. Analisis Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

Analisis Single Nucleotide Polymorphism (SNP) -217 Gen Human Angiotensinogen (hAGT)
pada Penderita Hipertensi di Rumah Sakit Syaiful Anwar secara PCR-Sekuensing
S.Fatiyatur Rahmah1), Widodo1), Jayarani Fatimah Putri1), Mifetika Lukitasari2), M. Saifur Rahman3)
1)
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya
2)
Jurusan Keperawatan, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya
3)
Departemen Kardiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya-Rumah Sakit Syaiful Anwar
S. Fatiyatur Rahmah : [email protected]
ABSTRAK
Hipertensi masih menjadi masalah kesehatan utama di dunia. Polimorfisme RAS (Renin
Angiotensin System) dikatakan sebagai penentu hipertensi dan beberapa kerusakan organ target.
Angiotensinogen merupakan protein awal dalam RAS yang memicu timbulnya hipertensi. Diketahui bahwa
populasi skala besar ras Amerika dan Afrika yang terkena hipertensi, terjadi polimorfisme pada daerah
5’untranslated region di titik -217 A/G. Variasi basa pada titik -217 guanine atau adenine meningkatkan
laju ekspresi gen angiotensinogen. Peningkatan ini terjadi akibat dari interaksi kuat antara faktor
transkripsi GR dan C/EBP-β yang berikatan dengan daerah enhanser kemudian mempengaruhi laju
transkripsi RNA polimerase III di daerah promoter gen angiotensinogen. Tujuan dari penelitian ini yaitu
mengetahui adanya single nucleotide polymorphism (SNP) -217 gen human Angiotensinogen (hAGT) pada
penderita hipertensi di Rumah Sakit Syaiful Anwar secara PCR-Sekuensing. Metode yang digunakan yaitu
isolasi whole genome (QIAamp DNA Blood Mini Kit) dari 14 sampel darah pasien hipertensi, gen hAGT di
amplifikasi dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) dan disekuensing untuk mengetahui adanya SNP
-217. Analisis yang dilakukan yaitu menggunakan software AB sequence Scanner, Bioedit dan BLAST
NCBI. Hasil analisis menunjukkan bahwa tidak ditemukan adanya SNP -217 gen hAGT pada sampel
pasien. Namun terdapat varian -6A pada gen tersebut yang juga mampu memicu terjadinya hipertensi.
Kata Kunci : angiotensinogen, gen hAGT, hipertensi, SNP -217 A/G
ABSTRACT
Hypertension still become main problem in the world. Angiotensinogen is an early protein in RAS
which increase hypertension risk. Nucleotide base variant in -217 point of human angiotensinogen gene at
5’untranslated region in which from guanine to adenine can accelerate these transcription. These problem is
caused by strongly interaction between transcription factor of GR and C/EBP-β with hAGT when adenine
nucleotide base in -217 hAGT. The aim of this research was to examine single nucleotide polymorphism -217
at 5’untranslated region in hAGT gene in Syaiful Anwar Hospital hypertension patients. Methods of this
research is whole genome isolation (QIAamp DNA Blood Mini Kit) from fourteen blood samples of
hypertension patients, hAGT gene amplification with Polymerase Chain Reaction and sequencing gene of
interest. The result was analyzed using AB sequence scanner and Bioedit software also BLAST NCBI. There
is no SNP -217 in 5’ untranslated region hAGT gene. But there is -6A variant in 5’untranslated region, that
have affect to increasing hypertension risk.
Keywords : angiotensinogen, hAGT gene, hypertension, SNP -217 A/G
PENDAHULUAN
Hipertensi
masih
menjadi
masalah
kesehatan utama di dunia. Salah satu faktor
pemicunya yaitu adanya polimorfisme pada
gen hAGT yang mempengaruhi tingkat
kerentanan seseorang menderita hipertensi [1].
Variasi di titik -217 A/G gen hAGT ternyata
mampu mempengaruhi pengikatan faktor
transkripsi tiga jenis glucocorticoid receptor
binding site (GR) dan C/EBP-β [13].
Glucocorticoid ini mampu memodulasi banyak
Jurnal Biotropika | Edisi 1 No.2 | 2013
faktor transkripsi yang meningkatkan laju
transkripsi gen hAGT [14][15].
Di Indonesia, penelitian SNP -217 gen
hAGT di daerah 5’UTR belum pernah
dilakukan pada populasi komunitas hipertensi.
Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan pada
populasi komunitas hipertensi di Kota Malang
dengan sampel penderita hipertensi di Rumah
Sakit Syaiful Anwar. Penelitian ini mengkaji
ada atau tidaknya SNP -217 gen human
angiotensinogen (hAGT) pada daerah 5’UTR.
71
METODE PENELITIAN
Pengambilan data dilakukan mulai Bulan
Agustus 2012 sampai Februari 2013
dilaksanakan
di
Laboratorium
Biologi
Molekuler
dan
Laboratorium
Biologi
Komputasi,
Jurusan
Biologi,
Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Brawijaya, Malang.
Empat belas pasien yang diambil sampel
darahnya memiliki kriteria inklusi yaitu
tekanan sistolik >120 mmHg dan tekanan
diastolik > 80 mmHg, fungsi ginjal normal
(kreatinin <2.5 mg/dl), memiliki kepatuhan
yang baik terhadap terapi antihipertensi, tidak
sedang terapi hormon dan tidak sedang hamil.
Metode isolasi DNA menggunakan QIAamp
DNA Blood Mini Kit. Kemudian dibuat gel
agarosa 0.9 % untuk running whole genome.
Hasil elektroforesis whole genome berupa gel
agarosa dengan DNA hasil running dilihat
menggunakan UV transluminator, difoto dan
data disimpan. Sampel DNA, PCR mix
(HotstarTaq Master Mix), ddH2O, primer
forward dan primer reverse (1st BASE)
dicampur
kemudian
disentrifugasi
dan
dimasukkan dalam mesin PCR dengan program
PCR yang telah dimodifikasi [16]. Produk PCR
untuk sekuensing dikirim ke Macrogen Korea
Selatan. Setelah data sekuensing didapat maka
dianalisis dengan AB Sequence Scanner,
software Bioedit, dan program BLAST NCBI.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan analisis BLAST NCBI dan
Bioedit yang dibandingkan dengan hasil
penelitian sebelumnya [4][10] diketahui bahwa
sekuens yang teramplifikasi dan terbaca dengan
sempurna berada pada posisi basa -469 sampai
+10. Posisi tersebut mengandung sekuens
konserve TATA Box yang menandakan daerah
promoter dekat dengan transcription initiation
site +1, SNP -6, SNP -20, SNP -217, daerah
binding
faktor transkripsi glukokortikoid,
estrogen, Acute phase, RNA polimerase III dan
sebagian daerah ekson 1 [6].
Hasil analisis juga menyebutkan bahwa
tidak ditemukannya polimorfisme pada posisi 217 untuk semua sampel yang diuji (Tabel 1).
Ketiadaan polimorfisme pada sampel darah
pasien yang diteliti kemungkinan karena
jumlah sampel yang diteliti kurang banyak.
Varian -217 G yang ditemukan pada penelitian
ini diketahui tidak menjadi faktor resiko
terjadinya hipertensi [15].
Jurnal Biotropika | Edisi 1 No.2 | 2013
Tabel 1. Polimorfisme -217 daerah 5’ UTR gen
human Angiotensinogen
NO
KODE PASIEN
Normotensive
(SBP/DBP<120/80 mmHg)
1.
DS
2.
EM
3.
IS
4.
LC
5.
MS
6.
MR
7.
MC
8.
SK
9.
SR
10.
SM
11.
SP
12.
ST
13.
TR
14.
US
POLIMORFISME
-217
A
G
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Hasil pada penelitian ini berbeda dengan
penelitian polimorfisme -217 yang biasanya
signifikan ditemukan pada ras Afrika-Amerika
dan ras Kaukasian di negara Kanada dan USA
yang menggunakan ratusan sampel darah
pasien [6][7][10]. Perbedaan hasil penelitian
juga ditemukan pada negara Taiwan dan China
di kota Shanghai, Jiangsu serta Henan yang
mana terjadi polimorfisme di titik G-217A.
Jumlah sample yang digunakan berkisar
minimal dua ratus sampel darah pasien
[8][9][12][17][19].
Kasus
terjadinya
polimorphisme G-217A untuk populasi Chinese
di kawasan Asia Timur sebanyak 1268 pasien
dengan
jumlah
kontrol
1081
pasien
(SBP/DBP<140/90 mmHg) [18].
Kasus terjadinya polimorphisme G-217A
untuk kawasan negara-negara di Asia Tenggara
masih belum diketahui. Faktor distribusi
geografi dan ras dalam beberapa penelitian
diketahui mampu mempengaruhi polimorfisme
pada gen hAGT [2][5]. Ketiadaan polimorfisme
di titik -217 sedangkan pasien tersebut
menderita hipertensi, kemungkinan disebabkan
oleh faktor yang lain yaitu adanya
polimorfisme di titik lain dalam 5’UTR hAGT
[10].
Berdasarkan penelitian sebelumnya [11]
diketahui bahwa adanya varian -217A selalu
diikuti oleh varian yang lain yaitu -532A, 793T dan -1074T membentuk haplotipe ATAT.
Haplotipe ini mampu meningkatkan aktivitas
promoter hAGT pada sel adiposa sebesar 1.4fold selama tiga hari dan 1,7-fold selama enam
hari setelah perlakuan dibanding haplotipe
GCGG (-217G, -532C, -793G dan -1074G).
72
Sehingga dimungkinkan jika pada penelitian ini
ditemukan varian -217G, maka SNP yang
menjadi kandidat penyebab hipertensi yaitu -20
dan -6.
Analisis
berikutnya
menelusuri
kemungkinan adanya polimorfisme pada titik
lain yaitu -20 dan -6. Kedua titik tersebut
mampu memicu datangnya faktor transkripsi
tambahan untuk meningkatkan laju transkripsi
gen hAGT yaitu dari kelompok glukokortikoid
dan USF/ERE [10]. Hasil analisis menunjukkan
tidak ditemukan adanya polimorfisme pada
kedua titik tersebut (-20 A dan -6A) untuk
semua pasien hipertensi. Namun jika dilakukan
perbandingan antara sekuens gen dari NCBI
yang memiliki normotensive dengan sampel
hasil sekuensing, terdapat varian yang berbeda
pada posisi -6 hAGT. Varian -6A diketahui
mampu meningkatkan aktifitas promoter hAGT
untuk mentranskripsi mRNA hAGT.
Berdasarkan penelitian yang lain [3] ada
keterkaitan kuat antara varian -6A dengan
T235. Polimorfisme M235T diketahui sebagai
kandidat utama marker resiko hipertensi untuk
protein angiotensinogen. Pengujian populasi
hipertensi pada ras Caucasian dan Japanese di
Utah, Jepang dan Prancis menunjukkan bahwa
-6A/T235 merupakan bentuk ancestral dari gen
hAGT yang secara langsung terkait pada
hipertensi. Hal ini ditunjukkan oleh adanya
frekuensi yang sama dan selalu dominan(antara
-6A dengan T235 yang terletak di ekson 2 gen
hAGT) ditemukan pada hampir semua
penderita hipertensi [10]. Keberadaan -6A juga
diketahui lebih signifikan dominan dibanding 217A pada penderita hipertensi populasi ras
Chinese [21].
Keberadaan SNP -217 hAGT sebenarnya
hanya faktor untuk memperbesar resiko
terjadinya hipertensi dan belum ada penelitian
yang menunjukkan keterkaitan langsung
dengan penyakit hipertensi. Ketentuan ini juga
berlaku pada SNP yang lain yaitu dalam
penelitian ini -6 hAGT. Diketahui bahwa
polimorfisme gen hAGT berasosiasi dengan
peningkatan laju transkripsi gen hAGT dan
sedikit
peningkatan
konsentrasi
angiotensinogen di plasma dan jaringan.
Peningkatan protein angiotensinogen pada
plasma dan jaringan terutama dikendalikan oleh
peningkatan konsentrasi ANG II, yang
dipengaruhi oleh overstimulasi sistem renin
pada reabsorbsi natrium di ginjal, hipertropi
vaskular, peningkatan aktivitas sistem syaraf
dan adanya penyakit kardiovaskular [3].
Jurnal Biotropika | Edisi 1 No.2 | 2013
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil analisa sekuens gen
angiotensinogen yang diambil dari 14 sampel
darah pasien di Rumah Sakit Syaiful Anwar
Kota Malang, Jawa Timur, Indonesia diketahui
bahwa tidak ditemukan polimorfisme gen di
daerah 5’UTR -217. Namun terdapat varian 6A yang juga berperan sebagai faktor resiko
hipertensi.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih kepada PERKI dan SPPDBP yang telah mendanai penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
[1]Aziza, L, M. Sja’bani, S.M. Haryana,
M.N.H.E.Soesatyo & A.H. Sadewa. 2010.
Hubungan Polimorfisme Gen AngiotensinConverting Enzyme Insersi/Delesi dengan
Hipertensi pada Penduduk Mlati, Sleman,
Yogyakarta, Indonesia. Maj Kedokt Indon.
60 (4).
[2] Baker, M.,T. Rahman,D. Hall, P.J. Avery,B.
M. Mayosi, J. M. Connell, M. Farrall,
H.Watkins & B. Keavney. 2007. The C532T
Polymorphism
of
The
Angiotensinogen Gene is Associated with
Pulse Pressure: A Possible Explanation for
Heterogeneity in Genetic Association
Studies of AGT and Hypertension.
International Journal of Epidemiology.
36:1356–1362
[3] Corvol, P. & X. Jeunemaitre. 1997.
Molecular
Genetics
of
Human
Hypertension: Role of Angiotensinogen.
Endocrine Reviews. 18(5): 662– 677.
[4] Fukamizu, A., S. Takahashi, M.S.Seo, M.
Tada, K. Tanimoto, S. Uehara & K.
Murakami. 1990. Structure and Expression
of Human Angiotensinogen Gen :
Identification of a Unique and Highly
Active Promoter. The Journal Of
Biological Chemistry. 265 (13): 75767582.
[5] Goldenberg, I., A. J. Moss, D. Ryan, S.
McNitt, S. W. Eberly & W. Zareba. 2007.
Polymorphism in the Angiotensinogen
Gene,
Hypertension,
and
Ethnic
Differences in the Risk of Recurrent
Coronary Events. Hypertension. 48:693699
[6] Jain, S., X. Tang, C.S. Narayanan, Y.
Agarwal, S.M. Peterson, C.D. Brown, J.
Ott & A. Kumar. 2002.Angiotensinogen
73
Gene Polymorphism at -217 Affects Basal
Promoter Activity and Is Associated with
Hypertension in African-Americans. J Biol
Chem. 277: 36889–36896.
[7] Jeunemaitre, X., F. Soubrier, Y.V.
Kotelevtsev, R.P. Lifton, C.S. Williams, A.
Charru, S. C. Hunt, P. N. Hopkins, R. R.
Williams, J.M. Lalouel & Pierre Corvol.
1992. Molecular Basis of Human
Hypertension: Role of Angiotensinogen.
Cell. 71(1): 169-180.
[8] Jiang, X., H. Sheng, J. Li, P. Xun, Y.
Cheng, J. Huang, H. Xiao & Y. Zhan.
2008.
Association
Between
Renin
Angiotensin System Gene Polymorphism
and Essential Hypertension: a CommunityBased Study. J Hum Hypertens. 23: 176–
181.
[9] Kong, X.D.,Y.X. Yang & S.Z. Zhang. 2004.
Haplotypes Extending Across AGT Are
Associated
Essential
Hypertension.
Hereditas. 26: 797–802.
[10]Kumar, A. 2005. Angiotensinogen Gene
Polymorphisms and Hypertension. cit.
M.K. Raizada, J.F.R. Paton, M.J. Katovich
& S. Kasparov. Contemporary Cardiology:
Cardiovascular Genomics. Humana Press
Inc. Totowa, NJ. hal. 61
[11]Li, Y., S. Jain, S. Patil & A. Kumar. 2006.
A Haplotype of Angiotensinogen Gene that
Is Associated with Essential Hypertension
Increases Its Promoter Activity in
Adipocytes. Vascular Pharmacology. 44
(2006) 29 – 33.
[12]Liu Y, Jin W, Jiang ZW, K. X. Zhang,
H.H. Sheng, L. Jin, Y.Y. Sheng, W. Huang
& J. D. Yu. 2004. Relationship Between
Six Single Nucleotide Polymorphisms of
Angiotensinogen Gene and Essential
Hypertension. Chin J Med Genet. 21:116–
119.
[13]Rupert, J.L., K. K. Kidd, L. E. Norman, M.
V. Monsalve, P.W. Hochachka & D. V.
Devine. 2003. Genetic Polymorphisms in
The Renin-Angiotensin System in High
Altitude and Low –Altitude Native
American Populations. Annals of Human
Genetics. 67:17–25.
[14]Sherman, C. T. & A. R. Brasier. 2001. Role
of Signal Transducers and Activators of
Transcription 1 and -3 in Inducible
Regulation of the Human Angiotensinogen
Gene by Interleukin-6. Mol Endocrinol.
15:441–457.
Jurnal Biotropika | Edisi 1 No.2 | 2013
[15]Sigmund, C.D. 2008. A Growing Chain of
Evidence Linking Genetic Variation in
Angiotensinogen
with
Essential
Hypertension: Focus on “A Haplotype of
Human Angiotensinogen Gene Containing
-217A Increases Blood Pressure in
Transgenic Mice Compared with -217G,”
by Jain et al. Am J Physiol Regul Integr
Comp Physiol. 295:R1846-R1848.
[16]Woodiwiss, A.J., B. Nkeh, N.J. Samani, D.
Badenhorst, M. Maseko, A. D. Tiago, G.P.
Candy, E. Libhaber, P. Sareli, R.
Brooksbank & G. R. Norton. 2006.
Functional
Variants
of
The
Angiotensinogen
Gene
Determine
Antihypertensive
Responses
to
Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitors
in Subjects of African Origin. Journal of
Hypertension. 24(6): 1065-1073.
[17]Wu, S.J., F.T. Chiang, J.R. Jiang, K.L. Hsu,
T.H. Chern & Y.Z. Tseng. 2003. The G217A Variant of The Angiotensinogen
Gene Affects Basal Transcription and Is
Associated With Hypertension in A
Taiwanese Population. J Hypertens. 21:
2061–2067.
[18]Xi, B., Y.Shen, Y.Yan & J. Mi. 2011.
Association of Polymorphisms in The AGT
Gene with Essential Hypertension in The
Chinese Population. Journal of the ReninAngiotensin Aldosterone System. 13 (2) :
282-288.
[19]Zhan,Y., X. Jiang, H. Sheng, J. Li, P. Xun,
Y. Cheng, J., Huang & H. Xiao. 2007.
Association of Angiotensinogen Gene
Polymorphisms with The Risk of Essential
Hypertension in The Elderly. Chin J Lab
Med. 30: 762–766.
74