. Staphylococcus aureus biasanya memberikan hasil positif
yang ditunjukkan dengan terjadinya perubahan ungu ke kuning, tetapi beberapa strain
biasanya memberikan hasil negatif.
d.
Uji produksi nuklease thermostabil
1. Tuang 3 ml toluidine blue-DNA agar di atas permukaan preparat. Setelah media
membeku, lubangi dengan diameter 2 mm.
2. Ambil 0,1 ml kultur BHI broth yang telah dipanaskan dalam waterbath mendidih
pada suhu 100 °C selama 15 menit
3. Letakkan gelas preparat pada kondisi yang lembab dan inkubasi selama 4 jam.
Apabila terbentuk lingkaran berwarna merah muda cerah di sekeliling lubang
sekurang-kurangnya 1 mm, menunjukkan reaksi positif.
66
UJI BIOKIMIA (UJI IMVIC)
Kompetensi: Mahasiswa
biokimianya
mampu mengidentifikasi mikroba berdasarkan kemampuan
A. Dasar Teori
Uji IMVIC merupakan cara untuk membedakan sesama mikroba yang termasuk dalam
kelompok enterobacteriaceae, dengan sasarannya adalah Escherichia coli. Pembedaan
anggota kelompok tersebut didasarkan proses biokimia dan reaksi enzimatis dari bakteri yang
menghasilkan
suatu
substrat
spesifik.
Sebagai
contoh
E.
coli
sebagai
anggota
enterobacteriaceae bersifat dapat memfermentasi laktosa mengahsilkan asam. Uji IMViC
terdiri dari serangkaian uji biokimia yaitu: Uji Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer dan
Citrate. Suatu bakteri yang diisolasi dari bahan pangan diidentifikassi sebagai E.coli jika
hasil uji IMVic = + + - -.
Aktivitas enzimatik tryptophanase dari bakteri yang dapat mengoksidasi asam amino
tryptophan dikonversi menjadi produk metabolik berupa indol. Indol adalah suatu
persenyawaan nitrogen yang kompleks yang dihasilkan bakteri sebagai hasil dari penguraian
protein. Indol hanya terbentuk dari asam amino tryptophan, dan triptopan tersebut berasal dari
pepton dalam komposisi medium. Indol dapat dideteksi dengan penambahan pereaksi
Kovac’s yang mengandung p-dimetil amino bensaldehid, butanol dan HCl. Reaksi ini
menghasilkan lapisan warna merah Chery pada permukaan biakan.
Tryptophan
Tryptopha
Indol + asam piruvat + NH3
nase
Indol + p-dimetil amino bensadehid
b
ut
Lapisan warna merah
+
Uji Methyl Red dilakukan untuk melihat kemampuan bakteri untuk memfermentasi
glukosa menghasilkan asam yang dapat dideteksi dengan penambahan pereaksi methyl Red
sehingga warna biakan menjadi merah. E.coli bersifat dapat memfermentasi glukosa.
Uji Voges-Proskauer dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
memfermentasi glukosa dengan hasil akhir berupa senyawa non asam atau senyawa netral
misalnya asetil metil karbinol. Senyawa ini, dengan penambahan KOH 40% dan larutan αnaftol sebagai katalisator akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna merah muda
67
(menunjukkan reaksi positif). E.coli tidak mampu menghansilkan senyawa tersebut, sehingga
hasil reaksinya negatif.
Uji Citrat dilakukan untuk melihat kemampuan bakteri memanfaatkan citrat sebagai
sumber karbon tanpa adanya glukosa maupun laktosa. E.coli tidak dapat tumbuh pada media
ini, karena tidak mampu menggunakan citrat sebagai sumber karbon, sehingga warna media
tidak berubah.
A. Uji Indol
1. Tujuan: Untuk menunjukkan ada tidaknya senyawa indol yang dihasilkan oleh suatu
biakan bakteri .
2. Alat dan Bahan
a. Jarum ose
b. Biakan E.coli dan Staphylococcus
c. Medium sim (sulfit indol motility) atau tripton 1% broth
d. Reagen kovac’s
3. Prosedur kerja :
a. Inokulasikan secara tusuk tegak(stab) biakan bakteri pada medium sim atau 1 ose pada
medium tripton 1% broth.
b. Biarkan satu tabung tidak diinokulasikan dan gunakan sebagai kontrol.
c. Inkubasikan pada suhu 37oc selama 48 jam.
d. Tambahkan 5 tetes (1 ml) reagen kovac’s kedalam setiap tabung termasuk kontrol.
e. Kocoklah perlahan-lahan dan biarkan tabung berada dalam posisi tegak.
f. Amati permukaan medium. Terbentuknya cincin merah tua pada permukaan medium
menunjukkan indol positif. Bandingkan dengan kontrol.
68
B. Uji Methyl Red
1. Tujuan : Untuk mengetahui kemampuan mikroba membentuk
asam dari hidrolisis
glukosa.
2. Alat dan bahan :
a. Jarum ose
b. Biakan E.coli dan Staphylococcus
c. Medium MR-VP
d. Biakan
3. Cara kerja:
a. Inokulasikan ke dalam medium MR-VP dengan 1 jarum ose biakan bakteri.
b. Inkubasi selama 72 jam pada suhu 37oc.
c. Tetes 3 tetes reagen Methyl Red.
d. Amati permukaan medium. Terbentuknya warna merah menunjukkan uji Methyl Red
positif. Bandingkan dengan kontrol.
69
C. Uji Voges-proskauer
1. Tujuan : Untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme menghasilkan senyawa
acetyl carbinol atau 2,3 butandiol.
2. Alat dan bahan
a. Jarum ose
b. Medium MR-VP
c. Biakan E.coli dan Staphylococcus
d. Reagen barrit (α-naftol 50% dan KOH 40%)
3. Cara kerja :
a. Inokulasikan medium MR-VP dengan 1 ose biakan yang telah disiapkan
b. Inkubasi pada suhu 37oc selama 72 jam.
c. Tambahkan 0,6 ml reagen α-naftol 5% dan 0,5 ml KOH 40%. Lalu kocok perlahanlahan selama beberapa menit.
d. Amati permukaan medium. Terbentuknya warna merah tua menunjukkan uji VP
positif. Bandingkan dengan kontrol.
70
D. Uji Citrat
1. Tujuan : Untuk mengetahui kemampuan mikroba memanfaatkan sitrat sebagai satusatunya sumber karbon.
2. Alat dan bahan
a. Jarum ose
b. Media Simon Citrate Agar (SCA)
c. Biakan E.coli dan Staphylococcus
3. Cara kerja :
a. Inokulasikan biakan bakteri kedalam medium SCA miring.
b. Biarkan 1 tabung tidak diinokulasikan dan gunakan sebagai kontrol
c. Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oc.
d. Amati pertumbuhan mikroba. Perubahan medium dari hijau menjadi biru menunjukkan
uji citrat positif.
71
DAYA KERJA ANTIMIKROBA DAN OLIGODINAMIK
Kompetensi : mahasiswa mengetahui cara kerja pengujian oligodinamik dan zat antimikroba
A. Dasar Teori
Pengertian dan Jenis Antibiotik
Antibiotik adalah bahan yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau sintetis yang
dalam jumlah kecil mampu menekan menghambat atau membunuh mikroorganisme
lainnya. Antibiotik memiliki spektrum aktivitas antibiosis yang beragam.
Antibiotik dikelompokkan berdasarkan gugus aktifnya, misal antibiotik macrolide,
antimikroba peptida. Adapun penamaannya biasanya berdasarkan gugus kimiawinya
ataupun mikroorganisma produsernya, misalnya:
ragam antibakteria:
 Penicillin dan cephalosporin

Erythromycine

Sulfadrugs

Trimethoprim dan sulfamethoxazole

Polymyxin B

Quinolone

Tetracycline
Antifungi :

Nystatin
 Azoles
Mekanisme kerja antibiotik antara lain :
• Menghambat sintesis dinding sel
• Merusak permeabilitas membran sel.
• Menghambat sintesis RNA (proses transkripsi)
• Menghambat sintesis protein (proses translasi).
• Menghambat replikasi DNA.
72
Prosedur difusi-kertas cakram-agar yang distandardisasikan (metode KirbyBauer)
merupakan cara untuk menentukan sensitivitas antibiotik untuk bakteri. Sensitivitas suatu
bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona hambat yang
terbentuk.
Semakin
besar diameternya maka semakin
terhambat
pertumbuhannya, sehingga diperlukan standar acuan untuk menentukan apakah bakteri itu
resisten atau peka terhadap suatu antibiotik.
Faktor yang mempengaruhi metode Kirby-Bauer :
- Konsentrasi mikroba uji
- Konsentrasi antibiotik yang terdapat dalam cakram
- Jenis antibiotik.
- pH medium.
1. Pengujian Antibiotik dengan Metode Kirby-Bauer
Alat dan Bahan
Cawan petri
Kertas cakram
Biakan E.coli dan Staphylococcus
Media Mueller Hilton Agar
Antibiotik Ampisilin dan Kanamisin
Cara kerja:
• Inokulasikan biakan pada Mueller-Hinton Agar dengan metode sebar
• Biarkan cawan selama 5 menit
• Kertas cakram dicelupkan dalam larutan antibiotik dengan konsentrasi tertentu.
• Angkat, biarkan sejenak agar tiris, selanjutnya letakkan kertas cakram pada
permukaan agar.
73
• Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel sempurna di
permukaan agar.
• Inkubasi pada suhu 37 0C selama 24-48 jam.
• Ukur diameter zona hambat (mm) kemudian bandingkan dengan tabel. sensitivitas
antibiotik.
Cara menginterpretasikan :
 Ukur diameter zona hambat (zona jernih)
 Misal didapatkan zona hambat suatu bakteri berdiameter 26 mm untuk
Eryhtromycin.
 Maka interpretasinya adalah bakteri tersebut peka terhadap antibiotik
Eryhtromycin.
 Resistent : tahan
 Intermediate : medium
 Susceptible : peka
2.
Pengujian Pengaruh Daya Oligodinamik
Logam-logam berat seperti Hg, Cu, Ag dan Pb bersifat racun terhadap sel
meskipun hanya dalam kadar rendah. Logam mengalami ionisasi dan ion-ion tersebut
bereaksi dengan bagian sulfihidril pada protein sel sehingga menyebabkan denaturasi.
Daya hambat atau mematikan dari logam dengan konsentrasi yang rendah disebut
daya oligodinamik.
Alat dan Bahan
Cawan petri
Biakan E.coli dan Staphylococcus
Kertas cakram
Media Nutrient Agar(NA)
Lempeng logam tembaga dan seng
74
Cara Kerja :
•
•
•
•
Inokulasikan E.coli dan Bacillus sp. pada cawan NA dengan streak kontinyu
Letakan koin tembaga dan seng ke dalam cawan dengan pinset
Inkubasi 370C selama 48 jam
Hitung zona hambat yang terbentuk dengan mengukur diameter daerah yang jernih atau
tidak ada pertumbuhan
75
AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME
Kompetensi : mahasiswa mengetahui beberapa teknik uji aktivitas enzimatik.
Aktivitas enzimatis mikroorganisme :
a.Uji aktivitas eksoenzim :
 Uji amilolitik
 Uji lipolitik
 Uji proteolitik
b. Uji aktivitas endoenzim :
 Uji oksidase
 Uji katalase
 Uji Triple Sugar Iron Agar
1. Uji Amilolitik
A. Dasar Teori
Amilum adalah senyawa yang memiliki berat molekul tinggi, terdiri atas polimer
glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. Degradasi amilum
membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis menjadi polisakarida
yang lebih pendek (dextrin), dan selanjutnya menjadi maltosa. Hidrolisis akhir maltosa
menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel. Indikator yang
dipakai pada uji amilolitik adalah iodine. Amilum akan bereaksi dengan iodine
membentuk warna biru hitam yang terlihat pada media.
Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase. NA yang tersuspensi pati
digunakan sebagai media. Indikator yang dipakai adalah iodine. Amilum akan bereaksi
dengan iodine membentuk komplex warna biru hitam yang terlihat pada media. Warna
biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang
berbentuk spiral.
76
B. Alat dan Bahan
Cawan petri
Jarum inokulasi
Biakan E.coli dan Staphylococcus sp
Media NutrientAgar-pati
lugol’siodine
C. Cara Kerja :
•
•
•
•
Inokulasi NutrientAgar yang mengandung pati (2 g/l) dengan E.coli dan
Staphylococcus sp. secara streak.
Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC
Setelah selesai inkubasi, tetesi cawan dengan lugol’siodine secukupnya sehingga
seluruh permukaan media terkena.
Hidrolisis zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni, sedangkan hasil
negatif ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam.
2. Uji Lipolitik
A. Dasar Teori
Lipid misalnya trigliserida merupakan sumber energi bagi sejumlah mikroorganisma.
Untuk mendapatkan energi dari lipid, mikroba menghasilkan enzim lipase dan esterase yang
memecah ikatan ester menghasilkan gliserol dan asam lemak.
Terdapat berbagai macam prosedur untuk mengetahui aktivitas lipase diantaranya adalah
dengan menggunakan media TrybutirinAgar, RodhamineAgar dan SpiritBlueAgar. Pada
prinsipnya metode-metode di atas menggunakan indikator yang mampu mendeteksi
keberadaan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis lemak.
B. Alat dan Bahan
Cawan petri
Jarum inokulasi
•
•
Biakan E.coli dan Staphylococcus sp
Media Tributyrin Agar
Neutra Red
lugol’siodine
C. Cara Kerja :
Inokulasikan Staphylococcus sp. dan E. coli pada mediaTributyrin Agar dengan indikator
neutral red
Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.
77
•
Reaksi positif ditandai oleh bercak-bercak kuning disekeliling koloni, sedangkan reaksi
negatif ditandai oleh bercak-bercak yang tetap berwarna merah.
3. Uji proteolitik
A. Dasar Teori
Uji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
menghasilkan enzim protease. Pada praktikum ini protein yang digunakan dalam bentuk
kasein susu. Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan monomernya berupa asam
amino. Proses ini disebut peptonisasi atau proteolysis.
B. Alat dan Bahan
Cawan petri
Jarum inokulasi
Biakan E.coli dan Staphylococcus sp
Media Skim Milk Agar (SMA)
C. Cara Kerja
Inkubasi
• Inokulasikan Staphylococcus sp. Dan E. coli pada Skim Milk Agar (SMA)
o
pada suhu 37 C selama 48 jam.
• Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih di sekeliling koloni.
78
4. Uji Oksidase
A. Dasar Teori
Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron selama respirasi
aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh molekul
oksigen. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob, fakultatif anaerob, dan mikroaerofilik.
Mikroorganisme ini menggunakan oksigen, sebagai akseptor elektron terakhir selama
penguraian karbohidrat untuk menghsilkan energi. Kemampuan bakteri memproduksi
sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen
oksidase pada koloni bakteri. Enzim ini merupakan bagian dari kompleks enzim yang
berperan dalam proses fosforilasi oksidatif. Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-Dphenylenediaminedihydrocloride. Reagen akan mendonorkan elektron terhadap enzim ini
sehingga akan teroksidasi membentuk senyawa yang berwarna biru kehitaman. Positif
tertunda (warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi) menandakan bahwa bakteri
uji memiliki sedikit enzim. Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang
dilakukan negatif.
B. Alat dan Bahan
Biakan cair E.coli dan Staphylococcus sp
Objek gelas
•
•
•
•
C. Cara Kerja :
Koloni bakteri diambil satu tetes (sebaiknya dari biakan cair) secara aseptis dan
diinokulasikan pada Objectglass.
Diatas object glass diberi kertas merang yang sehingga tetesan tersebar pada kertas.
Tetesi dengan reagen, lalu lihat perubahan yang terjadi
Jika warna berubah menjadi biru marun maka hasil uji positif, sedangkan bila tidak terjadi
perubahan maka hasil uji negatif. Hasil uji positif tertunda jika warna biru
muncul antara 10 -60 detik setelah ditetesi.
79
5.
Uji katalase
A. Dasar Teori
Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif), mikroorganisme
menghasilkan hidrogen peroksida, bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang
sangat beracun. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkan kematian pada
mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik, fakultatif aerob
maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur respirasi aerobik.
Superoksida dismutase adalah enzim yang
bertanggung jawab untuk penguraian khususnya
superoksida pada organisme aerob yang bersifat
katalase negatif. Produksi katalase bisa diidentifikasi
dengan menanmbahkan reagen H2O2 pada suspensi
bakteri. Jika dihasilkan gelembung gas, berarti bakteri
tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Jika
tidak dihasilkan gelembung gas berarti uji katalase
dinyatakan negatif.
.
80
B. Alat dan Bahan
Biakan cair E.coli dan Staphylococcus sp
Objek Gelas
C. Cara Kerja :



Koloni bakteri diambil satu ose secara aseptis dan diinokulasikan pada
Dengan menggunakan pipet tetes, 3% H2O2 diteteskan pada Objectglass secukupnya.
Amati adanya gelembung untuk hasil positif dan tidak ada gelembung untuk hasil
negatif (hati-hati membedakan antara gelembung yang muncul dari sel dengan
kumpulan sel yang mengambang akibat ditambahi reagen).
Uji Triple Sugar Iron Agar
A. Dasar Teori
TSIA adalah uji yang dirancang untuk membedakan beberapa jenis bakteri yang
termasuk
kelompok Enterobacteriaceae, yang bersifat gram negatif dan
memfermentasikan glukosa membentuk asam sehingga dapat dibedakan dengan bakteri
gram negatif intestinal lain. Perbedaan ini didasarkan pada pola fermentasi karbohidrat
dan produksi H2S pada tabung reaksi. Untuk mengamati fermentasi karbohidrat, media
TSIA mengandung laktosa dan sukrosa dengan konsentrasi 1%, dan mengandung glukosa
dengan konsentrasi yang lebih rendah yaitu 0,1%. Konsentrasi ini akan berpengaruh
terhadap penggunaan karbohidrat dan keadaan asam yang terbentuk. Indikator pH
(Phenol Red) ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan pH akibat fermentasi
karbohidrat. Perubahan warna menjadi kuning menandakan asam, sedangkan warna
menjadi lebih merah menendakan media menjadi basa. Warna media mula-mula adalah
merah-orange. Selain itu ditambahkan FeSO4 untuk mendeteksi adanya gas H2S.
B. Alat dan Bahan
Biakan E.coli dan Staphylococcus sp
media TSIA
6.
C. Cara kerja :
 Inokulasikan biakan pada media TSIA dengan cara inokulasi tusuk kemudian
dilanjutkan dengan diulaskan lurus tegak pada agar miring (lihat gambar).
 Inkubasi pada 37oC selama 24-48 jam.
 Interpretasikan hasil dengan melihat keterangan dibawah ini.
81
= slantdan butt merah (alkali) atau tidak terjadi perubahan warna
tidakterjadi fermentasi karbohidrat, sedangkan pepton yang ada digunakan
untuk sumber energi dalam keadaan aerob atau anaerob sehingga
meningkatkan pH karena produksi amonia meningkat sebagai hasil samping
metabolisme. Jika kemerahan lebih pekat pada slant maka terjadi degradasi
protein aerobik peptone, sedangkan warna merah pekat tampak di semua
media maka interpretasinya adalah degradasi peptone secara aerob maupun
anaerob.
= slant merah (alkali) sedangkan butt kuning (asam) dengan atau tanpa produksi gas
hanya terjadi fermentasi glukosa, sedangkan fermentasi laktosa dan sukrosa tidak
terjadi. Sel lebih memilih untuk mendegradasi glukosa terlebih dahulu karena
glukosa adalah monosakarida yang dapat langsung massuk ke dalam jalur
metabolisme (glikolisis). Media mengandung glukosa yang sangat sedikit (lebih
sedikit dibanding laktosa dan sukrosa) sehingga jumlah asam pada permukaan (slant)
hilang secara cepat menjadi basa, karena pada mulanya bagian slant telah menjadi
kuning tapi dalam waktu lebih dari 24 jam sel akan kehabisan glukosa dan memilih
untuk memanfaatkan protein sehingga media menjadi merah.
= slant dan butt kuning (asam) dengan atau tidak adanya gas
telah terjadi fermentasi glukosa, laktosa dan atau sukrosa karena laktosa dan sukrosa
memiliki konsentrasi yang lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan untuk substrat
fermentasi lanjutan (jika glukosa habis) menghasilkan asam yang ditandai warna
kuning setelah 24 jam.
= butt berwarna kehitaman
adanya H2S yang bereaksi dengan senyawa besi FeSO4 pada media menghasilkan FeS
yang berwarna kehitam-hitaman. H2S ini merupakan hasil dari metabolisme
= media pecah atau terangkat
timbul gas sebagai hasil samping fermentasi
82
PENGUKURAN KADAR PROTEIN MIKROBA
DENGAN METODE BRADFORD DAN LOWRY
Kompetensi: Mahasiswa mampu melakukan pengukuran kadar protein mikroba
A. Dasar Teori
Uji Bradford adalah suatu uji untuk mengukur konsentrasi protein total dengan secara
kolorimetri dalam suatu larutan. Dalam uji Bradford melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue
(CBB) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga memberikan
warna (kebiruan). Karena menghasilkan warna, sehingga secara kolorimetri dapat diukur
absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri (Lambert‐Beer) pada panjang gelombang
465‐595 nm (cahaya tampak).
B.
Alat dan Bahan
Spektrofotometer
Coomasie brilian blue (CBB) G‐250
Etanol 95%
Asam fosfor 85%
BSA (bovine serum albumin)
Biakan bakteri
C.
Cara Kerja
PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD
1.
PembuatanReagen Bradford
Reagen Bradforddibuat dengan cara menimbang 0.01 g coomasie brilian blue (CBB) G‐250
yang kemudian dilarutkan dalam 5 ml etanol 95% (v/v), lalu ditambahkan 10 ml asam fosfor 85%
(v/v). Campuran dihomogenkan (dikocok kuat) lalu disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam
botol gelap dan suhu rendah. Stok pereaksi Bradford harus diencerkan 5 kali sebelum digunakan..
2. Pembuatan Larutan standar protein
Standar proteindibuat dengan menimbang 0,01 g BSA (bovine serum albumin) yang kemudian
dilarutkan dengan 10 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA dengan konsentrasi 1000
ppm. Larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm diencerkan dengan melarutkan 0,5 ml larutan stok
ditambahkan 4,5 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA 100 ppm. Dari larutan stok
tersebut dilakukan pengukuran terhadap standar protein terlarut dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40,
50, 60, 70, 80, 90 dan 100 ppm. Kemudian dilakukan pengukuran terhadap standar protein dengan
menambahkan 0.1 ml seri larutan standar dengan 5 ml reagen Bradford. Kemudian larutan divortex
dan di inkubasi pada suhu ruang selama 10‐60 menit. Larutan ini memberikan warna biru dan dibaca
pada panjang gelombang 595 nm. Dengan menggunakan regresi linear, akan didapatkan persamaan
matematik untuk larutan standar protein yang diperoleh dari nilai absorbansi standar, yang akan
digunakan pada pengukuran kadar protein terlarut.
3. Pengukuran protein terlarut
Bahan yang digunakan adalah biakan bakteri Bacillus subtilis. umur 18 jam dalam
larutan kaldu nutrient yang ditambahkan 1% pati tapioca yang kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C. diperoleh supernatant yang
kemudian disebut dengan ekstrak enzim kasar (EEK).
Pengukuran sampeldilakukan dengan cara menambahkan 0,1 ml ekstrak enzim kasar dengan 5 ml
reagen Bradford divortex dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10‐60 menit. Absorbansi Larutan
83
sampel protein dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Dengan persamaan matematik dari kurva
standar protein, akan didapatkan kadar protein terlarut yang terkandung dalam larutan ekstrak enzim
kasar.
Penentuan kadar protein dengan Metode Lowry
Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode termodifikasi
Lowry dkk., menggunakan larutan standar Bovine Serum Albumin.
Disiapkan
reagen
Lowry
A
(larutan
asam
phosphor-tungstic-phospho-
molibdic),kemudian ditambahkan foolindan akuades dengan perbandingan 1:1 sedangkan
Lowry B dibuat dari campuran antara 100 mL larutan Na2CO3 2 % dalam larutan NaOH 0,1
N dengan 1 mL CuSO4.5H2O 1 % dan 1,0 mL natrium-kalium tartrat 2 %.
Prosedur Pembuatan Kurva Standar
a)
Dimasukkan ke dalam deret tabung reaksi : 0 (blanko); 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mL protein
standar BSA.
b) Ditambahkan aquadest sampai volume total masing-masing 2 mL. sehingga diperoleh
protein standar BSA dengan konsentrasi 0,10; 0,15; 0,20; 0,25, 0,30 mg/mL.
c)
Selanjutnya dipipet masing-masing 1 mL ke dalam deret tabung reaksi lalu ditambahkan
masing-masing 8 mL pereaksi Lowry B, dihomogenkan lalu dibiarkan selama 10-15 menit.
d) Ditambahkan 1 mL pereaksi Lowry A ke dalam tabung reaksi yang telah berisi Lowry B,
dikocok merata dengan cepat sesudah penambahan.
e)
Dibiarkan selama 30 menit sampai warna biru terbentuk. Diukur pada gelombang maksimum
lalu dibuat kurva standarnya.
Penentuan Kadar Protein sampel :
a)
Dipipet 1 mL larutan enzim tiap fraksi kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
b) Diberi perlakuan yang sama dengan larutan standar dan blanko(Ahmad, A., Patta, A. M., and
Natsir, H., 2013).
84
ISOLASI BAKTERIOFAGE
Kompetensi: Mahasiswa mampu melakukan isolasi bakteriofaga dari limbah cair
A. Dasar Teori
Bakteriofage adalah virus yang menginfeksi bakteri dan dapat menghancurkan secara
langsung sel bakteri , atau memadukan DNA-nya ke dalam kromosom bakteri. DNA fage
yang terintegrasi ke dalam kromosom sel inang dan tinggal di dalamnya tanpa
membahayakan inang dinamakan siklus lisogeni. Disisi lain fage juga dapat melisis sel inang
setelah bereproduksi dan keluar dengan sejumlah progeni melalui siklus litik. fage umum
ditemukan di lingkungan, terutama pada sampel limbah cair. Limbah merupakan habitat
bakteri fekal (coliform) dan diduga di dalam limbah mengandung banyak galur fage bakteri
koliform yang beragam. Keberadaan fage pada media agar
dapat dilihat dengan terbentunya plak pada media tersebut.
Plak menandakan bakteri yang ada pada area tersebut
mengalami lisis.
B. Alat dan Bahan
Water bath
Limbah cair
Kultur cair E. coli umur 3-5 jam
Nutrient Agar semi padat (agar 0.7%)
Nutrient Agar
Buffer Salin
C. Cara Kerja
 Lakukan pengenceran sampel limbah cair 10-1 dan 10-2 dengan menggunakan
buffer salin.
 Siapkan media agar semi padat (suhu 50 °C) dalam 4 tabung reaksi, beri label
masing-masing tabung dengan 1, 2, 3, dan4.
 Inokulasikan 1 ml limbah cair yang tidak diencerkan dam 1 ml kultur E. coli pada
tabung 1. Tuang pada media NA dan sebar dengan cara memutar cawan petri
membentuk angka 8.
 Inokulasikan 1 ml limbah cair yang telah diencerkan (10-1 dan 10-2) pada tabung 2
dan 3. Buat control pada tabung 4 dengan buffer salin tanpa limbah cair. Tuang
pada media NA dan sebar dengan cara memutar cawan petri membentuk angka 8.
 Biarkan media memadat. Inkubasi selama 48 jam.
 Hitung jumlah plak yang terbentuk pada setiap cawan, catat ukuran dan bentuk
plak.
.
85
DAFTAR PUSTAKA
Ali, A., 2004. Penuntun Praktikum Mikrobiologi I. Makassar; Universitas Negeri
Makassar.
Bibiana W. Lay, 1994. Analisis Mikrobiologi di Laboratorium. Penerbit Rajawali Pers. PT.
Raja Grafindo Persada Jakarta.
Fardiaz S., 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta.
Hafsah, 2008. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Analitik. Makassar; Universitas Islam
Negeri Makassar.
Suriawiria, U., 1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung; Angkasa.
Tiwari RP, Hondal GS, Tewari R. 2008. Laboratory techniques in Microbiology and
biotechnology. India. Abshike Publication Chandigarh.
______ , 2008. Materi Pelengkap Perkuliahan Mikrobiologi Analitik. Makassar;
Universitas Islam Negeri Makassar.
86
LAMPIRAN
1. Syarat Perhitungan SPC
Syaratsyarat perhitungan SPC sebagai berikut :
- Pilih cawan yang ditumbuhi koloni dengan jumlah 30-300 koloni. > 300 =
TNTC (Too Numerous To Count) atau TBUD (Terlalu Banyak Untuk
Dihitung). < 30 = TFTC (Too Few To Count).
10-2
234
650
TNTC
-
-
10-3
20
127
TNTC
10-4
5
10
195
SPC
2,3X104
1,3X105
2X106
Keterangan
28 dan 5 <30
650 >300
TNTC >300
Jumlah koloni yang dilaporkan terdiri dari 2 digit yaitu angka satuan dan
angka sepersepuluh yang dikalikan dengan kelipatan 10 (eksponensial),
missal 2,3 X 104, bukan 2,34 X 104. pembulatan keatas dilakukan pada angka
seperseratus yang sama atau lebih besar dari lima, missal 2,35 X 104 menjadi
2,4 X 104, atau 2,34 X 104 menjadi 2,3 X 104.
Bila diperoleh perhitungan < 30 dari semua pengenceran, maka hanya dari
pengenceran terendah yang dilaporkan.
10-2
15
-
10-3
TNTC
325
SPC
1,5X103
Keterangan
Semua <30
10-4
358
18
SPC
3,6X106
3,3X105
Keterangan
Pngc.trtgg(10-4)
Pngc.trtgg(10-3)
Bila ada 2 cawan, masing-masing dari pengenceran rendah dan tinggi yang
berurutan dengan jumlah koloni 30-300 dan hasil bagi dari jumlah koloni
pengenceran tertinggi dan terendah ≤ 2, maka jumlah yang dilaporkan adalah
nilai rata-rata. Jika hasil bagi dari pengenceran tertinggi dan terendah > 2
maka jumlah yang dilaporkan adalah dari cawan dengan pengenceran
terendah.
10-2
295
140
-
10-4
0
Bila diperoleh perhitungan > 300 dari semua pengenceran, maka hanya dari
pengenceran tertinggi yang dilaporkan.
10-2
TNTC
TNTC
-
10-3
1
10-3
40
35
10-4
5
1
SPC
3,5X104
1,4X104
Keterangan
40.000/29.500<2
35.000/14.000>2
Apabila setiap pengenceran digunakan 2 cawan petri (duplo), maka jumlah
angka yang digunakan adalah rata-rata dari kedua nilai jumlah masingmasing
setelah diperhitungkan.
10-2
175
208
135
10-3
15
20
45
10-4
5
2
5
SPC
(17.500+20.800)/2
= 1,9X104
(13.500+16.500)/2
Keterangan
15 dan 20 <30
45.000/13.500>2
87
= 1,5X104
165
45
8
275
35
5
(27.500/35.000)/2=a
285
40
7
(28.500+40.000)/2=b
(a+b)/2 = 3,3X104
290
25
5
(29.000+30.000)/2 =
3X104
305
28
0
45.000/10.500>2
Dilap. Pengc.
terendah
27.500/35.000<2
28.500/40.000<2
Dilap. Hasil ratarata
25 dan 28 <30
meskipun
305>300
Bagan alur persyaratan SPC
88