PENENTUAN DAYA INHIBISI EKSTRAK AIR DAN ETANOL
advertisement
PENENTUAN DAYA INHIBISI EKSTRAK AIR DAN ETANOL DAGING BUAH MAHKOTA DEWA (Phaleria marcrocarpa (Scheff.) Boerl.) TERHADAP AKTIVITAS ENZIM TIROSIN KINASE SECARA IN VITRO SALIM DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006 ABSTRAK SALIM. Penentuan Daya Inhibisi Ekstrak Air dan Etanol Daging Buah Mahkota Dewa (Phaleria marcrocarpa (Scheff.) Boerl.) Terhadap Aktivitas Enzim Tirosin Kinase Secara In Vitro. Dibimbing oleh DYAH ISWANTINI PRADONO dan GUSTINI SYAHBIRIN. Tirosin kinase berperan penting dalam mengatur pertumbuhan dan diferensiasi sel. Aktivitas berlebihan dari enzim ini akibat mutasi akan menyebabkan pertumbuhan sel menjadi tidak tekendali. Daging buah mahkota dewa (Phaleria marcrocarpa (Scheff.) Boerl.) merupakan tumbuhan yang secara tradisional digunakan sebagai obat. Penelitian ini menguji daya hambat dari ekstrak tanaman terhadap aktivitas tirosin kinase menggunakan teknik enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) dan hasilnya dibandingkan dengan genistein (kontrol positif). Ekstraksi daging buah mahkota dewa dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol 70%, akuademineral, dan air panas. Hasil menunjukkan bahwa ketiga ekstrak mengandung flavonoid, alkaloid, saponin, dan tanin. Toksisitas ekstrak etanol lebih tinggi dari ekstrak akuademineral dan air panas dengan nilai LC50 berturut-turut 542,42; 543,68; dan 548,62 ppm. Ekstrak akuademineral dan air panas menghasilkan daya hambat lebih besar daripada ekstrak kasar flavonoid (72,11%) dari penelitian sebelumnya. Daya hambat untuk ekstrak akuademineral, air panas, dan etanol masing-masing sebesar 78,38%; 73,52%; dan 63.61%. Ketiga ekstrak ini mampu menghambat aktivitas tirosin kinase lebih tinggi dari genistein (6,12%) pada konsentrasi 300 ppm. Maka ketiga ekstrak tersebut mempunyai potensi yang besar sebagai inhibitor enzim tirosin kinase. ABSTRACT SALIM. In Vitro Inhibition of Water and Ethanol Extract of Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) towards Tyrosine Kinase Enzyme Activity. Supervised by DYAH ISWANTINI PRADONO and GUSTINI SYAHBIRIN. Tyrosine kinase plays an important role in controlling the cell growth and differentiation. Over activity of this enzyme caused by mutation will cause an uncontrollable cell growth. mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) is a plant traditionally used as a herbal medicine. This research investigated the inhibition of Mahkota dewa fruit extracts towards tyrosine kinase activity using enzyme linked immunosorbent assay technique and the result was compared with genistein as a positive control. The extraction of mahkota dewa fruits was carried out using 70% ethanol, aquademineralized, and hot water. The results showed that the three extracts contain flavonoids, alkaloids, saponins, and tannins. The toxicity of ethanol extract was higher than both water and aquademineralized extract, with the LC50 of 542.42, 543.68, and 548.62 ppm, respectively. Aquademineralized and hot water extracts have inhibition activity higher than flavonoid crude extract (72.11%) from the previous research (Dardanella 2005), while the inhibition from aquademineralized, hot water , and ethanol extracts were 78.38%, 73.52%, and 63.61% , respectively. These three extracts were more able to inhibit tyrosine kinase activity than genistein (6,12%) on the concentration of 300 ppm. It proves that these three extracts have potency as an inhibition tyrosine kinase enzyme activity.. PENENTUAN DAYA INHIBISI EKSTRAK AIR DAN ETANOL DAGING BUAH MAHKOTA DEWA (Phaleria marcrocarpa (Scheff.) Boerl.) TERHADAP AKTIVITAS ENZIM TIROSIN KINASE SECARA IN VITRO SALIM Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006 Judul : Penentuan Daya Inhibisi Ekstrak Air dan Etanol Daging Buah Mahkota Dewa (Phaleria marcrocarpa (Scheff.) Boerl.) Terhadap Aktivitas Enzim Tirosin Kinase Secara in Vitro Nama : Salim NIM : G44201023 Disetujui: Pembimbing I, Pembimbing II, Dr. Dyah Iswantini Pradono, M.Agr NIP 131956706 Dra. Gustini Syahbirin, M.S. NIP 131842414 Diketahui: Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuann Alam Institut Pertanian Bogor Dr.Ir. Yonny Koesmaryono, M.S. NIP 131473999 Tanggal lulus : PRAKATA Bismillahirrahmaanirrahim. Puji dan syukur penulis panjatkan hanya kepada Allah SWT atas izin-Nya karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih adalah khasiat dari tanaman mahkota dewa sebagai antikanker, dengan judul Penentuan Daya Inhibisi Ekstrak Air dan Etanol Daging Buah Mahkota Dewa (Phaleria marcrocarpa (Scheff.) Boerl.) Terhadap Aktivitas Enzim Tirosin Kinase Secara in vitro. Penelitian ini dilakukan dari bulan Juni sampai Desember 2005 di Laboratorium Kimia Organik, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Virologi, Lipid dan Hispatologi, Pusat Studi Satwa Primata. Penulis berterima kasih terhadap berbagai pihak yang telah membantu penyelesaian karya ilmiah ini terutama ibu Dr. Dyah Iswantini Pradono, M.Agr dan ibu Dra. Gustini Syahbirin, MS. Kepada Departemen Kimia yang telah memberikan dana A2 untuk penelitian ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada staf Laboratorium Organik antara lain Ibu Yenni, Ibu Aah, Bapak Sabur, Mas Toni, dan Kak Budi Arifin atas fasilitas dan bimbingannya. Terima kasih kepada Ibunda tercinta, Ayahanda (alm), adeku, Ani, temanteman penelitian (Wiwi, Maya, Tri), warga walet, Dedi Irawan, soele, dan, seluruh temanteman Kimia angkatan 38 atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat Bogor, Febuari 2006 Salim RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 15 februari 1983 sebagai anak kedua dari tiga bersaudara, anak dari pasangan KH. Abdul Rozak Ma’mun (alm) dan Hj. Nurhasanah. Pada tahun 2001 penulis lulus SMU SULUH Jakarta dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih program studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Pada tahun 2004 penulis melakukan praktek lapangan di Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional Jakarta. DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ........................................................................................................... ii DAFTAR GAMBAR ....................................................................................................... ii DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................................... ii PENDAHULUAN ........................................................................................................... 1 TINJAUAN PUSTAKA Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) ..................................... 1 Kanker.................................................................................................................. 2 Uji Toksisitas Terhadap Larva Udang (Artemia salina Leach) ........................... 2 Enzim Protein Tirosin Kinase (PTK)................................................................... 2 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays) ................................................ 3 Mineral................................................................................................................. 3 Uji Aktivitas Enzim PTK..................................................................................... 4 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat..................................................................................................... 4 Metode penelitian................................................................................................. 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air ............................................................................................................. 6 Ekstraksi............................................................................................................... 6 Kandungan Fitokimia........................................................................................... 7 Uji Toksisitas Terhadap Larva Udang ................................................................. 8 Uji in vitro Ekstrak Terhadap Enzim Tirosin Kinase........................................... 8 SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................................. 10 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................................... 10 LAMPIRAN..................................................................................................................... 12 DAFTAR TABEL Halaman 1 Hasil uji fitokimia pada sampel basah dan kering daging buah mahkota dewa.......................................................................................... 7 2 Hasil uji fitokimia pada ekstrak etanol, akuademineral, dan air panas ........................ 8 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Buah mahokta dewa ..................................................................................................... 2 2 Struktur senyawa genistein sebagai inhibitor spesifik enzim tirosin kinase ................ 3 3 Nilai LC50 pada tiap ekstrak terhadap larva A. salina Leach ....................................... 8 4 Persen inhibisi enzim tirosin kinase oleh masing-masing ekstrak ............................... 9 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Prosedur pembuatan beberapa pereaksi yang digunakan dalam uji fitokimia ............. 13 2 Bagan alir penelitian .................................................................................................... 14 3 Penentuan kadar air dan rendemen .............................................................................. 15 4 Hasil uji fitokimia pada berbagai tahap percobaan ...................................................... 16 5 Aktivitas berbagai ekstrak terhadap larva udang setelah 24 jam ................................ 17 6 Contoh perhitungan nilai LC50 ektrak etanol menggunakan analisis probit ................ 18 6 Hasil uji inhibisi terhadap aktivitas enzim tirosin kinase............................................. 19 1 PENDAHULUAN Kasus kanker di Indonesia dari tahun ke tahun terus meningkat dan merupakan salah satu penyebab utama kematian, terutama kanker mulut rahim dan payudara. Kanker merupakan suatu penyakit yang disebabkan oleh pertumbuhan sel-sel jaringan tubuh yang tidak normal dan tidak terkontrol. Teknik pengobatan kanker yang lazim dilakukan diantaranya pembedahan, radioterapi dan kemoterapi. Teknik pengobatan ini membutuhkan biaya yang sangat mahal dan menimbulkan efek samping seperti mual, pusing, diare (Simadibrata 2004), terjadinya malnutrisi (Hariani 2004), pengurangan sel darah putih (Hukom 2004), dan kematian. Oleh karena itu, banyak penderita kanker mencari alternatif pengobatan yang lebih murah dan tidak menimbulkan efek samping. Alternatif pengobatan yang banyak diminati oleh penderita penyakit kanker, yaitu dengan mengkonsumsi tanaman obat yang berpotensi sebagai anti-kanker. Kanker dapat disebabkan oleh aktivitas enzim tirosin kinase yang tidak normal. Salah satu tanaman obat yang berpotensi menghambat kerja enzim tirosin kinase yaitu daging buah mahkota dewa. Enzim protein kinase berperan penting dalam mengatur pertumbuhan dan diferensiasi sel. Aktivitas tirosin kinase sebagai reseptor pertumbuhan dan protein onkogen sangat penting bagi perbanyakan sel. Inhibitor spesifik yang ditargetkan pada wilayah aktivitas tirosin kinase dapat berpotensi sebagai obat anti-perkembangbiakan. Salah satu inhibitor tirosin kinase yang telah diketahui ialah kelompok isoflavon alami, yaitu genistein dan daidzein (Challem 2002). Hasil penelitian terdahulu menunjukkan bahwa pontensi antioksidan daging buah mahkota dewa tua lebih besar (82,2%) daripada daging buah muda (26,3%) (Satria 2005). Ekstrak Etanol 70% daging buah mahkota dewa menghasilkan kadar flavonoid yang tinggi (Anni et al. 2003). Ekstrak kasar flavonoid buah mahkota dewa memiliki kandungan bioakif dan berpotensi sebagai antikanker. Buah mahkota dewa memiliki daya hambat terhadap aktivitas enzim tirosin kinase lebih tinggi dibandingkan dengan genistein sebagai kontrol positif. Ekstrak kasar flavonoid buah mahkota dewa 300 ppm menghasilkan penghambatan 72,11% (Dardanella 2005). Berdasarkan penelitian tersebut, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut, salah satunya adalah menentukan daya inhibisi ekstrak air dan ekstrak etanol dari buah mahkota dewa terhadap aktivitas enzim tirosin kinase. Pelarut air dan etanol 70% adalah pelarut yang diperbolehkan digunakan untuk produksi pangan dan farmasi agar produk yang dihasilkan aman untuk dikonsumsi. Pada penelitian ini dilakukan pengujian secara in vitro dari daya hambat kedua ekstrak daging buah mahkota dewa terhadap aktivitas enzim tirosin kinase. Selain itu, dilakukan juga uji fitokimia terhadap tanaman segar dan kedua ekstrak daging buah mahkota dewa, serta uji toksisitas untuk menentukan nilai LC50 dengan menggunakan larva udang. Penelitian ini bertujuan untuk menguji dan membandingkan khasiat dari ekstrak akuademineral, ekstrak air panas, dan ekstrak etanol daging buah mahkota dewa sebagai antikanker berdasarkan daya inhibisinya terhadap aktivitas enzim tirosin kinase. Hipotesis dari penelitian ini adalah bahwa daging buah mahkota dewa yang diekstraksi menggunakan pelarut etanol dan akuademineral memiliki potensi sebagai antikanker. TINJAUAN PUSTAKA Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) Mahkota dewa merupakan tanaman yang berasal dari Papua. Tanaman ini dikelompokkan dalam dunia Spermatofita, filum Angiosprmae, kelas Dycotyledoneae, ordo Thymelaeales, famili Thymelaeaceae, dengan genus Phaleria dan nama species Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl. Tanaman ini dikenal juga dengan nama: mahkota ratu, pusaka dewa, mahkota raja, trimahkota, buah simalakama, raja obat, pau (cina), dan the crown of god (Inggris) (Harmanto 2001). Tanaman ini berupa pohon perdu dengan tajuk pohon bercabang-cabang. Ketinggiannya sekitar 1,5-2,5 meter, namun jika dibiarkan, bisa mencapai lima meter. Mahkota dewa bisa berumur sampai puluhan tahun. Tingkat produktivitasnya mampu dipertahankan sampai usia 10 bahkan 20 tahun. Pohonnya terdiri dari akar, batang, daun, bunga, dan buah. Akarnya berupa akar tunggang yang panjangnya bisa mencapai 100 cm. Akar ini belum terbukti bisa digunakan untuk pengobatan (Harmanto 2001). 2 Mahkota dewa saat ini merupakan salah satu komoditas tanaman obat yang banyak menjadi bahan perbincangan. Hal ini dikarenakan banyak khasiat dari mahkota dewa yang baru dibuktikan secara empiris dan baru sedikit yang dibuktikan secara ilmiah. Secara empiris tanaman ini dilaporkan berkhasiat untuk menyembuhkan berbagai penyakit antara lain: kanker, penyakit hati, ginjal, diabetes, asam urat, rematik, darah tinggi, penyakit jantung, lemah syahwat, sirosis hati, paru-paru, disentri, alergi, flu, serta berbagi penyakit kulit (Taryono 2002). Penelitian sebelumnya mengenai buah mahkota dewa (Gambar 1) menunjukkan bahwa bahan alam ini memiliki potensi tinggi sebagai antikanker karena mempunyai daya hambat tinggi terhadap sel Leukemia pada konsentrasi yang rendah (4.99-7.71 μg/ml), dan memiliki aktivitas antioksidan yang cukup potensial (Lisdawati 2002). Gambar 1 Buah mahkota dewa. Buah mahkota dewa memiliki kandungan senyawa-senyawa golongan alkaloid dan saponin terutama pada bagian buah yang menyebabkan buah makota dewa bersifat racun (Winarto 2003). Selain itu, mahkota dewa memiliki kandungan polifenol dan flavonoid (Harmanto 2002). Kanker Kanker adalah suatu kondisi yang ditandai oleh replikasi dan pertumbuhan tak terkontrol badan sel. Kanker adalah tumor yang membahayakan atau malignant tumor (Siswandono & Soekarjo 1995). Sel kanker merupakan sel yang telah kehilangan daya aturnya. Sedangkan menurut Lisdawati (2002) kanker adalah penyakit sel dengan ciri-ciri kegagalan mekanisme pengatur multifikasi dan fungsi nomeostatis lain pada organisme multiseluler. Kanker adalah pertumbuhan sel somatik (sel tubuh) yang cepat dan tidak terkendali akibat adanya mutasi pada sel itu atau karena ketidakteraturan status hormon seseorang. Sel kanker mempunyai sistem enzim yang yang berbeda, yaitu jumlah macam enzim pada sel kanker lebih sedikit dan enzim untuk pertumbuhannya pada sel kanker lebih besar bila dibandingkan dengan sel normal. Kanker dapat dibagi menjadi empat kelompok, yaitu karsinoma, sarkoma, leukemia, dan limfoma (Ganiswara 1995). Karsinogen adalah sifat zat atau bahan yang dapat menyebabkan penyakit kanker. Zat ini bekerja dengan memicu perubahan genetik tertentu dalam suatu sel sehingga terbentuk neoplasma yang dapat berubah menjadi kanker (Lu 1995). Uji Toksisitas Terhadap Larva Udang (Artemia salina Leach) Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan untuk mengamati aktivitas farmakologi suatu senyawa. Salah satu metode uji bioativitas senyawa bahan alam adalah uji letalitas larva udang atau uji brine shrimp lethality test (BSLT). Metode BSLT umum digunakan karena cepat, murah, dan sederhana (tidak memerlukan keahlian serta peralatan khusus), dengan hasil yang dapat dipercaya. Selain itu, uji ini juga memiliki spektrum farmakologis yang luas (Meyer et al. 1982). Keunggulan penggunaan larva udang (Artemia salina Leach) untuk uji BSLT ialah sifatnya yang peka terhadap bahan uji, siklus hidup yang lebih cepat, mudah dibiakkan, dan harganya yang relatif murah. A. salina yang baik digunakan untuk uji BSLT ialah yang berumur 48 jam sebab jika berumur lebih dari 48 jam dikhawatirkan kematiannya bukan disebabkan toksisitas ekstrak melainkan oleh terbatasnya persediaan makanan (Meyer et al. 1982). Dari uji BSLT, diperoleh nilai konsentrasi letal 50% (LC50), yaitu dosis senyawa bioaktif yang dapat menyebabkan kematian 50% hewan uji. Penentuan LC50 dengan derajat kepercayaan 95% ditentukan dengan program analisis probit Finney. Senyawa kimia dikatakan berpotensi bioaktif jika mempunyai nilai LC50 kurang dari 1000 ppm (Meyer et al. 1982). Enzim Protein Tirosin Kinase (PTK) Aktivitas banyak enzim, protein target, dan saluran membran diatur oleh fosforilasi, yaitu suatu tipe modifikasi kovalen bolakbalik yang umum. Enzim yang mengkatalisis reaksi seperti ini disebut protein kinase. Terdapat dua kelompok protein kinase: (1) 3 Protein kinase yang memfosforilasi jenis spesifik serin dan treonin, dan (2) Protein kinase yang memfosforilasi jenis spesifik residu tirosin (Mahlmann 2000). Pada berbagai gen yang berkaitan dalam transduksi sinyal melalui reseptor membran sel, hanya beberapa yang terekspresi banyak di tumor. Bagian terbesar dalam transduksi sinyal adalah reaksi fosforilasi dan defosforilasi dari residu tirosin dalam protein faktor yang berkaitan dalam pengaturan sinyal. Akseptor dalam reaksi fosforilasi protein terjadi dalam sel ketika jumlah ATP berlimpah. Pada reaksi fosforilasi, gugus terminal (gama) fosforil milik ATP ditransfer ke gugus serin, treonin, atau tirosin. Enzim PTK adalah enzim yang mengkatalisis transfer gugus fosforil dari ATP ke tirosin pada substrat protein yang mengakibatkan perubahan struktur dan fungsi substrat (O’Dwyer et al. 2000). Enzim PTK (EC 2.7.1.112) dikenal juga dengan berbagai nama seperti tirosilprotein kinase, protein kinase (tirosin), ataupun gen lck tirosin kinase. Mutasi yang menyebabkan aktivitas tirosin kinase yang tidak terkontrol akan mengakibatkan kanker (Mahlmann 2000). Inhibitor spesifik enzim tirosin kinase yang umum digunakan adalah senyawa isoflavonoid genistein. Genistein (4’,5,7trihidroksiisoflavon) merupakan prekursor umum dalam biosintesis antimikrobial pitoaleksin dan pitoantisipin pada tumbuhan polong-polongan, dan molekul nutraceutical penting yang terdapat dalam biji kedelai. Genistein dapat menghambat kerja DNA topoisomerase dan protein tirosin kinase seperti yang dimiliki oleh antioksidan dan aktivitas inhibitor siklus sel (Gambar 2). Genistein memblokade EGF-mediated tirosin fosforilasi di dalam sel karsinoma epidermal manusia dan menghambat fosforilasi dari EGF-reseptor atau pada substrat tirosin kinase (Dixon 2002). O HO OH O OH Gambar 2 Struktur senyawa genistein sebagai inhibitor spesifik enzim tirosin kinase. MINERAL Mineral hampir selalu ditemukan dalam air tawar dan air laut, walaupun jumlahnya sangat terbatas. Dalam kondisi normal, beberapa macam logam baik logam ringan maupun logam berat jumlahnya sangat sedikit dalam air. Beberapa logam itu besifat esensial dan sangat dibutuhkan dalam proses kehidupan, misalnya kalsium (Ca), fosfor (P), magnesium (Mg) yang merupakan logam ringan berguna untuk pembentukan kutikula atau sisik pada ikan dan udang. Sedangkan tembaga (Cu), seng (Zn), mangan (Mn), merupakan logam berat yang sangat bermanfaat dalam pembentukan haemosianin dalam sistem darah dan enzimatik ( Darmono 1995). Mineral merupakan bagian dari tubuh dan memegang peranan penting dalam pemiliharan fungsi tubuh, baik pada tingkat sel, jaringan, organ maupun fungsi tubuh secara keseluruhan. Kalsium, fosfor, dan magnesium berperan dalam berbagai tahap metabolisme, terutama sebagai kofaktor dalam aktivitas enzim-enzim. Keseimbangan ion-ion mineral di dalam cairan tubuh diperlukan untuk pengaturan perkerjaan enzim-enzim, pemeliharan keseimbangan asam-basa, membantu transfer ikatan-ikatan penting membran sel dan pemeliharan kepekaan otot dan syaraf terhadap rangsangan (Almatsier 2002). Mineral digolongkan ke dalam mineral makro dan mineral mikro. Mineral makro adalah mineral yang dibutuhkan tubuh dalam jumlah lebih dari 100 mg sehari, sedangkan mineral mikro dibutuhkan kurang dari 100 mg sehari. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays) Enzyme-Linked immunosorbent Assays (ELISA) atau uji kadar imunosorbent terikatenzim merupakan metode analisis yang didasarkan reaksi antara antigen dan antibodi yang dideteksi oleh antibodi lain. Metode ini sangat bermanfaat untuk mengukur senyawa tertentu dalam larutan seperti serum, urin dan supernatant dari jaringan (culture supernatan). Metode ini juga banyak digunakan di laboratorium untuk mendeteksi adanya komponen antigen atau komponen antibodi dari sampel yang diuji (Tizard 1987). Terdapat beberapa variasi teknik ELISA secara umum, yaitu langsung (direct), tidak langsung (indirect), kompetitif, sandwich dan modifikasi dari semua teknik ini. Masingmasing teknik memiliki fungsi yang berbeda, teknik langsung, kompetitif dan sandwich umumnya digunakan untuk mendeteksi antigen, sedangkan teknik tidak langsung 4 untuk mendeteksi antibodi (Voller et al. 1979). Secara umum metode ELISA banyak dipilih karena ELISA merupakan uji serologis yang relatif cepat dan murah untuk dilakukan di laboratorium. Uji Aktivitas Enzim PTK Penelitian ini menggunakan uji aktivitas enzim dengan memakai metode Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). ELISA merupakan metode yang paling luas digunakan untuk pengujian yang dikenal dengan enzyme immunoassay (EIA). Terdapat dua teknik dasar yaitu, direct ELISA yang mendeteksi antigen dan indirect ELISA yang mendeteksi antibodi. Metode ini menggunakan lempeng mikrotiter yang terdiri atas sejumlah sumur yang dangkal. Prosedur dengan ELISA lebih menguntungkan karena dalam pengerjaannya tidak membutuhkan keahlian khusus dan hasil uji dapat menunjukkan hasil yang positif dan negatif dengan jelas. Selain itu metode ELISA memiliki kesensitifan dan kespesifikan yang tinggi (Voller et al. 1979). Beberapa keuntungan dari prosedur ini adalah kespesifikan dan kesensitifan yang tinggi dibandingkan dengan metode radioaktif, pengujian yang mudah dan dapat dipercaya, penunjukkan yang cepat dan ukuran komponen yang tepat untuk penanganan yang mudah. Selain itu, jika dibandingkan dengan metode radioaktif metode ini lebih aman. Sistem peralatan pengujian Protein Tirosin Kinase (PTK) untuk penentuan aktivitas protein tirosin kinase secara in vitro didasarkan pada uji ELISA dengan menggunakan mikropelat yang dilapisi dengan substrat polimer PTK yang spesifik. Mikropelat dilapisi dengan substrat polimer acak sintetik poli-Glu-Tyr (PGT) yang mengandung residu tirosin. Reaksi fosforilase dimulai dengan penambahan PTK dalam buffer tirosin kinase. Substrat polimer terfosforilasi diperiksa sebagai antibodi monoklonal spesifik fosfotirosin murni yang mengkonjugasikan horseradish peroxidase (HRP). Warna terbentuk oleh substrat kromogenik HRP (OPD). Warna yang terbentuk dikuantisasi dengan spektrofotometri dan menggambarkan jumlah relatif aktivitas tirosin kinase dalam sampel (kualitatif). Aktivitas protein tirosin kinase dalam sampel (kuantitatif) didapat dari kontrol EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) atau perhitungan grafik aktivitas EGFR pada panjang gelombang 492 nm terhadap unit aktivitas EGFR (Sigma). BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah daging buah mahkota dewa yang diperoleh dari kebun tanaman obat Karyasari Leuwiliang Bogor, kit untuk uji aktivitas tirosin kinase dengan metode ELISA, proteleum eter, metanol, kloroform, heksana, logam Mg, amil alkohol, HCl 2 N, HCl 37%, etanol 95%, NH4OH, H2SO4 pekat, eter, anhidrida asetat, NaOH, FeCl3, air laut, bibit A. salina Leach, aquades, air panas, akuademineral, dan etanol 70%, serta pereaksi Dragendorf, Mayer, Wagner, dan Lieberman-Burchard (Lampiran 1) Alat yang digunakan adalah alat-alat kaca, alat-alat ekstraksi, labu penguap putar, pengering beku, pipet mikro, mikroplate, cawan porselin, pinggan porselin, pipet Mohr, pipet volumetrik, gelas piala (vial), neraca analitik, aerator, oven, dan peralatan ELISA. Metode Penelitian Penelitian ini terdiri atas tiga bagian, yaitu (1) Analisis bahan, ekstraksi, penentuan rendemen, dan uji fitokimia ekstrak; (2) Uji toksisitas ekstrak dengan menggunakan nilai LC50; (3) Penentuan daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas tirosin kinase. Bagan alir penelitian terdapat pada Lampiran 2. Penentuan Kadar Air Bagian tanaman yang sudah dibersihkan, kemudian dikeringkan dalam oven suhu 450C sampai memiliki kadar air 10 %. Pengukuran kadar air dilakukan dengan cara mengeringkan cawan porselin pada suhu 105oC selama 30 menit, kemudian didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Serbuk tanaman kering ditimbang sebanyak 3 gram, lalu dimasukkan ke dalam cawan porselin dan dikeringkan dalam oven pada suhu 105oC selama 3 jam. Setelah itu didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Prosedur dilakukan berulang-ulang hingga diperoleh bobot tetap. Ekstraksi dengan Pelarut Etanol 70% Serbuk daging buah mahkota dewa kering dicuci dengan pelarut heksana selama 3 jam. Sampel kemudian diekstraksi dengan etanol 70% selama 2 hari lalu disaring. Ekstraksi 5 dilakukan 3 kali. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan labu penguap putar pada suhu dibawah 50oC sampai diperoleh residu kering. Hasil ekstrak ini selanjutnya digunakan untuk penentuan nilai LC50 dan diuji daya inhibisinya terhadap aktivitas enzim tirosin kinase. Ekstraksi dengan Pelarut Air Terdemineralisasi (Akuademineral) Serbuk daging buah mahkota dewa kering dicuci dengan l pelarut heksana selama 3 jam. Sampel yang telah dicuci dengan heksana kemudian diekstrak secara maserasi dengan akuademineral selama 2 hari. Ekstraksi dilakukan 3 kali. Filtrat yang dihasilkan dikeringkan menggunakan metode pengering beku (freeze-dried). Ekstrak kering yang diperoleh selanjutnya digunakan untuk penentuan nilai LC50 dan pengujian daya inhibisi terhadap enzim tirosin kinase. Ekstraksi dengan Pelarut Air Panas (Air Seduhan) Serbuk daging buah mahkota dewa diseduh dengan air mendidih kemudian diaduk terus sampai menjadi dingin lalu disaring. Filtrat yang diperoleh dikeringkan menggunakan metode pengering beku (freezedried). Ekstrak kering yang diperoleh selanjutnya digunakan untuk penentuan nilai LC50 dan pengujian daya inhibisi terhadap enzim tirosin kinase. Uji Fitokimia (Metode Harborne 1996). Uji fitokimia yang akan dilakukan meliputi uji alkaloid, uji flavonoid, uji terpenoid dan steroid, uji saponin, uji kuinon serta uji tanin. Uji Alkaloid. Sebanyak 1 gram ekstrak dilarutkan dengan kloroform dan beberapa tetes NH4OH kemudian disaring dalam tabung reaksi tertutup. Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi dikocok dengan 10 tetes H2SO4 2 M lalu lapisan asamnya dipisahkan dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada lempeng tetes dan ditambahkan pereaksi Dragendorf, Mayer dan Wagner yang akan menimbulkan endapan dengan warna berturut-turut merah jingga, putih, dan coklat. Uji Flavonoid. Sebanyak 5 mL filtrat ditambahkan serbuk magnesium (0,5 gram), 1 mL alkohol klorhidrat (campuran HCl 37% dan etanol 95% dengan volume sama), dan amil alkohol, kemudian dikocok kuat-kuat. Terbentuknya warna merah, kuning, dan jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya golongan flavonoid. Sebanyak 1 mL ekstrak ditambah dengan 1 mL metanol 95%, 0.5 g Zn, dan 2 tetes HCl 2N, didiamkan selama 2 menit lalu ditambah 1 mL HCl pekat. Uji akan positif untuk glikosida flavonoid bila dalam 2-5 menit terbentuk warna merah intensif. Uji Terpenoid dan Steroid. Sebanyak 2 gram ekstrak tanaman dilarutkan dengan 25 mL etanol panas (50oC) kemudian disaring kedalam pinggan poeselin dan diuapkan sampai kering. Residu ditambahkan eter dan ekstrak eter dipindahkan ke dalam lempeng tetes lalu ditambahkan 3 tetes anhidrida asam asetat dan 1 tetes H2SO4 pekat (Uji Lieberman-Buchard). Warna merah atau ungu menunjukkan kandungan triterpenoid sedangkan warna hijau atau biru menunjukkan kandungan steroid. Uji Saponin. Sebanyak 1 gram ekstrak tanaman dimasukkan ke dalam gelas piala dan ditambahkan 100 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit kemudian disaring dan filtrat digunakan untuk pengujian. Uji saponin dilakukan dengan pengocokan 10 mL filtrat ke dalam tabung tertutup selama 10 menit. Timbulnya busa hingga selang waktu 10 menit (buih stabil) menunjukkan adanya saponin. Uji Kuinon. Sebanyak 1 gram ekstrak tanaman ditambah 100 mL air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring. Ke dalam 10 mL filtrat ditambahkan beberapa tetes NH4OH. Warna merah yang terbentuk menunjukkan adanya kuinon. Uji Tanin. Sebanyak 1 gram ekstrak tanaman ditambahkan 100 mL air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring. Sebagian filtrat ditambahkan FeCl3. Terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan terdapatnya tanin. Uji Toksisitas (LC50) Penetasan Kista A. salina Leach. Kista A. salina ditimbang sebanyak 50 mg kemudian dimasukkan ke dalam vial yang berisi air laut yang sudah disaring. Setelah diaerasi kista dibiarkan selama 48 jam di bawah pencahayaan lampu agar menetas sempurna. Larva yang sudah menetas diambil untuk digunakan dalam uji toksisitas. Uji toksisitas terhadap A. salina. Sebanyak 10 ekor larva A. salina dimasukkan ke dalam vial yang berisi air laut lalu ditambahkan larutan ekstrak (ekstrak air, etanol, dan ekstrak kasar flavonoid) sehingga konsentrasi akhirnya menjadi 1000, 500, 100 dan 10 ppm. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan 6 menghitung jumlah larva yang mati dari total larva yang dimasukkan ke dalam vial. Perhitungan larva udang menggunakan bantuan kaca pembesar. Pengolahan data persen mortalitas kumulatif digunakan analisis probit LC50 dengan selang kepercayaan 95%. Kontrol dilakukan dengan air laut tanpa penambahan ekstrak. Penentuan Daya Inhibisi Ekstrak Terhadap Aktivitas Tirosin Kinase Pelapisan 96-wells Microtiter Plate Peralatan uji protein kinase (PTK) disediakan dengan sumur yang dapat dipindahkan sehingga pengujian dapat dilakukan hanya dengan jumlah sumur yang diperlukan dalam percobaan khusus. Pelapisan dilakukan dengan cara-cara berikut. Plastik penutup dilepaskan dari tempatnya, kemudian jumlah sumur yang diperlukan ditempatkan dalam well holder. Polimer sintetik acak poli-Glu-Tyr (PGT) dan protein tirosin kinase substrat dilarutkan dengan PBS (phosphate buffered saline), dan sebanyak 125 μL substrat tersebut ditambahkan ke dalam masing-masing sumur, kemudian ditutup. Setelah itu plate diinkubasi pada suhu 37oC selama semalam, jika diperlukan waktu pelapisan dapat diperpendek menjadi 4 jam. Larutan pelapis dibuang dan masing-masing sumur dicuci dengan 200 μL buffer pencuci (PBS-Tween 20). Sisa buffer pencuci dibuang dan sumur plate dikeringkan selama 2 jam pada suhu 30oC. Pengujian Protein Tirosin Kinase Pelarut buffer tirosin kinase (BTK) dengan konsentrasi 1x dibuat dengan cara, sebanyak 1 mL BTK konsentrasi 10x dilarutkan dengan 9 mL air deionisasi. Sebanyak 5 μL EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) (20U) dicairkan, kemudian ditambah 95 μL BTK (1x), lalu campuran dihomogenkan dan disimpan dalam es. Larutan stok ATP dicairkan, kemudian sebanyak 40 μL larutan ATP ditambahkan pada 1 mL BTK (1x), dicampurkan lalu disimpan dalam es. Sebanyak 90 μL BTK (1x) yang mengandung ATP dimasukkan ke dalam setiap sumur. Sebagai blanko digunakan 20 μL BTK (1x) yang dimasukkan ke dalam sumur. Sedangkan untuk kontrol digunakan EGFR sebanyak 20 μL (4U) dan sampel yang diuji, dilarutkan dengan perbandingan 1:1 atau 1:2 dan seterusnya dalam BTK. Konsentrasi akhir ATP dalam reaksi PTK adalah 0,3 mM. Setelah itu sumur-sumur ditutup dan diinkubasi pada temperatur kamar selama 30 menit. Campuran dikeluarkan dari setiap sumur, dan sumur dicuci dengan 200 μL buffer pencuci dengan lima kali pengulangan. Setelah itu, sebanyak 100 μL larutan antibodi konjugat (HRP, Horse Radish Peroxidase) dengan pelarutan yang tepat dimasukkan ke dalam sumur. Sumur ditutup dan diinkubasi selama 30 menit pada temperatur ruangan. Larutan substrat peroksidase segar dibuat dengan cara pelarutan satu tablet OPD (0Phenylenediamine) dan satu tablet urea hidrogen peroksida dalam 20 mL air deionisasi, dicampurkan sampai larut dan hindarkan dari cahaya sampai digunakan, larutan ini tidak untuk disimpan. Setelah itu, larutan antibodi dikeluarkan dari sumur, kemudian masing-masing sumur dicuci dengan 200 μL buffer pencuci, pencucian dilakukan lima kali. Kemudian, sebanyak 100 μL larutan substrat OPD segar ditambahkan pada masing-masing sumur dan diinkubasi selama tujuh menit dalam keadaan gelap dan suhu ruangan. Warna jingga-kuning akan muncul dalam sumur yang positif. Reaksi dihentikan dengan penambahan 100 μL H2SO4 2,5 N pada masing-masing sumur. Sumur diukur serapannya pada 490 nm. Pengukuran harus dalam waktu 30 menit dalam mikroplat ELISA yang ditetapkan pada hari penambahan larutan penghenti. Kurva aktivitas PTK dapat dibuat dengan kontrol EGFR, dilakukan dengan proses yang sama, hanya adanya modifikasi pada konsentrasi EGFR. Sebanyak 5 μL EGFR (20U) dicairkan dan ditambah 45 μL TKB 1x, kemudian dicampurkan. Ini menunjukkan pada 8U EGFR/20μL, dibuat seri larutan dari GFR dengan TKB sehingga mewakili 0,25U, 0,5U, 1U, 2U, dan 4U EGFR. HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air Penentuan kadar air berguna untuk menyatakan kandungan zat dalam tumbuhan sebagai % bahan kering. Selain itu juga untuk mengetahui ketahanan suatu bahan dalam penyimpanan (Harjadi 1993). Bila kandungan air yang terkandung dalam suatu bahan berkisar antara 3% dan 7%, maka kestabilan optimum bahan akan tercapai dan pertumbuhan mikrob dapat dikurangi sehingga dapat memperpanjang masa simpan tanaman kering (Winarno 1997). 7 Kadar air yang diperoleh dari bahan basah dan serbuk daging buah mahkota dewa masing-masing sebesar 90,48 % dan 9,71 % (Lampiran 3). Kadar air yang dihasilkan ternyata lebih dari kisaran 3−7% (Winarno 1997). Oleh sebab itu, sebaiknya sampel harus langsung digunakan agar tidak terjadi penyimpangan, atau dapat dikeringkan kembali untuk menghindari aktivitas mikrob. Ekstraksi Ekstraksi yang dilakukan menggunakan metode maserasi. Metode ini dipilih untuk mencegah rusaknya senyawa metabolit sekunder yang tidak tahan terhadap suhu tinggi. Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi daging buah mahkota dewa adalah air panas, akuademineral, dan etanol 70%, dengan nisbah 1:4. Pelarut etanol digunakan karena etanol memiliki dua gugus yang berbeda kepolarannya, yaitu gugus hidroksil yang bersifat polar dan gugus alkil yang bersifat nonpolar. Dengan adanya kedua gugus ini diharapkan senyawa-senyawa dengan tingkat kepolaran yang berbeda akan terekstrak ke dalam etanol. Selain itu, produksi skala industri biasanya menggunakan pelarut etanol. Air panas dipilih sebagai pelarut karena umumnya masyarakat menggunakan air panas untuk menyeduh atau merebus obat. Penggunaan akuademineral (bebas mineral) bertujuan untuk mengetahui dan membandingkan pengaruh mineral yang ada dalam air panas terhadap daya inhibisi tirosin kinase. Daging buah mahkota dewa yang sudah dikeringkan dengan oven sebagian diekstraksi menggunakan n-heksana. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan lemak yang mungkin dapat mengganggu proses ekstraksi selanjutnya. Ampas yang ada lalu di ekstraksi menggunakan pelarut etanol 70% dan akuademineral. Ekstrak etanol 70% dipekatkan menggunakan penguap putar pada suhu 40oC untuk mencegah kemungkinan terjadinya kerusakan komponen yang terkandung dalam ekstrak. Poses penghilangan lemak tidak dilakukan terlebih dahulu untuk sampel yang diekstraksi dengan air seduhan. Hal ini didasari oleh pemakaian tradisional daging buah mahkota dewa sebagai obat secara tradisional, yaitu dengan cara diseduh. Ekstrak yang diperoleh kemudian dikeringkan dengan pengering beku (freeze-dried) untuk menghindari kerusakan komponen dalam ekstrak. Pada proses freeze drying, bahan dibekukan terlebih dahulu dan es yang terjebak di dalamnya dibuang dengan pompa vakum (es menyublim) sehingga air dapat disingkirkan tanpa merusak bahan yang dikeringkan (Daintith 1990) dan dapat mencegah kemungkinan hilangnya senyawaan tertentu yang tidak tahan terhadap kalor. Semua ekstrak yang dihasilkan berbentuk oily dan berwarna coklat kemerahan. Rendemen yang dihasilkan dari ekstrak pelarut etanol 70%, akuademineral, dan air panas masingmasing sebesar 15.5 %, 7.02%, dan 12.68%. Kandungan Fitokimia Analisis fitokimia adalah salah satu cara untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder pada suatu tanaman. Analisis fitokimia dilakukan terhadap sampel basa, kering, dan ekstrak daging buah mahkota dewa. Senyawa-senyawa yang diperiksa keberadaannya meliputi flavonoid, alkaloid, tanin, saponin, kuinon, terpenoid dan steroid (Lampiran 4). Hasil uji fitokimia yang didapat untuk sampel basah dan kering adalah daging buah mahkota dewa mengandung flavonoid, alkaloid, tanin, dan saponin (Tabel 1). Flavonoid memberikan hasil positif pada semua ekstrak yang diuji (Tabel 2). Hal ini dikarenakan beberapa senyawa flavonoid mudah larut dalam air, terutama bentuk glikosidanya. Alkaloid memberikan hasil positif pada semua ekstrak yang diuji. Menurut Harbone (1996) alkaloid memiliki kelarutan yang berbeda. Alkaloid umumnya larut dalam pelarut lipofil tetapi dalam bentuk garamnya larut dalam pelarut hidrofil. Alkaloid dalam tanaman umumnya terdapat dalam bentuk garam, sehingga alkaloid dapat diekstrak dengan pelarut hidrofil. Saponin adalah senyawa aktif yang menimbulkan busa jika dikocok. Saponin memberikan hasil positif pada semua bahan yang diuji (Tabel 1 dan 2). Tabel 1 Hasil uji fitokimia pada sampel basah dan kering daging buah mahkota dewa Sampel Senyawa Basah Kering Flavonoid + + Alkaloid + + Tanin + + Saponin + + Kuinon Terpenoid Steroid Keterangan : + = memberikan hasil positif 8 = memberikan hasil negatif Hal ini terjadi karena saponin merupakan senyawa glikosida terpenoid atau glikosida steroid dan bersifat polar (Robinson 1993). Uji tanin menunjukkan hasil positif pada semua ekstrak yang diuji. Hal ini terbukti dari hasil pengujian menghasilkan warna hijau kehitaman. Senyawa metabolit sekunder yang terekstraksi oleh pelarut akuademineral dan air panas jumlah dan jenisnya sama. Hal ini menunjukkan bahwa pemanasan yang dilakukan tidak merusak kandungan metabolit sekunder. Triterpenoid dan steroid memberikan hasil negatif pada semua ekstrak yang uji. Hal ini disebabkan pada sampel basa dan kering tidak mengandung senyawa triterpenoid dan steroid. Senyawa triterpenoid dan steroid umumnya larut dalam lemak atau pelarut nonpolar. Saponin, flavonoid, alkaloid, dan tanin memberikan hasil positif pada semua bahan yang diuji. Hal ini sesuai dengan berbagai literatur yang menyatakan bahwa daging buah mahkota dewa diduga mengandung alkaloid, saponin, flavonoid, dan tanin (Harmanto 2003; Lisdawati 2002; Sumastuti 200) Tabel 2 Hasil uji fitokimia pada ekstrak etanol, akuademineral, dan air panas Ekstrak Senyawa Air Etanol Akudemineral Panas Flavonoid + + + Alkaloid + + + Tanin + + + Saponin + + + Kuinon Terpenoid Steroid Keterangan: + = memberikan hasil positif - = memberikan hasil negatif Uji Toksisitas Terhadap Larva Udang . Larva udang yang digunakan adalah larva udang yang berada pada kondisi paling peka terhadap kondisi lingkungannya. Hal ini disebabkan oleh keadaan membran kulitnya yang sangat tipis, sehingga memungkinkan terjadinya difusi zat dari lingkungan yang memengaruhi metabolisme dalam tubuhnya. Kondisi ini biasanya ketika larva berumur dua hari atau 48 jam. Jika larva berumur lebih dari 48 jam dikhawatirkan kematiannya bukan disebabkan toksisitas ekstrak, melainkan oleh terbatasnya persediaan makanan (Meyer et al. 1982). Menurut Meyer et al. (1982), suatu ekstrak atau fraksi dari suatu tanaman dianggap memiliki efek positif terhadap uji kematian larva udang jika LC50 nya kurang dari 1000 ppm, hanya spektrum keaktifannya masih sangat luas. Hasil perlakuan penambahan ekstrak selama 24 jam terhadap larva udang ditunjukkan oleh Lampiran 5. Jumlah larva udang yang mati akibat penambahan ekstrak kasar kemudian dianalisis dengan menggunakan analisis probit (Lampiran 6). Hasil pengujian menunjukkan semua ekstrak daging buah mahkota dewa mengandung senyawa bioaktif. Hal ini ditunjukkan dari nilai LC50 kurang dari 1000 ppm. Ekstrak etanol menghasilkan nilai toksisitas LC50 sebesar 542,42 ppm, ekstrak akuademineral 543,68 ppm, dan ekstrak air panas sebesar 548,62 ppm (Gambar 5). Hasil ini menunjukkan bahwa semua ekstrak memiliki senyawa metabolit sekunder yang aktif dan toksik. Konsentrasi LC50 yang diperoleh dari semua ekstrak tidak jauh berbeda dengan konsentrasi LC50 dari ekstrak kasar flavonoid sebesar 541,76 ppm (Dardanella 2005). Pengujian tingkat toksisitas dari ekstrak yang diperoleh, dilakukan untuk menentukan konsentrasi yang akan digunakan pada uji enzimatis terhadap enzim tirosin kinase. 548.62 549 548 Konsentrasi (ppm) - 547 546 545 543.68 544 542.42 543 542 541 540 539 Ekstrak etanol 70% Ekstrak air panas Ekstrak akuademineral Gambar 3 Nilai LC50 pada tiap ekstrak terhadap larva A. salina. Uji In vitro Ekstrak Terhadap Enzim Tirosin Kinase Uji in vitro dari semua ekstrak menggunakan uji ELISA ( Enzyme linked immunosorbent assay). Konsentrasi yang digunakan pada pengujian terhadap enzim tirosin kinase secara in vitro ini adalah konsentrasi yang berada di bawah nilai LC50 dari masing-masing ekstrak. Hal ini dilakukan untuk mengetahui daya hambat aktivitas 9 tersendiri dalam menghasilkan nilai daya hambat pada aktivitas tirosin kinase. Metabolit sekunder flavonoid sudah banyak diketahui sebagai inhibitor spesifik dari tirosin kinase. Berdasarkan uji fitokimia, kandungan flavonoid pada ekstrak akuademineral dan air panas lebih besar daripada kandungan senyawa metabolit sekunder lain. Maka, diduga senyawa flavonoid memiliki peran yang cukup besar dalam aktivitasnya menghambat tirosin kinase. Dalam penelitian sebelumnya ditunjukkan bahwa daya hambat ekstrak kasar 78.38 80 73.52 63.61 70 60 % Inhibisi enzim pada keadaan yang tidak toksik sehingga dapat diketahui tingkat kekuatan dari ekstrak yang digunakan pada kondisi yang paling aman bagi tubuh. Konsentrasi yang dipilih untuk uji ini adalah 300 ppm. Konsentrasi ini dipilih karena pada penelitian sebelumnya daya inhibisi yang dihasilkan paling besar pada konsentrasi 300 ppm (Dardanella 2005). Pengujian dilakukan dengan kontrol negatif (tanpa penambahan ekstrak) dan kontrol positif (mengandung genestein). Hasil yang diperoleh berupa absorbansi dari aktivitas enzim tirosin kinase (Lampiran 7). Semakin rendah nilai absorbansi yang dihasilkan akibat ekstrak yang ditambahkan semakin besar pula daya hambat terhadap aktivitas enzim tirosin kinase. Hal ini dikarenakan produk yang dihasilkan oleh enzim tersebut akan semakin sedikit. Gambar 6 menunjukkan persen inhibisi setiap ekstrak terhadap aktivitas enzim tirosin kinase. Ekstrak etanol, akuademineral, dan air panas masing-masing menghasilkan inhibisi sebesar 63,61%, 78,38%, dan 73,52%. Hasil pengujian menunjukkan semua ekstrak memiliki tingkat inhibisi lebih besar dibandingkan genestein. Hal ini menunjukkan bahwa semua ekstrak berpotensi sebagai antikanker. Ekstrak akuademineral menghasilkan daya inhibisi paling besar dibandingkan dengan genistein (kontrol positif) dan ekstrak lainnya. Hal ini diduga bahwa senyawasenyawa metabolit sekunder yang terekstraksi pada pelarut akuademineral lebih dapat menghambat aktivitas tirosin kinase. Kemungkinan senyawa-senyawa tersebut terikat dengan sisi aktif enzim secara lebih dominan dibandingkan dengan senyawa pada ekstrak lain. Uji fitokimia menunjukkan kandungan senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada ekstrak air panas dan ekstrak akuademineral sama dalam hal jenis ataupun jumlahnya (Tabel 2) tetapi daya inhibisi ekstrak air panas terhadap aktivitas tirosin kinase lebih rendah dibandingkan dengan akuademineral. Berdasarkan hasil tersebut diduga kandungan mineral yang terdapat di dalam air panas seperti kalsium, magnesium, besi, atu zeng berfungsi sebagai kofaktor bagi tirosin kinase itu sendiri atau menghambat bioaktivitas senyawa metabolit pada ekstrak (efek antagonis). Keberadaan dari beberapa senyawa metabolit sekunder seperti flavonoid, alkaloid, tanin, dan terpenoid pada ekstrak kasar yang diujikan, diduga memiliki peran 50 40 30 20 10 6.02 0 0 EGFR ( - ) Genestein (+) Ekstrak etanol 70% Ekstrak air panas Ekstrak akuademineral Gambar 4 Persen inhibisi enzim tirosin kinase oleh masing-masing ekstrak. flavonoid pada tanaman daging buah mahkota dewa lebih tinggi daripada genistein terhadap aktivitas tirosin kinase pada konsentrasi yang sama (300 ppm) sebesar 72,11 % (Dardanella 2005). Genistein yang digunakan sebagai kontrol positif pada penelitian ini lazim digunakan sebagai standar dalam menganalisis daya inhibisi dari tirosin kinase. Senyawa flavonoid ini berinteraksi secara kompetitif dengan sisi aktif ATP dan non-kompetitif dengan sisi aktif substrat dari tirosin kinase (Akiyama et al. 1987). Alkaloid yang terekstraksi dalam ketiga ekstrak kasar tanaman mahkota dewa juga diduga menyebabkan tingginya daya inhibisi. Beberapa penelitian tentang studi alkaloid menunjukkan efek toksisitasnya terhadap sel kanker (Alexandrova et al. 2000) dan terbukti efektif dalam mengobati pasien kanker payudara metastatik. Saponin dalam tumbuhan sudah dimanfaatkan untuk pengobatan. Saponin yang terkandung pada tanaman ciplukan berkhasiat sebagai antitumor dan menghambat pertumbuhan kanker terutama kanker usus besar (Mangan 2003). Selain itu saponin yang terdapat pada tanaman kunyit, tapak dara, sabung nyawa, mengkudu,dan kitolod memiliki khasiat sebagai antikanker (Mangan 10 2003). Saponin yang terekstraksi dalam ketiga ekstrak kasar tanaman mahkota dewa juga diduga menyebabkan tingginya daya inhibisi. Tanin adalah kandungan senyawa tumbuhan yang bersifat fenol. Senyawa ini juga diduga sebagai salah satu dari senyawa aktif yang dapat menginhibisi tirosin kinase. Penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa senyawa ini mempunyai aktivitas antioksidan, penghambat pertumbuhan tumor, serta dapat menghambat enzim seperti transkriptase dan DNA topoisomerase (Robinson 1993). Hasil uji ELISA terhadap ekstrak dengan pelarut akuademineral (78,38%) dan air panas (73,52%) menghasilkan daya inhibisi lebih besar dibandingkan dengan penelitian sebelumnya yaitu ekstrak kasar flavonoid buah mahkota dewa 300 ppm menghasilkan penghambatan 72,11% (Dardanella 2005). Hal ini mungkin dikarenakan senyawa metabolit sekunder yang terekstrak dalam akuademineral dan air panas berkerja secara sinergis untuk menghambat kerjanya enzim tirosin kinase. Semua ekstrak yang dihasilkan menunjukkan sifat inhibitor yang baik terhadap enzim tirosin kinase, bahkan memiliki daya hambat lebih besar daripada kontrol positif genestein. Hal ini sangat berguna sebagai bukti ilmiah pada kajian potensi dari beberapa tanaman yang berpotensi sebagai antikanker. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Sampel daging buah mahkota dewa basah, kering, ekstrak etanol, akuademineral, air seduhan mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, tanin, dan saponin. Rendemen yang diperoleh dari hasil ekstraksi dengan pelarut etanol 70%, akuademineral dan air seduhan serbuk daging buah mahkota dewa masingmasing sebesar 15,59%, 12,68% dan 7,02%. Nilai LC50 ketiga ekstrak tersebut masingmasing sebesar 542,42 ppm, 543,68 ppm dan 548,62 ppm. Data hasil penelitian menunjukkan bahwa daging buah mahkota dewa berpotensi menghambat aktivitas kerja enzim Tirosin kinase. Ekstrak akuademineral dan air panas dengan konsentrasi 300 ppm memiliki daya inhbisi yang lebih tinggi dibanding dengan ekstrak kasar flavonoid (72,11%) dari penelitian sebelumnya. Ekstrak etanol, air panas ,dan akuademineral menghasilkan penghambatan berturut-turut sebesar 63,61%; 73,52%; dan 78,38%. Ketiga ekstrak ini mampu menghambat aktivitas tirosin kinase lebih tinggi dari genistein (6,12%) pada konsentrasi 300 ppm. Terbukti bahwa ketiga ekstrak berpotensi sebagai obat antikanker. Saran Perlu dilakukan pemurnian ekstrak kasar yang menghasilkan daya inhibisi tersbesar, sehingga dapat diketahui secara pasti senyawa bioaktif yang berperan sebagai antikanker. Selain itu, perlu dilakukan pengujian terhadap sel kanker. DAFTAR PUSTAKA Akiyama et al. 1987. Genestein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinase. J Biol Chem 262:5592-5595. Alexandrova R, Varadinova T, Velcheva M, Genova P, Salnova I. 2000. Cytotoxic effect of isoquinoline alkaloid on tumor cell lines. Experimental Pathology and Parasitology 4:8-14. Almastsier, S 2002. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta: Gramedia. Anni S, Nurmawan D, Alfiani F, Hertiani T. 2003. Daya Antioksidan dan Kadar Flavonoid Hasil Estrak Etanol-Air Daging Buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa(Scheff.) Boerl.). Buletin Penalaran Mahasiwa UGM 10:2-6. Challem J, Toecus VD, Knittel L. 2002. The Soy Sensation. New York: McGraw-Hill. Daintith J. 1990. Kamus Lengkap Kimia. Achmadi SS, penerjemah; Marias, Sitohang DP, editor. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Concise Science Dictionary. Darmono 1995. Logam dalam Sistem biologi Makhluk hidup. Jakarta: Universitas Indonesia. hlm 21-23. Dardanella D. 2005. Penapisan beberapa tanaman asli Indonesia yang berpotensi sebagai antikanker secara enzimatik [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan 11 Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Dixon RA, Ferreira D. 2002. Molecules of interest. Phytochemistry 60:205-211. Satria E. 2005. Potensi Antioksidan dari Daging Buah Muda dan Daging Buah Tua Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpaI (Scheef.) Boerl.) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Ganiswara S et al. 1995. Farmakologi dan Terapi. Ed ke-4. Jakarta: Universitas Indonesia. hlm 686-689. Harborne JB. 1996. Metode Fitokimia: Cara Menganalisis Tanaman. Terjemahan K. Padmawinata dan I Sudiro. Bandung: Penerbit ITB. Hariani R. 2004. Nutrisi pada penderita kanker.http://www.dharmais.co.id./new/c ontent.php?page=article&lang=id&id=4y u [1 April 2005]. Harmanto N. 2002. Mahkota Dewa Obat Pusaka Para Dewa. Jakarta: Agromedia Pusaka. Hukom RA. 2004. Transfusi komponen darah pada penderita kanker. http://www.dharmais.co.id./new/content.php?page=article &lang=id&id=8 [1 April 2005]. Harjadi W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: Gramedia. Lu FC. 1995. Toksikologi Dasar. Terjemahan Edi Nugroho. Jakarta: Universitas Indonesia Press. Lisdawati V. 2002. Buah Mahkota Dewa (Phaleria marcrocarpa (Scheff) Boerl) toksisitas, efek antioksidan dan efek antikanker berdasarkan uji penapisan farmakologi. [artikel]. http://ver1.mahkota dewa.com/VFC/Vivi.htm. [7 April 2005]. Malhmann S. 2000. Signalling by Tirosin Kinase on Regular and Disrupted Hemetopiesis. Swiss: Brussel Institute for Immunology. Markam KR. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Bandung: Penerbit ITB. Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE & Mclaughlin JL. 1982. Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituents. Planta Med. 45: 31-34. Mangan. 2003. cara Bijak Menaklukan Kanker. Jakarta: Agromedia Pustaka. O’Dwyer ME, Druker BJ. 2000. The Role of Tyrosine Kinase Inhibitor ST1571 in The Treatment of Cancer. Portland: Oregon Health Sciences University. Robinson T. 1993. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Ed Ke-6. Terjemahan Kosasih Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB. Simadibrata M. 2004. Diare dan konstipasi akibat kemoterapi. http://www.Dharmais. co.id./new/content.php?page=article&lang =id&id= 8yu [1 April 2005]. Siswandono, Soekardjo. 1995. Kimia Medicinal. Surabaya: Airlangga University Press. Taryono, Ruhnayat A. 2002. Mahkota Dewa Si Raja Obat. Warta Balitro 45:45-49. Tizard I. 1987. Immunology Veteriner. Ed. Ke-2. Penerjemah Soehardjo Hardjosworo. Surabaya: Universitas Airlangga. Voller A, Bidwell DE, Bartleft A. 1986. Microplate enzyme immunoassay for the imunodiagnosis of virus infections. Di dalam Rose NR, Friedman H, editor. Manual of Clinical Laboratory Immunology. Ed ke-3. Washington: American Society for Microbiology. Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Winarto WP. 2003. Mahkota dewa: Budi daya dan Pemanfaatan Untuk Obat. Jakarta: Argomedia Pustaka. 12 LAMPIRAN 13 Lampiran 1 Bagan alir penelitian Daging buah mahkota dewa Di cuci, iris tipis, dioven suhu 40oC selama ± 3 hari dengan kadar air ± 10%, dihaluskan. Uji Fitokimia Serbuk Dimaserasi dengan n-heksana residu Dimaserasi dengan akuademineral. Etanol 70% filtrat Uji fitokimia Di-rotavapour Ekstrak etanol 70% Air panas filtrat filtrat Uji fitokimia Di-rotavapour, Freeze-drying Uji fitokimia Di-rotavapour, Freeze-drying Ekstrak akuademineral Penentuan nilai rendemen Uji toksisitas LC50 Uji aktivitas enzim tirosin kinase Ekstrak air panas 14 Lampiran 2 Penentuan kadar air dan rendemen Kadar air basah daging buah mahkota dewa Bobot Kosong Bobot + Sampel Bobot Basah Bobot Kering Kadar air (g) (g) (g) (g) (%) 1 41.6039 43.6141 2.0102 0.1984 90.13 2 36.6811 38.7192 2.0381 0.1857 90.88 3 28.6004 30.7154 2.1150 0.2018 90.45 Ulangan Kadar air kering daging buah mahkota dewa Bobot Kosong Bobot + Sampel Bobot Basah Bobot Kering Kadar air (g) (g) (g) (g) (%) 1 41.6093 43.6122 2.0029 1.8088 9.69 2 36.6826 38.7220 2.0394 1.8435 9.61 3 28.6361 30.6577 2.0216 1.8229 9.83 Ulangan Perhitungan Kadar Air (%) = Bobot Basah (g) − Bobot Kering (g) x 100% Bobot Basah (g) Data rendemen yang diperoleh dari hasil ekstraksi Serbuk sampel Labu kosong Labu + ekstrak Bobot ekstrak Rendemen (g) (g) (g) (g) (%) Etanol 70% 2.05 131.0279 131.3165 0.2886 15.59 Akuademineral 2.02 130.1975 130.3256 0.1281 7.02 Air Kran 2.05 130.4628 130.6974 0.2346 12.68 Ekstrak Perhitungan: Rendemen (%) = Bobot ekstrak (g) x 100% (1 − kadar air kering) x Serbuk sampel (g) 15 Lampiran 3 Hasil uji fitokimia pada berbagai tahap percobaan Alkaloid Ekstrak Flavonoid Dragendrof Mayer Wagner Tanin Saponin Kuinon Terpenoid Steroid Bahan Basah + + + + + + - - - Bahan Kering + + + + + + - - - Etanol 70% + - + + + + - - - Air Panas + - + + + + - - - Akuademineral + + + + + + - - - Keterangan : + = memberikan hasil positif - = memberikan hasil negatif 16 Lampiran 4 Aktivitas berbagai ekstrak dari daging buah mahkota dewa terhadap larva A. salina setelah 24 jam Ekstrak Etanol Akuademineral Air Kran Konsentrasi Jumlah Larva Udang yang Mati (ppm) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 0 0 0 0 10 0 0 0 100 0 0 0 500 6 8 6 1000 9 10 7 0 0 0 0 10 0 0 0 100 0 0 0 500 5 6 7 1000 10 9 10 0 0 0 0 10 0 0 0 100 0 0 0 500 5 5 4 1000 10 10 9 17 Lampiran 5 Hasil uji inhibisi terhadap aktivitas enzim tirosin kinase Ekstrak Kasar Konsentrasi Absorbans Persen Inhibisi (%) Ulangan (ppm) Ulangan 1 2 1 2 Rata-rata EGFRa 300 0.47 0.477 0 0 0 Genistein 300 0.443 0.447 6.54 5.70 6.12 Ekstrak Etanol 70% 300 0.182 0.163 61.60 65.61 63.61 300 0.107 0.098 77.43 79.32 78.38 300 0.136 0.115 71.30 75.73 73.52 Ekstrak Akuademineral Ekstrak Air panas a epidermal growth factor receptor Contoh Perhitungan Persen Inhibisi Ekstrak Etanol 70% 300ppm = ⎛⎜1 − Absorbans ekstrak etanol 70% 300 ppm ⎞⎟ × 100% ⎜ ⎟ ⎝ Absorbans EGFR 300 ppm = ⎛⎜1 − 0.182 ⎞⎟ ×100% ⎝ 0.474 ⎠ = 61.60 % ⎠ 18 Lampiran 6 Prosedur pembuatan beberapa pereaksi yang digunakan dalam uji fitokimia ► Pereaksi Dragendroff Bismut subnitrat (basic), BiNO3(OH)2 BiO(OH) ditimbang sebanyak 0.85 gram, kemudian dilarutkan dalam pelarut campuran CH3COOH glasial 10 mL dengan 40 mL H2O. Campuran ini kemuadian ditambahkan larutan KI (KI sebesar 8 gram dilarutkan dalam 20 mL H2O). ► Pereaksi Mayer HgCl2 ditimbang sebanyak 1,3 gram kemudian dilarutkan dalam 30 mL H2O dan dihomogenkan (larutan 1). KI ditimbang sebesar 5 gram lalu dilarutkan kedalam 30 mL H2O kemudian dihomogenkan (larutan 2). Larutan 1 dan 2 kemudian dimasukkan kedalam labu takar 100 mL dan ditambahkan H2O hingga tanda tera. Pereaksi ini disimpan pada botol gelap atau berwarna untuk menghindari kerusakan. ► Pereaksi Wagner KI ditimbang sebesar 2 gram dan I2 ditimbang sebanyak 2,5 gram. Keduanya dimasukkan kedalam gelas piala dan ditambahkan H2O sebanyak 100 mL lalu dihomogenkan. Setelah itu, larutan disaring dan disimpan dalam botol gelap atau berwarna. ► Pereaksi Lieberman-Burchard Asam sulfat pekat dipipet sebanyak 5,0 mL lalu dimasukkan kedalam gelas piala dan disimpan dalam penangas es (dalam keadaan dingin). Setelah itu ditambahkan asam asetat anhidrat sebesar 5,0 mL dan volume akhir dijadikan 50 mL dengan pelarut etanol p.a (~ 40 mL etanol p.a). 19 Lampiran 7 Contoh perhitungan nilai LC50 ekstrak etanol (hasil uji toksisitas larva udang) menggunakan analisis probit * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S Confidence Limits for Effective VAR00001 Prob VAR00001 .01 .02 .03 .04 .05 .06 .07 .08 .09 .10 .15 .20 .25 .30 .35 .40 .45 .50 .55 .60 .65 .70 .75 .80 .85 .90 .91 .92 .93 .94 .95 .96 .97 .98 .99 -108.21784 -31.82852 16.63806 53.09757 82.75458 107.99735 130.13032 149.94775 167.97091 184.56127 253.24976 307.84119 354.67578 396.73469 435.70853 472.69090 508.47177 543.68535 578.89893 614.67980 651.66217 690.63601 732.69492 779.52951 834.12095 902.80943 919.39979 937.42295 957.24038 979.37335 1004.61612 1034.27313 1070.73264 1119.19922 1195.58854 95% Confidence Limits Lower Upper -344.20145 -243.39147 -179.83224 -132.27586 -93.78421 -61.17688 -32.71835 -7.35273 15.61241 36.65686 122.65082 189.39187 245.22870 294.05575 338.05854 378.63129 416.76164 453.21933 488.66344 523.71549 559.02454 595.34600 633.66650 675.44637 723.18792 782.12336 796.20495 811.44490 828.13785 846.70830 867.80249 892.48077 922.68248 962.62874 1025.20640 39.16152 102.65010 143.33304 174.19400 199.48879 221.17374 240.31892 257.57675 273.37592 288.01409 349.75570 400.43021 445.32546 486.95893 526.78131 565.75043 604.57778 643.85764 684.15108 726.05672 770.28955 817.79325 869.93328 928.88549 998.55949 1087.35962 1108.96065 1132.48502 1158.41552 1187.44878 1220.64687 1259.75504 1307.97065 1372.26656 1473.98747 * *
